Caractérisation des inhibiteurs de DCIR, une lectine de type C … · 2018. 4. 25. · Caractérisation des inhibiteurs potentiels de DCIR, une lectine de type C participant à la
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Caractérisation des inhibiteurs potentiels de DCIR, une lectine de type C participant à la transmission du VIH-1
à 0,125 mM final, SDS 20% à 8% final, β-mercaptoéthanol à 10% final, glycerol à 17,5% final,
bleu de bromophénol 0,1% à 0,0025% final, orthovanadate de sodium 200 mM à 5 mM final et
aprotinin-leupeptine 1 mg/ml à 0,025 mg/ml final) à 100°C pendant 7 minutes, tout en
vortexant. Les cellules prétraitées ou non avec les inhibiteurs sont ensuite activées avec un
anticorps anti-DCIR à (5 µg/ml pendant 2 minutes à 37°C puis avec un F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à
15 µg/ml. Une suspension cellulaire est par la suite prélevée à différents temps et transférée
dans un tube contenant le SB 2X bouillant. Les lysats cellulaires obtenus sont par la suite
gardés à -20°C
.
3.7. Immunobuvardage
3.7.1. Migration sur gel de polyacrylamide 12%
Les cellules Raji-DC4-DCIR et Raji-CD4-IRES sont lysées dans le SB 2X réducteur ou non
réducteur (le β-mercaptoéthanol est remplacé par l’eau milli Q) bouillant à 100°C pendant 7
minutes. Les lysats cellulaires obtenus sont chauffés, vortexés et centrifugés puis déposés sur
mini-gel SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel) de 12% de polyacrylamide
46
et un marqueur de poids moléculaire y est déposé au même moment. Les protéines sont
migrées pendant 1h30’ à 120 volts à TP. Après migration, les protéines sont transférées sur
les membranes de PVDF de 0,22 µm à 4°C soit à 300 mA pendant 1h30’ soit à 60 mA
pendant toute la nuit. Les membranes sont colorées avec le rouge ponceau 0,1% pour
apprécier l’efficacité du transfert et de la quantité de protéines présentes dans chaque puit.
Puis elles sont rincées avec le tampon de lavage TBST 0,15% (TBS: Tris Buffer Saline, T :
Tween-20) pour les membranes destinées à l’immunobuvardage avec les anticorps anti-GFP
et anti-actine ou le TBST 0,1% pour l’immunobuvardage avec les anticorps anti-DCIR, anti-p24
et anti-HLA-DR. Les sites non spécifiques des membranes sont bloqués avec le lait 5 %
pendant 1h00 à la TP. Après un lavage de 5 minutes, les membranes sont incubées à 4°C
pendant toute la nuit et sous agitation, avec les anticorps primaires appropriés dilués dans une
solution de lait à 5 % : l’anti-hDCIR à 1mg/ml avec une dilution de 1/1000 (1 µg/ml final), l’anti-
GFP à 1mg/ml avec une dilution de 1/3000 (0,3 µg/ml final), l’anti-actine à 200 µg/ml avec une
dilution de 1/4000 (0.05 µg/ml final), l’anti-HLA-DR à 1 mg/ml avec une dilution de 1/1000 (1
µg/ml final) et l’anti-p24 à 1 mg/ml avec une dilution de 1/2000 (0.5 µg/ml final). Après trois
lavages successifs de 5 minutes, les membranes sont mises en contact avec les anticorps
secondaires (anticorps de chèvre et anticorps de souris conjugués à la peroxydase) à une
dilution de 1/10000 pendant 1h00 à TP. L’anticorps de chèvre conjugué à la peroxydase était
utilisé pour le blot anti-actine et a été dilué dans du TBST. Ex aequo pour l’anticorps de souris
utilisé pour les immunobuvardages avec les anti-GFP, anti-p-24 et anti-HLA-DR, excepté le
blot anti-DCIR ou l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase était dilué dans le diluant
signal Boost immunoreaction Enhancer pour anticorps secondaires. Cette étape est suivie par
trois lavages consécutifs de 5 minutes, puis les membranes sont incubées avec la solution de
révélation luminata forte pendant 3 minutes pour le blot anti-DCIR et le substrat de révélation
western lightning ECL plus pendant 1 minute pour les autres blots.
3.7.2. Migration sur gel gradient de polyacrylamide 7,5 %- 20 %
Les lysats cellulaires sont chauffés, vortexés, centrifugés puis déposés sur un grand gel
gradient de polyacrylamide SDS-PAGE (7.5% à 20%) en raison de 20 µl par puit et les
protéines sont migrées à 15 mA pendant 4h00 à la TP. Les protéines sont par la suite
transférées sur les membranes de PVDF de 0,45 µm à 4°C, dans un tampon de transfert avec
Objectif 2 Perspectives Conclusion
47
20% de méthanol et avec un courant électrique de 300 mA pendant toute la nuit. Les
membranes sont ensuite colorées avec le rouge ponceau 0,1 % pour juger de la qualité du
transfert, puis lavées avec du tampon TBST 0,15 %. Cette étape sera suivie par un blocage
des sites non spécifiques de la membrane par la gélatine 2% pendant 30 minutes à 37°C, puis
les membranes sont rincées une seule fois avec la solution de TBST 0,15 % pendant 5
minutes à 37°C. Les membranes sont incubées avec l’anticorps anti-phosphotyrosine à 0.25
µg/ml pendant 1h00 à 37°C sous agitation. Trois lavages consécutifs de 5 minutes sont
nécessaires pour débarrasser la membrane de l’excès d’anticorps, puis elles sont incubées 30
minutes avec un deuxième anticorps, le second anticorps de souris couplé à la peroxydase à
une dilution de 1/10000. Après trois lavages de 5 minutes à TP, les protéines sont révélées sur
la membrane après une incubation d’une minute avec le substrat de révélation western
lightning ECL+.
3.8. Purification du DCIR et de HLA-DR par colonne
d’affinité
3.8.1 Purification de DCIR
La purification de la molécule de DCIR a été réalisée sur colonne de sépharose activée au
CNBr (Bromure de cyanogène qui est l’un des réactifs utilisé pour coupler une cible à la
matrice de la colonne) à partir d’un lysat cellulaire de Raji-CD4 surexprimant le DCIR. Cette
colonne fonctionne sur le principe de la chromatographie d’affinité.
3.8.1.1. Préparation de la colonne
1 g de billes sont resuspendues dans 5 ml de HCl à 1mM puis transférées dans la colonne de
10 ml. Ensuite le gel est lavé en faisant passer à travers la colonne 200 ml de HCl 1mM. Les
billes sont ainsi retenues dans la colonne acidifiée. Après cette étape, 1 mg d’anticorps anti-
DCIR est centriconné et resuspendu dans 5 ml du tampon NaHCO3 à 0.1 M et à pH 8.3 puis
ajouté dans la colonne. Les deux bouts de la colonne sont ensuite bien fermés avec le
parafilm et cette dernière est agitée par rotation pendant toute la nuit à 4°C. La présence du
tampon NaHCO3 permet d’équilibrer la colonne. Le couplage étant réalisé, les anticorps anti-
DCIR sont fixés sur les billes permettant ainsi au gel de sépharose activé au CNBr de former
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un lien covalent avec son ligand, l’anti-DCIR. L’excès d’anticorps (anticorps non fixés aux
billes) est enlevé après passage à travers la colonne du tampon Tris-HCl à 0.1 mM et à pH 8.0
pendant 2h00 à la TP. On réalise ensuite 3 cycles de lavage en alternance avec les tampons
acétate à 0.1M et à pH 4.0 et carbonate à 0.1 mM et à pH 8.3 en raison de 10 ml par cycle
pour équilibrer la colonne.
3.8.1.2. Préparation de lysat cellulaire
Les Raji-CD4-DCIR (2x108 cellules) sont centrifugés pendant 5 minutes à 300 x g et le culot
est resuspendu dans le RPMI. Les cellules sont ensuite comptées à l’aide d’un hémacytomètre
puis lavées avec le HBSS + Ca+2 froid pour éliminer le RPMI et distribuer en raison de 2x107
cellules dans les tubes eppendorf 1,5 ml déjà froid. Après le lavage, le culot cellulaire est
resuspendu dans 500 µl de tampon de CHAPS 0.6% frais et froid (CHAPS 0.6 % :, Tris-HCl à
10 mM et à pH 7.5, NaCl à 137 mM, EDTA à 1Mm et à pH 7.4, Na3VO4 à 2 mM, aprotinine et
leupeptine à 10 µg/ml, PMSF à 2 mM et l’inhibiteur de soybean trypsin à 50 µg/ml). Après
avoir bien vortexé, le lysat cellulaire est centrifugé à 13 000 x g pendant 10 minutes à 4°C. Le
lysat de chaque tube est recueilli puis transféré dans un seul tube. Ceci constitue le lysat
nécessaire pour la purification de DCIR.
3.8.1.3. Purification et élution
Le lysat est passé dans la colonne d’affinité, les molécules de DCIR sont retenues par les
anticorps anti-DCIR. Le DCIR est ensuite détaché grâce à 10 ml de tampon glycine à 0.1 M pH
2.4 et les éluats sont recueillis dans 10 tubes contenant chacun, 75 µl de la solution de Tris-
HCl à 2 M et à pH 9.0 afin de neutraliser la solution acide. Après élution, la colonne est
renaturée avec 3 cycles de lavage en alternance avec les tampons acétate et carbonate en
raison de 10 ml par tampon, puis elle est ensuite rangée à 4°C avec la solution de
conservation (0.01 M Tris-HCl pH 7.4, 0.15 M NaCl)
3.8.2. Purification de HLA-DR
La molécule de HLA-DR a été purifiée de la même manière que la molécule de DCIR, en
utilisant comme anticorps, l’anti-HLA-DR (L-243).
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3.9. Dosage des protéines
3.9.1. Dosage avec le Biodrop
Les protéines récoltées dans les différents tubes sont d’abord dosées semi-quantitativement
avec le Biodrop, afin de pooler les fractions avec des fortes concentrations de protéines. Le
pool de protéine obtenu est ensuite centriconné avec amicon ultra 4 MWCO 10 kDa à 3000
rpm pendant 30 minutes à 4°C. Les protéines concentrées dans la partie supérieure de
l’amicon sont recueillies et resuspendues dans du PBS puis dosées avec une méthode
quantitative, le BCA. Les aliquots des protéines sont ensuite préparés et gardés à -80°C.
3.9.2. Dosage avec le BCA
Le dosage des protéines avec le kit BCA est basé sur le principe de Biuret. En effet, en milieu
alcalin, les protéines forment avec l’ion cuivre II un complexe pourpre typique dont la
concentration de la coloration est proportionnelle à la concentration des protéines. Une courbe
standard en concentrations protéiques allant de 0 µg/ml à 2000 µg/ml est préparée à partir
d’un étalon (BSA : Bovine serum albumine) à 2000 µg/ml. Les concentrations de protéines
sont déterminées par colorimétrie sur une plaque de 96 puits en duplicata en fonction de cette
courbe.
Sur une plaque de 96 puits, on dépose 25 µl de chacun des standards (0, 5, 25, 50, 125, 250,
500, 750, 1000, 1500 et 2000 µg/ml) en duplicata dans les puits de deux extrêmes. On dépose
ensuite les échantillons puis on ajoute dans chacun des puits 200 µl du réactif BCA (1 volume
de sulfate de cuivre à 4% et 50 volumes de 0.1 M de carbonate de sodium, bicarbonate de
sodium, acide bicinchonique et de tartrate de sodium dans l’hydroxyde de sodium) et on laisse
incuber pendant 30 minutes à 37°C. La plaque est ensuite lue à l’aide d’un lecteur
spectrophotométrique à 562 nm.
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Chapitre IV : RESULTATS
4.1. Activation de DCIR sur la lignée cellulaire Raji-CD4-
DCIR
4.1.1. La présence de DCIR sur les Raji-CD4
Les Raji-CD4 sont des cellules B transformées par transfection pour qu’elles expriment le
récepteur CD4 [233]. Les Raji-CD4-DCIR par contre, sont des Raji-CD4 chez lesquelles on a
exprimé de manière stable le DCIR humain [207, 233] tel que décrit dans la section du
matériel et méthodes. L’expression du CD4 et de DCIR a rendu ce modèle susceptible à
l’infection par le VIH-1 et l’a rapproché du modèle physiologique comme les cellules
dendritiques et les LTCD4. Pour vérifier la présence de DCIR dans ce modèle cellulaire, ces
cellules ont été lysées dans le SB 2x non réducteur. A partir des lysats cellulaires obtenus,
nous avons réalisé un immunobuvardage avec un anti-DCIR, un anti-GFP et un anti-actine.
Les résultats présentés à la figure 12 montrent la présence de DCIR sur les Raji-CD4-DCIR et
aucune trace de cette protéine n’a été révélée sur les Raji-CD4-IRES. Ceci confirme l’absence
de DCIR sur cette lignée cellulaire et montre que l’anticorps anti-DCIR utilisé est réellement
spécifique vis-à-vis de la protéine DCIR. La présence de la protéine GFP à 45 kDa et de
l’actine à 25 kDa confirment respectivement la transformation des lignées par la détection de
la GFP et une quantité comparable des protéines déposées sur le gel et transférées sur la
membrane de PVDF. Ce test fût réalisé au moins à six reprises tout au long des études en
guise de contrôle.
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Figure 12 : Expression de DCIR sur les Raji-CD4. 2x107 cellules/ml de chaque lignée
cellulaire ont été lysées dans le tampon d’échantillon. 15 µl de lysat cellulaire ont été déposés
dans le puit pour chacune des lignées cellulaires. Le DCIR, la GFP et l’actine ont été révélés
par immunobuvardage avec les anticorps correspondants.
4.1.2. Détermination de la concentration saturante de l’anti-DCIR
Pour connaitre la concentration de l’anticorps capable de lier le maximum de DCIR présent sur
les cellules, mais aussi la concentration cellulaire à laquelle nous souhaitions faire l’activation
de DCIR, nous avons incubé 2x107cellules/ml avec l’anti-DCIR à différentes concentrations (1
à 10 µg/ml) pendant 30 minutes. Après un lavage pour enlever l’excédent d’anticorps non fixé,
les anti-DCIR fixés sur les cellules ont été marqués avec un deuxième anticorps, un anti-souris
couplé à Alexa 647. La quantité d’anti-DCIR maximale pouvant être liée sur les Raji-CD4 DCIR
a été déterminée par cytométrie en flux. Le résultat présenté à la figure 13 montre que l’anti-
DCIR est capable de lier le DCIR présent à la surface des cellules, montrant des intensités
croissantes en fonction de la dose d’anticorps comprise entre 1 et 5 µg/ml. Le même protocole
a été appliqué avec les cellules n’exprimant pas le DCIR, les Raji-CD4-IRES en guise de
témoin. Les Raji-CD4-DCIR non marqués et ceux traités avec un anticorps du même isotype et
servant aussi de contrôle ont été inclus dans l’expérimentation. Cette analyse nous a permis
de considérer que l’anticorps anti-DCIR utilisé à 5 µg/ml final était suffisant pour lier tous les
DCIR présents à la surface cellulaire à une concentration de 2x107/ml.
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s
1u
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2.0106
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4.0106
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Ind
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Figure 13 : Détermination de la concentration d’anticorps anti-DCIR saturante de DCIR.
Les cellules ont été incubées avec une dose croissante d’anti-DCIR (1 à 10 µg/ml) puis
incubées avec un anti-souris couplé au fluorophore Alexa 647. La concentration saturante de
l’anti-DCIR a été déterminée par la cytométrie en flux. Un contrôle positif avec un anti-DCIR
APC a été utilisé à 5 µg/ml. Cette figure est représentative de deux expériences réalisées.
4.1.3. Activation des Raji-CD4-DCIR et mesure du patron de
phosphorylation des protéines sur leurs résidus tyrosine
L’attachement du VIH-1 sur le DCIR est dépendant de la phosphorylation des résidus tyrosine
présents sur son motif ITIM [207]. Plusieurs protéines intracellulaires sont impliquées dans
cette phosphorylation notamment les tyrosines kinases de la famille de Src. Nous souhaitions
donc vérifier la génération d’un patron des protéines phosphorylées sur leurs résidus tyrosine
à la suite de l’activation directe de DCIR par un anti-DCIR. Dans le but de répondre au premier
objectif assigné dans ce travail, qui est celui de développer un modèle d’activation directe de
DCIR par un anticorps anti-DCIR, nous avons dans un premier temps provoqué l’activation
directe de DCIR présent sur les Raji-CD4-DCIR avec un anticorps monoclonal anti-hDCIR et
avons renforcé cette activation avec un fragment F(ab’)2 anti-F(ab’)2. Les cellules activées ont
été lysées dans le tampon SB 2x réducteur afin de réaliser l’immunobuvardage avec un
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anticorps anti-phosphotyrosine. Les résultats présentés à la figure 14 (panneau de gauche)
montrent un patron de protéines phosphorylées sur leurs résidus tyrosine dont l’intensité du
signal augmente avec le temps de pontage.
Sachant qu’après l’activation de la cellule via ces récepteurs, les tyrosines kinases de la
famille Src sont rapidement recrutées dans la membrane cellulaire via leur domaine de
myristoylation [236, 237], faisant en sorte qu’elles soient souvent les premières enzymes à
être impliquées dans la cascade de signalisation. Nous avons ainsi procédé à l’activation de
DCIR sur des cellules ayant été traitées avec un inhibiteur pharmacologique bien connu et
spécifique des tyrosines kinase de la famille de Src, le PP-2. Le résultat présenté au panneau
de droite montre une inhibition de patron de phosphorylation. Ce résultat montre le rôle d’avant
plan des Src kinases dans la cascade de signalisation ainsi que dans l’augmentation du patron
de phosphorylation des protéines sur leurs résidus tyrosine après l’activation de DCIR. Ceci
nous a permis de valider le modèle d’activation de DCIR. Ces résultats nous ont amenés à
utiliser le même protocole sur les cellules primaires en l’occurrence les cellules dendritiques et
les LTCD4 polarisés en Th17.
Figure 14 : Augmentation de la phosphorylation des protéines sur leurs résidus tyrosine
à la suite de l’activation de DCIR. 2x107 cellules/ml ont été prétraitées d’une part avec le
DMSO et d’autre part avec le PP-2 à 10 µM. Les Raji-CD4-DCIR ont été ensuite incubées
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avec ou sans l’anti-DCIR à 5 µg/ml et activées avec ou sans un second anticorps, le F(ab’)2
anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml. Les cellules ont ensuite été lysées dans le SB 2x réducteur. Les lysats
cellulaires ont été déposés dans les puits. Après l’analyse sur gel de polyacrylamide SDS-
PAGE 7.5%-20%, un immunobuvardage avec un anticorps dirigé contre les protéines
phosphorylées sur leurs résidus tyrosine a été réalisé.
4.2. Activation de DCIR dans les cellules primaires
4.2.1. Activation de DCIR sur les cellules dendritiques
Plusieurs études ont montré que les cellules dendritiques immatures expriment de grandes
quantités de DCIR à leurs surfaces et que ces cellules sont impliquées dans la pathogenèse
de l’infection par le VIH-1 telles que décrits dans l’introduction. Certaines études ont montré
que le DCIR exprimé sur les cellules dendritiques constitue un facteur d’attachement et
d’internalisation du VIH-1 et par conséquent occasionne la propagation du virus dans
l’organisme. La phosphorylation du motif ITIM de même que les tyrosines kinases Lyn, Hck,
Src et Syk semblent participer à cet attachement et à la transmission du virus par le DCIR
[207]. Par rapport à cela, nous souhaitions dans un premier temps vérifier si les cellules
dendritiques stimulées avec l’anti-DCIR pouvaient générer un patron de protéines
phosphorylées sur leurs résidus tyrosine tel que cela a été montré pour les Raji-CD4-DCIR
(Figure 14). Puis dans un deuxième temps, vérifier si les inhibiteurs de la portion extracellulaire
de DCIR pouvaient inhiber cette phosphorylation. Nous avons donc appliqué le même
protocole que celui utilisé pour stimuler les Raji-CD4-DCIR. Les cellules dendritiques ont été
activées avec ou sans anti-DCIR à 5 µg/ml puis avec ou sans F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml
ou encore avec F(ab’)2 anti-F(ab’)2 seul. Les cellules dendritiques ont été ensuite lysées dans
le SB 2x afin de réaliser l’immunobuvardage avec un anticorps dirigé contre les protéines
phosphorylées sur leurs résidus tyrosine. Le résultat présenté à la figure 15 montre que les
cellules dendritiques stimulées avec un anti-DCIR puis avec un ponteur, ont généré un patron
de phosphorylation avec un signal fort et croissant, mais qui a tendance à chuter après la
120ème minute d’activation. Cependant, au niveau des cellules non stimulées et celles
stimulées uniquement avec le F(ab’)2 anti-F(ab’)2, nous avons observé un signal faible et non
croissant en fonction de la cinétique. Ce qui explique une certaine spécificité avec l’anti-DCIR.
D’autre part, les cellules dendritiques ont été prétraitées avec un inhibiteur de la portion
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extracellulaire de DCIR, le 1-methyl-4-[(4-methylphenyl)-NNO-azoxy]benzene (B2) à 10 µM/ml
avant d’être stimulées avec l’anti-DCIR à 5 µg/ml et le F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml. Le
résultat présenté à la figure 16 montre une légère inhibition du patron de phosphorylation à la
120ème minute d’incubation des cellules prétraitées avec l’inhibiteur. L’inhibiteur n’a cependant
montré aucun effet sur le DCIR à la 60ème minute d’incubation. Nous avons également
constaté que les cellules dendritiques non stimulées n’ont pas généré un patron des protéines
tyrosine phosphorylées.
Figure 15 : Patron des protéines phosphorylées sur leurs résidus tyrosine à la suite de
l’activation directe de DCIR sur les cellules dendritiques. 2x107 cellules/ml ont été activées
avec ou sans anti-DCIR à 5 µg/ml puis avec ou sans le F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml ou
encore avec le ponteur seul à 37°C. Après la lyse des cellules dans le SB 2x réducteur, un
immunobuvardage avec un anti-phosphotyrosine a été réalisé.
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Figure 16: Inhibition du patron de phosphorylation sur les cellules dendritiques par les
inhibiteurs de DCIR. 2x107 cellules/ml ont été prétraitées d’une part avec le DMSO et d’autre
part avec l’inhibiteur B2 à 10 µM pendant 10 minutes à 37°C. Les cellules ont par la suite été
activées avec 5 µg/ml de l’anti-DCIR puis avec ou sans le F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml à
37°C. Les cellules ont été lysées dans le SB 2x réducteur. 20 µl de lysats cellulaires ont été
déposé dans les puits. Après migration sur un gel SDS-PAGE, un immunobuvardage a été
réalisé sur les échantillons avec un anticorps dirigé contre les protéines phosphorylées sur les
tyrosines.
4.2.2. Activation de DCIR sur les LTCD4 polarisés en Th17
Les LTCD4 polarisés en Th17 sont très permissifs à l’infection par le VIH-1 [88]. Il a été montré
dans notre laboratoire que ces cellules expriment de grandes quantités de DCIR (Figure 10).
Cette grande expression de DCIR peut faciliter l’infection de ces cellules Th17, mais pourrait
aussi promouvoir l’infection des LTCD4 non infectés appelés bystander en attachant du virus.
Nous avons d’une part, stimulé les cellules Th17 avec un anti-DCIR puis avec un F(ab’)2 anti-
F(ab’)2 afin de réaliser un immunobuvardage avec un anti-phosphotyrosine. Nous souhaitions
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voir si cette activation pouvait générer un patron de phosphorylation des protéines sur leurs
résidus tyrosine, tel que montré pour les cellules dendritiques. D’autre part, nous avons
procédé à un traitement des cellules par des inhibiteurs de la portion extracellulaire de DCIR,
1-benzofuran-2-yl(phenyl)methanone (B1) et 1-methyl-4-[(4-methylphenyl)-NNO-
azoxy]benzene (B2) pour vérifier si ces derniers pouvaient inhiber la phosphorylation en
réponse à l’activation par l’anti-DCIR. Le résultat présenté à la figure 17 révèle que les LTCD4
polarisés en Th17 stimulés par un anti-DCIR sont capables de générer un patron de
phosphorylation des résidus tyrosines. Les deux inhibiteurs de la portion extracellulaires de
DCIR utilisés affectent le patron de phosphorylation généré en réponse à l’anti-DCIR.
Figure 17 : Inhibition du patron de phosphorylation sur les LTCD4 Th17 par les
inhibiteurs de DCIR. 2x107 cellules/ml ont été prétraitées ou non avec les inhibiteurs B1 et B2
à 10 µM pendant 10 minutes à 37°C. Elles ont ensuite été activées avec ou sans l’anti-DCIR à
5 µg/ml puis avec ou sans le F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml. Les Th17 ont par la suite été
lysés dans le tampon SB 2x réducteur. Les lysats cellulaires obtenus ont été déposés dans les
puits. Après migration sur gel SDS-PAGE 7.5%-20%, un immunobuvardage avec un anticorps
dirigé contre les protéines phosphorylées sur leurs résidus tyrosine a été réalisé.
58
4.3. Évaluation de la liaison du DCIR avec les ligands
4.3.1. Détection de la protéine DCIR purifiée
Pour arriver à développer un modèle de liaison physiologiquement pertinent entre le VIH-1 et
le DCIR, nous devons avoir une molécule de DCIR fortement glycosylée que nous pourrons
déglycosyler in vitro, car la liaison avec ses ligands ainsi que sa phosphorylation sur les
résidus tyrosine sont influencées par cette glycosylation [185, 186]. Le DCIR est une protéine
glycosylée au niveau de son domaine CRD. C’est une N- glycosylation située à la position
185ème de la chaine peptidique de son domaine de reconnaissance des sucres [185]. Cette
glycosylation est impérative pour étudier la liaison entre le DCIR et ses ligands puisque in vivo
le DCIR sera préférentiellement glycosylé. Ainsi donc, pour purifier le DCIR, il a fallu utiliser les
cellules où la glycosylation est conservée et non d’avoir recours aux cellules bactériennes qui
peuvent produire des grandes quantités de DCIR non glycosylé. Nous avons donc décidé de
purifier la molécule de DCIR à partir de culture des cellules Raji-CD4-DCIR. Cette purification
a été effectuée sur la colonne de sépharose activé au CNBr et la protéine purifiée a été
quantifiée par la méthode de BCA à l’aide d’un spectrophotomètre tel que décrit au point 4.9
du présent travail. Après purification, la molécule de DCIR a été resuspendue dans le SB 2x
non réducteur et nous avons réalisé un immunobuvardage avec un anticorps anti-DCIR pour
évaluer sa pureté. La protéine HLA-DR que nous avons aussi purifiée de la même manière
était incluse comme contrôle. Le résultat présenté à la figure 18 révèle une protéine à la
hauteur de 31 kDa en comparaison avec la protéine HLA-DR purifiée dont aucune trace n’a
été révélée. La protéine révélée correspond bien au DCIR.
Figure 18 : Détection de la protéine DCIR purifiée par l’anticorps anti-DCIR. La protéine
DCIR et de la protéine HLA-DR purifiées ont été resuspendues dans le tampon SB 2x non
réducteur. 15 µg de chacune des protéines ont été déposées dans les puits et elles ont été
migrées sur gel de polyacrylamide 12%. Un immunobuvardage avec l’anticorps dirigé contre le
DCIR a permis de révéler le DCIR uniquement dans le puit correspondant au DCIR purifié
59
Chapitre V : Discussion
Le DCIR facilite la liaison et l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et son activation
augmente la production et la propagation du virus. Sachant que le rôle joué par le DCIR,
notamment la liaison entre le DCIR et le VIH-1, son internalisation ainsi que son trafic dans les
endosomes est dépendant de la transduction du signal due à la phosphorylation du résidu
tyrosine contenu dans son motif ITIM, nous avons cherché à savoir si l’activation de DCIR
avec un anti-DCIR pouvait générer un patron de phosphorylation des résidus tyrosine. Ensuite,
nous avons vérifié si les inhibiteurs de la portion extracellulaire de DCIR pouvaient bloquer le
DCIR et inhiber cette phosphorylation, témoin des évènements précoces d’activation cellulaire.
Pour ce faire, nous avons, dans un premier temps, évalué la présence de DCIR dans les
cellules Raji-CD4-DCIR. Dans un deuxième temps, nous avons montré que la stimulation de
DCIR par un anticorps anti-DCIR générait un patron de phosphorylation des résidus tyrosine
dans les Raji-CD4-DCIR ainsi que dans les cellules primaires notamment les cellules
dendritiques et les LTCD4 polarisés en Th17. Sachant que les Src kinases jouent un rôle de
premier plan dans la cascade de signalisation, nous avons voulu vérifier si l’utilisation des
inhibiteurs spécifiques à ces protéines pouvait inhiber cette phosphorylation. Ainsi, nous avons
montré dans cette étude que le prétraitement des Raji-CD4-DCIR avec l’inhibiteur
pharmacologique des tyrosines kinases de la famille de Src, le PP2 était capable d’inhiber
cette phosphorylation, validant ainsi notre modèle d’activation. Cela étant, nous avons testé
quelques inhibiteurs de la portion extracellulaire de DCIR dans les cellules primaires. Et nous
avons montré que ces inhibiteurs ont affecté la phosphorylation des protéines sur leurs résidus
tyrosine. Cette inhibition parait très légère avec le 1-methyl-4-[(4-methylphenyl)-NNO-
azoxy]benzene (B2) sur les cellules dendritiques. Elle s’est avéré cependant, très forte avec
l’utilisation des inhibiteurs 1-benzofuran-2-yl(phenyl)methanone (B1) et 1-methyl-4-[(4-
methylphenyl)-NNO-azoxy]benzene (B2) spécifiques au motif EPS dans les LTCD4 Th17. Ces
résultats révèlent une différence dans la réponse des cellules dendritiques versus celle des
LTCD4 Th17 lors d’une stimulation de DCIR. Cette observation renforce ainsi notre idée de
valider les effets de son activation et l’impact des inhibiteurs de DCIR dans les différents
modèles cellulaires l’exprimant.
Le niveau de glycosylation de DCIR affecte la liaison de son domaine CRD avec ses ligands.
Ceci nous a amené à purifier le DCIR à partir des Raji-CD4 le surexprimant et avons évalué sa
60
pureté par immunobuvardage. Une analyse protéomique déterminera avec précision son
niveau de glycosylation pour développer éventuellement des mesures de liaison in vitro avec
le VIH-1 en présence ou non des inhibiteurs de DCIR.
5.1. Différence de phosphorylation dans les trois modèles
cellulaires
Nous avons constaté que la phosphorylation générée à la suite de l’activation de DCIR par un
anticorps anti-DCIR était différente selon qu’il s’agissait des cellules Raji-CD4-DCIR, des
cellules dendritiques ou des LTCD4 polarisés en Th17. Dans les Raji-CD4-DCIR, le profil de la
phosphorylation augmente avec le temps de pontage et aucune protéine ne semble plus
phosphorylée qu’une autre. La phosphorylation de base est importante et ne semble pas être
influencée par l’ajout de l’anti-DCIR. Dans les cellules dendritiques, la phosphorylation est
fortement influencée par l’ajout de F(ab’)2 anti-F(ab’)2 qui ponte les anti-DCIR déjà fixés. Le
signal croit jusqu’à 2 minutes, suivi d’une diminution contrairement au Raji-CD4-DCIR. Dans
les LTCD4 Th17, nous avons constaté que l’ajout du ponteur n’a eu aucune influence sur
l’induction de la phosphorylation déjà augmentée simplement par l’ajout de l’anti-DCIR. Les
observations faites sur la mesure de phosphorylation dans les trois types cellulaires montrent
que ces cellules se comportent différemment et par conséquent doivent être traitées
indépendamment les unes des autres.
5.2. Le rôle de DCIR dans la transmission de l’infection par
le VIH-1
Comme nous l’avions dit précédemment, le DCIR est capable de lier le VIH-1 à travers son
domaine extracellulaire, jouant ainsi un rôle dans la pathogenèse associée à ce virus. Les
résultats obtenus dans notre étude (figures 16 et 17) montrent qu’il est possible de bloquer le
DCIR par des inhibiteurs extracellulaires spécifiques afin de l’empêcher de reconnaitre et de
lier la gp120 du VIH-1. Ceci réduirait la liaison et le transfert du virus. Ces résultats se
rapprochent de ceux obtenus par Claude M. Mfunyi et al, qui a observé que les cellules
dendritiques prétraitées avec les inhibiteurs pharmacologiques de la portion extracellulaire de
DCIR avant leur activation avec le VIH-1 ou avec un anticorps anti-DCIR, libéraient
61
significativement moins d’exosomes [232]. Les travaux de Lambert ont montré que les
inhibiteurs extracellulaires de DCIR étaient capables de diminuer l’attachement du virus sur les
cellules cibles ainsi que son transfert vers les LTCD4 [228]. Ces résultats mis en ensemble
montrent que le DCIR peut constituer une cible thérapeutique intéressante capable de moduler
l’infection par le VIH-1 dans les cellules cibles.
5.3. Rôle du motif ITIM de DCIR dans l’infection par le VIH-
1
L’activation du DCIR et par conséquent, la phosphorylation du résidu tyrosine contenu dans le
motif de signalisation intracellulaire ITIM pourraient affecter la production des cytokines
médiées par le TLR8 et le TLR9, notamment l’IL-12, le TNF-α et l’IFN-α [120, 121]. L’IL-12 est
requise pour la différenciation des LTCD4 naïfs en LTCD4 Th1, mais aussi à la stimulation
d’IFN-γ afin d’assurer la réponse immunitaire cellulaire. Son inhibition dans le contexte de
l’activation de DCIR pourrait être avantageuse pour le virus. En effet l’IFN-α joue un rôle
crucial dans l’immunité innée pour combattre la réplication virale. La diminution de ces
cytokines peut ainsi contribuer au dysfonctionnement du système immunitaire dirigé contre le
virus et participer à l’aggravation de l’infection. Plusieurs stratégies peuvent être utilisées pour
empêcher la phosphorylation des résidus tyrosine du motif ITIM. Ainsi, l’utilisation des peptides
phosphorylés tels que décrits dans les travaux de Lambert [207] constitue une approche
favorable. De plus, des inhibiteurs de la portion extracellulaire de DCIR, tels que montrés dans
le présent travail et qui sont capables de bloquer l’activation de DCIR et d’inhiber le patron de
phosphorylation générée à la suite de l’activation de DCIR par un anticorps anti-DCIR,
pourraient être intéressants comme stratégies immunomodulatrices. Ces stratégies pourraient
empêcher la liaison entre le DCIR et le VIH-1. Cela éviterait l’internalisation de DCIR dans les
endosomes et pourrait empêcher l’inhibition de l’activation de TLR8 et de TLR9 et augmenter
le pouvoir de présentation antigénique médiée par d’autres lectines de type C comme le DC-
SIGN. Ceci rejoint la publication de Kanazawa qui a montré que la mutation du résidu tyrosine
du motif ITIM du DCIR par un résidu phénylalanine faisait perdre au DCIR sa fonction de
régulation négative [182]
62
Plusieurs protéines intracellulaires sont impliquées dans la cascade des voies de signalisation
médiées par le DCIR notamment les kinases Src, Syk, Lyn, Hck, PKCα, Erk1/2, p38 et les
phosphatases SHP-1 et SHP-2 comme décrites aux points 1.2.4.5. et 1.2.4.6. Ces protéines
participent à l’infection dépendante du DCIR. Elles peuvent être inhibées et ainsi diminuer la
signalisation par le DCIR et de surcroit empêcher son attachement avec le virus. Le résultat
obtenu avec l’utilisation de l’inhibiteur pharmacologique des tyrosines kinases de la famille Src,
le PP2, a validé l’implication de ces protéines dans la signalisation intracellulaire médiée par le
DCIR (Figure 14, panneau de droite). La transfection des Raji-CD4-DCIR avec des
oligonucléotides anti-sens spécifiques telle que décrite par Lambert [207] a montré une
diminution du transfert du virus aux LTCD4. Ces deux résultats mis ensemble montrent qu’une
approche ciblée contre certaines kinases ou phosphatases impliquées dans la signalisation
médiée par le DCIR pourrait être intéressante. Mais malheureusement, ces protéines sont
aussi impliquées dans beaucoup d’autres voies de signalisations intracellulaires médiées par
l’engagement de plusieurs autres récepteurs. Elles jouent un rôle crucial dans la réponse
cellulaire comme la phagocytose, l’endocytose, la présentation antigénique, l’induction de la
réponse immunitaire et tant d’autres. Il serait donc pertinent de faire une étude approfondie sur
le fonctionnement et le rôle que joue chaque protéine, pour s’assurer si l’inhibition de telle ou
telle protéine n’entraverait pas les réponses fonctionnelles des cellules dendritiques ainsi que
celles d’autres cellules impliquées dans la réponse immunitaire.
5.4. Les antirétroviraux versus les inhibiteurs de DCIR
Il existe actuellement plusieurs antirétroviraux regroupés en 6 classes comme décrits au point
1.4. La majorité de ces molécules ciblent les protéines virales et agissent sur les différents
stades du cycle du VIH-1 dans le LTCD4 afin d’empêcher la réplication et la prolifération du
virus. Les inhibiteurs ayant un effet sur les molécules de la cellule hôte constituent une
minorité parmi les antirétroviraux. Il s’agit notamment de maraviroc, un antagoniste de
récepteur de chimiokine CCR5 et tant d’autres en développement comme l’AMD3100
(antagoniste du CXCR4) [238] et autres antagonistes de CCR5, le vicriviroc [239] et le
cenicriviroc [240]. Avec une combinaison classique de trois à quatre molécules différentes
(HAART : Highly active anti-retroviral therapy), les antirétroviraux permettent de réduire
l’hyperactivation du système immunitaire et contribuent à l’augmentation de l’espérance de vie
63
des personnes infectées par le VIH-1. Mais malheureusement, ce traitement ne permet pas
d’éliminer les réservoirs viraux [241]. Pour espérer éradiquer les réservoirs viraux et restaurer
l’intégrité du système immunitaire, il faudrait sortir le virus de sa latence ou détruire toutes les
cellules en latence virale. Ce qui n’est pas actuellement possible avec les antirétroviraux. En
plus ces médicaments sont principalement virostatiques et n’agissent que sur la réplication
virale dans les LTCD4. Aucun de leurs effets n’est à ce jour connu sur les cellules autres que
les LTCD4. Aussi, outre les antagonistes des récepteurs des chimiokines, ces médicaments
ne présentent aucun effet sur les protéines présentes sur certaines cellules de l’hôte, capables
de lier le VIH-1 comme le DCIR. Ce récepteur facilite la dissémination du virus dans
l’organisme dès les premières étapes de l’infection. Il serait donc important de développer des
nouvelles approches thérapeutiques dirigées contre le VIH-1 en ciblant le DCIR exprimé sur la
cellule dendritique et sur les LTCD4. Ceci pourrait résoudre notamment les problèmes de
résistance due à la survenue des mutations ou de toxicité telle qu’observée chez les
personnes sous antirétroviraux. Cette thérapie agirait au niveau des muqueuses dès la primo-
infection et pourrait limiter sensiblement la propagation du virus via les cellules dendritiques ou
les LTCD4 infectés et apoptotiques. Elle pourrait ainsi prévenir ou limiter la dérégulation du
système immunitaire.
5.5. Le DCIR dans le macrophage
Le macrophage est une cellule myéloïde qui exprime aussi le DCIR presqu’au même titre que
la cellule dendritique. Et il constitue un réservoir du VIH-1 [242]. En présence d’IFN-γ et d’IL-
12, les macrophages adoptent un phénotype qui favorise l’élimination du virus [243]. Donc la
diminution de l’IL-12 pourrait favoriser l’établissement des réservoirs viraux dans les
macrophages; puisque la différenciation des macrophages en M2 (macrophage exprimant
beaucoup de lectines de type C et capable d’assurer le transfert du VIH-1 au LTCD4) [244] en
défaveur de M1 (macrophage non permissif à l’infection par le VIH-1) permettrait la production
du virus et sa propagation dans l’organisme [245, 246]. L’activation de DCIR sur les cellules
dendritiques et les macrophages entrainerait une régulation négative de l’IL-12 médiée par le
TLR8 [120], cependant cette interleukine est requise pour la différenciation des LTCD4 en Th1
et des macrophages en M1. Ceci suggère que le DCIR peut jouer son rôle de régulation
négative aussi bien dans la cellule dendritique qu’indirectement ou directement dans le
64
macrophage. Il serait intéressant d’étudier l’infection par le VIH-1 médiée par le DCIR dans le
macrophage pour voir si l’utilisation des inhibiteurs extracellulaires de DCIR et autres
approches thérapeutiques dirigées contre le DCIR telles que les siRNA, les peptides
phosphorylés ou les oligonucléotides spécifiques aux protéines intracellulaires, pourraient
empêcher l’inhibition de TLR8. Ce qui favoriserait la polarisation des macrophages M1 et
diminuerait la susceptibilité des macrophages à l’infection par le VIH-1.
5.6. Perspectives
Les études réalisées sur ce projet de recherche ont montré que les inhibiteurs testés ont un
effet sur l’activation de DCIR. Cependant, beaucoup restent à faire pour finaliser ce projet.
Ainsi donc, notre étude pourrait être complétée par un certain nombre d’expériences dont voici
quelques-unes. Il serait utile de
poursuivre la caractérisation avec les inhibiteurs extracellulaires non encore testés de
manière à identifier davantage les plus efficaces.
réaliser le test de liaison entre la protéine DCIR et le VIH-1 (Test d’immunocapture).
Ici, il faudrait voir si le DCIR purifié est suffisamment glycosylé pour lier ou non la
gp120 du VIH-1 et ensuite faire le prétraitement de DCIR avec des inhibiteurs avant
son activation avec le VIH-1 puis mesurer l’inhibition de la liaison.
réaliser l’analyse protéomique du DCIR purifié pour vérifier son niveau de
glycosylation, qui est une caractéristique importante pour la liaison des sucres des
pathogènes.
évaluer les réponses fonctionnelles des cellules en présence des inhibiteurs de DCIR
en comparaison avec les inhibiteurs des autres lectines de type C. En effet, notre
étude n’a porté que sur les inhibiteurs de DCIR. Cependant, en dehors de celui-ci, il
existe d’autres lectines de type C capables de lier le VIH-1 et d’assurer son transfert
aux LTCD4 notamment le DC-SIGN et le MMR. Il serait donc nécessaire d’évaluer les
réponses fonctionnelles de la cellule dendritique en inhibant l’une ou l’autre des
lectines de type C ou en inhibant simultanément deux ou plusieurs lectines. Cette
étude permettrait non seulement d’évaluer les réponses fonctionnelles de la cellule
65
dont plusieurs récepteurs sont bloqués, mais aussi de voir l’impact du multi-blocage
des récepteurs sur l’infection par le VIH-1.
évaluer l’impact de l’internalisation de DCIR dans les endosomes, sachant que le
DCIR inhibe la production d’IFN-α induite à la suite de l’activation de TLR9 ainsi que
celle d’IL-12 et de TNF-α médiée par l’activation de TLR8. Il serait donc pertinent de
mettre en place un protocole capable de mesurer la capacité des inhibiteurs
extracellulaires de DCIR à empêcher l’inhibition de l’activation de TLR8 et TLR9. On
peut aussi mesurer cette capacité en utilisant les peptides phosphorylés sur leurs
résidus tyrosine ou thréonine, le siRNA spécifique de DCIR ainsi que des
oligonucléotides spécifiques des protéines intracellulaires impliquées dans la
signalisation médiée par le DCIR.
Enfin, la caractérisation des voies d’activation de DCIR dans les cellules dendritiques
et les LTCD4 Th17 ainsi que les effets des inhibiteurs de DCIR pourront être
poursuivis grâce à ce travail de maitrise.
66
Conclusions
En conclusion, la présente étude a permis de mettre en place un protocole de phosphorylation
de résidu tyrosine générée à la suite de l’activation directe de DCIR par un anti-DCIR dans les
Raji-CD4-DCIR, les cellules dendritiques et dans les LTCD4 Th17. Ces travaux ont également
montré que les inhibiteurs extracellulaires de DCIR étaient capables d’empêcher cette
phosphorylation. En utilisant l’inhibiteur de tyrosine kinase de la famille de Src, nous avons
confirmé l’implication de cette kinase dans la cascade de signalisation médiée par
l’engagement de DCIR. A travers cette étude, nous avons réussi à purifier le DCIR sur colonne
de sépharose activé au CNBr à partir des Raji-DC4-DCIR et nous avons évalué sa pureté par
immunobuvardage. Après l’analyse protéomique évaluant son niveau de glycosylation, elle
pourra être utilisée dans le test d’immunocapture.
Les résultats observés dans cette étude montrent qu’il est possible d’empêcher la liaison entre
le DCIR et le VIH-1 en utilisant des inhibiteurs spécifiques de DCIR. Cependant, d’autres
études telles décrites au point 5.6 sont nécessaires, pour avoir globalement une vision éclairée
sur les effets de ces inhibiteurs sur les réponses fonctionnelles des différents leucocytes
exprimant le DCIR.
67
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