Caracterización molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae en ponedoras comerciales y reproductoras pesadas de la zona centro de Colombia Cesar Enrique Ventura Politte, MV Maestría Salud Animal Línea de Microbiología y Epidemiologia Aviar
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Caracterización molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae en ponedoras comerciales y reproductoras pesadas de la zona centro de Colombia.
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Caracterización molecular de Mycoplasma gallisepticum y
Mycoplasma synoviae en ponedoras comerciales y
reproductoras pesadas de la zona centro de Colombia
Cesar Enrique Ventura Politte, MVMaestría Salud Animal
Línea de Microbiología y Epidemiologia Aviar
CONTENIDOGeneralidades de la micoplasmosis
Conclusiones y Recomendaciones
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
Generalidades de la micoplasmosis
Conclusiones y Recomendaciones
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
HISTORIA• 1898 en bovinos pleuroneumonia• En aves en los años 30- Sinusitis de
los pavos en 1938• Años 50, en pollos y pavos-ERC
Nocard y Roux, 1898; Nelson 1935; Dickinson y Hinshaw, 1938; Delaplane y Stuart, 1943;Markham y Wong, 1952; Van Roekel y Olesiuk, 1953
ETIOLOGÍA• Clase Mollicutes (mollis = suave y cutes = pared), • Orden Mycoplasmatales• Familia Mycoplasmataceae • Género Mycoplasma • 23 especies pueden afectar aves• Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma
sinoviae, Mycoplasma meleagris y Mycoplasma iowa
Kleven, 2000Browning & Markhan, 2004
600-1350 kpb, con 23-40 % de G-C, 740 genes. Funciones claras 469 genes.
Papasizi et al., 2003
GENOMA DE MG
EPIDEMIOLOGÍA
OIE, 2004;Kleven, 2006
Problemática de pollos, ponedoras, reproductoras y pavos
Aves silvestres y de traspatio
Distribución mundial
EPIDEMIOLOGÍATransmisión Horizontal y VerticalCondiciones de granja: alimento,
roedores, aguaReservorios y transmisores: Personas,
vehículos, Polvo, Insectos y BiofilmsBioseguridad
Kleven, 1996; Christensen, et al., 1994; Butcher, 2008
*
Estudios han demostrado la supervivencia de los micoplasmas a pesar de su notable sensibilidad a desinfectantes y condiciones ambientales extremas de frio y calor. Puede sobrevivir en plumas 4 dias, 3 en el pelo, 3 en el algodon, etc.
Bencina et al., 1987;Bradbury & McClenaghan, 1982; Mardassi et al., 2008
IgM7-10 DPI
IgG15-21 DPI
ConfirmatoriaSerotipificación
Detección del material genético - ADN
Bencina et al., 1987;Bradbury & McClenaghan, 1982; Mardassi et al., 2008
Generalidades de la micoplasmosis
Conclusiones y Recomendaciones
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
DISTRIBUCIÓN GEOGRAFICA AVICULTURA NACIONAL
MINISTERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURALDEPARTAMENTO ADMINISTRATIVO NACIONAL DE ESTADÍSTICA-DANEFEDERACIÓN NACIONAL DE AVICULTORES DE COLOMBIA-FENAVIFONDO NACIONAL AVÍCOLA-FONAV
63 Granjas de Ponedoras Comerciales – GPC9,5 % del Censo145 Lotes
30 Granjas de Reproductoras Pesadas- GRP33 % del Censo48 Lotes
ENCUESTA Ubicación geográfica
Tamaño y número de lotes en la granja
Uso de vacunas de MG y MS
Edad – Raza – Granjas Cercanas
Tipo de Explotación y Tipo Instalación
Programa de Bioseguridad
MATERIALES Y MÉTODOS• Enero de 2010 y marzo de 2012. • Hisopos traqueales
MATERIALES Y MÉTODOS• 45 animales por cada uno de los lotes
presentes en las granjas• Un hisopo humedecido en PBS por cada
tres aves.
MATERIALES Y MÉTODOS• Lavado del total de hisopos como un pool. • Conservación en un recipiente estéril a -20 0C • Extracción por un procedimiento no fenólico
Modificado de Hernández et al., 2009;OIE, 2008
Primers Secuencia Gen Producto
MG-FMG-R
5' CGC AAT TTG GTC CTA ATC CCC AAC A 3' 5' TAAACC CAC CTC CAG CTT TAT TTC C 3'
mgc2 237 pb300 pb
MS-F 1MS-R 1
5´ CCA TTG CTC CTG CTG TTA T 3´ 5´ GAT TCT GTT GTA GTT GCT TCA A 3´
vlhA 300 pb
MS-F 2MS-R 2
5´ AGT AAC CGA TCC GCT TAA TGC 3´ 5´ GAT GCG TAA AAT AAA AGG AT 3´
vlhA 450 pb
28S-F28S-R
5´ GGC GAA GCC AGA GGA AAC T 3 5´ GAC GAC CGA TTT GCA CGT C 3´
28S 61 pb
García et al., 2005; Wetzel et al., 2010; Hammond et al., 2009; Suzuki et al., 2009
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
• Estadística descriptiva para las diferentes variables
• Pruebas de correlación de variables chi cuadrado
• Pruebas de regresión logística• Software estadístico Statistix 8.0
Mycoplasma gallisepticum
Cepa F
Cepa 6/85
POS NEG
300 pb
300 pb
Mycoplasma synoviae
POS NEG
POS NEG
300 pbWVU1853
450PbWVU1853
300 pb
450 pb
300 pb
500 pb
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
Cepa F Cepa 6/85
Cepa WVU1853 Cepa
WVU1853
300 pb
300 pb
200 pb
Alto porcentaje de positividad a MG y MS
0
20
40
60
80
MSMG
51,81
30,05
48,18
69,94
NEG POS
Po
rcen
taje
n : 193
Positividad a MG y MS
GRPGPC
0
20
40
60
80
100
MG
MS
45,8
20,8
77,9
57,2
Po
rce
nta
jeMayor positividad a MS en los dos tipos de
explotación
p<0,05
Variables sin diferencias estadísticasGPC
Ponedoras comerciales
GRPReproductoras
PesadasAltitud 268-2780 m.s.n.m
p>0,051010-2572 m.s.n.m p>0,05
Tamaño de los lotes
1000 – 121380 avesp>0,05
770 – 36300 avesp>0,05
Departamento p>0,05 p>0,05
Tipo de Instalación
p>0,05 p>0,05
BioseguridadCumplimiento de 6 parámetros
61,8 % p>0,05
100 %
Variables con diferencias estadísticasGPC GRP
Raza 5 Razas p<0,05 en MG 20 – 73 %p<0,05 en MS 60 – 91 %
2 razas p<0,05 en MG 4 – 36 %p<0,05 en MS 39 – 52 %
Grupos Etáreos p<0,05 MG 13% al 74 %p<0,05 MS 13 % al 94%
p<0,05 MG 17% al 33 %p<0,05 MS 17% al 100%
Numero de lotes 1 – 10 p>0,05 en MS p<0,05 para MG 40% - 83%
1 - 3 lotes p>0,05
USO de Vacunas MG y MS
35,2 % MG p>0,050% MS
91,7 % MG p>0,050 %
Infecciones Mixtas MG y MS
POS MG y MS0
20
40
60GPC
GRP
8,3
55,2
Po
rce
nta
jeMayor positividad mixta en Ponedoras Comerciales
Generalidades de la micoplasmosis
Conclusiones y Recomendaciones
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
Cepas MG Sitios de corte HaeIII en el gen mgc2 de MG Longitud de losFragmentos
Acceso Genbank AY556230.1; AY556231.1 y AY556228.1
PCR-RFLP para diferenciar cepas de MG
www.insilico.ehu.es
MG 300
157 184
HaeIII 63
53
31
53
MG 237
248
52
CampoCepa F
6/85
Lectura de Patrones de restricción para M. gallisepticum
ROJO: Patrón 1
AMARILLO: Patrón 2
Identificación de patrones RFLP de MG con Tinción de plata
Control Cepa
F
Muestra con
Patrón1
Control Cepa6/85
Muestra con
Patrón1
Muestra con
Patrón2
100pb
40pb
200pb
60pb
300pb
160pb
Patrones RFLP de MG
POS MG0
20
40
60
80Patron 1
Patron 260,2
39,8
Po
rce
nta
jeMayor porcentaje de cepas de campo de
MG
n:93
Sin diferencias estadísticasPatrón 1 Patrón 2
Altura p>0,05 p>0,05
Número de lotes en las granjas
p>0,05 p>0,05
Tamaño de los lotes p>0,05 p>0,05
Departamento p>0,05 p>0,05
Bioseguridad cumplimiento de 6 parámetros
p>0,05 p>0,05
Con diferencias estadísticasPatrón 1 Patrón 2
Raza p<0,05 7 – 40 % GPC
p<0,05 2 – 53 % GPC
Tipo de Instalación
p<0,05 Jaulas 22% - Piso 57%
p<0,05 Jaulas 5-9 %- Piso 86 %
Tipo de Explotación
p<0,05 30% GPC- 90% GRP
p<0,05 70% GPC- 10 % GRP
Generalidades de la micoplasmosis
Conclusiones y Recomendaciones
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
CONCLUSIONES• Alta presencia de MG y MS de campo
en los dos tipos de explotación en estudio.
• Mayor presencia en granjas multiedad y mayor edad de los lotes
• Posibilidad de Transmisión Vertical
CONCLUSIONES• Infecciones mixtas que afectan el
manejo farmacológico y vacunal de lo agentes a nivel de granja
• Se debe determinar el uso y la importancia del uso de vacunas para el control de la enfermedad en las granjas
RECOMENDACIONES• Estudios que involucren todas las etapas de
producción en los diversos tipos de explotación
• Evaluación de programas vacunales • El mismo tipo de estudio en otras zonas
avícolas del país• Evaluar interacción de micoplasmas con