UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI PRÓ-REITORIA DE ENSINO ENGENHARIA AGRONÔMICA André Henrique Campelo Mourão Caracterização molecular de Bacillusthuringiensis e produção de bioinseticida para controle de pragas do milho (Zeamays) Sete Lagoas – MG
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Caracterização molecular de - UFSJ 2014.pdf · Os danos causados pelas pragas da fase vegetativa e reprodutiva do milho variam de acordo com o estádio fenológico da planta, condições
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI
PRÓ-REITORIA DE ENSINO
ENGENHARIA AGRONÔMICA
André Henrique Campelo Mourão
Caracterização molecular de
Bacillusthuringiensis e produção de
bioinseticida para controle de pragas do milho
(Zeamays)
Sete Lagoas – MG
2014
ANDRÉ HENRIQUE CAMPELO MOURÃO
Caracterização molecular de Bacillus thuringiensis e produção de
bioinseticida para controle de pragas do milho (Zeamays)
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado ao curso de Engenharia
Agronômica da Universidade Federal
de São João Del Rei como requisito
parcial para obtenção do título de
Engenheiro Agrônomo.
Área de concentração: Microbiologia/Controle Biológico
Orientador: Prof. Dr. Juliano de Carvalho Cury
Sete Lagoas – MG
2014
ANDRÉ HENRIQUE CAMPELO MOURÃO
Caracterização molecular de Bacillusthuringiensis e produção de
bioinseticida para controle de pragas do milho (Zeamays)
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado ao curso de
Engenharia Agronômica da
Universidade Federal de São
João Del Rei como requisito
parcial para obtenção do título
de Engenheiro Agrônomo.
Sete Lagoas, 11 de julho de 2014
Banca examinadora:
________________________________
Fernando H. Valicente – Pesquisador – EMBRAPA/CNPMS
________________________________
Leonardo Lucas Carnevalli Dias – Professor – UFSJ
_________________________________
Juliano de Carvalho Cury – Professor – UFSJ
Orientador
DEDICO
Aos meus pais pela dedicação e carinho
e ao meu irmão pelo companheirismo.
AGRADECIMENTOS
A Deus, fonte de luz e inspiração.
A Embrapa Milho e Sorgo por possibilitar a realização do trabalho,
cedendo laboratório e material às pesquisas.
A Universidade Federal de São João Del Rei por fornecer conhecimento
e pela oportunidade de ingressar no curso de Engenharia Agronômica.
Ao Doutor Fernando HercosValicente pela oportunidade, incentivo, por
proporcionar momentos descontraídos e principalmente pelos
ensinamentos e lições não só profissionais, mas de vida.
Ao professor Dr. Juliano de Carvalho Cury pela compreensão,
disponibilidade e confiança.
A Prof Leonardo Lucas Carnevalli Dias,pela participação como membro da
banca de defesa.
Aos colegas de laboratório Osmar (Nate), Celso, Camila, Thaís, Priscilla,
Daniele, Fernando, Donald, Rosane, Arthur pelo convívio e auxílio nas
tarefas desenvolvidas.
Aos meus pais Luiz e Jussara pelo auxílio incondicional e por me
proporcionarem mais este momento feliz em minha vida.
Ao meu irmão Mateus por me ajudar a esquecer as dificuldades que
passamos, e por dar forçaa meus pais e a mim nos momentos difíceis.
Ao meu irmão Vitor (in memorian) que sei que esta olhando por nós, uma
grande perda durante esta minha caminhada. Aprender a perder nunca
saberemos, mas o tempo transforma todos os sentimentos.
A minha namorada Julie pela paciência, compreensão e palavras de
incentivo.
E a todos que de alguma forma me ajudaram e continuam me ajudando.
A todos, muito obrigado.
“A adversidade desperta em nós capacidades que, em
*Código universal para bases degeneradas: R=A, G; Y=C, T; M=A, C; S=G, C; H=A, T, C; D=G, A, T; N=A, C, G, T. Tm: Temperatura de anelamento .
Para eliminação de falso negativo foram utilizadosiniciadorespara
amplificação do gene 16S ribossomal, sendo esta subunidade encontrada no RNA
ribossomal de procariontes. (968F e 1494R).
Para as reações de amplificação foram utilizados microtubos de 0,2 mL
contendo um volume final de 10 µl, com 30 ng de DNA, 3mM de MgCl2, 1 µl de
tampão 10× (Tris 20 mM e KCl50 mM), 250 µM de dNTPs (A, T, C, G), 10 µM de
cada iniciador e 1 unidade de Taq DNA Polimerase. As amplificações foram
realizadas em termocicladorVeriti® 96-“Well ThermalCycler” (AppliedBiosystems)
utilizando o seguinte programa:95°C por 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 95°C por
1 minuto, temperatura de anelamento específica para cada iniciador (Tabela 1) por 1
minuto e 72°C por 1 minuto, seguido de um ciclo de 72°C por 10 minutos.
Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em géis de
agarose (1,5% ou 2,0%, variando de acordo com o tamanho do fragmento
amplificado). Foi utilizado Gel Red (BIOTIUM) para a visualização do produto de
PCR de acordo com as instruções do fabricante. Após a corrida o gel foi visualizado
sob luz ultravioleta. As imagens foram captadas pelo fotodocumentador Kodak Gel
Logic 200 Imaging System.
Após a detecção destes genes foi feita uma comparação de genes tóxicos a
algumas pragas descritas em Kees van Frankenhuyzen (2009), que relaciona a
presença do gene com a toxicidade a algumas ordens de inseto.
23
Produção do bioinseticida
Para a produção do pré-inóculo foi utilizado o meio de cultura LB (Luria
Bertani)sólido (12g de Bacto Ágar), acrescido de sais (0,002 g.L-1 de FeSO4 , 0,02
g.L-1de ZnSO4 , 0,02 g.L-1de MnSO4 , 0,3 g.L-1de MgSO4), pH ajustado para 7,5. A
incubação foi realizadapor 24 horas a 28°C. Posteriormente as placas foram
raspadas e o material foi retirado e inoculado em meio de cultura LB + sais líquido e
deixadosob agitação constante de 200 RPM por 16 horas a 28°C.
Para averiguação da quantidade de esporos presentes no pré inoculo foi feita
uma contagem inicial em câmera de Newbauer utilizando microscopia de contraste
de fase. Após esta etapa foi realizado um teste rápido de mortalidade quanto à
toxicidade desta cepa às três espécies testadas (Spodoptera frugiperda, Helicoverpa
zea e Diatrea saccharalis).
Após confirmação da quantidade de esporos presentes e da eficiência da
cepa para o controle de tais pragas, o pré-inoculo foi adicionado ao meio de cultura
proposto em Valicente e Mourão (2008), composto por 4,0% de glicose de milho
(fonte de Carbono), 3,0% de farinha de soja (fonte de Nitrogênio), além dos
micronutrientes (FeSO4, ZnSO4, MnSO4 e MgSO4), que são essenciais para o
crescimento e desenvolvimento da bactéria, pH ajustado para 7,5 e mantido sob
agitação (200 RPM) e temperatura (28°C) constantes. Amostras foram coletadas em
períodos pré determinadose armazenadas para posterior realização dos testes
(Tabela 2).
Foi feita a inoculação de 5% do pré inoculo no meio de cultura a ser avaliado.
Foram feitas 3 repetições e os erlenmeyers foram deixados em shaker com agitação
constante (200rpm) por 72 horas a 28°C.
Tabela 2. Horários de coleta das amostrasdo produto em processo de fermentação
e testes realizados.
Amostra Horas após inoculação
pH Densidade ótica
Massa celular
Contagem de esporos
Mortalidade
24
01 00 x x x x x 02 02 x x 03 04 x x 04 06 x x 05 08 x x x x x 06 24 x x x x x 07 26 x x 08 28 x x 09 30 x x 10 32 x x x x x 11 48 x x x x x 12 50 x x 13 52 x x 14 54 x x 15 56 x x x x x 16 72 x x x x x
Parâmetros avaliados durante o crescimento
Densidade Ótica
Amedição da densidade ótica (DO) a 600nm do meio de cultura foi realizada
utilizando-se espectrofotômetro.
Biomassa
Amostras de 100 ml foram centrifugadas a 10.000rpm durante 20 min. O
sobrenadante foi descartado e o pellet foi liofilizado. O peso seco foi calculado e
expressoem gramas por litro.
Contagem de esporos
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As amostras coletadas foram submetidas a diluições seriadas e a contagem
de esporos realizada em câmera da Newbauer, microscopia de contraste de fase,
em três repetições.
pH
O pH do meio foi ajustado inicialmente para 7,5 ± 0,1 com NaOHapós a
esterilização, e foi medida a intervalos regularesdurante 72h do processo de
fermentação utilizando-se um medidor de pH de bancada.
Teste de toxicidade
O complexo de cristais de esporos produzidos em diferentes horários foi
testado contra lagartas de dois dias de idade(S. frugiperda, H. zea e H. armigera) e
de cinco dias de idade (D. saccharalis) criadas em laboratório. A fim dedeterminar a
toxicidade, a cultura foi amostrada em 8, 24, 32,48, 56 e 72horas após inicio do
processo de fermentação.
Foi utilizado o método de superfície para testar a toxicidade, no qual foi
aplicado 165 µl da suspensão de esporos/cristais sobre um pedaço de dieta artificial
com aproximadamente 3,5 cm3 de volume. Após inoculação as lagartas foram
mantidas em BOD a27°C, 70% de UR (Umidade Relativa) efoto período de 16 horas
de luz e 8 horas de escurodurante 7 dias. Após este período foi avaliada a
eficiência/taxa de mortalidade das lagartas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
26
PCR
Dos 20 iniciadorestestados para a identificação dos genes Cry presentes na
cepa 1644, dez tiveram resultados positivos, como mostrado na Tabela 3.
Tabela 3. Detecção de genes Cry na cepa 1644 de Bacillus thuringiensis.
Levando em consideração os relatos em Kees van Frankenhuyzen (2009), as
classes de genes aqui analisadas e detectadas nesta cepa (Cry1A, Cry1B, Cry1C,
Cry1I, Cry1H, Cry2Ae Cry9) apresentam certa toxicidade àordem Lepidóptera, que
são os insetos alvo deste estudo.
Neste mesmo trabalho, analisando a nível de espécie, podemos citar cinco
genes (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1aC, Cry1Ad e Cry2Ab) presentes nesta cepa que são
tóxicos a pelo menos uma espécie de lagarta testada. Deve-se considerar que há a
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possibilidade da presença de outros genes tóxicos a estas lagartas que não foram
testados ou até mesmo detectados nesta cepa.
Contagem de esporos e mortalidade das lagartas
Foram feitas três contagens de número de esporos do pré inoculo em câmara
de Newbauer, podendo-se observar uma concentração de 3,175 x 107esporos.mL-
1.Já as taxas de mortalidade foram de 95% pra S. frugiperda, 70% para H. zea e
65% para D. saccharalis.
Densidade ótica
A leitura da densidade ótica (DO) de uma cultura bacteriana em
espectrofotômetro nos da uma estimativa da concentração celular no meio. Como
podemos observar na Figura 2, houve um aumento da DO entre 8 e 24 horas após a
inoculação,sendo que após 24 horas essa variação é bem menor, se mantendo
quase estável. Resultado similar foi relatado por Ernandesetal. (2007), no qual foi
observado um crescimento exponencial de Bt entre 12 e 24 horas de inoculação.
28
Figura 2. Leitura de densidade ótica das amostras de Btcoletadas em
espectrofotômetro a 600nm.
Biomassa
A maior produção de biomassa foi observada 72 horas após a
inoculação,sendo de 3,83 g.L-1. A Figura3mostra o crescimento bacteriano expresso
em g.L-1. Resultados similares foram relatados por Valicente et. al(2010) após
trabalho no qual também foram utilizados meios de cultura alternativos contendo
Nitrogênio e Carbono como fonte de nutrientes para o Bt.
Densidade ótica
Tempo de fermentação
0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs
Abso
rbân
cia
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
29
Figura 3. Produção de massa celular das amostras coletadasem função do tempo
de cultivo.
Contagem de esporos
Assim como relatado em Valicente et.al(2010) e Valicente e Mourão (2008),
após um período de crescimento há uma queda na concentração de esporos a partir
de 72 horas após a inoculação, apesar de terem sido feitos testes com meio de
cultura diferentes. Já no presente trabalho é possível observaruma redução na
concentração de esporos após 56 horas de inoculação (Figura 4).
Biomassa
Tempo de fermentação
0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs
g/L
0
1
2
3
4
5
6
30
Figura 4. Variação do número de esporos de Btpor mL do meio de cultura em
função do tempo de cultivo.
Correlação entre concentração de esporos, biomassa e densidade ótica
Assim como relatado em diversos trabalhos de fermentação e produção de
bioinseticidas (ANEGELO etal, 2010; VALICENTEetal. 2010; VALICENTE e
MOURÃO 2008; ERNANDES etal., 2007; VIEIRAetal., 2008), há uma tendência que
com o passar do tempo, após a inoculação do Bt em meio de cultivo, a massa
celular, densidade ótica e concentração de esporos também aumente, pois estas
tem uma relação direta entre si. Na Figura 5 podemos observarumacorrelação entre
crescimento, massa celular e a concentração de esporos, sendo que no inicio (0
horas a 24 horas) a densidade ótica também seguiu essa tendência, mas após esse
período a cultura entrou no estágio estacionário.
Concentração de esporos
Tempo de fermentação
0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs
Esp
oro
s / m
L
0
1e+8
2e+8
3e+8
4e+8
31
Figura 5. Comparação entre concentração de esporos de Bt,biomassa e densidade
ótica ao longo do tempo de cultivo.
pH
Vários autores relatam a queda do pH no inicio da fermentação seguida do
aumento do pHapós 96 horas de crescimento. Na Figura 6 é possível observar uma
redução no pH um pouco mais significativa entre 8 a 24 horas de
inoculação,ocorrendo um aumento após este período. Valores de pH maiores que 7
talvez não tenham sido alcançados neste experimento pelo fato da fermentação ter
sido encerrada com 72 horas de crescimento.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
0,00E+00
5,00E+07
1,00E+08
1,50E+08
2,00E+08
2,50E+08
3,00E+08
3,50E+08
0 h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs
Concentração de esporos x Biomassa x D. O
Contagem de esporos
(esp/mL)
Massa celular (gr/mL)
Densdidade ótica
32
Figura 6.Determinaçãodo pH em diferentes tempos de crescimento de Bt após o
inicio do processo fermentativo.
Toxicidade
Uma eficiência na toxicidade do Bt a espécies de insetos pragas é o principal
objetivo quando se inicia um processo fermentativo. Em testes já realizados no
laboratório de Controle Biológico da Embrapa Milho e Sorgo com esta cepa e
utilizando o meio de cultura LB + sais, foi possível encontrar até 100% de
mortalidade para algumas destas pragas testadas neste estudo. Porém, como pode
ser observado naFigura 7, em nenhum momento foi observada toda essa eficiência,
sendo as maiores eficiências observadas para S. frugiperdaapós 72 horas da
inoculação (81,75%), para H. zeaapós 72 horas da inoculação (58,75%) e para D.
saccharalis após 56 horas da inoculação (50,00%).
pH
Tempo de fermentação
0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs
pH
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
33
Figura 7. Toxicidade de Bt a diferentes insetos pragas do milho, em diferentes
tempos de cultivo.
Mortalidade
Tempo de fermentação
0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs
% m
ortos
0
20
40
60
80
100
Spodoptera frugiperda Helicoverpa zea
Diatrea saccharalis
34
CONCLUSÕES
De uma forma geral os resultados de pH, densidade ótica, biomassa e concentração de esporos corroboraram com os resultados de vários outros trabalhos. Os resultados obtidosacompanharam o que é comumente encontrado quando se trabalha com fermentação de Bacillusthuringiensis. O resultado mais importante relaciona-se com aeficiência no controle das pragas Diatreasaccharalis, Helicoverpazea e Spodopterafrugiperda. Porem não houve controle satisfatório de tais pragas, sendo recomendável novos estudos e o teste de meios de cultura alternativos com diferentes composições e proporções de fontes de Carbono e Nitrogênio como fontes de nutriente para se obter um biopesticida eficiente a partir do crescimento deBt. Pois esta mesma cepa testada com o meio de cultura padrão do laboratório (LB + sais), apresentou eficiência no controle de tais pragas acima de 90%, porem o alto custo de meio, pode inviabilizar a produção do biopesticida em escala comercial.
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REFERENCIAS
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