MICROBIOLOGIA DI PROCESSO è quella parte della microbiologia applicata dipendente dall’impiego di microrganismi (o di cellule animali o vegetali) come mezzo di produzione di biomasse o metaboliti in condizioni controllate L’equazione semplificata di un processo è così rappresentabile: cellule metaboliti primari metaboliti secondari prodotti complessi prodotti di biotrasformazione PRODOTTO SUBSTRATO Recupero Fermentazione CELLULE O LORO COMPONENTI Ingegneria di processo +
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CELLULE O LORO SUBSTRATO COMPONENTI Ingegneria ...6H 12O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2O (ΔG ’ = -2870 kJ/mole) C 6H 12O 6 3CO 2 + 3CH 4 (ΔG ’ = -390 kJ/mole) La bassa resa energetica
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MICROBIOLOGIA DI PROCESSOè quella parte della microbiologia applicata dipendente dall’impiego di
microrganismi (o di cellule animali o vegetali) come mezzo di produzione di biomasse o metaboliti in condizioni controllate
L’equazione semplificata di un processo è così rappresentabile:
Si definisce FERMENTAZIONE quel tipo di metabolismo con il quale un m.o.ricava energia da un substrato in assenza di ossigeno
In pratica vengono definite con FERMENTAZIONE INDUSTRIALE tutti i processi di produzione basati sulle attività metaboliche dei m.o. sia in aerobiosi
che in anaerobiosi.
Le FERMENTAZIONI TRADIZIONALI, sono quelle condotte in enologia per la produzione di bevande alcoliche, nella produzione di derivati del latte (es.
yogurt) o nella produzione tradizionale di lievito per panificazione.In queste fermentazioni gli zuccheri contenuti nella materia prima vengono
trasformati in diversi prodotti, etanolo, a. lattico, cellule di lievito.
Le PRODUZIONI MODERNE sono disegnate e condotte per garantire accumuli di cellule o di prodotti del metabolismo di degradazione (es. etanolo, metano), o del metabolismo di biosintesi (es. antibiotici) da materie prime a basso costo e
con alte rese
FERMENTAZIONI
Il metabolismo si divide in catabolismo ed anabolismo.
I microrganismi possono essere distinti e classificati sulla base del loro catabolismo e delle esigenze nutrizionali.
•Fonte di energia
•Donatore di H
•Accettore di e-
Le molecole entrano nelle cellule attraverso trasporto attivo mediato da ATPasi associate alle membrane, o attraverso trasporto passivo con un sistema di traslocazione che coinvolge zuccheri fosforilati
IL METABOLISMO MICROBICO
Radiazione
Ossidazione
Fototrofi
Chemotrofi
Prod. inorg. ridotti
Molec. org. ridotte
NH4+; NO2-; S2-; S; S2O3
2-
Zuccheri; lipidi; proteine
O2;
Mol.org.ox; NO3-; SO42-; CO2
Aerobi
Anaerobi
Lo schema generale del catabolismo è diviso in tre stadi:
STADIO 1Degradazione delle molecole complesse in monomeri più piccoli. Non viene rilasciata energia.
STADIO 2Ulteriore degradazione dei monomeri con rilascio di parte dell’energia sottoforma di ATP, potere riducente (es. NADH+) e importanti intermedi metabolici (es. piruvato):
STADIO 3Completamento della degradazione dei substrati e raccolta della maggior quantità di energia (ATP; potere riducente) con il ciclo di Krebs accoppiato alla catena di trasporto degli elettroni (respirazioni aerobiche e anaerobiche) od alle fermentazioni.
METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA E’ un processo metabolico molto meno esoergonico della respirazione
aerobica o delle respirazioni anaerobiche La conversione di un esoso a CH4 rilascia solo il 15% dell’energia ottenibile
dalla degradazione aerobica
C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O (ΔG°’ = -2870 kJ/mole)
C6H12O6 3CO2 + 3CH4 (ΔG°’ = -390 kJ/mole)
La bassa resa energetica della metanogenesi costringe i microrganismi coinvolti a cooperare molto efficientemente ed a stabilire relazione di
“SINTROFIA”la cooperazione tra 2 organismi che dipendono l’uno dall’altro. La mutua
dipendenza non può essere sostituita dall’aggiunta di nutrienti. Ad es. la co-coltura di Methanobacillus omelianskii degrada l’etanolo a:
Strain S2CH3CH2OH + 2H2O 2CH3COO- + 2H+ + 4H2 (ΔG°’ = +19 kJ per 2 mol of ethanol)Strain M.o.H.4H2 + CO2 CH4 + 2H2O (ΔG°’ = -131 kJ per mol of methane)
Co-Culture2CH3CH2OH + CO2 2CH3COO- + 2H+ + CH4 (ΔG°’ = -112 kJ per mol of methane)
METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA Un processo che favorisce la sintrofia è il
TRASFERIMENTO INTERSPECIE DI H2, HCOO- E CH3COO-
in cui un efficiente “scavenger” per questi substrati (es. metanogeni o solfatoriduttori) ne mantiene una bassa concentrazione, favorendone la
produzione da parte degli acetogeni sintrofici
METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA
Oltre al classico network metabolico con 3 livelli trofici (acidogenesi, acetogenesi, metanazione) è stato identificato un network metabolico a 2 livelli (acetogenesi e metanazione), in cui un gruppo batterico, le spirochete, produce direttamente acetato, H2 e CO2 da glucosio insieme a quantità variabili di lattato ed etanolo.
In presenza di efficienti “scavenger” per l’H2 come i metanogeni la maggior parte del flusso elettronico del metabolismo delle spirochete va nella direzione di acetato, H2 e CO2 a spese di lattato ed etanolo. In questa situazione metabolica gli acetogeni sintroficihanno un ruolo insignificante ed il processo di metanogenesi viene completato in due livelli trofici.
COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALEQuale è la stabilità dei processi metabolici metanogenici esposti a stress?La risposta di reattori con i 2 tipi di pathway metanogenici (a 2 o 3 livelli) a shock da sovraccarico di substrato indica che la miglior reazione metabolica si ha dove il flusso elettronico di degradazione del substrato a CH4 avviene per vie metaboliche parallele piuttosto che sequenziali.
FLUSSI METABOLICI PARALLELINel caso di reattori ad alto contenuto di spirochete la formazione dei substrati di metanazione(acetato ed H2) da glucosio avviene attraverso 2 vie indipendenti, quella diretta catalizzata dalle spirochete a quella con l’intervento di acetogeni sintrofici
FLUSSI METABOLICI SEQUENZIALINel pathway metanogenico a tre livelli la produzione di acetato e H2 avviene attraverso step metabolici sequenziali catalizzati da diversi gruppi trofici.
COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALEPer verificare la risposta a stress di sovraccarico organico di comunità microbiche metanogeniche che si differenziano per flussi metabolici paralleli piuttosto che sequenziali, sono stati comparati due tipi di reattori derivanti dal medesimo inoculo e condotti nelle medesime condizioni operative, ma selezionati sulla base di differenze per il tempo medio di residenza cellulare (17,5 contro 5,8 giorni) .
L’analisi d’immaginecomputerizzata dei morfotipi microbici e l’analisi ARDRA dei cloni in librerie di 16Sottenute dai due set di reattori indicavano una distinta composi-zione in m.o.:REATTORI HS (high-spirochete) dominati da spirocheTe, bastoncini corti e Methanosarcina.REATTORI LS (lowspirochete) dominati
da cocchi e Methanosaeta. Il sovraccarico di substrato (glucosio) determinava una maggior variazione delle popolazioni nelle comunità HS che ritornavano alla composizione iniziale dopo 24 giorni dall’inizio della perturbazione. Mentre le popolazioni nel reattore LS rimanevano relativamente stabili.
COMUNITA’ FLESSIBILI E STABILITA’ FUNZIONALE
Dal punto di vista metabolico, la co-munità LS reagiva più prontamente: ripristinando in un tempo più breve gli equilibri iniziali di concentrazione dei metaboliti del processo di metanogenesi.
Le caratteristiche del processo HS erano:
i) Più lenta utilizzazione del substrato glucosio.
ii) Mantenimento di un livello più basso dei metaboliti intermedi.
iii) Inizio simultaneo dei diversi processi fermentativi (produzione dei diversi acidi).
METANOGENESI: DIVERSITA’ MICROBICA E STABILITA’ FUNZIONALE
Comunità microbiche con i principali flussi metabolici paralleli sono funzionalmente più stabili in risposta a
perturbazioni esterne come shock da sovraccarico organico rispetto a comunità con flussi metabolici seriali.
Comunità microbiche più complesse (con maggiore biodiversità) possono rispondere meno prontamente agli
stress di comunità microbiche più semplici ma organizzate in maniera funzionalmente diversa.
Per un’efficiente risposta agli stress alla biodiversità genetica e fenotipica deve accompagnarsi una biodiversità
funzionale.
METANOGENESI: I REATTORI
Per la digestione anaerobica dei
reflui si distinguono diversi tipi di reattori che si differenziano
per:
•Schema idraulico dei sistemi
•Forma della biomassa (libera,
adesa)
METANOGENESI: I REATTORI PER REFLUI
Reattori a letto fisso espanso fluidizzato
Le cellule sono immobilizzate in un biofilm adeso ad un supporto inerte
(plastica, legno,ecc.)
•Reattori a biomassa libera•Reattori a biomassa adesa
Migliore contatto tra le cellule e migliore sintrofia(es. la rimozione dell’H2 prodotto dagli acetogeni sintrofici, Sintrophomonas e Sintrophobacter, da parte dei metanogeni idrogenotrofi che agiscono da “scavenger” dell’H2 tossico per gli acetogeni)Stabilità della biomassa nel reattore(basso “washout” cellulare)
Reattori UASB (upflow anaerobic sludge bed)
La biomassa è organizzata in biofilm autoimmobilizzato in granuli compatti (diam. 0.1-1 cm) ad alta sedimentabilità
Strati di microrganismi
Materiale di supporto
METANOGENESI: I REATTORI UASB
Influente
Effluente
Biogas
MESOFILI TERMOFILI
Ric
ircol
o
METANOGENESI: I REATTORI UASB
Nei reattori UASB (Upflow anaerobicsludge Blanket) si sviluppano granuli con biomassa strati-ficata in cui sono particolarmente effi-cienti gli scambi tro-fici tra i diversi m.o. (es. metanogeni e acetogeni sintrofici).L’ibridazione in situ con sonde specifiche per Archaea (rosse) e per Bacteria (verdi) mostra che gli strati superficiali sono prevalentemente colonizzati da batteri, mentre gli strati profondi dei granuli sono colonizzati da archaea, sia in granuli mesofiliche termofili. La parte centrale dei granuli non da segnale di ibridazione e sembra costituita da residui cellulari e materiale inorganico.
ARC915: sonda universale per Archaea ( fluorescina)
SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina)
ARC915 SYN-7 ARC915+SYN-7
ARC915: sonda universale per Archaea (fluorescina)EU338: sonda universale per Bacteria (rodamina) MX825: sonda spec. per Methanosaeta sp. (rodamina)
MG1200: sonda spec. per M.microbiaceae (fluorescina) SYN-7: sonda spec. acetogeno sintrofico SYN-7 (rodamina)
ARC915+EU338+MX825 MG1200+SYN-7
Sekiguki et al. 2001 Appl. Environ. Microbiol., 67:5740-5749
INTERAZIONE METANOGENI-SOLFATORIDUTTORI IN UASBL’interazione spaziale tra solfatoriduttori e metanogeni, 2 gruppi microbici che competono per i donatori di elettroni diretti (acetato e H2) ed indiretti (es. lattato, etanolo, ecc.) è stata studiata attraverso impiego di microsensori per CH4 e H2S, per misurare negli strati di granuli UASB metanogenici e sulfidogenici-metanogenici, la concentrazione dei 2 gas e l’attività metanogenica e sulfidogenica.
Le analisi di attività e di microprofili dei gas indicano che i solfatoriduttori si posizionano negli strati più esterni del biofilm, mentre gli archaeametanogenicolonizzano il centrodel granulo. Questi risultati venivano confermati da esperimenti di ibridazione “in situ”.
Batteri a superficie idrofilica sulla superficie del biofilm
1 cm
WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALELa stabilità dei granuli è determinata dall’interazione con le microbolle di gas e quindi dalla tensione superficiale all’interfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i ΔG di adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni interfacciali:
Ad alti carichi organici ed alte produzioni di biogas la biomassa granulare inizia a flottare ed è trasportata fuori dal reattore con il fenomeno del wash-out della biomassa
WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALELa maggior parte degli acidogeni sono IDROFILICI, mentre la maggior parte dei metanogeni e degli acetogeni sono IDROFOBICI
WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALELa stabilità dei granuli è determinata dall’interazione con le microbolle di gas e quindi dalla tensione superficiale all’interfaccia superficie granulo/bolla di gas secondo i ΔG di adesione descritti dalla seguente legge che è funzione delle diverse tensioni interfacciali:
C’è quindi una finestra ottimale di tensione superficiale del liquido che aumenta l’esposizione di batteri idrofilici sulla superficie dei granuli e abbassa i valori di ΔG di adesione per i microganismi idrofilici
La configurazione 1 risponde anche al flusso trofico che deve essere stabilito tra l’esterno e l’interno del granulo. All’esterno del granulo è abbondante il glucosio e gli zuccheri substrati del primo gruppo trofico della metanogenesi, gli ACIDOGENI che sono idrofilici
WASH-OUT DEI GRANULI E TENSIONE SUPERFICIALELa configurazione dei granuli UASB in relazione alla tensione superficiale del reflo e in accordo a considerazioni termodinamiche può essere così schematizzata:
Olive Olive MillMill WastewaterWastewater
Southern Europe Countries world major producers of olive oiland hence major producers of OMW
OMW characteristsicsVery high COD (up to 200 g l-1)High content of polyphenols (up to 6 g l-1)Relatively low pH (4-5)
OMW anaerobic digestionCH4 productionSpontaneous separation of CH4Low sludge production
[Bertin et al. 2004 FEMS Microbiol. Ecol. 48:413-423]
Polyphenols can strongly decrease the process efficiency being toxic for methanogenic Archaea, a key component of the reactor microflora
[Field & Lettinga 1987 Water Res. 21:367-371]
How methanogen community respond to increasing OMW organic loads?
Anaerobic digester (11 L)Up-flow fixed bed digester (7.5 L)Contact reactor (3.5 L)Packing with wood chipsHRT = 48 hTemperature = 37 °CVol. Org. Load = 1-15 g COD l-1d-1
OMW-InfluentDiluted OMWInfluent pH = 6.1-6.4N correction with NH4ClInfluent COD = 5.9-31 g l-1
ProcessProcess PerformancesPerformancesTABLE 1. Process parameters of OMW anaerobic digestion at different VOL. For each process phase average values SD of the parameters were calculated for a number of samples n reported in brackets. Parameter VOL (g COD l-1
- At VOL 10 g COD l-1d-1 the effluent COD is 1.6 g l-1- Since 1g C2 gives 1g COD, more than 50% of effluent COD was due to VFA- Hence low residual polyphenols
A decrease of specific CH4 production at VOL of 10 g COD l-1d-1!!
- PCR with a P-labelled primer- λ-nuclease digestion of the P-labelled strand- PCR on a collection of 30 methanogen species- PCR on biofilm collected at 5.7 and 10 g COD l-1d-1
P798 915Methanogen-specific primer Archaea-universal primer
MethanogenicMethanogenic ArchaealArchaeal Community: Community: AbundanceAbundanceQuantification of the different phylogenetic groups of methanogens based on
extinction of PCR signals amplified from biofilm sludge DNA[Wang et al., 1996 Appl. Environ. Microbiol. 62:1242-1247]
PCR sensitivity(the minimal n° of cells giving
amplification)
PCR titer(The maximum sludge DNA dilutions for positive PCR)
+++- -
PCR sensitivity
DNA extr.
Microscopic cell counts
Culture
Culture dilutions PCR
Sample
Sample dilutions
DNA extr.
+++- -PCR
PCR Titer
MethanogenicMethanogenic ArchaealArchaeal Community: Community: AbundanceAbundanceSpecific PCR for the different phylogenetic groups of methanogens were set
up basing on 16S rRNA gene signatures [Raskin et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60:1232-1240]
5’ end bitinilated probe Magnetic Capturehybridization
B798 915Methanogen-specific primer Archaea-universal primer
Fwd 300 800 1100 1200
M.bact.
M.sarc.
M.coc.
M.micr
Specific PCR
Species (strains) Primer sets PCR sensitivity Mb Mc Mm Ms1 Ms2 Mb. formicicum 1535, 3637, 3636, 2639, 3722, 6299; Mb. ulginosum
Following VOL increase methanogencommunity responded by changing the
relative abundance of different phylogenetic/physiological groups
VOL = 5.7(5.7 g COD l-1d-1)
VOL = 10.1(g COD l-1d-1)
PCR TITER IN THE BIOFILM
H2consuming
Acetate consuming
M.bacteriaceae 1011 108
M.microbiaceae 104 106
M.coccaceae n.d. n.d.
M.sarcina/M.saeta 108 109
H 2 H 2
12
10
8
6
4
2
0Met
hano
gen
coun
ts(L
og M
PN
g-1
VS
S)
Acet
ate
Acet
ate
ConclusionsConclusions
In the adopted reactor OMW were efficiently treated (COD removal around 90%) up to VOL of 15 g COD l-1 d-1
A decrease of CH4 specific production occurred at VOL of 10 g COD l-1 d-1
The overall diversity of methanogen was not affected as shown by SSCP and sequencing
Methanogen community reacted by re-balancing the H2trophic/acetotrophic methanogen ratio
TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLAGli scarti delle cantine vinicole sono costituiti dalle acque di lavaggio degli impianti di vinificazione e contengono parti dei raspi e le bucce degli acini
I reflui di cantina contengono concentrazioni residue di zuccheri e acido tartarico(dall’uva), etanolo, acido acetico e acido lattico (residui delle fermentazioni)
I reflui che derivano dalla vinificazione del vino rosso contengono anche considerevoli quantità di composti fenolici (antociani e tannini) che possono avere effetto tossico sui microrganismi coinvolti nella degradazione anaerobica, in particolare i metanogeni.
Trattamento dei reflui di cantina:• trattamento aerobico elevato consumo di energia richiesto dall’aerazione, e
necessità di aggiungere nutrienti• digestione anaerobica abbattimento del carico organico, con recupero di energia
(produzione di metano)
TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA
Un processo di digestione anaerobica degli effluenti di cantina vinicola è stato messo a punto in un impianto in scala di laboratorio
IMPIANTO:digestore cilindrico, h= 130 cm, riempito con materiale inerte di riempimento (truciolato di legno) come matrice di supporto. Caricamento in fase ascendente.
Il digestore conteneva una microflora selezionata nei trattamenti dei precedenti anni (depurazione degli effluenti di pirolisi, dell’acqua di vegetazione delle olive, degli impasti di cartiera)
TRATTAMENTO:le acque di cantina erano diluite fino ad avere un carico organico di COD=7-7,5 g/l, ed addizionate di NaHCO3 e NH4Cl.
Dopo un periodo di adattamento, il reattore ha raggiunto una fase di equilibrio “steady state” con una rimozione del COD del 90%. Il carico organico è stato quindi aumentato a 10,5-12,5 gCOD/ld, diminuendo il tempo di ritenzione a 16-17h
TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA
La digestione anaerobica delle acque provenienti dalla vinificazione in rosso è risultata meno efficiente rispetto a quella in bianco:
• minore rimozione di COD • inferiore produzione di metano• maggior contenuto di AGV nell’effluente (segnale di un’inibizione dei processi di acetogenesi e
metanogenesi)• le cariche dei metanogeni presenti nella fase circolante sono inferiori, mentre i batteri eterotrofi e
glucosio-fermentanti sono superiori
TRATTAMENTO DEGLI EFFLUENTI DI CANTINA VINICOLA
Il reattore è in grado di recuperare rapidamente (circa 10 giorni) shocks da carico organico pari ad un aumento improvviso di tre volte del carico organico specifico volumetrico
METANOGENESI A BASSA TEMPERATURAStart-up and operation of an anaerobic high-rate staged expanded granular sludgebed (EGSB) system for the treatment of cold (3 to 8°C), dilute wastewater (0.5 to
0.9 g of COD liter-1), containing 12 mg of O2 liter-1
METANOGENESI A BASSA TEMPERATURA
POTENZIALITA’ DELLA PRODUZIONE DI METANO- Trattamento termofilo reflui acidificati- Reattori UASB multipli- Carico organico fino a 100 kg COD m-3 day-1
POTENZIALITA’ DELLA PRODUZIONE DI METANO- Rimozione del COD > 90%- Tempo di ritenzione idraulico = 2-2.5 h- Produzione di biogas 40-50 m3 m-3
reattore day-1
LA METANOGENESI
POLIMERI
MONOMERI
ALCOLI SUCCINATOLATTATO
ACIDI GRASSI C2 C3
COMP. C1H2
ACETATO
CH4 CO2
1
1
2
3
4 5
Aci
doge
nesi
Ace
toge
nesi
Met
anaz
ione
Produzione di idrogeno scorporando le fasi di acidogenesi da quella di metanazione per favorire la produzione fermentativa di idrogeno
PRODUZIONE DI IDROGENO
PRODUZIONE DI IDROGENO
Produzione di idrogeno da reflui solidi scorporando acidogenesi da metanazionein due reattori con diverso tempo di ritenzione