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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F.
Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de
Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54
+11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis de Posgrado
Caracterización de proteínas G enCaracterización de proteínas G
enTrypanosoma cruziTrypanosoma cruzi
Coso, Omar Adrián
1992
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en
CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y
de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir,
disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe
seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la
fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the
Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in
digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the
correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:Coso, Omar Adrián. (1992). Caracterización de
proteínas G en Trypanosoma cruzi. Facultad deCiencias Exactas y
Naturales. Universidad de Buenos
Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2513_Coso.pdf
Cita tipo Chicago:Coso, Omar Adrián. "Caracterización de
proteínas G en Trypanosoma cruzi". Tesis de Doctor.Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
1992.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2513_Coso.pdf
http://digital.bl.fcen.uba.arhttp://digital.bl.fcen.uba.arhttp://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2513_Coso.pdfhttp://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2513_Coso.pdfmailto:[email protected]
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A mi familia
no le dedico esta tesis
sino el gusto de trabajar
que de ellos aprendí
y que puede producir muchas cosas,
además de esta tesis
-
No soy buen matemático. pero quisiera hablar sobre
algunosnúmeros que me han estado molestando los últimos años. Ellos
sonel 0 y el 1.
Primero echemos un vistazo a 0. Nadie quiere ser un 0. Ser un
0significa ser nada o nadie. Ser "de última".
Por eso es que casi todo el mundoquiere ser número 1. Eso
significa ser un ganador, ser excelente, estar en la cima del
mundo.
No les resulta a Uds. extraña esta lógica de los números ?
Bien, yo opino que el problema con estos dos números es
que,estan tan cerca, que se parecen.
Y no dejan espacio para la gente de verdad.
(Tomadodel monólogo inicial de Laurie Andersonen "Home of The
Brave")
El maestro mediocre. dice.Un buen maestro, explica.Un maestro
superior, demuestra.Y el verdadero maestro, inspira.
(A Florencio E.; Maestro antes que Dr.)
-
DESEO AGRADECER:
- A la Dra. Mirtha Maria Flawiá por la oportunidad de
trabajaresta tesis en su laboratorio, por su comprensión y por todo
loque junto a ella pude aprender.- Al Dr. Hector Norberto Torres
por su constante apoyo verbalpara con estos experimentos, por
mantener activo el INGEBIpese alas crisis económicas y por su
parsimonioso buen humor.
- Al Dr. Alberto Rodolfo Kornblihtt por las horas de
docenciacompartidas y. demas esta decir, disfrutadas, hayamosestado
delmismo o de lados opuestos del "mostrador".
- A la Dra. Maria Teresa Tellez de Iñon (Tia Tere) por
consejosvarios.—Al Dr. Gerardo Glikin por críticas, y esperanzas
mutuas.- A1 Dr. Alejandro Paladini (jr ) "Amodel instituto" por
sucolaboración directa o indirecta en el funcionamiento
y/ooperación de casi todo aparato.- Al Dr. Luis Jimenez de Azua por
sus contundentes palabras deapoyo, reforzadas por sus particulares
verborragia y vocabulario.Tambienpor ser fuente de inspiración de
alguna futura novela.- Al Dr. Alejandro Mentaberry.- A la Comision
de Investigaciones Científicas de la Provincia deBuenos Aires.
— EN EL "GRUPO CICLASA":—A Alberto Diaz Añel por saber,
calladamente, dejar con
stancia frente a sus pares de su confiabilidad para
trabajar,discutir y convivir.
— A Jorge Prometeo Muschietti por Técnicas BioquímicasVarias,
por el recíproco fluir de ladridos, por ser oreja (en elmejor
sentido) y por haberme permitido cumplir con algo que miabuelo no
ha podido.
—A mi querido compañero Horacio Martinetto, entre otrascosas,
por no haber cumplido, al menos hasta ahora, con supermanente
promesa de matarme.
—A Marisa Farber y Diego Fraidenraich.—A Marcelo ("Academia")
Kazanietz, por poner un poco de
celeste y blanco en un laboratorio tan rojo.— A todos ellos pero
especialmente al primero por su
colaboración en el laboratorio.
- Al equipo que ayuda a sostener todo esto aunque no firme
ningunpaper: Norberto Malarini, Tito Contreras, Luis Acosta,
NenéParodi, Maria Julia Alvarez, Leonor Acevedo, Irma Gelmi,
GabrielPaissan, Marta Judewicz, Adriana Urman (la que zafó del
Borda) yMariano Rodriguez (El Hombreque Volvió de la Muerte
II).
—A mis compañeritos "de la primera hora":Andrés Muro: Porque nos
vimos subir y bajar de los pedestales ingebianos y siempre buscamos
la oportunidad para comentarlo.Fernando Bravo: Por mil y una
preguntas respondidas con la mejorde las voluntades. Pablo
Rabinowicz: Por aquellos relatos asombrosos. Mercedes Goin, Vivi
Bernath, Betina Orman, AlejandroShijman (con "S" de entropía) y
Patricia Levy-Yeyati.
-
- A Laura Moratinos, quien también pasó por "aquello"
- A las Ingenieras Nora Paños y Claudia Ochatt por su
hospitalidad.- A la eméritas Rita Ulloa, Silvia Cabral y Sonia
Lafón.—A los Jóvenes Anabella Srebrow ("la“ ayudante de mi
últimocuatrimestre de cátedra . . . . ..por ahora), Gustavo Pesce,
por lasganas envidiables (acompañadas por esa musiquita de
vidriosrotos) que pone en el aula, en el laboratorio y en todo y mi
cocromático Claudio Alonso.—A Dan Kaplan, Martin Vazquez, y Alfredo
Panebra. A SandraOgueta, Pablito Nalz, Ximena Ares, Gaby Calamante,
FlorenciaRodriguez y demás compañeros del INGEBI.
— A los que se fueron, al primer mundo, a otras realidades o
allimbo y quien sabe cuando volveran: Javier Caceres, Leo
Erijman,Enrique Mesri, Malala Gomez, Graciela Bianchini, Liliana
Haim,Roxana Celnik y Alvaro Estevez de Azua.—A Clarita Rubinstein,
Alejandra Mandel. Valentina Carricarte,Alejandro Gutman. Gabriel
Aisemberg y Pedro de Mendoza.- A los profetas de los que a veces
pude y otras no supeaprender: DannyAltschuler, Ricardo Attar, Erich
Grotewold yGuillermo "Tacho" Taccioli: Tachito: Jamás olvidaré la
"parábolade la bijouterie“.
—A los alumnos y a mis compañeros docentes de Genética
Bacteriana, Introducción a la Biología Molecular y
Celular,Regulación Metabólica e Ingenieria Genética; quienes
tienenmuchísimo que ver en mi formación en estos años.
-
Por último, especialmente, a Edith (Diti. Emi) Kordon:
- Por su aún no asumida generosidad.
- Por la "serena seguridad" de apariciones fugaces
peroclaves.
- Por saber 'jugar (y haberlo hecho conmigo estos últimosaños)
aquello de hablar, escuchar, enseñar y aprender.
-
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-
INTRODUCCION
-
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INTRODUCCION - 2 —
SISIEMAS_DE_IBANSDHQQIQN_DE_SEEALES
Las células que conforman los seres vivientes estan formadas
poruna serie de entidades moleculares rodeadas por un entorno
acuosodelimitado por una bicapa lipídica a la cual se denomina
membranaplasmática. La actividad de una célula esta determinada por
distintas reacciones bioquímicas que ocurren en su interior.
Muchasde ellas estan dadas en respuesta a señales externas a la
célulaen si. Para que dicha señal sea reconocida por la maquinaria
bioquímica interna debe existir un sistema que permita la
transducción de esa señal a traves de la membrana.
Los diferentes organismos han desarrolado una serie
deestrategias moleculares para transducir señales
extracelulares(Figura 1; Bourne y De Franco, 1989).
Z
Cytoplasm
ExtracellularFluid
Sl 82 S3 S4 85 SG
Sl nos muestra el sistema mas simple en el cual la señal
hormonales lo sufucientemente liposoluble comopara atravesar la
bicapalipídica y encontrarse con un receptor en el citoplasma
celular(Ej.: cortisol u hormonastiroideas).
Un receptor ubicado en la membranacelular puede transportarhacia
el interior una molécula no liposoluble que se una a su
-
INTRODUCCION — 3
cara externa. Ese mecanismo (82 en la figura) se llama
endocitosis mediadapor receptor y es la estrategia utilizada para
internalizar colesterol transportado por lipoproteinas de baja
densidad.
En algunos casos la llegada del mensaje a la cara externa
delreceptor produce un cambio conformacional en el mismoque
resultaen una actividad enzimática del lado interno de la misma
molécula(83) comoocurre para los receptores de factores de
crecimientocomo EGFy PDGFque por unión del ligando adquieren la
capacidadde fosforilar residuos de tirosina (Y) en proteínas.
En sinapsis y uniones neuromusculares la llegada de la
señaldirectamente regula la apertura (S4) de un canal iónico.
Las señales que regulan la forma celular (85) son componentes
dela matriz extracelular que, por unión a un receptor de
membrana,se conectan con componentes del citoesqueleto.
El 90% de las señales extracelulares que actúan a traves
dereceptores estan acopladas a proteinas que unen e hidrolizan
GTPllamadas proteínas G (86).
Las proteínas G pertenecen a un grupo muy amplio de proteínas
conlas que comparten un diseño estructural común. Este grupo ha
sidodenominado "la superfamilia de las GTPasas" (Bourne et a1,
1990).Cada una de estas proteinas posee la capacidad de cambiar
suafinidad por distintas macromoleculas. Debido a esto actúan
comotransmisores de información entre las entidades con las
cualesinteraccionan. Todas ellas son activadas por la unión de GTP
ydesactivadas por su hidrólisis, produciendo modificaciones
conformacionales que cambian su afinidad por las
distintasproteínas. Undeterminado estimulo externo provoca el
reemplazo
-
INTRODUCCION - 4 —
del GDPresultante de dicha hidrólisis por una nueva molécula
deGTPcon lo cual recomienza el ciclo. (Figura 2).
Membranaplasmática
Actividad fosfatasade la subunidad G.
H20
Reacción de intercambiode nuclcótido de la GDFsubunidad G.
Dimero GFGTPG .
Existen tres grupos principales dentro de la superfamilia de
lasGTPasas:
—Los productos de los oncogenes y proto-oncogenesras, proteinas
de peso molecular 21.000 aproximadamente.
- GTPasas que participan en la síntesis deproteínas por los
ribosomas como el factor de elongación bacteriano, EF-Tu.
—Las subunidades a de las proteinas G heterotriméricas.
En esta introducción nos referiremos principalmente a este
últimotipo y brevemente a los otros dos.
-
INTRODUCCION - 5 WWELa literatura cientifica publicada en el
último decenio muestraun número aún creciente de sistemas en los
cuales una señal externa es transformada en una reacción bioquímica
en el interior_deuna célula para producir una respuesta
fisiológica. Comoacabamos de ver en el esquema 86 de la figura 1
para que esosuceda debe existir una molécula receptora ubicada en
la membranaplasmática que detecte la señal y la transfiera hacia el
ladocitoplasmático. Se ve ademásI en el mismoesquema, la
existenciade una entidad intermediaria que se encarga de
interaccionar conla molécula efectora propiamente dicha. Estas
etapas sonnecesarias para que 1a información a transmitir sea
detectada,decodificada, amplificada, integrada y transformada en
una señalbioquímica intracelular.
Dentro de este esquema las proteinas G son las encargadas
detransducir la señal desde el receptor hasta el efector.
Tres tipos de subunidades con los siguientes pesos
molecularesconforman las proteínas G:
—subunidades a: entre 39 y 52 kDa.- subunidades B: de 35 o 36
kDa.- subunidades 3: entre 6 y 10 kDa.
Hasta el momentose ha reportado la existencia de 20 subunidadesa
distintas y un número menor de subunidades B y 3.
Las subunidades a poseen las siguientes caracteristicas
generales:
- Localización en la membranaplasmática.—Un sitio de unión para
nucleótidos de guanina.—Actividad GTPásica.
Capacidad de unir cationes divalentes como elMg2+al cual se une
en condiciones fisiológicas
-
INTRODUCCION — 6 —
- Residuos específicos susceptibles de ser covalentemente
modificados por el agregado de grupos ADP-ribosa apartir de
NAD+.Esta reacción conocida comoADP-ribosilación escatalizada por
toxinas bacterianas.
auhnnLdadeLQs
La subunidad aa de proteinas G fue la primera en ser
descriptapor su capacidad de activar la adenilil ciclasa. Esta
primeradefinición a nivel funcional (Rodbell et al, 1971a; Rodbell
etal, 1971b) surgió al ver la necesidad de la presencia de
GTPparala activación de la adenilil ciclasa por glucagón
(actualmente sesabe que ao puede activar adenilil ciclasas a través
de otrosagonistas como ACTH,LH, TSH, etc). Los resultados de
Rodbellsugurieron la existencia de una molécula (ver "Adenilil
Ciclasa”)capaz de transducir una señal desde el receptor hasta ese
efector. Masadelante, se veria que esa actividad descripta por
Rodbell estaba dada por una mezcla de dos polipéptidos a
diferentes(de 45 y 52 kDa.) con subunidades B y 3 indistinguibles
(Northupet al, 1980; Sternweis et al, 1981).
La puesta en práctica de las técnicas de clonado
molecularpermitió aclarar el panoramasobre la identidad de las
subunidades as. Diversos grupos aislaron cDNAsa partir de
materialbovino o humano (Harris et al, 1985; Robishaw et al, 1986 a
y b;Nukadaet al, 1986). Todas las proteinas codificadas por
dichoscDNAs caen en dos grupos de 45 y 52 kDa.
A partir de una biblioteca de cDNAhumano se obtuvieron
clonescorespondientes a las dos formas (Matera et al, 1986)
.generadassegun sus autores por un mecanismode 'splicing
alternativo. 4'cDNAs diferentes de la subunidad as de cerebro
humano fueronencontrados (Bray et al, 1986), correspondiendo los
nombres asLaaa, asa y asa a las proteinas de 394 (52 kDa), 395 (52
kDa), 379(45 kDa) y 380 (45 kDa) aminoacidos respectivamente.
Dichaheterogeneidad fue adjudicada al uso alternativo de un exon y
de
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INTRODUCCION - 7 —
un sitio aceptor secundario para el splicing , dato que fue
confirmado con el clonado a partir de una biblioteca
genómica(Kozasa et al, 1988).
Si bien el gen de as parece ser un gen de expresión
permanentedada la función que cumple la proteina existen reportes
quemuestran que el tratamiento con glucocorticoides aumenta
losniveles de mRNAde as (Chang et al, 1987) mientras que con
etanollos disminuye (Mochly-Rosen et al, 1988). Existe ademas
unaregulación específica de tejido: mientras cerebro e hígado
contienen ambas formas (52 y 45 kDa), en eritrocitos sólo aparece
laforma de menor peso molecular. De lo que se ha visto hasta
ahorase desprende que aal sería la ao más expresada en
diferentestipos de células.
A pesar de que ambas proteínas (45 y 52 kDa) interactúan
demanera similar con 1a adenilil ciclasa, con las subunidades
BSycon sus respectivos receptores, la velocidad de disociación
delGDP de la forma de 52 kDa es alrededor de 2,5 veces más
rápidaque la de 45 kDa. Esto implicaría que la activación de
laadenilil ciclasa producida por la proteína de 52 kDa (aal) es
másrápida que la llevada a cabo por la de 45 kDa (aa4) (Graziano
etal, 1939).
Tanto a45 como a5: pueden ser ADP-ribosiladas por toxina
delcólera, dicha modificación se produce en el residuo Arg-201
yprovoca una activación permanente de la adenilil ciclasa(Graziano
et al, 1987) debida a la inactivación de la GTPasaendógena del
complejo G.
Se ha comprobado que las 4 especies de as humanas pueden
activartanto la adenilil ciclasa comocanales de Ca2+ (Brownet
al,1988; Mattera et al, 1989). Esto muestra un nuevo rasgo de
losmecanismos de transducción de señales ya que queda en claro
quelas proteinas G no sólo pueden interactuar con diferentes
receptores pasando la información a un solo efector, sino que
tambiénactivan múltiples efectores ampliando —ycomplicando a la vez
suestudio- las posibilidades de la transferencia de la
información.
-
INTRODUCCION - 8 —
thunidadflñ__ai
ai fue originalmente conocida al estudiar la inhibición de
laadenilil ciclasa en una línea celular, S49, que era deficiente
enGa (Hildebrandt et al, 1983a y b). Más tarde. se identificó a
Gicomoel primer sustrato de la acción ADP-ribosilante de la
toxinade Bordetella pertussis, y se la caracterizó comoun
heterotrimero con subunidad a entre 40 y 41 kDa (Bokoch et al,
1984;Codina et al. 1983).
El uso del nombre Gi (correspondiendo la "i" a inhibición de
laadenilil ciclasa) es genérico y para emplearlo debe hacerse
lasiguiente aclaración: nunca se ha demostrado, realmente, una
acción inhibitoria sobre los niveles basales de dicha enzima,
sinosólo una inhibición de la estimulación de la adenilil
ciclasaproducida por Ga.
Estudios de clonado molecular revelaron que a diferencia de
loque ocurre con Ga las tres distintas Giconocidas provienen detres
genes distintos: au.(Nukada et al, 1986), ai: (Itoh et al,1986), y
aaa (Jones et al, 1987). Tanto au.como ai: tienen unpeso molecular
de 41000, mientras que aiz. 40000. Las secuenciasde aminoácidos
deducidas a partir de los cDNAs muestran unahomologia mayor al 85%.
Por experimentos de Southern-blot se havisto que cada uno de estos
genes se encuentra como copia únicapor genoma haploide humano
(Kaziro et al, 1991). Los tres tiposde Gi son sustrato de la
ADP-ribosilación ya mencionada lo queresulta en un bloqueo de su
actividad.
Tanto por experimentos de Northern-blot como por uso
deantisueros contra secuencias específicas que permitan
diferenciarlos tres subtipos, se encontró que au (41 kDa) está
distribuidade modo mas heterogéneo, siendo mas abundante en cerebro
yeritrocitos y que ai: (40 kDa) y ai: (41 kDa) aparecen en
diferentes tejidos de modo mas homogéneo (Bray et al, 1987; Brann
etal, 1988; Codina et al, 1988). El significado funcional de
estadistribución no se conoce aún.
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INTRODUCCION - 9
Ademásde su acción sobre adenilil ciclasa, se ha
reportado(Yatani et al, 1988) que los tres subtipos de Gi son
capaces deactivar canales de K+en músculo atrial con la misma
potencia.indicando esto su multifuncionalidad. Debidoa esta
actividad selas ha bautizado tambien como Gk (Yatani et al, 1987) y
asi se laencuentra en diversas citas bibliográficas.
thnnidadefi__ao
Intentando purificar Gi de cerebro bovino dos grupos
descubrieronen forma casi simultanea Gao, la cual mostró tener las
características de una proteina G y ser también sustrato de la
toxinade B. pertussis (Sternweis et al, 1984)(Neer et al, 1984).
Esta"otra" proteina (por eso llamada Gao), resultó tener un
pesomolecular de 39000, y ser la responsable de la altísima
actividadde binding de GTPX[3SS]en cerebro.
La subunidad Gao es una de las principales proteínas de
membranaen el tejido nervioso y constituye aproximadamente el 1%de
laproteína de membrana (Asano et al, 1987). Esto sugiere que
Goestaría involucrado en funciones que se encuentran altamente
expresadas en cerebro. Sin embargo, su distribución no es
homogéneaya que es más abundante en corteza, tálamo, hipotálamo y
cerebeloque en médula. También se lo ha reportado en retina
(Terashima etal, 1987)
La secuencia codante completa de Gao ha sido reportada (Jones
yReed, 1987; Van Meurs et al, 1987) y tiene una homologia del
82%(73% de identidad) con Gan y menor con la otras Ga. Se
hareportado tambien el clonado de una variante de ao. producida
porel splicing alternativo de un mensajero primario (Hsu et
al,1990; Murtagh et al, 1991).
Nose conoce a ciencia cierta la función de ao, pero existen
algunos datos experimentales de reconstitución que han mostrado
queGao es incapaz de interactuar con los componentes del sistema
deadenilil ciclasa (Roof et al, 1985; Katada et al, 1986b) pese
a
-
INTRODUCCION - 10
que en otros sistemas Gao y Gai funcionan de modo similar
(Bockaert et al, 1990). La evidencia de que no interacciona con
laadenilil ciclasa (comosí lo estaban las hasta ese momento
conocidas as y ai) asi comosu localización en cerebro, produjo
ungran impacto entre los estudiosos del tema ya que planteaba
laposibilidad de un papel mucho más amplio de la familia
deproteinas G.
Distintos experimentos de reconstitución heteróloga han
mostradoque Goestaria involucrada en el enlace bioquímico de:
- receptores quimioatractantes y fosfolipasa C bloqueadapor
toxina de B. pertussis (Kikuchi et al, 1986)
- receptor adrenérgico a2 (Cerione et al, 1986)- canales de Ca2+
regulados por opiodes (Hescheler et al,
1987)—estimulación de 4 canales distintos de K+ (Van Dongen
et
a1, 1988)—incremento del Ca2+ intracelular luego de la inyección
en
ovocitos de XEnopuslaevi activando a la enzima fosfolipasa
C(Moriarty et al, 1990).
Snbnnidadea_aq
Durante un tiempo se estudió la posibilidad de la
participaciónde proteinas G en la transducción de señales a las
fosfolipasas Casociadas a membranaplasmática. Dichas sospechas
estaban basadasen hechos comola activación de esta por nucleótidos
de guanina(Cockcroft et al. 1985), su estimulación por agonistas en
un mododependiente de GTP y la capacidad de los análogos
nohidrolizables de GTPde mimificar ese efecto (Smith et al,
1985).Moriarty y colaboradores (Moriarty et al, 1988) aportaron un
datointeresante sobre la existencia de un heterotrimero análogo
alque participa de la transducción de señales a adenilil ciclasa
almostrar que altas concentraciones de 9%bloquean la estimulaciónde
fosfolipasa C por el agonista.
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INTRODUCCION — 11 —
La sensibilidad de dicho camino a la acción de toxinas
bacterianas ha sido reportada en trabajos contradictorios. En
1989,se mostró la existencia de dos vias que comunican
distintosreceptores a la hidrólisis de fosfoinosítidos dentro de
una mismacélula, siendo una via sensible y la otra insensible a la
acciónde toxina pertussis (Ashkenazi et al, 1989).
En 1990 fue purificada una proteina de cerebro de rata cuyo
pesomolecular resultó de 42 kDa.. Dicha proteína mostró tener
laszonas consenso de proteinas G y no ser sustrato de
ADPribosilación por toxina pertussis (Pang et al, 1990) y
fuebautizada aq. Por clonado molecular fueron encontradas
variasnuevas subunidades Ga (Strathmann et al, 1989). Una de
ellas(all) difiere solo un 12 Z en secuencia aminoacidica con
respectoa aq y ambas son idénticas a la proteina de 42 kDa. ya
mencionada.
En experimentos de reconstitución, aq aisladas de
distintostejidos resultaron estar involucradas en la regulación de
la actividad de PLC-BI pero no de los isotipos PLC-8 o PLC-
(Smrckaet al, 1991; Blank et al, 1991).
Otros tres isotipos pertenecientes a la familia aq han sido
encontrados en distintos tipos celulares. Se ha postulado que
estosnuevos miembros llamados a14, als, y als interactuen con
distintos miembrosde la familia de las fosfolipasas (Simon et
al,1991).
SsibnnidadethWEn los segmentos externos de los bastones (células
de la retinaparticipantes del mecanismo de vision) existe una
proteína Gheterotrimérica involucrada en la transducción de las
señalesvisuales. Su subunidad a tiene un peso molecular de 39 kDa
(Fung,1983; Yamazakiet al, 1987) y tiene la particularidad de no
estarasociada a la membranacelular sino a la membranade los
discos(ver mecanismode visión). representando hasta el 50%de
las
-
INTRODUCCION - 12
proteínas solubles o debilmente asociadas a membranasen su
tipocelular (Chabre y Deterre, 1990). Es ADP-ribosilable por
lastoxinas cólera y pertussis y su molécula efectora es la
Fosfodiesterasa de GMPc.
Su estructura no difiere de otras G a tal punto que
anticuerposanti-ai reconocen a: y que sus subunidades B son
idénticas a lasde aa y ai (Codina et 31,1986). Muchas de las cosas
que actualmente se saben de la bioquímica de las proteínas G fué
observadoprimero en la transducina.
WLMUna proteina G nueva ha sido recientemente caracterizada
(agustducina) por clonado a partir de tejidos especializados en
elsentido del gusto (Mc-Laughlin et al, 1992). Su expresión
selimita a aquellas zonas de la lengua involucradas en el
sentidodel gusto. Su estructura la asemeja muchoa las transducinas
deconos y bastones. Sus últimos 38 aminoácidos son idénticos lo
queindica que gustducina podria interactuar con receptores para
luzcomorodopsina. La presunción de que gustducina transduce
señalesde gusto, de un modosimilar al cual emplea transducina
paratransducir señales lumínicas, esta apoyada por el hecho de
quepodría tener comoefector la Fosfodiesterasa de AMPc.
Snbnnidadeuou
Muchos datos han sugerido que AMPces el segundo mensajero en
laactivación de neuronas del sistema olfatorio (Lancet y
Pace,1987). La respuesta a olores es especifica de tejido y de
ligandoy dependiente de GTP, como se esperaría para una
enzimageneradora de segundos mensajeros acoplada a una proteina G.
Hasido aislado y secuenciado un cDNAespecífico de
neuroepitelioolfatorio que codifica para una proteina Gas-like
(Jones y Reed,1989). Dada su expresión aparentemente limitada a
neuronas ol
-
INTRODUCCION — 13 —
fatorias, fue bautizada Gaolí. La proteina aolf tiene 381 aa y
un88%de identidad con aaa. Expresión de Gaou en células cyc-
dellinfoma S49 permitió restituir la estimulación de
adenililciclasa a través del receptor B-adrenérgico y en presencia
deGTP-X-S o NaF, lo cual confirma que puede funcionar como Gas.
Sudistribución particular lleva a pensar que esta proteína
podríajugar un papel en la transducción de señales olfatorias
aunque eneste caso lo haría a traves del aumento de los niveles de
AMPcadiferencia de gustducina.
WKAunquelas proteínas G contienen tres polipéptidos, pueden
considerarse dímeros funcionales, ya que las subunidades B y X
solose disocian por desnaturalización y actuan juntas, como
unaunidad.
El principal rol conocido de estas subunidades seria el
modularla actividad de las subunidades a.
Contrastando con la diversidad que se ha observado para
distintassubunidades a y la cantidad de datos obtenidos sobre
ellas. menosse sabe de la naturaleza y variedad de las subunidades
BSque lasacompañan. Estudios llevados a cabo para medir la
actividad de HXsugieren que estas son funcionalmente
intercambiables entre distintas proteinas G. (Katada et al. 1984;
Neer et al, 1984)
Existen al menos dos formas de la subunidad B (BI de 36 kDa. y
BZde 35 kDa), codificadas por distintos genes (Amatruda et al,1988)
las cuales presentan diferencias inmunológicas peromuestran una
gran homologia a nivel de secuencia. Rastreandobibliotecas de
cDNAde retina humana y bovina, fue aislada unatercera forma de 37
kDa. codificada por un gen no alélico con losotros dos (Levine et
al, 1990). Existiria una cuarta formaabundante en cerebro y pulmón
pero escasa en otros tejidos (vonWeizsacker et al, 1991).
-
INTRODUCCION - 14
Hasta el momentose han clonado 5 G3 distintas: El de
retinabovina (Hurley, J B., 1984), 32 de glandula adrenal y
cerebrobovino (Robishaw et al, 1989), 33 tambien de cerebro bovino,
X4de retina y riñon murino (Gautam et a], 1990) y 35 de hígado
yplacenta humanos (Fisher y Aronson, 1992)
Las subunidades B y X estan firmemente asociadas a membranas
encasi todos los tejidos en que se las ha estudiado con excepciónde
retina, y solo pueden ser solubilizadas desensamblando la membrana
con detergentes. No se ha reportado que la entidad 63 unamoléculas
pequeñas o metales pesados.
El agregado de 83 libre puede resultar en inhibición de la
actividad de adenilil ciclasa previamente activada via Gas
(Northupet al, 1983). En neutrófilos. un exceso de BBlibre resulta
ensupresión de la actividad de adenilil ciclasa (Bokoch,
G.M.,1987). Inicialmente se propuso que esa inhibición era
producidapor el secuestro de subunidades a por el exceso de BB, sin
embargo en 1986, Katada propuso la existencia de un mecanismo
aindependiente.
Dos trabajos recientes (Federman et al, 1992 y Tang y
Gilman,1991) muestran la influencia de las subunidades B y 3 sobre
laactividad de adenilil ciclasa. El primero de elos indica que
bajociertas condiciones B y X provenientes de la disociación de
otrostrímeros como el de Gai pueden estimular adenilil ciclasa II
siesta es previamente estimulada por Gas. Tang y Gilman obtienen
elmismo resultado y ademas ven inhibición de la actividad
deadenilil ciclasa I mediada por el dímero 83.
Otro efecto directo de Bbsobre efectores ya reportado, es la
activación de fosfolipasa A2de retina para producir ácido
araquidónico (Jelsema y Axelrod, 1987). Actualmente se
estaestudiando la influencia del dímero sobre la actividad de
fosfolipasa C-X (Sue Goo Rhee, comunicación personal).
-
INTRODUCCION - 15 WYWWMMLos sistemas de transducción de señales
mediados por proteínas Gheterotriméricas estan difundidos entre una
amplia gama de seresvivos. Lo conveniente de estos sistemas es que
poseen lassiguientes características sobresalientes:
direccionalidad yamplificación.
La direccionalidad esta dada por la actividad GTP-ásica;
lahidrólisis irreversible del GTPimpide que el ciclo funcione
enreversa entre efector y receptor. Esto es lo que diferencia aeste
proceso del alosterismo en el cual la inactivación se da porun
proceso inverso a la activación. En el caso de las proteínas Gpara
volver al estado unido a GTPdebe existir una nueva interacción con
el receptor (Heideman y Bourne, 1990).
La amplificación se da por dos mecanismos: Por un lado, la
activación de una molécula de receptor puede activar
muchasproteínas G, tal como sucede en el mecanismo de visión en que
unarodopsina fotoactivada, activa 500 moleculas de transducina
(Fungy Stryer, 1980).
El segundo mecanismo esta dado por el hecho de que la
moléculaefectora, produce muchas moléculas de segundo mensajero
antes deque la proteína G que la regula, se inactive por hidrólisis
deGTP. Este fenómeno se produce aunque el receptor active una solaG
y puede durar mas tiempo de lo que dura la interacción
ligando—receptor.
La Figura 3 muestra como el "factor de amplificación"
(10!)aumenta 5 o 6 ordenes desde la llegada de la señal hasta que
seproduce la respuesta celular.
-
INTRODUCCION - 16 —
1
7. CHANGE INCELLBEHAmHRELEASE OF GLUC(
1.HRST ' ' " xMESSENGER /"—‘ÏSÁ -*
EPINEPHRINE fi a E(AAÏD'PE E 5.55MBTRIPHOSPHATE) ‘
6.ENZYMÁT'CCASCADE
El mecanismogeneral por el cual ejercen su acción las
proteínas
-
INTRODUCCION - 17 —
G heterotriméricas está esquematizado en el siguiente
dibujo(Figura 4):
«¿- ena 1%De no mediar ninguna estimulación de por medio, las
evidenciasindican que las proteínas G se encuentran comotrímeros
unidos aGDPconformando el complejo inactivo a-(GDP)BB. Esta forma
es laque se une al receptor activado (3*). La activación se
producepor unión del agonista pal receptor y cataliza el
intercambio deGDP por GTP. El complejo a-(GTP)58 se separa del
receptor activado (R*) el cual puede provocar la entrada de GTPa
otrotrímero. Inmediatamente, a-(GTP) se separa de BEy se une
alefector, el cual pasa a su forma activa (E*). Dicha formaresponde
produciendo moléculas del segundo mensajero (A-——>B)(sise trata
de un efector enzimático). Toda subunidad a tiene una
-
INTRODUCCION - 18
actividad GTP-ásica intrínseca que transforma a-(GTP) en
a-(GDP).Esta segunda entidad ya no puede seguir estimulando al
efector,por lo tanto se libera de él y se reúne con un dimero 83
libre.El heterotrímero reconstituido esta asi listo para iniciar
otrociclo.
Se ha desarrollado un modelode la estructura tridimensional
delas subunidades Ga basado en las estructuras de la proteína Ras
ydel factor de elongación TU (de Vos et al, 1988 y Jurnak st
al,1985). Entre los productos p21 de los oncogenes ras y este
factorinvolucrado en la síntesis protéica se han identificado
4regiones altamente conservadas en la secuencia primaria
(Hallidayet al, 1984) a las que se las llamó A, C, E y G (Figura
5).
Zonas deHalllday A ' - c G lNHa(:-:-:-:-::Ï’COOH
IToxlna ToxlnaCólera Formula
Esas mismas regiones están conservadas entre todas las Ga y
sonlas que les confieren las características comunesa la familia
delas GTPasas, mientras que las zonas en las cuales las
secuenciasdivergen, estan involucradas en las funciones
particulares decada una de ellas‘
-
INTRODUCCION - 19
Existe un modelo esquemático de como se ordenarian
espacialmentelos distintos dominios de las proteinas Ga, basado en
lacristalografía de EF-Tuy de p21ras (Masters et al, 1986), elcual
no representa a ninguna Ga especifica sino que pretende serun
"promedio" (por eso se lo llama Gapto) de lo que serian
lasestructuras de las distintas Ga. En la Figura 6 se ve como
esemodelo ubica espacialmente las 4 zonas de Halliday y el lugar
queocupa la molécula de GTP.
lun
La region A forma un rulo que se ubica cerca de los fosfatos a
yB del nucleótido. Esta región estaria involucrada en laregulación
(y quizás en la catálisis) de la hidrólisis del GTPunido. La
secuencia de aminoacidos GXXGXGKSesta presente enmuchas proteinas
que unen GTPy en particular en las proteinas Gase ajusta a
GAGESGKS.En p21ra9 la mutación que reemplaza a la
-
INTRODUCCION - 20
glicina de la posición 12 (correspondiente a la glicina 49
deGapro) por casi cualquier otro aminoácido puede provocar
latransformación maligna de fibroblastos (Seeburg et al, 1984).
Lamisma mutación tambien inhibe la capacidad de la proteína Ras
dehidrolizar GTP(Barbacid, 1987).
La región C (DXXG)en EF-Tu está compuesta de una lámina B
conectada por un rulo a una hélice a. Un residuo de aspartato (D)
enla lámina B (correspondiente a Asp227 en apro) interactúa con
uncatión Mg++(Pai et al, 1990) el cual a su vez esta coordinadocon
los fosfatos del GDP.El protón de la glicina (G) formaría unpuente
de hidrógeno con el fosfato 8 del GTP. La conformación deesta zona
es muydiferente dependiendo de que la molécula esteunida a GTP o
GDP.
Los cambios conformacionales asociados a la unión a GTPo GDP
sehan visto claramente al obtener formas cristalográficas de
p21rasunidas a esos nucleótidos (de Vos et al, 1988; Pai et al,
1989).El mas claro se ve en la región comprendida entre la Asp39 y
laThr74 (Jurnak et al, 1990).
La región E contiene aminoácidos hidrofóbicos (FXAAL)Y Junto ala
zona G (NKXD)forman un bolsillo en el cual se ubica el anillode
guanina; este bolsillo "a medida" es lo que confiere a laproteina
especificidad de nucleótido. Los oxígenos del carbonodel aspartato
(D), interactuarían con el grupo 2-amino del anillode guanina y los
protones de asparragina (N) y lisina (K)estabilizarian la unión.
Mutacionesen ese aspartato conservado(Asp297 en apto) impiden
discriminar entre GDPe IDP (Sigal etal, 1986).
El aspecto general que ofrece apto es el de un núcleo en el
cualqueda delimitado el bolsillo donde se ubica el nucleótido y
zonasperiféricas involucradas en la interacción con los
componentesubicados antes y después en la cadena de transmisión de
la señal.
El extremo amino-terminal de las subunidades Ga es el que se
encargaría de interactuar con B y X, dado que por proteólisis
de
-
INTRODUCCION — 21
ese extremo se pierde esa propiedad (Neer et al, 1988) (ver
tambien: Modificaciones Post-Traduccionales). La interacción con
elreceptor estaria dada por el otro extremo de la
molécula.Anticuerpos dirigidos contra el extremo carboxi-terminal
de algunas Ga también bloquean la interacción con receptores
(Dereticet al, 1987).
Las interacciones Ga-efector han sido estudiadas mediante la
construcción de subunidades Ga quiméricas, los resultados
parecenindicar que la zona carboxi-terminal sería la que
determinaespecificidad de efector (Masters et al, 1988; Osawaet al,
1990;Gupta et al, 1990). En estas subunidades Ga los residuos
236-356de as comprenden el menor segmento lineal requerido para la
activación de adenilil ciclasa (Berlot y Bourne, 1992). Dentro
deesos 121 aminoácidos, los autores encuentran cuatro regiones
quepor mutación previenen la activación del efector. Noexiste
información disponible sobre las zonas determinantes de
activacióndel efector en otras Ga, pero las similitudes en
estructuraprimaria sugieren que comparten una estructura
tridimensionalWWEn líneas celulares clonadas usando distintas
sondas se han encontrado en la misma célula mRNAspara Gas, Gail,
Gaia, Gao, Gaz,Gaq y Ga11 (Simon et al, 1991). La diversidad de las
subunidadesB y 3 (4 y 3 respectivamente encontradas tambien en
célulasclonadas) asi comola posibilidad de que exista intercambio
entrelas BSasociadas a distintas Ga apuntan a que el dímero
tendríauna importante función en la integración de los varios
circuitosmediados por G. Mas aún, si todas estas subunidades se
pudiesenasociar de modo azaroso, habria casi cien distintas
Gheterotriméricas que podrían interactuar con un númerosimilar
dedistintos receptores, potenciando la utilidad del sistema.
Si bien parece probable la existencia de estas redes o
"G-proteinnetworks", la reunión combinatoria de distintas
subunidades G no
-
INTRODUCCION - 22
se da totalmente al azar. Experimentos de reconstitución
hanmostrado la afinidad diferente de Gas, Gai y Gat por
distintosdimeros ax (Casey et al, 1989 y Konhken et al, 1989). El
mododiferente de eluir de una columna de agarosa-Bx por parte de
distintas Ga, lleva a la mismaconclusión (Pang et al, 1989).
Partesdel sistema intracelular podrian servir de escudos para
impedirel "diálogo" entre distintos caminos de transducción.
Existenevidencias de compartamentalización de sistemas
(Strittmatter etal, 1990) y ademas se han reportado ubicaciones
intracelularesdistintas para Gaiz y Gaia (Ercolani et al, 1990).
Por otro ladosubunidades Ga comoGaia y Gao activadas por distintos
receptoresy con distintos efectores, pueden interactuar con otros
efectorescon menor afinidad, lo cual habla en favor de la
existencia deredes.
Futuros estudios llevarán a la luz hasta que punto podrian
interaccionar distintos caminos de transducción de señales
mediadospor proteinas G pero ya existen ejemplos en sistemas
descriptostales comoel aprendizaje asociativo en Aplysja el cual
esmediado por múltiples caminos G (Volterra et al, 1988).
anggenmLG
La aparición de oncoproteinas G fué anticipada hace ya unos
años(Bourne, 1987; Mc Cormick, 1989). La idea de que mutaciones
activantes de proteinas G pueden causar transformación celular
escoherente con los diversos datos acumulados gue relacionan
alsistema con eventos como la diferenciación o
proliferacióncelular.
La primera evidencia directa en ese sentido fue el
descubrimientode mutaciones en la subunidad Gas en un tumor
pituitario (Landiset al, 1989). Estas mutaciones caen en dos
sitios: Arg-201 y Gln227. El primero es el sitio de
ADP-ribosilación por toxina delcólera y el segundo equivale a la
Gln-Gl de ras-p21. Ambasdestruyen la actividad GTP-ásica intrínseca
de Gas manteniendola
-
INTRODUCCION — 23
en su estado activo unida a GTP.
Buscando en forma sistemática en distintos tumores mutaciones
queinhibieran la actividad GTP-ásica se encontró un nuevo grupo
demutantes (Lyons et al, 1990). Algunos tumores de corteza
adrenalmostraron mutaciones en Gaia.
Mutaciones que activan Gac resultan en un aumento de los
nivelesde AMPcintracelulares mientras que mutaciones en Gaia los
disminuyen. El hecho de que la mutaciones en Gao y Gaia sean
muyrestringidas y no se superpongan, implica que estas proteínas
Gno transducen la señal mitogénica de un modogeneral sino
quecumplenpapeles especificos en cada tejido (Cantley et al,
1991).WWWWLa reacción de ADP-ribosilación es una modificación
proteicaampliamentedistribuida en la naturaleza. La trasferencia de
ungrupo ADP-ribosa a partir de NAD+como sustrato es parte de
unmecanismomolecular diseñado para modular la estructura y la
actividad de distintas proteinas (Ueday Hayaishi, 1985)
En vista de la importancia de las proteínas G en la
transducciónde señales y en la regulación de caminos metabólicos no
es sorprendente el hecho de que alteraciones en su función sean
lacausa de enfermedades. En particular, dos bacterias producen
enfermedades en el hombre mediante la acción de toxinas por
ellasproducidas. La ADP-ribosilación de Gs y Gi produce
finalmentealteraciones en los contenidos de AMPccelulares.
Paradojicamenteeste fenómeno que tanto ha dañado a muchos
individuos de laespecie humana, provee por otro lado una
herramienta para elestudio de las proteinas G.
La toxina de Bordetella pertussis bloquea la inhibición de la
actividad de adenilil ciclasa mediante la adición covalente de
un
-
INTRODUCCION - 24
grupo ADP-ribosa a Gai.
La toxina pertussis es una proteína oligomérica de 117 kDa.
comPuesta por 5 subunidades 81-85 de pesos moleculares 28, 23,
22,17 y 9,3 kDa. respectivamente (Tamura et al, 1982). El
componenteB o componente de binding tiene la forma
[(Sz-S4)(Ss)(Sa-S4)]. La
actividadessubunidad 81 es el componente funcional (A) y poseede
ADP-ribosiltranferasa y NAD-glicohidrolasa (Tamura et al,1982;
Katada et al, 1983).
latente y debe ser,La actividad de la subunidad Sl in
vitro es activada por incubación previa conditiotritol
(DTT)(Moss et al, 1986).
El NAD+está formado (Figura 7) por una ADP-ribosa unida
medianteun enlace de alta energia a un grupo nicotinamida (Zatman
et al,1963; Ueda et al,la ADP-ribosa a un aceptor como H20 o una
proteina.
1985). La toxina cataliza la transferencia de
H
ProteínaGa.)“(CH2)3_ N\ (43 ¡aC=NH2 + NADV/
lfiN
(MI OH
Derivado ADP-ríbosílado de un residuode arginina cn la proteína
GM
-
INTRODUCCION - 25
Los sustratos clásicos de esta toxina en el laboratorio
hanresultado ser: Gai, Gao y Gat. El sitio de modificación es
unaminoácido (Cys) ubicado cerca del extremo carboxi-terminal.
comose ha visto en el nonapéptido
Glu-Asn-Leu-Lys-Asp-Cys-Gly-Leu-Phe(West et al, 1985).
La toxina del cólera (cuyo componente activo es
llamado"Colerágeno") es el producto secretorio de Vibrio
choleraeresponsable de la diarrea producida en los pacientes
coléricos.Su efecto bioquímico es la activación permanente de Ga y
consecuentemente de la enzima adenilil ciclasa que resulta en
unaumento drástico de los niveles de AMPc. Dicha modificaciónderiva
en una alteración del flujo iónico de las membranas decélulas
intestinales y finalmente en el síndrome señalado.
Esta toxina tambien es un oligómero y esta compuesto por una
subunidad A (84 kDa.) y cinco subunidades B (11,6 kDa.) asociadas
demodono covalente (Gill, 1976).
El pentámero B es responsable de la unión de la holotoxina a
lasuperficie celular interaccionando con un
monosialogangliosido(GMI) (Richards et al, 1983; Kanfer et al,
1973).
La subunidad A esta compuesta por dos cadenas unidas por
unpuente disulfuro (A1 de 23,5 kDa. y A2 de 5,5 kDa.) y la
actividad catalítica residente en A1se activa químicamente
contioles en el laboratorio o por una enzima (proteina
disulfurotiol reductasa) presente en muchascélulas animales (Moss
et al,1980). La formación de A1 libre es el paso que determina
lavelocidad de la reacción (Chang et al, 1983).
La acción de esta toxina se efectúa sobre muchasproteínas y sela
ha visto correlacionada con la cantidad de residuos
argininapresentes (Moss y Vaughan, 1978). La reacción crítica
quedetermina la activación de adenilil ciclasa y la intoxicación
decélulas de la mucosa intestinal, que desemboca en la
conocidadiarrea, es la ADP-ribosilación de Gao (Northup et al.
1980). Entransducina se ha identificado a la arginina blanco por
digestión
-
INTRODUCCION — 26
tríptica en el péptido Ser-Arg-Val-Lys. Esa arginina
(ArgZOl)esta conservada en todas las Ga que son sustrato de
ADPribosilación por toxina colérica.
Se ha visto en elgunos reportes que la trasferencia de
ADP-ribosade NAD+a Gas requiere además de la catálisis por la
toxina delcólera, de la colaboración de una proteína de 21 kDa.
llamadafactor de ADP-ribosilación (ARF) (Kahn, 1990). La mayoria de
lasmoleculas de ARFestan presentes en el citosol aunque tambien
selo ha purificado de membranas (Kahn et al, 1988).
La caracteristica saliente de ARFes que se trata de una
entidadcapaz de unir GTP. La secuencia de su CDNAcompleto ha sido
obtenida (Sewell y Kahn, 1988) y se han encontrado homologías
significativas con proteínas de las familias Ga y ras; sin
embargoninguna de las otras proteínas de 21 kDa. que unen GTP
hanmostrado actividad ARF(Kahn, 1990). También se le ha asignado
unrol en la formación de vesículas controlado por la hidrólisis
deGTP(Serafini et al, 1991).
a .1 .5
Por expresión de los cDNAcorrespondientes en células en
cultivose ha visto que las subunidades Ga clásicas, excepto as (ai,
ao yat) sufren miristoilación en sus extremos amino-terminales
(Joneset al, 1990; Mumbyet ¿1,1990). La capacidad de Gao expresada
enE. coli de interaccionar con subunidades HXes dependiente de
lacoexpresión de una N-miristoil-transferasa en las
mismascélulas,lo cual sugiere que esta modificación
post-traduccional es importante para dicha interacción (Linder et
al, 1990 y 1991).
Todas las subunidades x son modificadas por el clivaje de
lostres aminoácidos del extremo carboxi-terminal adjacente
acisteína y por la carboximetilación e isoprenilación de
dichacisteína (Clark et al, 1988; Gutierrez , 1989). El isotipo
GX;(que se encuentra asociado a fotoreceptores) forma complejos
inactivos con B si no esta isoprenilado (Fukada et al, 1990) lo
-
INTRODUCCION - 27
cual indica que dicha modificación post-traduccional podría
estarinvolucrada en la regulación de la transducción de la
señal.
Subunidades E extraídas de cerebro también resultaron
serisopreniladas aunque por una entidad de 20 carbonos en vez de
15comoen el caso anterior. Tal adicion sería la responsable
delanclado de la subunidad X a la membranacelular (Yamane et
al,1990; Mumbyet al, 1990).
ReceptorNH2
EXTRACELLULAR :‘j':-:—:-:-:-:-:-:-:-:———
/ :ï:Í:Í:ï:ï:ï:ï:ï:ï:ï:ï:
/ ZZZZZZÍ:.':Í:Í:Í:Í:Í:I:Í
/ :ï:Í:Í:Í:ï:f:f:f:f:f:f:
x ïiïifzïz}:f:}:ff:f:f:}
INTRACELLULAR c=o ‘cl:=o s' 132¿1¿2¿2¿I¿Z¿2:2:2;2¿2
Effector
G Protein
-
INTRODUCCION - 28
Se han identificado mas de 100 receptores acoplados a proteinas
Gen mamíferos, si se incluyen diferentes receptores que unen
almismo ligando. El número de estos aumenta rapidamente gracias
alas técnicas de clonado molecular (Dohlman et al. 1991 hacen
unarevisión interesante).
Entre ellos se cuentan los receptores a y B-adrenérgicos. BI y
Baestimulan a la enzima adenilil ciclasa via Gas mientras que
elreceptor a2 la inhibe por medio de una Gai. El receptor
a1participa de la transducción de señales a fosfolipasa C
(Lefkowitz y Caron, 1988). Tambien estan acoplados a proteinas
G,receptores dopaminérgicos, muscarínicos y los receptores para
laluz ubicados en las células de retina: rodopsina en bastones ylas
opsinas para los tres colores primarios en conos.
El hecho de que exista una conservación en la estructura de
lasproteinas G hace que no sea sorprendente el hecho de que
susreceptores tambien pertenezcan a una familia con
caracteristicascomunes (Bourne y De Franco, 1989): Una cadena
polipeptídica queatraviesa 7 veces la membranaplasmática, con su
extremo aminoterminal en el lado extracelular y su extremo
carboxi-terminaldel lado citoplasmático (Figura 9).
El extremo carboxilo terminal tiene varios residuos
susceptiblesde ser fosforilados por quinasas especificas,
produciendo unadesensibilización del receptor.
Las vueltas o "loops" que conectan cada paso intermembrana con
elsiguiente del lado extracelular, participan de la interacción
deestos receptores con el ligando. La unión del ligando provoca
enel receptor un cambio conformacional, que trasladado al otro
ladode la membrana permite la transducción del mensaje. El
séptimodominio hidrofóbico de los receptores adrenérgicos a2 y Bz
es
-
INTRODUCCION - 29
determinante en la especificidad de unión a agonistas
yantagonistas.
Oligosacsharidel
I l AAA ML!+
Extracellular
mm e 1 WWWWM f y 1 HMHMMM
Cytosolicside
COO‘
Las opsinas llevan unido un cromóforo llamado 11-015 retinal
elcual se encuentra paralelo a la membranaplasmática, en un
bolsillo formado por las regiones transmembranosas del receptor.
Esprobable que los ligandos para los otros receptores de la
familiase unan a bolsillos de unión en membranasimilares. Varios de
losprimeros cinco dominios hidrofóbicos contribuirían a esa
unión.Del lado interno los receptores transmiten la señal a
proteínas Gque la llevaran hasta los efectores.
Construyendoquimeras entrereceptores de los tipos a2 y Dz se ha
visto que la especificidadpara el acople a las proteinas G está
dada por las zonas transmembranaV y VI y por el tercer "loop"
citoplasmático (Kobilka etal, 1988).
-
INTRODUCCION - 30 —
El .].] c. 1
El estudio de la transferencia de información en la
superficiecelular a segundos mensajeros citoplasmáticos fué
reportado porprimera vez en 1956 (Rall et al, 1956). En 1962 se
reportó la existencia de una adenilil ciclasa, enzima capaz de
convertir ATPen AMPC, molécula que actúa como segundo mensajero en
larespuesta a muchas hormonas y neurotransmisores (Sutherland
yRall, 1957).
ATP AMPddkowAMP)
Dadoque la hormona que llega a la célula no debe entrar al
interiorv para producir su efecto, se propuso la existencia de
unamolécula receptora en la membrana y, además, de un
elementotransductor ubicado entre el receptor hormonal o
discriminador yel efector o amplificador (Rodbell et al,
1971a)(Figura 11).
V \
I
\ \ KATPl
DISCRIMI- 'TRANSDUCTOR ’ AMPLIFICADOR
\ l\ ‘ AMPC\ X
}—————MEMBRANAPLASMATICA———-|
-
INTRODUCCION — 31
El requerimiento de GTP para obtener estimulación de
adenililciclasa por glucagon en membranas de higado (Rodbell et
al,1971b), fué la primera evidencia del papel regulatorio de
esenucleótido en sistemas de transducción de señales. Luego se
vioque análogos no hidrolizables de GTP podian mantener la
activación (Londos et al, 1974). Trabajando con eritrocitos depavo,
Cassel y Selinger mostraron que la hidrólisis del GTPsirvepara
terminar con la activación de adenilil ciclasa, adjudicandola
reactivación por medio del complejo hormona-receptor a lasalida del
GDPresultante (Cassel y Selinger, 1978). Estas observaciones
llevaron a proponer el modelodel ciclo regulatorio delGTP (Figura
12) en el cual E es la enzima efectora adenililciclasa.
GTP External Stimulus GDF.
lnactive GGDP GG -E Active
PI
El alto interés en caracterizar el sistema de proteínas G,
transductoras de señales, hizo que paradójicamente la propia
enzimablanco fuese la que mas se tardó en caracterizar. En la
décadadel 80 se purificó adenilil ciclasa partiendo de
distintostejidos (miocardio de conejo, cerebro de rata, cerebro
bovino ohigado porcino), por solubilización de membranas y pasaje
porcolumnas de afinidad como forskolina-sefarosa o
calmodulinasefarosa (Pfeuffer y Metzger, 1982; Wescott et al, 1979;
Smigel,
-
INTRODUCCION — 32 —
1986). Tanto la adenilil ciclasa de cerebro (sensible a
calmodulina) como la de higado (insensible a calmodulina),
parecenmigrar en geles de SDScomo proteinas de 120-130 kDa., dato
confirmado por experimentos de “binding” de ATPradioactivo.
Pordeglicosilación enzimática de la enzima de higado se ha visto
quecontiene azúcares unidos a un esqueleto de proteína de 110
kDa.
Por fin, rastreando una biblioteca de cDNAde cerebro bovino,
selogró clonar el correspondiente a una adenilil ciclasa
(Kuprinski
1989). La lapredice una pasos
et al, secuencia de 1134 aminoacidos resultante detraducción
estructura protéica con variostransmembrana (Figura 13).
xevavLssExtracellularspace
0
5 en R A °vL A n
Lc EG o A
n E e ene R PAF E o 9 GAk F s G ”E A E eLC e G
E P A GGG Cytoplasm
En la figura se ve como las dos mitades, cada una de ellas
conseis zonas hidrofóbicas, están unidas por un largo
dominiocitoplasmático el cual podria estar involucrado en la unión
alnucleótido y en la catálisis de la reacción. Existen zonas
con
-
INTRODUCCION - 33
senso para la fosforilación por PKC y PKA y su
similitudtopológica con algunas proteínas transportadoras o canales
iónicos ha llevado a postular su participación en la exportación
deAMPC.
Las adenilil ciciasas que estan acopladas a proteinas G
soncaracteristicas de eucariotes superiores y utilizan
ATP-Mn++oATP-Mg++comosustrato, a diferencia de las adeninlil
ciclasas debacterias y algunos eucariotes inferiores, que no tienen
componente regulatorio sino solo el catalítico y presentan
actividadsolo con ATP-Mn++.
La Figura 14 muestra los pasos que siguen desde la llegada de
unaseñal hormonalhasta la activación de la adenilil ciclasa.
___r—‘{4 /7/Capila/// Hormona//G,“ (au /
Membrana celular
Proteína receptora )Adenilato (b)de membrana Proteína 'G‘
ciclasa
(inactiva)
Proteína Gs
-
INTRODUCCION - 34
Citoplasma
El CAMP activa aciertasproteínasen /el interior de la célula
La Figura 15 muestra como el AMPcresultante de dicha
activaciónpuede actuar sobre otros componentes celulares comoen
estela quinasa de proteínas dependiente de AMPC.
Proteínaquinasa inactiva\
VProteínaquinasa activa
caso
-
INTRODUCCION - 35 —
La enzima adenilil ciclasa se encuentra distribuida entre
losseres vivos en un amplio rango evolutivo como muestra
lasiguiente tabla:
bacterias Escherichia coli (Aiba et 81.1984)Bordetella pertussis
(Ladant, D.,1988)Anabaena sp. (Bianchini et al, 1990)
hongos Dictyostellium discoideum (Kachatrian et
a1,1987)Saccharomyces cerevisiae (Kataoka et a1,1985)Neurospora
crassa (Flawiá et al,1872ayb)MUoorrouxii (Cantore et al,1982)
protozoos Trypanosomacruzi (Torruella et al,1986)
plantas Médicagosativa (Carricarte et 31,1988)
mamíferos B. taurushígado (Pohl et al,1969)cerebro (Coussen et
81,1985)eritrocitos (Davorenet a1,1963)
El gráfico (Figura 16) muestra en sus distintas ramas los
componentes caracterizados hasta el momentoen distintos
organismos.
-
INTRODUCCION - 36
CGR CGR CGR CGR CGR CGR ? C CG C CAH S "(PHLES MAMIFEROS
ANFISIOS PECES INVERÏEBRADCIS PLANVAS ALGAS HONGOS BACH ¡HAS
Pnorozoos n c
l HONGOSrussuoos
Joa . uo‘a
REPHLESPRIMITIVOS
NETAZOOS
EUCARIOTESPRIHH’IVOS
PROCARIDÏESPRINIÏIVDS
¡son - 10‘
C,Gy R significan componentecatalitico, regulatorio y
receptorrespectivamente.
En eucariotes inferiores la enzimaadenilil ciclasa
presentacaracterísticas intermedias, en algunos casos se ha
verificado suasociación a GTPasas y en otros no.
En estos organismos se ha visto que variaciones en los niveles
deAMPc están asociados a procesos tales como conidiación,elongación
de hifas, agregación celular, germinación de esporas,etc. (ver
tambien PROTEINAS G EN DIVERSOS ORGANISMOS).
En Mucor rouxii el nivel de AMPCaumenta cuando se alarga eltubo
germinal (Cantore et al, 1980) y cuando se pasa de unaatmósfera
anaeróbica a una aeróbica, se produce una transición delevadura a
forma filamentosa con disminución de los niveles deAMPc(Paveto et
al, 1975).
Los estudios en Néurospora crassa muestran que, la
adenililciclasa esta unida a membranasen forma débil, depende de
ATP
-
INTRODUCCION - 37
Mn++, no responde a GTP (Flawiá y Torres. 1972a; Flawiá y
Torres,1972b; Flawiá y Torres, 19720), y es activable por
Ca++—calmodulina (Reig et al, 1984). Experimentos de reconstitución
desistemas heterólogos indican que además de las
caracteristicasmencionadas, la ciclasa de N. crassa es capaz de
interactuar confactores regulatorios. Acoplandola in vitro a
rodopsina y transducina (receptor y proteína G del sistema de
transducción visual)se vio que es capaz de convertir un estímulo
lumínico en unaumento en la producción de AMPc(Muschietti et al,
1989).
Otros eucariotas inferiores. comoSaccharomycescereviciae y
Dictiostellum discoideum, tambien tienen actividad de
adenililciclasa acoplada a proteinas G (ver PROTEINASG EN
DIVERSOSORGANISMOS).
QanalesJánicos
La caracterización de los canales iónicos transmembrana
hademostrado que no están solo regulados por diferencias de
potencial sino que también lo estan bioquímicamente. La
modulacióndependiente del tiempo (horas) de la actividad de los
canales,está dada por la sintesis y degradación de las proteínas
que losconforman, mientras que las modificaciones rápidas (rango
desegundos a minutos) podrian darse por los siguientes
procesos(Herscheler et al, 1990):
—Interacción de moléculas señalizadoras intracelulares con los
canales.
—Fosforilación de las proteínas del canalestimulada por
mensajeros intracelulares.
Interacción de los canales iónicos conproteínas G.
E1 método experimental mas usado para este sistema es la
técnicade "patch-Clamp" (Hammil et al, 1981) la cual provee un modo
conveniente para la medición de corrientes transmembrana. Por
estemedio se puede estudiar el transporte a través de una
pequeña
-
INTRODUCCION - 38
porción de membrana ( patch ) que cubre la entrada a una
micropipeta. Agregando diferentes compuestos dentro de la pipeta
odentro del recipiente en el cual esta se sumerge, es
posiblesometer a uno u otro lado de las membranas a distintas
condiciones químicas.
Existen diversos estudios que ligan a proteínas G del tipo Gi,
Goy Gk en el control de la actividad de canales de Ca++ y K+, delos
cuales existen interesantes revisiones (Herscheler et al,1990;
Yatani et al, 1990; Rane y Dunlap, 1990).WLa enzima fosfolipasa C
(PLC) específica de fosfatidilinositol(PI) fué descripta por vez
primera en los trabajos de Dawson yKemp (Dawson, 1959; Kempet al,
1961) y se la encuentra tanto enprocariotes comoen eucariotes
(Shukla, 1982).
La ocupación de ciertos receptores celulares, comolos de
factores de crecimiento o neurotransmisores, por sus agonistas
esseguida por activacion de PLC, la cual cliva a los
diferentesfosfatidilinositoles para dar inositolfosfatos y
1,2diacilglicerol. Este último activa a la quinasa de proteinas C
lacual interviene en distintas reacciones de fosforilación. Los
inositolfosfatos elevan la concentración de Ca++intracelular loque
facilita una variedad de reacciones.
Todas las formas de PLC descriptas hasta hoy utilizan
comosustratos fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol
4-fosfato(PIP) y fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) (Wilson et
al,1984; Ryu et al, 1978b; Rebecchi y Rosen. 1987b) los cuales
compiten por la enzima. La actividad de PLCen células de mamíferose
encuentra principalmente en el citoplasma aunque existenreportes de
PLCasociada a fracciones particuladas en cerebro(Lapetina y
Mitchell, 1973; Lee et al, 1987). Existen múltiplesformas
descriptas de PLC. La mayoria de los tejidos contienenvarias formas
que se pueden distinguir por cromatografía. Los
-
INTRODUCCION — 39 —
distintos pesos moleculares reportados incluyen variaciones
dentro de un mismotipo de tejido proveniente de distintas
especies.Si a esto se suma el hecho de que la nomenclatura es
ambigua enlos distintos reportes se entiende que hasta el
momentosea imposible determinar cuantas PLCse conocen (Deckminet
al, 1990).
Hasta el momentola actividad de las enzimas PLCse ha visto
influida por: [Ca++], pH, entorno de lípidos y proteínas G.
El aumento de [Ca++], favorece la utilización de PI
comosustratoel cual no es utilizado en ausencia de Ca++, mientras
que algunasformas de PLCpueden hidrolizar PIP y PIPz en esas
condiciones(Wilson et al, 1984). El pH óptimo es 5,2 a 5,5 pero en
presenciade deoxicolato aumenta a 7.
La participación de proteinas G en la regulación de la
actividadde PLCya ha sido tratada en esta Introducción (ver ” aq“)
ypuede verse en la Figura 17.
Espacioextracelular
Membranaplasmática
0“Io-cono'moooeoo
fá‘á‘á‘fi’®
C
ll‘
Citosol
Retr'culoendoplásmico
C3®NWW> Respuestacelular P_l
CanaldeCa® .ï
-
INTRODUCCION - 40 —
Resta agregar que podría existir un mecanismode inhibición
dePLCmediada por proteínas-G. Dopamina previene la formación
deinositolfosfatos en células pituitarias estimuladas
porangiotensina II (Enjalbert et al, 1986). Si las células
sonpreviamente tratadas con toxina pertussis la inhibición se
bloquea (Journot et al, 1987). Este hecho sumadoa la descripción
deuna aq estimulatoria de 42 kDa. ya mencionada (Pang et a1,
1990)podría completar el paralelismo entre los sistemas de
regulaciónde PLCy adenilil ciclasa.
H i l . ..
El mecanismo de visión comienza con la entrada de luz por
laabertura del ojo. El haz de rayos luminicos debe atravesar
lacórnea y el cristalino, verdaderas lentes biológicas que
proyectan la imagen sobre la retina.
La transducción de señales luminicas se desarrolla en las
célulasfotorreceptoras del oJo que están ubicadas precisamente en
la superficie de la retina. Cada una de ellas, recibe información
deun punto de la imágen. La integración en el cerebro, de la
información aportada por cada célula constituye lo que
nosotrospercibimos.
Estas células son:
— bastones, que forman imágenes en blanco ynegro bajo luz
débil.
conos, los cuales son responsables de lavisión en colores.
-
INTRODUCCION
La Figura 18 muestra la estructura de una célula bastón.
Outersegment
Innersegment
NF
Discs
Plasmamembrane
Cytoplasmicspace
lntradiscalspace
Cilium
Mitochondrion
Golgiapparatus
Endoplasmicreticulum
Nucleus
Synapticterminal
41
-
INTRODUCCION - 42
El segmento externo de los bastones se encuentra organizado
endiscos. En las membranas que delimitan los discos se produce
larecepción de la señal. Cerca de 2000 discos se apilan unos
sobreotros en el interior de los bastones y están
exteriormenterodeados por la membranaplasmática celular.
La membranacelular externa separa soluciones con distintas
concentraciones de iones: Mayorconcentración de K+en el citoplasmay
mayor concentración de Na+en el medio externo. Este gradientees
mantenido en oscuridad por una "bomba Na+/K+" dependiente deenrgia.
La membranadel fotoreceptor es permeable al K+, por lotanto este
tiende a salir al medio extracelular generando unpotencial interno
negativo en la célula. Tambien, en oscuridad,el fotoreceptor
presenta una apreciable permeabilidad al ión Na+,a través de los
canales de Na+, ubicados en la membrana celular(Cook et al, 1989),
cuya apertura es dependiente de GMPc.
Los fotones que llegan hasta la retina son registrados por
unreceptor con siete pasos de membrana (ver la sección de
receptores). llamado rodopsina. ubicado en la membranade los
discos.Dada la imposibilidad de los fotones de difundir en el medio
comolo hacen las hormonas que interactúan con los receptores
(porejemplo, B-adrenérgicos), la concentración de rodopsina en
membranas es 1000 veces mayor a la de aquellos. En oscuridad
elcromóforo permanece en su forma inactiva 11-cis-retinal y
latransducina se encuentra como trímero at(GDP)BXt.
Por acción de la luz el cromóforo pasa a su forma "todo-trans"
locual induce cambios conformacionales en la rodopsina; el mas
importante de ellos permite exponer el sitio de interacción con
latransducina (Fung, 1983). Comoresultado de dicha interacción,
elGDPes intercambiado por GTP y el complejo se disocia en rodopsina
activada (que permanece en la membranadel disco) y at(GTP)y Büt que
difunden hacia el citoplasma. at(GTP) activa entonces ala
fosfodiesterasa de GMPc(PDE-GMPc). Dicho fenómeno mas que
unaactivación es un bloqueo de una inhibición, dado que at(GTP)
interactúa con el inhibidor de la PDE-GMPc,dejando a la enzimalibre
(Deterre et al, 1986) para hidrolizar el GMPc.
-
INTRODUCCION - 43 —
Así, por fotoexcitación de una sola molécula de rodopsina,
luegode 0,2 seg. se produce la hidrólisis de 105 moléculas de GMPc
yeso redunda en el cierre de todos los canales de Na+,dependientes
de GMPC,en un entorno de 5pm.
La interrupción del flujo de iónes produce, entonces, una
hiperpolarización de membrana suficiente para generar un
impulsoeléctrico que es transmitido a las neuronas del aparato
visual.
La integración de las señales producidas en cada neurona por
elmecanismoaqui descripto resulta en la formación de una imágenen
el cerebro.
El sistema de transducción de señales mediado por proteínas
G,presenta caracteristicas altamente versátiles, tal es asi que
elnúmerode procesos caracterizados que utilizan dicha via
paratransducir información a través de la membranaplasmática
aumentadia a dia. Lo que sigue es una breve reseña de algunos de
ellos.
—En 1983 se sugirió que la hormona insulina podría ejercer
almenos parte de su acción interactuando con el sistema deproteínas
G (Heyworth et al, 1983; Huoslay y Heyworth, 1983).Desde entonces
se ha acumulado bastante información apoyando esateoría pero aun
resta saber si existe una hipotética Ginaespecífica de insulina o
si la acción se produce simplemente pormodificación de proteínas G
ya conocidas (Houslay. 1990).
—Los caminos de transducción asociados a factores de
crecimientopodrian involucrar uno o una red de caminos G. Una
reseña de loconocido ha sido publicada por J. Pouyssegur
(Pouyssegur, 1990).
—La idea de que el GTPpodría ser un mediador intracelular
desecreción nació de frustraciones en probar un mecanismo
demovilización de Ca++ con hidrólisis de fosfatidilinositol
(PI)
-
INTRODUCCION — 44
(Gomperts, 1983). Desde entonces se han conocido dos
actividadesdependientes de GTPen el proceso de exocitosis. A la que
actúaen estadios tempranos del proceso se la ha llamado Gp y a la
queactúa mas tardíamente se la ha llamado Ge (Gomperts et al,
1986).Existen ahora evidencias de que proteínas G están
involucradas enprocesos de exocitosis estimulados y constitutivos.
tanto encélulas de mamífero como en levaduras (MelanCon et al,
1987; Salminen y Novick, 1987)
—El péptido somatostatina inhibe crecimiento celular y
estimulala actividad de 1a enzima fosfotirosin-fosfatasa.
Recientementese ha mostrado la participación de una proteína G
mediando eseproceso de activación (Pan et al. 1992).
La reconstitución de sistemas heterólogos constituye
básicamentela formación de un nuevo sistema de transducción de
señales. Esenuevo sistema se forma por el reemplazo o agregado de
un nuevocomponente en una determinada via.
Los componentes mas comunmentereemplazados sonzlas proteínas
receptoras, las proteínas G o las enzimas efectoras. Lo que se
obtiene son sistemas mixtos en los cuales se conserva el
mecanismode acción a pesar de que se genera una respuesta final,
diferentea la fisiológica, frente a un mismoestimulo inicial.
Las técicas mas utilizadas para lograr dicho fin son:
— fusión de membranas puras mediada porpolietilenglicol 6000; se
produce la mezcla de las proteínas deambas membranaspudiéndose
generar nuevos sistemas heterólogos.
- electrofusión de células.- extracción con detergente de
proteínas de
membranay posterior adición a otras membranas.- armadode
vesículas fosfolipidicas utilizando
los componentes purificados y generando el sistema deseado.
-
INTRODUCCION - 45
Mediante el uso de dichos sistemas se ha logrado:
- reconstituir el sistema de receptor Badrenérgico, proteína,
Gay adenilil ciclasa en vesículas fosfolipidicas, a partir de sus
constituyentes purificados, y lograrreproducir fielmente las
respuestas de la enzima, obtenidasnormalmente en su entorno
fisiológico (membrana plasmática)(Cerione et al. 1984).
- rearmar en vesículas fosfolipídicas las interacciones entre el
receptor B-adrenérgico, rodopsina, proteinasGa, Gi y Gt. Utilizando
esta técnica se comenzóa evidenciar que,a pesar de que actúen todas
de igual manera, no son. lasproteínas G, intercambiables para
cualquier sistema; por ejemplo,transducina y Ga interaccionan de
manera muydébil con el receptor B-adrenérgico y rodopsina,
respectivamente (Cerione et al,1985). '
- diferenciar funcionalmente las subunidades 8%de Gi y 53 de
transducina, sugiriendo un potencial papelregulatorio a las
subunidades X (Cerione et al, 1987).
- reconstituir funcionalmente un sistema en elque receptores
para opiodes interactúan con Gi y Go de cerebrobovino (Ueda et al,
1988) y en el que receptores muscarinicosinteraccionan con Go
(Florio et al. 1989).
La información aqui citada fue obtenida purificando y
utilizandoproteínas del mismotejido (es decir, que interactúan
fisiológicamente), o a lo sumode diferentes tejidos pero siempre
dentrodel mismo ser vivo.
Unanálisis similar ha permitido hecer inferencias sobre la
conservación evolutiva de los constituyentes
protéicos.Reconstituyendo sistemas en los cuales células animales
proveianlas moléculas efectoras y transductoras y las células
deeucariotes inferiores (Nburospora crassa o Trypanosonacruzi),
lamoléculaefectora (adenilil ciclasa), se logró ver interacción
deestas ciclasas con componentesregulatorios de vertebrados.
Unaadenilil ciclasa de N. crassa (exclusivamente dependiente de
ATPMn2+para formar AMPcíclico) funcionó en presencia de
ATP-Mg2+y
-
“"73
mostróagonistas B—adrenérgicos(Flawiá et al,
activación
‘ EMBRANAS. ..cruz¡o N.crussa
'A}
CAMP
-
INTRODUCCION — 47
Mastarde se vió por electrofusión de células que T. cruzi
escapaz de proveer Gas a un sistema desprovisto de ese
componentecomoes el de las células de la variante cyc- del linfoma
S49(Eisenschlos et al, 1986b).WWWEn organismos multicelulares
simples se han encontrado variasproteinas G que se encuentran
claramente relacionadas con lasdescriptas en mamíferos (Simon et
al. 1991).
En Drosophila se han caracterizado a nivel molecular varios
segmentos de DNAque codifican para proteínas G. Se ha encontradoque
sus secuencias son similares a las subunidades a de Go, Gi,Ga, Gq y
G12. Ademas se ha reportado la presencia de un gen quecodifica para
una subunidad B (Yarfitz et al, 1988). Una proteínaGao-like de 40
kDa. con 87%de identidad con la de vertebrados esabundante en las
cabezas de Drosophila. Su expresión en neuronasy a menornivel en
ojos sugiere su participación en la transmisión del impulso
nervioso (Thambi et al. 1989). Tambien se haencontrado una proteína
Gas-like que guarda una 71%de similitudcon la de vaca (Quan et al,
1989). El producto del gen DGal esidéntico en un 78% a la proteina
Gail bovina (Provost et al,1988). Varias evidencias entre las que
se destaca el hecho de quela mala regulación de los niveles de
AMPcprovoca defectos en eldesarrollo de Drosophila (Bellen et al.
1987), asi comosu expresión principal en embriones y pupas, ha
llevado a sus descubridores a destacar la importancia que este gen
podria tener enestadios tempranos del crecimiento de estas moscas.
Un gen importante durante el proceso de gastrulación es el cta.
Este gen hasido clonado y secuenciado y ha resultado codificar para
unaproteína Ga-like (Parks et al, 1991).
En Cbenorhabditis elegans se han identificado por
clonadomolecular varias proteinas Ga. Algunas de ellas han
sidoidentificadas como homólogos de proteinas G de mamíferos, una
deellas es 87%idéntica en secuencia aminoacídica a otras Gao
con
-
INTRODUCCION — 48
ocidas. Otras dos han resultado ser 48%iguales entre sí a
nivelde aminoácidos pero no han podido ser clasificadas en alguna
delas subfamilias de proteinas G conocidas por lo que resultan
serexclusivas de este nematodo (Lochrie et al, 1991).
En plantas tambien hay reportes de proteinas G. Un gen para
subunidad a (GPAI)ha sido reportado en Arabidopsis thaliana, elcual
codifica para una proteina de 44,5 kDa. con un 73% dehomologia con
Gai de mamíferos (Ma et al, 1990). En Medicagosativa existe un
sistema de proteinas G, de las cuales hastaahora han sido
detectadas entidades a y B por medios bioquímicose inmunológicos.
Dicho sistema estaria relacionado con la transducción de señales
lumínicas (Muschietti et al. enviado a publicar).
Dictyostelljum discoideum pasa durante su ciclo de vida por
unaserie de estadios morfologicamentediferentes. Bajo condicionesen
las cuales el alimento es escaso, amebas libres
unicelularescomienzan a agruparse en un cuerpo multinucleado que
resulta de1a fusión de 105 individuos. Este proceso espontáneo se
producepor la unión de AMPca receptores ubicados en la membrana
celular(Devreotes P., 1989). A su vez cada célula es capaz de
sintetizary secretar AMPcen respuesta a esa estimulación, lo que
resultaen la formación de centros de agregación. Dichos centros
derivanen el agrupamiento ya mencionado. Por último, este se
transformaen un cuerpo fructífero que libera formas
unicelulares.
Tres serían los procesos desencadenados por las señales
externastransducidas al interior celular: quimiotaxis, agregación
ydiferenciación a esporas. Los caminos activados tambien
seriantres, los cuales involucran: adenilil y guanilil ciclasas y
fosfolipasa C. Estos caminos se conectarian entre si y ademas
notodos serían escenciales para cada proceso dado que mutantes
incapaces de activar adenilil ciclasa no pueden formar
agregadospero si moverse quimiotacticamente (Firtel, R.A.,
1991).
Durante los últimos tres años se han clonado genes para
cuatroreceptores de AMPcy seis proteínas Ga en Dictyostelium, cada
unode ellos con un patrón de expresión distinto durante el
desar
-
INTRODUCCION - 49
rollo lo que indica que funcionan en distintos pasos del ciclo
devida (Pupillo et al, 1989; Hadwiger et al, in press; Saxe et
al,1991a; Saxe et al, 1991b). La comparación de las secuencias
delas Ga muestra que la identidad es baja excepto en las
zonasaltamente conservadas entre todas las Ga conocidas. Se
hapropuesto que una de ellas (Gaz ligada al receptor cARl)
activafosfolipasa C y posiblemente guanilil ciclasa, mientras que
inVivoes indispensable para la activación de adenilil
ciclasa,aunque no se conoce si se acopla a esta enzima
directamente;otras Ga podrian cumplir esta función con la
colaboración, poruna via indirecta, de Gaz. Por otro lado Ga4 sería
esencial en elproceso de formación de esporas (Hadwiger J., 1991).
Las funciones de las otras subunidades Ga no están aun determinadas
y seestan realizando experimentos para conocerlas. Pese a todo lo
queaun resta por estudiar sobre la fisiología de la
diferenciaciónen este organismo, ya no caben dudas sobre la
importancia delsistema de transducción de señales mediado por
proteinas G en eldesarrollo de Dictyostellium díscoídeum.
Saccharomycescerevisiae presenta un ciclo de vida con
alternancia de fases haploide y diploide. En la fase haploide se
puedendistinguir dos grupos de conjugación llamados a y a. Cada uno
deellos produce un factor que lleva el mismonombre y posee
unreceptor para el opuesto. Dicha caracteristica permite que
individuos de grupos opuestos conjuguen entre si para dar inicio
ala fase diploide a/a. Los receptores mencionadosson codificadospor
los genes STEZ(factor a) y STE3 (factor a) (Jenness et al,1983;
Hagen et al, 1986; Blumer et al, 1988). El estudio de laestructura
de dichos receptores ha mostrado que poseen 7 dominiosque
atraviesan la membranaplasmática, tal comotodos los receptores
acoplados a proteinas G.
Algunos genes codificando para polipeptidos Ga-like han
sidoreportados en levaduras. GPAlcorresponde a una proteina de
54kDa. (Nakafuku et al, 1987), la cual es específica del
estadiohaploide y esta involucrada en el camino de transducción de
lasseñales de feromonas a y a (Miyajima et al. 1987). Un
segundogen, GPA2, para una proteína de 50.5 kDa. (Nakafuku et al.
1988)
-
INTRODUCCION — 50
esta relacionado con la regulación de los niveles de AMPc.
El sistema de transducción de señales relacionado con
lasensibilidad a feromonas en Saccharomycescerevisiae no solo
contiene proteínas análogas a las Ga, sino que los productos de
losgenes STE 4 y STE 18 de estas levaduras son proteínas
estructuralmente similares a B y X respectivamente. Estos últimos
dosproductos tendrian una influencia positiva en la respuesta
deconjugación ya que mutantes defectivos en cualquiera de ellos
sonincapaces de conjugar o de dar respuesta alguna a las
feromonas(Whiteway et a1, 1989). Por otro lado la falta de
subunidades aresulta en una respuesta constitutiva que deriva en un
arrestodel ciclo celular (Dietzel y Kurjan, 1987). Si lo analogamos
alos sistemas de mamíferos, en este caso la activación del receptor
de feromonas implicaría disociación del trimero y activaciónpor 63
de una enzima aún desconocida. En este caso la subunidad aactuaria
comomodulador negativo a diferencia de la gran mayoríade los otros
sistemas regulados por proteinas G descriptos, enlos cuales es la
subunidad a la que interacciona con el efector.Sea cual sea la
entidad que interacciona con el receptor, estesistema se asemeja al
de Dictyostelium en el sentido que unheterotrímero G participa de
pasos decisivos entre las distintosestadios del ciclo de vida en un
eucariote inferior.
Un trabajo recientemente publicado muestra el clonado del
genCAGIen el hongo Cándjda albicans 'utilizando una sonda de
SCGl(un alelo de GAPl). Dicho clon contiene un marco de
lecturaabierto de 429 aminoacidos con identidad del 65%con la
proteínade Saccharomyces cerevisiae (Sadhu et al, 1992). La
disrupción deese gen no provoca un fenotipo detectable. Sin
embargo, en Sabcharomyces es capaz de revertir defectos en las
funciones de conjugación. Aun no se conoce una forma sexual de
Candida albicans,pero está descripto un cambio en la forma de
crecimiento que pasade células libres que se reproducen por brotes
(como laslevaduras) a hifas que forman un micelio. Dicho cambio se
produceen respuesta a una serie diversa de factores ambientales, y
sibien estos no han sido caracterizados todavía no es osado
pensarque en este hongo debe existir un sistema de transducción de
esas
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INTRODUCCION — 51
señales que dispare el cambio en el desarrollo indicado.
Futurosexperimentos nos dirán si el producto de CAGlparticipa o no
deese proceso .
En Tïwpanosomacruzi también se han encontrado proteinas G (Verel
capitulo correspondiente de esta introducción y los resultadosde
esta tesis).WLos genes ras fueron identificados por primera vez
como los oncogenes responsables de los sarcomas virales murinos
Harvey yKirstein (Ha-MSV y Ki-MSV). Desde entonces se han
encontradogenes homólogos en una variedad de organismos y se ha
visto suresponsabilidad en ciertos tumores humanos (Barbacid, M.,
1987).Su capacidad de unir e hidrolizar GTPasí comosu asociación
conmembranas sugiere la participación de las proteinas RAS
enprocesos de transducción de señales.
Los genes ras de mamíferos codifican para proteínas de 21
kDa.,las cuales tienen una alta homología. Sus primeros 85 aa
sonidénticos y los siguientes 80 se parecen en un 85% (Mc
Cormick,F., 1989). Estos 165 aa forman la zona de unión al
nucleótido dela cual se conoce su estructura cristalina (de Vos et
al, 1988).Entre los aa 165 y 185 las secuencias difieren, lo cual
indicaque cada una de estas proteínas tiene una función exclusiva.
Enlos extremos carboxilo terminales existe un residuo de
cisteínasusceptible de ser poli-isoprenilado (Hancock, et al,
1989).Dicha modificación es lo que le permite asociarse a
membranas.
El termino "genes ras (rat sarcoma virus)" ha sido extendido
atoda una familia de genes que codifican para proteínas de un
pesomolecular entre 21 y 26 kDa. entre los cuales se encuentran
loscorrespondientes a las subfamilias ras, ¡fio y rab.
Pese a los muchos datos bioquímicos, biológicos y
estructurales
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INTRODUCCION — 52
sobre las p21 de mamíferos que se han venido acumulando en
estosaños, todavía no se conoce cual es su función exacta,
aunquevarias lineas de evidencia la relacionan con
proliferacióncelular. Por microinvección de anticuerpos
neutralizantes contraras en células en cultivo se ha visto que se
bloquean varioscaminos de transducción de señales (Hall, 1990). El
mismo autorseñala una serie de experimentos que vinculan a ras con
la transducción de señales iniciadas por factores de crecimiento,
aunqueno queda claro en que consiste esa participación.
En donde se conoce un poco mas sobre las funciones de ras es
enSaccharomyces cerevisiae. Dos genes homólogos Rasl y
Rasz(codificando para proteínas de peso molecular 45 kDa.) han
sidoencontrados en estas levaduras. RASZestimula la actividad
deadenilil ciclasa del modoque lo hace Gas en mamíferos (Gibbs
etal, 1989). Pese a la diferencia de tamaño, existe ciertahomología
a nivel funcional dado que ras de mamíferos o viralespueden
reemplazar a los de levaduras en sus funciones esencialesy una
versión de RASl con una mutación oncogénica (RASlVal-9)transforma
células de mamífero (DeFeo-Jones et al, 1985).
En Neurospora crassa se ha encontrado y clonado un gen
quecodifica para una proteína de un peso molecular de 24
kDa(Altschuler et al, 1990) que contiene:
las cuatro secuencias conservadas para la unióncon GTP.
— el sitio de unión para el anticuerponeutralizante Yl3-259.
—los residuos Gly17, Glle, Ala34 y Gln66 característicos de las
posiciones 12, 13, 59 y 61 de las proteínas Hras-l normales de
humanos cuyos cambios eliminan la actividadGTPasa.
La reunión de todas estas características determinó la
incorporación de “NC-ras" como un nuevo miembro de la familia
ras.
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INTRODUCCION — 53
En la búsqueda de candidatos para ser el efector de ras, fue
encontrada una proteina de 125 kDa. capaz de estimular la
actividadGTP-asa de Ras p21 en extractos crudos de ovocitos de
XGnopus(Trahey y McCormick, 1987). Bautizada GAP(Proteina
activadorade la GTPasa) su actividad fue detectada en muchos
tejidos ylíneas celulares. GAPes la única proteína bien
caracterizada queinteractúa en forma directa y especifica con ras
p21. Se hapropuesto un rol comoefector asociado a ras p21 basándose
en lossiguientes hechos:
- Ras p21 se une a GAPde un modo GTP-dependiente(Vogel et al,
1988).
—GAPinteractúa con el dominio de Ras p21 que secree sería el
encargado de unirse con el efector (Schlichting etal, 1990).
—Mutantes de Ras incapaces de transformar no seunen a GAP
- Mutantes de Ras trasformantes pueden unir GAP(Cales et al,
1988).
—GAP interactúa con todos las p21 conocidas (McCormick, F.,
1989).
NORMAL TRANSFORMADO
SEÑALMITOGENICA
' inactivo c,pr
lia! GDP IiiGrasa GTPGAP-depend. 2‘ membranaP csrnáuco
p‘
«¡Hondón
cúosol CELULAR
membfqnaplusmatnca
RESPUESTACELULAR
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INTRODUCCION - 54
Análogos de GAPen Saccharomyces eerevisiae estan codificados
porlos genes IRAl e IRAZ. Las proteínas que resultan de su
traducción tienen 2938 y 3079 aa respectivamente (Tanaka et al,
1989 y1990), y sus dominios cataliticos guardan 45%de homologia con
lazona carboxi-terminal de GAPbovino, la cual es suficiente
paraestimular la actividad GTP-ásioa de Ras p21 (Marshall et
al,1989). Esto sumado al hecho de que GAP bovino es capas
desuprimir fenotipos ira- y de que la proteina Ira
recombinantemuestra actividad GAP(Ballester et al, 1989 y Tanaka et
al,1991) confirma la suposición de que IRAl y 2 son a RAS
delevaduras lo que GAPes a Ras p21 de mamíferos.WWVarias proteínas
que unen GTP están involucradas en labiosíntesis de proteinas: El
factor de iniciación 2 (IF-2) y losfactores de elongación Tu y G
(EF-Tu y EF-G) de procariotes, asicomo sus homólogos de eucariotes
eIF-Z, EF-la y EF-Z. En Escherichia coli existen dos puntos en el
ciclo de elongación de lacadena polipeptídica dependientes de
GTP.
(Met (Met Arg
P sim A su,
AmunoacyI-IRNAdelivery by EF-Tu
GTP GDP.+
ch 3 p ch —
{Met fMet
Release of I
unchargod(RNAx Arg
Translocaliondriven by EF-G *
GDP GTP+p' GCU
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INTRODUCCION — 55
El primero de ellos es la unión del complejo aminoacil-tRNA
alribosoma, promovido por EF-Tu. proteína de 43 kDa. EF-Tu-GTP esla
forma activa que se une al aa-tRNA primero y al ribosomadespués. Es
necesario que el GTPsea hidrolizado para que el factor se libere y
quede en condiciones de reiniciar el ciclo. Unmecanismo análogo
permite que EF-G-GTPpueda interactuar con elcomplejo y promover la
reacción de traslocación.
Durante el proceso de sintesis de proteinas estos factores
sealternan en la interacción con el ribosoma y es necesario quecada
uno de ellos se haya despegado para que pueda pegarse elotro.
Dadoque el "despegue" es depend