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Premessa
Il citomegalovirus (CMV) è il più importante agente di
in-fezione congenita dell’uomo e la sordità neurosensoriale
(sensorineural hearing loss o SNHL) è la più frequente conseguenza
dell’infezione (1). L’infezione congenita da CMV (cCMV) colpisce
annualmente dal 2 al 22‰ dei nati vivi dove la maggior incidenza
dell’infezione è registrata nei paesi a basso reddito. Le
conseguenze cliniche dell’in-
fezione da cCMV riguardano circa un quinto degli infetti e
possono essere riconoscibili alla nascita o manifestarsi nel corso
dell’infanzia, soprattutto come danni al sistema nervoso centrale,
quali sordità neurosensoriale e ritardo di sviluppo psicomotorio
(2). L’identificazione dei neonati con cCMV non si può basare
sull’osservazione clinica in quanto il 90-95% degli infetti è
asintomatico e nei neonati sintomatici il quadro clinico è spesso
aspecifico (1, 2). Per una diagnosi certa di infezione da cCMV è
indispensabile avvalersi di una diagnosi viro-logica qualificata in
grado di isolare il virus infettivo o in-dentificarne le componenti
virali (DNA/proteine) in campioni biologici quali urine, saliva e
sangue, raccolti entro un tem-po massimo di due settimane dalla
nascita, procedura com-plessa e difficilmente realizzabile in
mancanza di fattori di
Articolo originale
Diagnosi dell’infezione congenita di citomegalovirus (cCMV)
tramite CMV DBS test in bambini sordi LAURA PELLEGRINELLI, UMBERTO
AMBROSETTI, ENRICO FAGNANI, FEDERICA DI BERARDINO, MIRKO ALDE’,
LUISELLA ALBERTI, ELENA PARIANI,VALERIA PRIMACHE, SANDRO BINDA
Riassunto: Diagnosi dell’infezione congenita di citomegalo-virus
(cCMV) tramite CMV DBS test in bambini sordi.
lauRa pelleGRinelli, umbeRto ambRosetti, enRiCo FaGnani,
Federica di Berardino, Mirko alde’, luisella alBerti, elena
paRiani, valeRia pRimaChe, sanDRo binDa
Il citomegalovirus (CMV) è il più importante agente di infezione
congenita dell’uomo; la sordità neurosensoriale in caso di
infe-zione congenita è la più frequente conseguenza della stessa.
Lo screening uditivo neonatale permette di identificare la
maggio-ranza dei bambini con sordità bilaterale o monolaterale
perma-nente molto precocemente.Il CMV DBS test, basato sulla
evidenziazione, mediante PCR, del DNA virale nei campioni di sangue
neonatale essiccato su Guthrie card presenta una sensibilità del
99% permettendo di porre la diagnosi di infezione congenita da CMV
a posteriori. Nel periodo 2014-2017 i neonati che hanno fallito lo
screening audiologico tramite TEOAE e con sordità confermata dei
potenziali ABR sono stati arruolati nello studio: 85 bambini sono
risultati affetti da ipoa-cusia neurosensoriale; per 71 (83,6%) di
questi (età mediana 3,4 anni; interquartile; 3,3 anni) è stato
possibile valutare l’eventuale presenza di CMV-DNA nei rispettivi
campioni di DBS. Dei 71 bambini esaminati, 51 (71,8 %) presentavano
sordità bi-laterale, di questi 40 (78,4 %) avevano una asimmetria
di soglia. Circa la metà 36 (50,7%) dei 71 bambini mostrava una
sordità di grado grave/profondo (ABR soglia ≥70 dB). La presenza di
cCMV è stata accertata nel 7% (5/71) dei bambini; la quota di
bambini con sordità grave/profonda è statisticamente maggiore tra
quelli risultati cCMV-positivi rispetto ai cCMV-negativi (100% vs
47%; p= 0,028).
summaRy: Diagnosis of congenital cytomegalovirus (cCMV)
infection by CMV DBS test in deaf children.
lauRa pelleGRinelli, umbeRto ambRosetti, enRiCo FaGnani,
Federica di Berardino, Mirko alde’, luisella alBerti, elena
paRiani, valeRia pRimaChe, sanDRo binDa
Cytomegalovirus (CMV) is the most important congenital
in-fection in human beings. Sensorineural hearing loss is the most
usual consequence in congenital infection.Newborn auditory
screening let us know to identify the majority of children
suffering from bilateral or monolateral deafness very early.The CMV
DBS test, based on the evidence by PCR test of viral DNA in newborn
dried blood samples on Guthrie card, shows a sensibility of 99% and
allows to diagnose congenital CMV in-fection in
retrospectively.Within 2014-2017 the newborns that failed the
auditory scree-ning by TEOAE suffering from deafness evidenced by
ABR test, were selected in this study: 85 newborns were affected by
sen-sorineural hearing loss.71 newborns were submitted to the DBS
test: 71,8% were af-fected by bilateral deafness; 78,4% were
affected by asymme-tric deafness; 50,7% had a profound deafness; 7%
(5/70) were affected by a congenital CMV infection.
Key woRDs: Sordità neurosensoriale - screening uditivo neonatale
- CMV DBS test.Sensorineural hearing loss - newborn auditory
screening - CMV DBS test.
Fondazione IRCCS “Ca’ Granda” Ospedale Maggiore Policlinico di
Milano, Italia Dipartimento di Scienze Cliniche e di Comunità
Autore per la corrispondenza: Umberto Ambrosetti, e-mail:
[email protected]
© CI
C Ed
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azion
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L. Pellegrinelli et al.
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Solamente nella Regione Toscana tutti i neonati risultati
“refer” o “fail” allo screening uditivo neonatale al primo livel-lo
realizzato con le emissioni acustiche evocate transienti (TEOAE)
devono eseguire non oltre il 15° giorno dalla na-scita la ricerca
del DNA di CMV nelle urine (4).Il presente studio preliminare e
monocentrico ha valutato il contributo di cCMV in bambini con
sordità neurosensoriale attraverso uno screening di cCMV integrato
allo screening audiologico neonatale condotto in un centro
Audiologico di terzo livello (U.O.S.D. di Audiologia, Fondazione
IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano) in
Lombardia dal 2014 al 2017.
Materiali e metodi
Il Laboratorio di Virologia del Dipartimento di Scienze
Bio-mediche per la Salute dell’Università degli Studi di Milano ha
messo a punto un metodo di diagnosi retrospettiva dell’infe-zione
congenita da citomegalovirus (CMV DBS test), basa-to sulla
evidenziazione, mediante PCR, del DNA virale nei campioni di sangue
neonatale essiccato su Guthrie card. Tali campioni, dopo essere
stati utilizzati per la diagnosi precoce delle malattie metaboliche
ereditarie, obbligatoria in Italia, vengono conservati presso il
corrispondente Cen-tro Regionale di Screening che in Lombardia si
trova presso l’Ospedale V. Buzzi di Milano. La sensibilità e la
specificità del test, ottenute dal confronto con il test
diagnostico di riferimento tramite isolamento virale in coltura
cellulare da campioni di urine raccolte entro le prime 2 settimane
di vita, sono risultate superiori al 99% (5).La metodica, messa a
punto dal gruppo Barbi et al. (5) pre-vede: a) una prima fase di
estrazione del DNA dal campione me-
diante shock termico b) l’amplificazione di una sequenza
specifica del genoma
virale (gene gB) mediante n-PCR (in house) c) la visualizzazione
degli amplificati mediante corsa elet-
troforetica su gel di agarosio (2%). I risultati ottenuti
vengono interpretati secondo uno speci-fico algoritmo. Nel
dettaglio: dal DBS neonatale si ricava 1 dischetto di 3 mm di
diametro che viene depositato in una provetta da 0,5 ml con
aggiunta di 35 μl di terreno sterile (E-MEM, Ea-gle-Minimum
Essential Medium). Tale operazione viene ri-petuta tre volte. Per
evitare cross-contaminazioni la punzo-natrice viene decontaminata
mediante lavaggio con alcool etilico al 70% seguito da
flambatura.Ciascuna delle tre provette, inizialmente conservata a
4°C over-night, viene sottoposta a 55°C per 1 ora e a 100°C per 7
minuti. Dopo centrifugazione a 10.000 rpm, il surnatante viene
trasferito in una nuova provetta da 0,5 ml e posto a -80°C. Il
materiale è quindi utilizzato come templato per l’amplifi-cazione
in nested-PCR di una regione conservata del DNA di CMV codificante
la glicoproteina gB (gene gB). I neonati che hanno fallito lo
screening audiologico at-traverso la valutazione delle TEOAE e con
sordità con-fermata dei potenziali evocati uditivi del tronco
(Auditory Brainstem Response o ABR), coorte di nascita 2014-2017 in
Lombardia, sono stati arruolati nello studio dopo aver sottoscritto
l’apposito consenso informato. I pazienti per i quali è stato
possibile svolgere indagini virologiche in
rischio riconosciuti, quali lo stato sierologico in gravidanza.
La mancanza di informazioni su un’infezione materna in gravidanza e
l’assenza nel neonato di una sintomatologia chiaramente rilevabile
possono concorrere in misura con-sistente nel sottostimare la
frequenza delle infezioni con-genite e il loro ruolo nel
determinare la sordità infantile. E’ noto che circa l’1 ‰ dei
bambini nati è affetto da sordità neurosensoriale grave o profonda
già presente alla nascita o che si manifesta in seguito (2, 3). Il
ritardo nella diagno-si della sordità neurosensoriale infantile,
oltre ai danni a livello dell’acquisizione del linguaggio, comporta
anche la difficoltà nella corretta identificazione della causa, in
parti-colare per quanto riguarda le forme da infezione
congenita.
Screening neonatale della sordità
L’ipoacusia bilaterale infantile è una condizione clinica
fre-quente (l’incidenza in Regione Lombardia varia dallo 0,7 ‰ nati
fino allo 0,9 ‰ nati considerando i bambini con uno o più fattori
di rischio audiologico, in modo particolare i di-messi dalle
terapie intensive neonatali) e rilevante per la salute
dell’individuo e per i costi economici e sociali che comporta. Lo
screening uditivo neonatale permette di identificare mol-to
precocemente la maggioranza dei bambini con sordità bilaterale o
monolaterale, entro il 3°- 4° mese dalla nascita, ed intervenire
con un programma terapeutico e riabilitativo entro il 6° mese di
vita, nel periodo di massima plasticità cerebrale, nel quale si
sviluppano complessi circuiti inter-neuronali in cui l’input
acustico periferico è essenziale per una corretta maturazione delle
vie uditive centrali.Lo screening uditivo neonatale universale deve
essere ef-fettuato nel punto nascita prima della dimissione
ospedalie-ra su tutti i neonati. La realizzazione dello screening
si basa sulla collaborazio-ne tra diverse figure professionali
(neonatologi, pediatri, infermieri, ostetriche, audiologi,
otorinolaringoiatri, pediatri di famiglia, neuropsichiatri
infantili, logopedisti, audiometri-sti), che lavorano in modo
multidisciplinare e a livello inte-raziendale, comunicando in modo
efficace e sostenendo i genitori nel percorso di cura.Recentemente,
l’approvazione del D.P.C.M. n. 15, 12 gen-naio 2017, riguardante la
definizione e aggiornamento dei livelli essenziali di assistenza
(LEA), di cui all’articolo 1, comma 7, del D.L. 30 dicembre 1992,
n. 502, ha reso ob-bligatorio l’effettuazione dello screening
uditivo neonatale in tutte le Regioni (art. 38 “Ricovero ordinario
per acuti” al punto 2 afferma...diagnosi precoce della sordità
conge-nita…).Attualmente solo 6 regioni, con apposite delibere di
Giunta (Toscana D.G.R. n. 365, 21/05/2007, UmbriaD.G.R. n. 789,
21/05/2007 Campania D.G.R. n. 267, 23/02/2009, Emilia Romagna
D.G.R. n. 694, 23/05/2011, Lazio D.G.R. n. 115, 23/03/2012, Veneto
D.G.R. n. 2077, 30/12/2015), hanno stabilito norme per
l’effettuazione dello screening neona-tale della sordità.Va
precisato che nelle altre regioni scoperte da una specifi-ca
normativa, i programmi di screening della sordità vengo-no attuati
a “pelle di leopardo” e non in modo “universale”.Oggigiorno in
Italia non sono previsti né screening univer-sali né screening
mirati per identificare l’infezione congeni-ta di citomegalovirus
(cCMV).
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Diagnosi dell’infezione congenita di citomegalovirus (cCMV)
tramite CMV DBS test in bambini sordi
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Conclusioni
I risultati si allineano con quelli riportati recentemente da
altri gruppi di ricerca (7, 8), ma si discostano da quelli di un
nostro precedente lavoro in cui la percentuale di casi di SNHL
attribuibili all’infezione da CMV congenita era del 10% nei bambini
il cui SNHL era stato diagnosticato nei primi 2 mesi di vita e
34,2% nei bambini con sordità di cau-sa non identificata
diagnosticata nella prima infanzia. In quest’ultimo gruppo il 42,7%
dei bambini con una perdita uditiva >70 dB era CMV-positivo
(9).Lo studio ha confermato l’utilità dei DBS per la definizio-ne
dell’eziologia di una sordità non genetica, soprattutto quando sono
trascorse le prime 2 settimane di vita per cui le indagini
virologiche di riferimento non sono più in grado di distinguere
un’infezione pre- da una perinatale poten-zialmente contratta
durante il parto o con il latte materno (10-12). La ricaduta
relativa al prezioso contributo che il DBS fornisce per fini
diagnostici è che tali campioni devono essere conservati per lunghi
periodi di tempo. La delibera di giunta della Regione Lombardia
Welfare, documento direttore Generale 1.12.2017 n. 15229 (BURL
serie ordinaria 13.12.2017) “Approvazione della versione 04 del
Titulario e massimario del sistema sanitario lombar-do, già sistema
sanitario e sociosanitario di Regione Lom-bardia” alla classe 3
prevenzione medica-sanitaria, codice sottoclasse 04 (pag. 202)
stabilisce che i documenti relativi alla gestione degli screening
abbiano un tempo di conser-vazione di 10 anni.L’approccio
diagnostico utilizzato in questo lavoro potrebbe aiutare i clinici
nella diagnosi differenziale della sordità e nell’opportuna
gestione del paziente.
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campioni di Dried Blood Spot (DBS) sono stati inclusi nel-lo
studio. Non tutti i casi di SNHL sono stati indagati per cCMV in
quanto i rispettivi DBS erano stati raccolti tar-divamente o in
quantità scarsa o rimossi dopo un dato periodo di
conservazione.
Risultati
In base ai risultati dello screening audiologico, nel perio-do
di studio 85 bambini sono risultati affetti da ipoacusia
neurosensoriale; per 71 (83,6%) di questi (età mediana 3,4 anni;
interquartile; 3,3 anni) è stato possibile valutare l’e-ventuale
presenza di CMV-DNA nei rispettivi campioni di DBS. Dei 71 bambini
esaminati 51 (71,8%) presentava sordità bilaterale, di questi 40
(78,4 %) avevano una asimmetria di soglia. Circa la metà 36 (50,7
%) dei 71 bambini mostrava una sordità di grado grave/profondo (ABR
soglia ≥70 dB). La presenza di cCMV è stata accertata nel 7% (5/71)
dei bambini; la quota di bambini con sordità grave/profonda è
statisticamente maggiore tra quelli risultati cCMV-positivi
rispetto ai cCMV-negativi (100% vs 47%; p= 0,028).
Discussione
Annualmente in Italia, a fronte di una frequenza di cCMV pari
allo 0,3-0,5%, su circa 450.000 nati vivi, 1.350-2.250 bambini
risultano essere congenitamente infetti e di questi 270-450 sono a
rischio di danni permanenti (5). È ormai accertato come l’infezione
citomegalica congenita sia la seconda causa, dopo le mutazioni
genetiche, della sordi-tà che si può manifestare anche tardivamente
nell’arco dei primi 6-8 anni di vita (6). In assenza di uno
screening neonatale universale per Cito-megalovirus in grado di
identificare tutti i bambini positivi, lo screening di cCMV
integrato allo screening audiologico per-metterebbe almeno
l’identificazione delle infezioni legate a sordità. I motivi per
cui si ritiene utile eseguire la ricerca del citomegalovirus
risiedono, oltre che per fini epidemiologici ed eziologici, nella
constatazione che la perdita dell’udito neurosensoriale presenta un
alto tasso di progressione che può essere prevenuta mediante un
tempestivo trattamen-to farmacologico e nel fatto che può essere
monitorata la comparsa di altri sintomi, in particolare
neurologici.La cCMV può essere rilevata con elevata specificità
me-diante coltura cellulare o tecniche di biologia molecolare in
campioni di urina e/o saliva raccolti prima delle 2 settimane di
età o a posteriori mediante il CMV DBS test da eseguire su campioni
ematici essiccati, raccolti nei primi giorni di vita (5). Il
ricorso al CMV DBS test presenta alcuni vantaggi, tra i quali:
utilizzo di un campione ematico già raccolto per gli altri
screening obbligatori, è organizzativamente meno impegnativo
dell’impiego del test di riferimento, garantisce risultati ottimali
in termini di sensibilità e specificità, con-sente facilmente di
diagnosticare l’infezione congenita da CMV anche a distanza di mesi
o anni dalla nascita.Questo studio retrospettivo di cCMV mediante
CMV DBS test condotto dall’Università degli Studi di Milano e
dall’U.O.S.D di Audiologia, Fondazione I.R.C.C.S. Ca’ Granda
Ospedale Maggiore Policlinico di Milano ha dimostrato che il 7% dei
bambini in età pediatrica con SNHL aveva contratto l’infe-zione
citomegalica in utero.
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C Ed
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L. Pellegrinelli et al.
50 Audiologia&Foniatria 2019; 4(1):47-50
12. Meyer L, Sharon B, Huang TC, Meyer AC, Gravel KE, Schimmenti
LA, Swanson EC, Herd HE, Hernandez-Alvarado N, Coverstone KR,
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