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CARACTERIZAO DE SUBSTNCIAS FENLICAS DE
RESDUOS DE FRUTOS AMAZNICOS E AVALIAO
PARA O USO BIOTECNOLOGICO
KLENICY KAZUMY DE LIMA YAMAGUCHI
MANAUS 2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
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KLENICY KAZUMY DE LIMA YAMAGUCHI
CARACTERIZAO DE SUBSTNCIAS FENLICAS DE
RESDUOS DE FRUTOS AMAZNICOS E AVALIAO
PARA O USO BIOTECNOLOGICO
Orientador: Prof. Dr Valdir Florncio da Veiga Junior
Co-orientador: Prof. Dr Emerson Silva Lima
MANAUS 2015
Tese apresentada Coordenao do
Programa de Ps-Graduao em
Qumica da Universidade Federal do
Amazonas, como requisito para a
obteno do ttulo de Doutora em
Qumica, rea de concentrao
Qumica Orgnica.
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Ficha catalogrfica
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RESUMO
A utilizao de produtos naturais vem aumentando consideravelmente
nos ltimos anos devido s atividades biolgicas relacionadas sua
composio qumica. Porm, um entrave para as pesquisas a quantidade de
matria prima disponvel para a produo em larga escala. Paralelo a
isso, o consumo de frutas amaznicas vem conquistando espao nos
mercados nacional e internacional e os resduos das indstrias de
polpa esto crescendo proporcionalmente. Verifica-se que pouco
conhecido sobre a composio qumica desses subprodutos gerados e das
atividades biolgicas de seus extratos possam ter, sendo estes
geralmente descartados em grandes quantidades, resultando em
problemas ambientais e econmicos. No presente estudo analisou-se a
composio dos extratos fenlicos de 19 frutos amaznicos, avaliando-se
as atividades antioxidantes, bem como inibio enzimtica, e
antimicrobiana visando o uso biotecnolgico. Os extratos mais
promissores foram analisados de forma mais detalhada por meio da
deteco e identificao das substncias em tcnicas cromatogrficas e
espectromtricas. As amostras foram gentilmente cedidas em
diferentes cidades da regio norte (Belm e Coari) e extradas em
etanol e etanol:gua. As atividades antioxidante, citotxica,
enzimtica, antimicrobiana e fotoprotetora foram analisadas por
diferentes tcnicas qumicas e em clulas. Os extratos analisados
neste estudo, obtidos como subprodutos da extrao das polpas
demonstram-se fontes de substncias fenlicas e flavonodicas, alm de
possurem significativas atividades biolgicas com baixa
citotoxicidade, destacando-se os resduos de aa, bacuri e piqui. Os
extratos de piqui apresentaram alta capacidade antioxidante,
superior ao padro quercetina, tanto nos testes in vitro, com CS50
de 7,810,34 m.mL-1 para DPPH, e 3,930,12 m.mL-1 para ABTS, quanto
em clula (70,69 2,77%, 79,89 6,50% e 79,48 8,6% paras cascas,
polpas e sementes, respectivamente), bem como potencial para
atividade antiinflamatoria. Os extratos de diferentes aas (Euterpe
precatoria e Euterpe oleracea) e os extratos de bacuri (exocarpo e
mesocarpo de Platonia insignis) foram otimizados quanto metodologia
e o melhor solvente de extrao. Os extratos obtidos por macerao a
frio e a quente com etanol apresentaram o melhor poder extrator das
substncias fenlicas, comparados com os extrados em ultrasson. De
forma geral, as metodologias testadas apresentaram diferentes
propores das substncias, porm o mesmo perfil. A caracterizao dos
extratos foi realizada por espectrometria de massas, utilizando
tcnicas bidimensionais, com ionizao DESI e CLAE. O extrato das
sementes de E. oleracea e E. precatria apresentaram perfis
diferentes do que comumente relatado para a polpa, destacando a
presena de procianidinas, flavonoides e fenlicos como crisoeirol,
cido cafeico e cido cumrico. Foram detectados mais de 50 ons em
cada um dos extratos. No extrato do mesocarpo de P. insignis foram
71, onde detectou-se a presena de ons de flavonoides, procianidinas
e isoflavonoides. Nos extratos de cascas de Caryocar villosum foram
detectados e quantificados a presena de cido elgico (1873,63 63,12
g.g-1) e cido glico (1712,62 56,79 g.g-1) como os constituintes
majoritrios. Este estudo abre a perspectiva de agregar valor ao que
considerado descarte, devido composio qumica e s atividades
biolgicas encontradas, diminuindo assim a contaminao ambiental por
resduos e contribuindo para a utilizao sustentvel de matrias primas
amaznicas.
Palavras-chave: frutos amaznicos, resduos, fenlicos, DESI.
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ABSTRACT
The use of natural products has increased in recent years
because the biological activities related to its chemical
composition. However, an obstacle to research is the amount of raw
material available for large-scale production. Parallel to this,
the consumption of Amazonian fruits has gained space in national
and international markets and waste from pulp industries are
growing proportionally. It appears that little is known about the
chemical composition of these products generated and the biological
activity of its extracts may have, which are usually discarded in
large quantities, resulting in environmental and economic problems.
In the present study we analyzed the composition of phenolic
extracts of 19 fruits Amazon, evaluating the antioxidant activity,
antimicrobial and enzyme inhibition aiming to biotechnological use.
The most promising extracts were analyzed by means of the detection
and identification of substances in chromatographic and
spectrometric techniques. The samples were kindly provided in
different cities of the Amazon northern region (Belem and Coari).
Extracts were obtained in ethanol and ethanol: water. The
antioxidant, cytotoxic, enzyme, antimicrobial and photoprotective
activities were analyzed by different techniques: chemistry and in
cell. The extracts analyzed in this study, obtained as by-products
of the extraction of the pulp showed up sources of phenolic
substances and flavonoidics, besides having significant biological
activity with low cytotoxicity, highlighting the acai, bacuri and
piquia waste. Piquia shell extracts showed free radicals scavenger
capacity of ABTS (CS50: 3.93 0.12 g.mL-1) and DPPH (CS50: 7.81 0.34
g.mL-1), in cellular assays, with percentages of 70.69 2.77%, 79.89
6.50% and 79.48 8.6% for shell, pulp and seed extracts,
respectively, low cytotoxicity in human fibroblasts, but high at
tumor strains, and also a high anti-inflammatory potential observed
by the inhibition of nitric oxide production. Different extracts of
the aa (Euterpe oleracea and Euterpe precatoria) and bacuri
extracts (exocarp and mesocarp of the Platonia insignis) have been
optimized on the methodology and the best solvent extraction. The
extracts obtained by cold and hot maceration with ethanol showed
most efficient than ultrasound method. Methodologies analysed
showed different proportions of the substances, but the same
profile. The characterization of the extracts was performed by mass
spectrometry using two-dimensional techniques, DESI ionization and
HPLC. The extract of E. oleracea and E. precatoria seeds presented
different profiles than is commonly reported to the pulp,
highlighting the presence of procyanidins, flavonoids and phenolic
as crisoeirol, caffeic and coumaric acid. More than 50 ions were
detected in each of the extracts. P. insignis mesocarp was 71,
which detects the presence of ions flavonoids, isoflavones and
procyanidins. In extracts of Caryocar villosum shells were detected
and quantified the presence of ellagic acid (1873.63 63.12 g.g-1)
and gallic acid (1712.62 56.79 g.g-1) as the compounds major. This
study opens the possibility of value adding to what is considered
waste due to the chemical composition and biological activities
found, thereby reducing environmental pollution by waste and
contributing to the sustainable use of Amazonian raw materials.
Keywords: Amazonian fruits, waste, phenolic, DESI.
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APOIO FINANCEIRO
Este trabalho foi realizado no Laboratrio de Qumica de
Biomolculas do
Amazonas (Q-BIOMA) no Departamento de Qumica , Laboratrio de
Extresse
Oxidativo na Faculdade de Cincias Farmacuticas e Laboratrio de
Estatstica
(LABEST) na UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS (Manaus-AM) e no
Mass
Spectrometry Laboratory (IFAs Lab) na York University em Toronto
(Canad), com
apoio financeiro das seguintes Agncias de Fomento:
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal do Ensino Superior
(CAPES);
Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
(CNPq);
Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM).
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A vida, como a fizeres,
estar contigo em
qualquer parte.
Chico Xavier
Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas
vezes, Mas no esqueo de que minha vida a maior empresa do mundo E
que posso evitar que ela v falncia. Ser feliz reconhecer que vale a
pena viver Apesar de todos os desafios, incompreenses e perodos de
crise. Ser feliz deixar de ser vtima dos problemas e Se tornar um
autor da prpria histria atravessar desertos fora de si, mas ser
capaz de encontrar um osis no recndito da sua alma agradecer a Deus
a cada manh pelo milagre da vida. Ser feliz no ter medo dos prprios
sentimentos. saber falar de si mesmo. ter coragem para ouvir um
No!!! ter segurana para receber uma crtica, Mesmo que injusta
Pedras no caminho?
Guardo todas, um dia vou construir um castelo Fernando
Pessoa
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Dedico esta tese minha amada
me, Auxiliadora Yamaguchi por
todo o exemplo, carinho e amor
destinados a mim. Ela que abriu mo
da minha companhia em prol da
minha educao, sempre esteve
presente em minha vida. Dedico-a
todas as vitrias conquistadas ao
longo dos anos.
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AGRADECIMENTOS
O doutorado um momento em que o tempo passa muito rpido,
acompanhado de disciplinas, experimentos e prazos e o que
acreditvamos que demorariam meses, na verdade no passam de alguns
momentos que rapidamente chegam ao final. Devido a isso, acredito
que a todo o momento devemos agradecer e dar valor s pessoas que
esto ao nosso redor, pois no sabemos quanto tempo ficaro presentes
na nossa vida. Os ensinamentos adquiridos durante todos esses 48
meses no podem ser mensurados nem expressos apenas nos resultados e
discusso deste trabalho. Na tentativa de demonstra-los, eis meus
agradecimentos:
A Deus por tantas bnos concedidas ao longo da minha vida. A
todas as oportunidades que tive de crescer como pessoa e da fora
nos momentos mais difceis, sempre demonstrando sinais de Seu
infinito amor e de Suas orientaes, confortando meu corao e
colocando na minha vida pessoas que fazem a diferena;
minha famlia, alicerce fundamental no decorrer dessa caminhada,
em especial, a meus amados pais Katsuo e Auxiliadora Yamaguchi por
terem me dado uma base de educao, carter e amor. Vocs so a rvore e
eu, apenas um fruto que reflete a criao que vocs deram para a nossa
famlia. Certamente no seria possvel sem a ajuda de vocs chegar at
aqui! E olha que apenas o comeo...
Aos meus amados irmos, Kenne e Kendy Yamaguchi, que mesmo
estando em Coari (assim como toda a famlia) sempre estiveram perto
de mim me dando fora para continuar seguindo em frente e
compartilhando os mais diversos momentos durante o doutorado. Aos
manos Willian e Gssica, e meus cunhados David, Antnia e Miro
Yamaguchi por me apoiarem e sempre terem palavras de conforto e
incentivo;
A minha madrinha Mariza e tia Nely pelo carinho e cuidado
recebido. Aos meus tios e primos por sempre torcerem por mim e pela
energia positiva que vocs enviaram (e enviam) me dando fora em
todas as situaes;
Aos meus amigos antigos, Enio, Daiana Ges e Leandro. Nessa
correria que o doutorado, vocs sempre estiveram comigo. As ligaes,
mensagens e visitas me fortaleceram e fizeram com que eu sempre me
sentisse amada;
Ao querido Leonardo Florisbal pela fora, pacincia e compreenso
nos momentos em esse trabalho ocupou a maior parte do meu tempo.
Obrigada pelo companheirismo, incentivo e amor dedicado. Voc a
sorte que a vida me deu.
s lindas Joelma Alcntara, Lidiam Maia e Priscilla Oliver, que
mesmo no estando mais to perto, se fazem presente sempre! Vocs so o
presente que Deus me deu. Eu no teria como selecionar to bem
pessoas to especiais como vocs. Os conselhos, os incentivos, as
brincadeiras e os momentos de descontrao foram situaes que
guardarei para sempre. Obrigada pelos valorosos momentos;
Milena Campelo, pelo companheirismo e amizade nessa trajetria
cheia de pedras, que nem sempre lembramos que fazem parte do
castelo;
Ao parceiro de todas as coletas e de inmeras dificuldades...
Victor Lamaro;
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Aos meninos Isadora Mota, Yasmin Cunha, Alanne, Larissa,
Priscila, Leandro, Dbora Raquel e Felipe Ravazi, meus filhos de
corao; A Olinda, Frederico, Rosiane, Rosilene, Alcilene, Marcos
Tulio, Nilma, Jesika, Orlando pelo companheirismo e amizade nos
momentos descontrados no laboratrio.
Ao professor Valdir Veiga pelo carinho, confiana e incentivo nos
momentos em que to difcil conseguir ver os motivos que nos levam a
trajetria de um caminho...principalmente quando pensamos que no
termos mais fora para percorre-lo. Por ser muito mais que um
orientador, por ser meu padrinho (literalmente!). Sempre com seu
ombro amigo, seu abrao acolhedor e seus valorosos conselhos me
acompanhando desde a iniciao cientfica. Realmente fazer cincia no
fcil, mas um dia eu aprendo!
Ao grupo de pesquisa Q-Bioma como um todo, a todos os membros.
Somos
uma famlia cientfica e mesmo com todas as diferenas, a unio e o
respeito
sempre prevalecero.
Aos professores Afonso Duarte e Rita Nunomura pela amizade,
carinho, valorosos conselhos e incentivos. Vocs moram no meu corao.
Obrigada por estarem na minha vida. Aos professores Roberto
Castilho, Genilson Santana e Marcos Batista
Ao laboratrio de Estatstica Labest, em especial ao prof. Max
Lima e David Dias pela ateno e pacincia nas orientaes das anlises
estatsticas.
Aos queridos Rodrigo, Lucileno, Arleilson e Patrcia por todo o
acolhimento e pelo companheirismo na Faculdade de Farmcia;
professora Marne Vasconcellos pelo incentivo dado a cada Bom dia e
em cada vistoria que era feita no final da tarde da FCF;
Ao professor Emerson Silva que me tirou da zona de conforto e
acreditou no meu trabalho. Muito obrigada por todo o incentivo no
decorrer desses anos. Ser sua orientanda trouxe ensinamentos que
vou levar comigo pra onde eu for;
Ao professor Demian Rocha Ifa pela grande oportunidade de
aprendizado durante todo o doutorado sanduiche. Cada caf
compartilhado foi sinnimo de muito aprendizado. Obrigada pelo
exemplo de humildade e profissionalismo que recebi todo o tempo que
estivesse ao seu lado.
Aos companheiros do doutorado sanduiche Paulo Yamasaki e
Consuelo Perez pela amizade e recepo...
Em especial, querida Alessandra Tata e Michel Campos que
fortaleceram a minha tese de que existem pessoas boas em qualquer
lugar do mundo, dispostas a auxiliar sem intenses. Obrigada por
todo o apoio e incentivo. Espero um dia poder ajudar algum assim
como vocs me auxiliaram e passar esse ensinamento de bondade para
frente.
Aos queridos primos Iara Ganzer e Marcelo Apolinario pelo
companheirismo e amizade. No h como agradecer em algumas palavras
todo o carinho que sinto. Somente Deus, com todo o seu amor,
poderia me dar a oportunidade de convvio e aprendizado que tive
durante o tempo que morei com vocs;
A caminhada longa, mas os passos j esto sendo dados...
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xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Sementes de (A) E. precatoria e (B) E.
oleracea...............................................13
Figura 2: Estrutura qumica de substncias isoladas de cascas de
bacuri.......................15
Figura 3: Substncias qumicas detectadas e/ou isoladas de
piqui................................17
Figura 4: Padro de oxidao tpicos das vias metablicas. A: via do
acetato e B) via do
cido
chiqumico...............................................................................................................19
Figura 5: Exemplo da biossntese de fenlicos oriundos da via do
acetato. ...................19
Figura 6: Formao do cido
chiqumico..........................................................................20
Figura 7: Estrutura bsica dos
flavonoides.......................................................................21
Figura 8: biossntese geral dos
flavonoides......................................................................22
Figura 9: Estrutura qumica do cido
hialurnico..............................................................26
Figura 10: Representao esquemtica do poder de penetrao da radiao
solar nas
camadas da
pele...............................................................................................................27
Figura 11: Exemplos de substncias qumicas utilizadas como
filtros solares em (A) UVB,
(B) UVA e (C) amplo espectro.
.......................................................................................28
Figura 12: ciclo oxidativo do
ascorbato.............................................................................31
Figura 13: Estruturas qumicas de antioxidantes
fenlicos...............................................32
Figura 14: Modelo de ionizao por
electrospray.............................................................36
Figura 15: Esquema de seleo do on precursor e de sua
formao..............................37
Figura 16: Fonte de ionizao do tipo DESI. A) Ilustrao do
processo e B)
Espectrmetro de massa com DESI.
...............................................................................38
Figura 17: Reduo do radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil a
1,1-difenil-2-
picrilhidrazila.....................................................................................................................45
Figura 18: Estabilizao do radical ABTS+ por um
antioxidante.......................................46
Figura 19: Formao do formazan a partir do
NBT...........................................................47
Figura 20: Frutos
amaznicos...........................................................................................63
Figura 21: Microfotografia de extrato seco por asperso de
Maytenus ilicifolia 500 e
2000x
...............................................................................................................................66
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Figura 22: Extrato de carambola seco por
asperso........................................................66
Figura 23: Atividade antimicrobiana pelo mtodo de
difuso...........................................74
Figura 24: Ilustrao da anlise da CIM dos
extratos......................................................76
Figura 25: Espectro de absoro dos extratos de resduos em
concentrao de 1,00
mg.mL-1.............................................................................................................................92
Figura 26: Espectro de absoro dos extratos diludos em 1,00
mg.mL-1, 0,50 mg.mL-1 e
0,25
mg.mL-1.....................................................................................................................93
Figura 27: Espectro do perfil das extraes de BAE por
espectrometria de
massas...........................................................................................................................
123
Figura 28: cido
cafico..................................................................................................125
Figura 29: Espectro do perfil das extraes de BAM por
espectrometria de
massas...........................................................................................................................
126
Figura 30: Estrutura das substncias correspondentes aos ons
moleculares detectados
nos extratos de
BAM.......................................................................................................128
Figura 31: Espectro do perfil das extraes de E. precatoria por
espectrometria de
massas............................................................................................................................129
Figura 32: Estrutura das substncias com massas caractersticas de
picos detectados
nas extraes de E.
precatria.......................................................................................131
Figura 33: Espectros do perfil das extraes de E. oleracea por
espectrometria de
massas............................................................................................................................132
Figura 34: Imagem ptica em em HPTLC-UV de compostos de extrato
de E. precatoria
100 mg/mL. (A) Imagem aps a eluio com a mistura de solvente I
para cima. (B)
Imagem aps a eluio utilizando a mistura de solventes I para cima
seguido de eluio
usando mistura de solventes II para a direita. ......134
Figura 35: Ilustrao da localizao dos ions detectados por DESI-MS
da placa de
HPTLC 2D. (A) modo positivo. (B) Modo negativo. .....135
Figura 36: ons detectados por DESI-EM de E. precatoria..136
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Atividades biolgicas de espcies de
Euterpe.................................................12
Tabela 2. Esqueleto bsico de alguns compostos
fenlicos............................................18
Tabela 3: Nome cientfico, partes utilizadas e as datas da obteno
do material...........42
Tabela 4: Rendimento dos extratos
(%)...........................................................................64
Tabela 5: Inibio enzimtica dos
extratos......................................................................68
Tabela 6: Percentagem de inibio das enzimas teciduais dos
extratos.........................72
Tabela 7: Lista dos microorganismo
testados..................................................................73
Tabela 8: Atividade antimicrobiana dos
extratos..............................................................74
Tabela 9: Critrio de avaliao da atividade
antimicrobiana............................................75
Tabela 10: Valores das concentraes inibitrias mnimas dos
extratos........................76
Tabela 11: Resumo dos testes espectrofotomtricos dos extratos
hidroalcoolicos (6:4
etanol:gua), na proporo 10%
(m/v).............................................................................81
Tabela 12: Resumo dos testes espectrofotomtricos dos extratos em
etanol, na
proporo 10%
(m/v).......................................................................................................82
Tabela 13: Percentagem da atividade antioxidante em linhagem
celular dos extratos em
concentrao de 20
g/mL...............................................................................................87
Tabela 14. Perfil de absoro de extratos hidroalcolicos e
etanlicos na concentrao
1,00
mg.mL-1.....................................................................................................................91
Tabela 15: Resultados das anlises de otimizao das sementes de E.
oleraceae......102
Tabela 16: Matriz de correlao dos erros referentes as variveis
respostas das
extraes de sementes de E.
oleraceae........................................................................103
Tabela 17: ANOVA para os valores dos rendimentos, fenlicos e
flavonoides dos
extratos dos resduos de nos fatores mtodo de extrao e solvente.
Efeitos com valor-p
< 0,05 so considerados significativos; gl = grau de
liberdade; SQ = soma de quadrados;
QM = quadrado
mdio....................................................................................................103
Tabela 18: Rendimento dos diferentes parmetros dos mtodos de
extrao de E.
oleraceae. Interaes com letras iguais no diferem
significativamente entre si...........108
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xv
Tabela 19: Resultados da quantificao da capacidade antioxidante
dos melhores
parmetros dos mtodos de
extrao............................................................................108
Tabela 20: Resumo dos resultados das anlises de otimizao de
E.
precatria........................................................................................................................110
Tabela 21: Matriz de correlao dos erros referentes a E.
precatoria...........................110
Tabela 22: Resumo dos resultados das anlises de otimizao de
mesocarpo de P.
insignis............................................................................................................................114
Tabela 23: Matriz de correlao dos erros referentes ao Bacuri
amarelo
(mesocarpo)....................................................................................................................115
Tabela 24: Resumo dos resultados das anlises de otimizao do
epicarpo de
bacuri..............................................................................................................................118
Tabela 25: Matriz de correlao dos erros referentes ao Bacuri
amarelo
(endocarpo).....................................................................................................................118
Tabela 26: Intensidade dos picos majoritrios (m/z) das extraes
de
BAE.................................................................................................................................124
Tabela 27: Percentual da intensidade dos picos majoritrios das
extraes de BAM por
espectrometria de
massas..............................................................................................127
Tabela 28: Percentual da intensidade dos picos majoritrios das
extraes de E.
precatoria por espectrometria de
massas.......................................................................130
Tabela 29: Percentual dos picos majoritrios das extraes de E.
oleracea por
espectrometria de
massas..............................................................................................133
Tabela 30: Sugesto das substncias presentes em Euterpe
precatoria por
espectrometria de massas
(DESI-EM)...........................................................................137
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xvi
LISTA DE GRFICOS
Grfico 1: Brasil Variao do PIB e do mercado de cosmticos 2000 a
2011............8
Grfico 2: Espectro de absoro UV dos filtros (A) p-metoxicinamato
de 2 etil-hexila e
(B)
1-(4-terc-butilfenil)-3-(4-metoxifenil)propano-1,2-dionaoxibenzona............................29
Grfico 3: Rendimento de
extratos..................................................................................63
Grfico 4: Percentagem de inibio de -amilase em concentrao de 100
g.mL-1.....69
Grfico 5: Percentagem de inibio das enzimas digestivas em
concentrao de 100
g.mL-1..............................................................................................................................71
Grfico 6: Percentual de fenlicos e flavonoides totais dos
extratos..............................79
Grfico 7: Capacidade de varredura dos radicais ABTS dos
extratos.............................83
Grfico 8: Capacidade de varredura dos radicais DPPH dos
extratos............................84
Grfico 9: Atividade antioxidante pelo mtodo de
-caroteno.........................................85
Grfico 10: Correlao da atividade antioxidante (DPPH) e fenois
totais.......................86
Grfico 11: Percentagem da atividade antioxidante em linhagem
celular dos extratos em
concentrao de 20
g/mL...............................................................................................88
Grfico 12: Percentual mdio de substncias extradas por cada
resduo...................101
Grfico 13: Influencia do solvente nas metodologias para os
resultados de A)
Rendimento; B) compostos fenlicos, C) antioxidante frente ao
DPPH e D) em radical
ABTS de E.
oleraceae....................................................................................................104
Grfico 14: Grfico de superficie de resposta para A) Rendimentos,
B) fenlicos totais,
C) DPPH e ABTS de E.
oleraceae..................................................................................105
Grfico 15: Interao solvente-mtodo no percentual dos rendimentos
dos extratos
brutos das sementes de E.
precatoria............................................................................111
Grfico 16: Grfico de interao solvente-mtodo dos extratos brutos
das sementes de
E.
precatria....................................................................................................................112
Grfico 17: Interao solvente-mtodo no percentual do rendimento
dos extratos brutos
do mesocarpo de P.
insignis...........................................................................................115
Grfico 18: Grfico de interao solvente-mtodo no percentual de
fenis totais dos
extratos brutos do mesocarpo de P.
insignis..................................................................116
Grfico 19: Grfico de interao solvente-mtodo no percentual de
rendimento dos
extratos brutos do epicarpo de P.
insignis......................................................................119
Grfico 20: Grfico de interao solvente-mtodo no percentual de
fenis totais dos
extratos brutos do epicarpo de P.
insignis......................................................................120
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xvii
LISTA DE SIGLAS
ABTS+ 2, 2-azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato
Abs - Absorbncia
AcOEt - Acetato de etila
ANOVA Anlise de Varincia Univariada
BAE bacuri amarelo epicarpo
BAM bacuri amarelo mesocarpo
BIOPHAR I Laboratrio de Atividades Biolgicas e Farmacuticas
I
CBM - Concentrao bactericida mnima
CC - Cromatografia em coluna
CCD - Cromatografia em camada delgada
CS50 - Concentrao do extrato necessria para decrescer a
concentrao inicial em
50%
DPPH. 2,2-difenil-1-picrilhidrazila
CLAE-UV Cromatografia Lquida de Alta Eficincia com detector de
Ultravioleta
CHCl3 - Clorofrmio
CIM - Concentrao inibitria mnima
CLAE Cromatografia lquida de alta eficincia
DMSO - Dimetilsulfxido
DPPH - 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
EM Espectrometria de massas
EtOH - Etanol
Hex Hexano
IV - Infravermelho
MeOH - Metanol
NP/PEG - Difenilaminoborato/polietileloglicol
MANOVA Anlise de varincia multivariada
MF macerao a frio
MQ macerao a quente
SON sonicao
UV - Radiao ultravioleta
UV-Vis - Ultravioleta-Visvel
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xviii
SUMRIO
1.
INTRODUO.......................................................................................................01
2.
OBJETIVOS...........................................................................................................04
2.1 OBJETIVO
GERAL..............................................................................................05
2.2 OBJETIVOS
ESPECFICOS................................................................................05
3. REFERENCIAL
TERICO.....................................................................................06
3.1 FRUTOS AMAZNICOS E SEUS
RESDUOS...................................................07
3.1.1 AA
.................................................................................................................11
3.1.2
BACURI.............................................................................................................14
3.1.3
PIQUI..............................................................................................................16
3.2 FENOIS E
FLAVONOIDES..................................................................................18
3.3 ATIVIDADES
BIOLGICAS.................................................................................23
3.3.1 ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA........................................................................23
3.3.2 ATIVIDADE
ENZIMTICA.................................................................................24
3.3.3
FOTOPROTEO............................................................................................27
3.3.4 ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE............................................................................29
3.4 CARACTERIZAO
QUMICA............................................................................34
3.4.1 ESPECTROMETRIA DE MASSAS DESI E ESI
............................................34
4.
METODOLOGIAS.................................................................................................40
4.0 PROCEDIMENTO
EXPERIMENTAL...................................................................40
4.1 MATERIAL VEGETAL E OBTENO DOS
EXTRATOS....................................42
4.2
BIOENSAIOS.......................................................................................................44
4.2.1.1 AVALIAO DA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE..............................................44
4.2.1.1 VARREDURA DO RADICAL 2,2-DIFENIL-1-PICRILHIDRAZIL
(DPPH)......44
4.2.1.2 VARREDURA DO RADICAL
ABTS+............................................................46
-
xix
4.2.1.3
SUPERXIDO................................................................................................46
4.2.1.4 SISTEMA CAROTENO / CIDO
LINOLEICO................................................48
4.2.2 AVALIAO DO POTENCIAL
FOTOPROTETOR...........................................48
4.2.3 ENSAIOS
ENZIMTICOS...............................................................................49
4.2.3.1 ENZIMAS
TECIDUAIS...................................................................................49
4.2.3.1.1
TIROSINASE...............................................................................................49
4.2.3.1.2
HIALURONIDASE.......................................................................................50
4.2.3.1.3
COLAGENASE............................................................................................50
4.2.3.2 ENZIMAS
DISGESTIVAS...............................................................................50
4.2.3.2.1
-AMILASE.................................................................................................50
4.2.3.2.2
LIPASE........................................................................................................51
4.2.3.2.3
-GLICOSIDASE........................................................................................52
4.2.4 ENSAIOS EM
CLULA.....................................................................................53
4.2.4.1 ANTIOXIDANTE EM
CLULA........................................................................53
4.2.4.1.1 CULTURA DE
CLULAS...........................................................................53
4.2.4.1.2 ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE......................................................................53
4.2.4.2
CITOTOXICIDADE.........................................................................................54
4.2.4.2.1 ENSAIO DE VIABILIDADE
CELULAR........................................................54
4.2.4.3 AVALIAO DO POTENCIAL
HEMOLTICO................................................54
4.3 QUANTIFICAO DE MOLCULAS
BIOATIVAS..............................................55
4.3.1 FENIS
TOTAIS...............................................................................................55
4.3.2 FLAVONOIDES
TOTAIS...................................................................................55
4.4 OTIMIZACAO DAS EXTRACOES DE
FENOLICOS............................................57
4.4.1
SONICAO...................................................................................................57
4.4.2
MACERAO..................................................................................................58
4.5 ANLISE
ESTATISTICA..................................................................................59
-
xx
4.6 CARACTERIZACAO
QUIMICA............................................................................60
4.6.1 MTODOS
ESPECTROMTRICOS.................................................................60
4.6.1.1 ESPECTROMETRIA DE
MASSAS...............................................................60
4.6.1.2 IMAGEM DE PLACAS DE
HPTLC.................................................................60
4.6.2 MTODOS
CROMATOGRFICOS..................................................................61
4.6.2.1 CROMATOGRAFIA EM CAMADA
DELGADA...............................................61
4.6.2.2 CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA
(HPLC)......................61
5. RESULTADOS E
DISCUSSO.............................................................................62
5.1 RESIDUOS AMAZONICOS E SUAS
BIOATIVIDADES.......................................63
5.2 ENZIMAS
DIGESTIVAS.......................................................................................67
5.3 TIROSINASE E
COLGENASE...........................................................................71
5.4 ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA...........................................................................73
5.5 QUANTIFICAO DE COMPOSTOS BIOATIVOS: FENLICOS E
FLAVONOIDES
TOTAIS............................................................................................78
5.6 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN
VITRO..............................................................84
5.7 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE EM
CLULA..........................................................87
5.8
FOTOPROTEO...............................................................................................90
5.9 OTIMIZAO DA EXTRAO DE SUBSTNCIAS
FENLICAS.......................97
5.9.1. AA DO PAR (E.
oleraceae)......................................................................102
5.9.2 AA DO AM (E.
precatoria)............................................................................110
5.9.3 BACURI (P. insignis)
MESOCARPO............................................................114
5.9.4 BACURi (P. insignis)
EPICARPo..................................................................117
5.10 CARACTERIZAO POR ESPECTROMETRIA DE
MASSAS.......................122
5.10.1 PERFIL DAS EXTRAES DE BAE POR ESPECTROMETRIA DE
MASSAS...................................................................................................................123
-
xxi
5.10.2 PERFIL DAS EXTRAES DE BAM POR ESPECTROMETRIA DE
MASSAS...................................................................................................................126
5.10.3 PERFIL DAS EXTRAES DE E. PRECATORIA POR
ESPECTROMETRIA
DE
MASSAS.............................................................................................................129
5.10.4 PERFIL DAS EXTRAES DE E. OLERACEA POR ESPECTROMETRIA
DE
MASSAS...................................................................................................................132
5.11 CARACTERIZAO QUMICA POR DESI-EM EM
HPTLC............................134
6. CONSIDERAES FINAIS
................................................................................166
7. REFERENCIAS
...................................................................................................142
8. ANEXOS.166
8.1 ANTIOXIDANT ACTIVITY OF AMAZON FRUITS (Capitulo de livro
publicado no
Bioactive Phytochemicals: Perspectives for Modern Medicine - Vol
2)
8.2 AMAZON ACAI: CHEMISTRY AND BIOLOGICAL ACTIVITIES: A
REVIEW
(Artigo I - publicado na revista FOOD CHEMISTRY)
8.3 QUMICA E FARMACOLOGIA DO BACURI (Platonia insignis)..
(Artigo II -
publicado na revista SCIENTIA AMAZONIA)
8.4 AMAZONIAN BIOREFINARIES: FROM FRUIT WASTE TO ANTIOXIDANT
SUPPLEMENTS (Artigo III - submetido a revista FOOD RESEARCH)
8.5 HPLC-DAD PROLIFE OF PHENOIC COMPOUNDS AND ANTIOXIDANT,
CITOTOXICITY AND ANTI-INFLAMMATORY POTENTIAL OF THE AMAZON
FRUIT
PIQUIA (Caryocar villosum) (Artigo VII - revista QUIMICA
NOVA)
8.6 AVALIACAO IN VITRO DA ATIVIDADE FOTOPROTETORA DE RESDUOS
DE
FRUTAS AMAZONICAS (Artigo IV - submetido a revista SCIENTIA
AMAZONIA)128
8.7 APRESENTAES EM CONGRESSOS COM PUBLICAO DE RESUMOS
8.8 CAPTULOS DE LIVROS E ARTIGOS PUBLICADOS
8.9 ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAO E ARTIGOS EM ANDAMENTO /
SUBMETIDOS
-
1. INTRODUO
-
2
A tendncia de envelhecimento da populao e a busca por uma vida
melhor e
mais saudvel reforam a valorizao do uso de produtos naturais
como uma das
grandes alternativas para as pesquisas cientficas. O Brasil um
dos pases mais
privilegiados em biodiversidade em todo o mundo, sendo um dos
grandes
produtores mundiais de frutas. Nesse contexto, a regio Amaznica
destaca-se pela
quantidade de frutas exticas consideradas ricas em substncias
bioativas, como os
fenlicos e os flavonoides, que esto sendo associados a benefcios
para a sade
(Paz et al., 2015, Rabelo, 2012; Barreto et al., 2009).
Espcies como aa (Euterpe oleraceae Mart), cupuau (Theobroma
grandiflorum L.), bacuri (Platonia insignis Mart), guaran
(Paulinia cupana var.
sorbilis (Mart.) Ducke) e tucum (Astrocaryum aculeatum Meyer)
esto em alta no
mercado da fruticultura e geram resduos que ultrapassam o
percentual de matria
utilizada para o consumo (Barros et al., 2015, Canuto et al.,
2010). Estudos vm
demonstrando que alguns nutrientes e substncias antioxidantes se
concentram
majoritariamente nas cascas e nas sementes, que so os principais
subprodutos
gerados no processamento e despolpamento de frutas (Berto et
al., 2015; Melo et
al., 2008; Roesler et al., 2007)
Algumas sementes so utilizadas por pequenas indstrias na produo
de
semijias, biodiesel, carvo e raes para peixe. Verifica-se, porm,
que uma parte
considervel deste material, assim como os resduos oriundos das
cascas, so
descartados sem nenhum estudo prvio sobre as propriedades de
seus constituintes
e suas possveis atividades biolgicas, tornando-se fonte de
contaminao de rios e
florestas (Sousa et al., 2011a e 2011b).
Uma das dificuldades encontradas para o desenvolvimento das
indstrias de
biotecnologia a quantidade de matria prima disponvel para a
produo em larga
2
-
3
escala. Os produtos naturais precisam ser obtidos
sustentavelmente, de forma que a
industrializao no afete a natureza e prejudique o equilbrio
ecolgico.
Calcula-se que do total de frutas processadas para a produo de
sucos e
polpas, 30 a 40% sejam de resduos agroindustriais. Como a
quantidade de resduos
pode chegar a muitas toneladas, agregar valor a esses produtos
de interesse
econmico e ambiental, necessitando de investigao cientifica e
tecnolgica que
possibilite seu uso (Schieber et al., 2001).
Nesse contexto, pesquisas relacionadas ao aproveitamento
destes
subprodutos da fruticultura esto sendo conduzidas com o intuito
de investigar a sua
composio qumica, valorizando-os e sugerindo novas alternativas
de utilizao,
minimizando o desperdcio e possibilitando a gerao de produtos
biotecnolgicos
(Berto et al., 2015). Prope-se ento um estudo dos extratos de 21
frutas (cascas
e/ou sementes), visando a caracterizao da composio de substncias
fenlicas e
flavonodicas e bioensaios para avaliao das atividades
antioxidante,
antimicrobiana, e enzimtica dos extratos e fraes.
Considerando as elevadas taxas de produo de resduos
agroindustriais
gerados a partir das frutas e a importncia de substncias
bioativas em aplicaes
biotecnolgicas para a sade da populao, seu estudo fitoqumico
aliado a
bionsaios til para o aproveitamento em massa dessas matrias
primas, com a
perspectiva de uma melhor utilizao das mesmas, agregando valor
aos resduos e
aos seus possveis produtos.
-
4
2. OBJETIVOS
-
5
2.1 GERAL
Caracterizar a composio fenlica de subprodutos da indstria de
fruticultura
da Amaznia para uso biotecnolgico.
2.2 ESPECFICO
2.2.1 Avaliar a quantidade de fenis e flavonoides totais e as
atividades
antioxidantes in vitro e em clulas dos extratos etanlicos e
hidroalcoolicos de
resduos de frutas;
2.2.2 Avaliar a atividade antimicrobiana em relao a 30 patgenos
de interesse da
Amaznia e potencial fotoprotetor dos extratos;
2.2.3 Avaliar o potencial de inibio de enzimas de importncia
cosmtica e/ou
econmica: tirosinase, colagenase, hialuronidase, -amilase,
-glicosidase e
lipase;
2.2.4 Avaliar a citotoxicidade dos extratos em clulas normais e
clulas
cancergenas;
2.2.5 Otimizar a extrao de substncias fenlicas e flavonodicas em
diferentes
metodologias por anlise estatstica de superfcie de resposta;
2.2.6 Caracterizar quimicamente os extratos de aa (Euterpe
oleracea e E.
precatoria), bacuri (Platonia insignis) e piqui (Caryocar
villosum) por mtodos
espectromtricos e espectroscpicos;
-
6
3. REVISO BIBLIOGRFICA
-
7
3.1 FRUTAS AMAZNICAS E SEUS RESDUOS
No decorrer do tempo, o homem veio a descobrir que as frutas
possuam no
s um grande valor nutritivo, mas tambm efeito medicinal e
cosmtico, estando
atualmente entre os maiores agentes teraputicos obtidos da
natureza (Iha et al.,
2008; Lima et al., 2007). A utilizao de frutas amaznicas devido
s suas
propriedades teraputicas descrita na literatura desde longas
dcadas, como o
consumo de guaran (Paullinia cupana) e de castanha-da-Amaznia
(Bertholletia
excelsa) pelos ndios amaznicos por sculos (Rodrigues et al.,
2007; Souza, 2006).
O sabor e as propriedades qumicas das substncias presentes nas
polpas
desses frutos contm diferentes constituintes e tem despertado o
interesse de
diversos grupos de pesquisas devido s propriedades biolgicas que
podem estar
relacionadas com atividades benficas para o organismo humano
como a preveno
e uma menor incidncia de doenas crnicas e degenerativas ( Berto
et al., 2015;
Paz et al., 2015; Silva et al., 2012; Vieira et al., 2011; Melo
et al., 2008 ).
Nos ltimos anos esto sendo associados aos cosmticos substncias
que
visem o benefcio da sade humana. Esses produtos, identificados
como
cosmticos, mas que tratam ou previnem doenas ou, ainda, que
afetam a estrutura
ou funo da pele humana, so considerados como cosmecuticos
(Kligman, 2005).
O Brasil apresenta a terceira posio em consumo de cosmticos em
geral,
tornando-se um dos maiores do mundo. Em termos relativos, o
mercado brasileiro
de cosmticos tem apresentado crescimento constante, superando a
prpria
dinmica da economia nacional (grfico 1) (IBGE, 2013; ABIHPEC,
2013 apud
Herculano, 2013).
-
8
Essas atividades biolgicas esto sendo correlacionadas a
substncias
bioativas, como os fenis e flavonoides, o que tem incentivado a
pesquisas de
produtos naturais para a elaborao de novos produtos na rea de
cosmticos.
Entre os ativos, podem ser destacados os agentes
despigmentantes, retinides,
filtros solares, vitaminas, antioxidantes, minerais e
hidratantes (Monteiro e Baumann,
2008).
Grfico 1: Brasil Variao do PIB e do mercado de cosmticos 2000 a
2011. Fonte: ABIHPEC (2013) apud Herculano, 2013.
As frutas amaznicas recebem destaque devido s atividades
biolgicas que
esto sendo relatadas nas pesquisas, que aliados composio qumica
estimulam
varreduras que possam selecionar os mais promissores para
estudos mais
aprofundados em busca de produtos aplicveis biotecnologicamente.
Verifica-se, no
entanto, que um dos entraves para a utilizao industrial dos
produtos da Amaznia
a quantidade de matria prima disponvel para que possam ser
produzidos em
larga escala. Na regio amaznica, diversas matrias primas foram
utilizadas ao
longo dos anos, porm pelo fato destas no apresentarem
sustentabilidade,
acabaram sofrendo reduo e algumas rvores entraram para a lista
de espcies em
extino, como o caso de pau rosa, pau brasil, entre outros
(Rizzini e Mors, 1995).
-
9
considervel a produo de resduos de origem vegetal na regio
amaznica
provenientes do despolpamento de frutos. Segundo Demajorivic
(1995), esses
resduos diferenciam-se do termo lixo, pois apresentam valor
agregado por
possibilitarem o reaproveitamento no prprio processo produtivo.
Esses subprodutos
podem proporcionar outra fonte de valor indstria de
processamento uma vez que
so geralmente descartados em grandes quantidades, sendo
potencialmente
causadores de prejuzos ao meio ambiente. Assim, agregar valor a
estes
subprodutos de interesse econmico e ambiental, sendo
necessrias
investigaes cientificas e tecnolgicas que possibilitem sua
utilizao (Sena e
Nunes, 2006; Martins e Farias, 2002).
Os subprodutos da indstria de frutas da regio vm sendo testados
com a
finalidade de verificar seu desempenho em alimentos de peixes,
como por exemplo,
a semente do ara-boi (Psidium araa R.), o resduo do jenipapo
(Genipa
americana L.), de camu-camu (Myrciaria dbia (HBK) McVaugh) e de
acerola
(Malpighia glabra L.). Outras finalidades so adubo para vegetais
e suplementos
alimentares, porm em baixa escala e sem estudos mais
aprofundados sobre a
composio qumica (Oliveira et al., 2009b; Anselmo, 2008; Sena e
Nunes; 2006;
Silva et al., 2000, Roubach, 1991).
Estudos recentes tm demonstrado que as frutas so ricas em
muitos
nutrientes e substncias antioxidantes, e que esses constituintes
se concentram
majoritariamente nas cascas e sementes, fraes normalmente
desprezadas
durante o consumo in natura ou nas formulaes caseiras de
compotas, sorvetes e
outras (Sousa et al., 2011a e 2011b; Roesler et al., 2007).
A casca de pequi (Caryocar brasilense) apresentou maior valor de
substncias
fenlicas nos extratos etanlico e aquoso, em comparao com o da
polpa,
-
10
possuindo excelente capacidade de seqestrar radicais livres
(Roesler et al., 2007).
Na amndoa detectou-se elevada quantidade de leo comestvel, rico
em vitamina
A, de interesse para a indstria cosmtica e de alimentos
(Siqueira et al., 2012;
Batista et al., 2010; Soares Jnior et al., 2010; Perez,
2004).
No trabalho realizado por Sousa e colaboradores (2011), com
resduos de seis
frutas, alguns extratos, como o de acerola (Malpighia
emarginata) e goiaba (Psidium
guajava), apresentaram atividade antioxidante in vitro
superiores de alimentos com
reconhecida atividade antioxidante. No artigo de reviso de
Oliveira e colaboradores
(2009b) foram reunidos resultados de fontes naturais atrativas
de antioxidantes a
partir de resduos da indstria alimentcia. Estes resduos, apesar
de possurem em
sua composio vitaminas, minerais, fibras e compostos
antioxidantes so
desperdiados na maioria das fbricas. Porm, poderiam ser
utilizados como
antioxidantes, antimicrobianos e dermocosmticos, minimizando os
efeitos
ambientais e gerando uma nova fonte de renda para os produtores
rurais.
A diversidade de princpios ativos presentes nas espcies
Amaznicas indica
grande potencial de aproveitamento industrial, sobretudo, das
espcies nativas. Foi
realizado um levantamento das principais frutas Amaznicas e a
atividade
antioxidante relacionada aos constituintes qumicos. Esse
trabalho resultou na
publicao de um captulo de livro publicado pela editora DAYA
PUBLISHING
HOUSE, NEW DELHI, 2014, como o primeiro resultado desta tese. O
resumo desta
publicao, assim como os dados relacionados a esse captulo
encontram-se no
ANEXO 1.
-
11
3.1.1 AA
O gnero Euterpe possui cerca de 28 espcies localizadas nas
Amricas
Central e do Sul, estando distribudas por toda bacia Amaznica.
As trs espcies
que ocorrem com maior frequncia so E. oleraceae, E. edulis e E.
precatoria. No
entanto, s duas espcies so exploradas comercialmente, E.
precatoria e E.
oleracea. Umas das principais diferenas entre os dois aas, est
no hbito de
crescimento das plantas. E. precatoria uma espcie nativa do
estado do
Amazonas, conhecida popularmente como aa do Amazonas e
encontrada na
bacia do Solimes, em terreno de terra firme e rea de baixio
(Almeida et al., 2004;
Cavalcante, 1996).
E. oleracea, conhecida popularmente como aa do Par,
encontrada,
sobretudo, em terrenos de vrzea e igap. multicaule,
diferentemente da E.
precatoria que unicaule. Espcie nativa da Amaznia, tem suas
maiores
populaes concentradas nas florestas da Amaznia Oriental,
principalmente, nos
Estados do Par, Amap e Maranho (Cavalcante, 1996; Muiz-Miret et
al., 1996).
Estas espcies tem alto potencial econmico, principalmente pelo
uso de seus
frutos na preparao do vinho de aa que so exportados para todo o
mundo
como energticos. A polpa deste fruto tem sido objeto de estudos
em funo do
valor nutritivo, sendo considerado um alimento nutracutico face
ao elevado teor de
substncias bioativas (Costa et al., 2013; Menezes et al., 2011;
Sabbe et al., 2009).
O aa demonstra benefcios sade associados composio qumica.
Devido a isso, uma quantidade considervel de atividades
biolgicas descrita para
as espcies desse gnero, principalmente para E. oleracea (tabela
1). A atividade
antioxidante, vasodilatadora e antiinflamatria da polpa a mais
avaliada por meio
-
12
de diferentes testes, desde a varredura de radicais in vitro at
em modelos celulares
e plasma humano, sugerindo uma possibilidade do uso do aa como
planta
medicinal (Costa et al., 2013; Pacheco-Palencia et al., 2008;
Rocha et al., 2007).
Tabela 1: Atividades biolgicas de espcies de Euterpe.
Espcie Atividade biolgica Referncias
E. oleracea
Antioxidante Atividade antiproliferativa
Efeito vasodilatador Atividade anticociceptiva
Antiinflamatria Citotoxicidade em clulas
cancergenas
[1-14] [15-17]
[18] [19-20]
[14, 21-24] [25]
E. precatoria Antioxidante
Antiinflamatria
[14, 26] [14]
[1] Matheus et al., 2003; [2] Hassimitto, et al., 2005; [3]
Schauss et al., 2006; [4] Lichtenthler et al.,
2005; [5] Mertens et al., 2006; [6] Rodrigues et al., 2006; [7]
Chin et al., 2008; [8] Santos et al., 2008;
[9] Mertens-Talcott et al., 2008; [10] Spada et al., 2009; [11]
Ribeiro et al., 2010; [12] Rojano et al.,
2011; [13] Rufino et al., 2011; [14] Kang et al., 2012; [15] Del
Pozo-Insfra et al., 2006; [16] Pacheco-
Palencia et al., 2008; [17] Hogan et al., 2010; [18] Rocha et
al., 2007; [19] Marinho et al., 2002; [20]
Favacho et al., 2011; [21] Schauss et al., 2006; [22] Xie et
al., 2012; [23] Kang et al., 2011; [24]
Noratto et al., 2011; [25] Fragoso, et al., 2013; [26] Galotta
et al., 2008 e 2005;
Na colheita, pode-se diferenciar as espcies por meio das
caractersticas
botnicas, porm ao ser preparado para consumo, no possvel ter a
certeza
sobre o tipo de aa que est sendo consumido. Sabe-se que as
espcies de E.
oleracea so comumente encontradas na regio paraense, enquanto
que na
amazonense prevalece as espcies de E. precatria, porm, no h
distino para a
vendas da polpa, sendo vendidos apenas como aa.
H poucos estudos diferenciando as espcies. De forma geral,
caracterizam-
se quimicamente por apresentarem substncias fenlicas como cidos
fenlicos,
flavonoides e antocianinas (Kang et al. 2011; Pacheco-Palencia
et al., 2008; Del
Pozo-Insfran et al. 2006; Kuskoski et al., 2006).
-
13
Figura 01: Sementes de (A) E. precatoria e (B) E. oleracea.
A polpa de corresponde a cerca de 10% do peso final, resultando
em 85-95%
de resduos que so descartados (Yuyama et al., 2011; Pompeu et
al., 2009).
Atualmente, este subproduto vem sendo utilizado como adubo para
plantas e
biojias. Algumas pesquisas sugerem a utilizao como fonte de
fibras para
alimentos e fonte de energia. Verifica-se, porm, que so escassos
os estudos
qumicos e biolgicos com este material e que mesmo com essas
finalidades, a
quantidade de material descartada superior que utilizada,
tornando-se assim
um problema ambiental (Martins et al., 2009; Tinoco, 2005).
Levando-se em
considerao que a polpa dessas espcies rica em substncias
bioativas, o estudo
sobre a composio qumica das sementes torna-se uma oportunidade
para o
aproveitamento em larga escala de uma matria prima que
atualmente est sendo
descartada e que pode gerar produtos biotecnolgicos
sustentveis.
Foi realizado uma extensa pesquisa bibliogrfica sobre os
trabalhos cientficos
descritos para as duas espcies de aa (E. precatoria e E.
oleracea), tanto da parte
qumica quanto biolgica. No ANEXO 2 pode-se encontrar o resumo e
os dados do
artigo resultante desse trabalho, publicado pela revista Food
Chemistry, em 2015.
A B
-
14
3.1.2 BACURI (Platonia insignis)
Nos ltimos anos, o bacurizeiro tem sido frequentemente citado
como espcie
promissora, pelas amplas possibilidades que apresenta, com
interesse na indstria
de alimentos e madeireira. Pelo sabor e aroma peculiar, os
frutos so bastante
utilizados para elaborao de sucos, sorvetes, cremes, doces,
compotas ou mesmo
consumidos in natura pela populao da Amaznia e parte do Nordeste
do Brasil,
particularmente nos Estados do Maranho e Piau (Nascimento et
al., 2007)
Mesmo apresentando cerca de 71% de casca e 15% de sementes
(Souza et
al., 2001; Mouro et al., 1996), verifica-se que o aproveitamento
integral do fruto do
bacurizeiro tm sido pouco estudado. Os trabalhos concentram-se
em avaliaes da
polpa e poucas alternativas foram levantadas para os resduos que
visem a
utilizao do fruto como um todo (Valena et al., 2008).
Villachica e colaboradores (1996) relataram a possibilidade da
utilizao da
casca de bacuri para obteno de leo ou pelo uso na fabricao de
doces.
Atualmente, as empresas descartam esse resduo que a maior parte
do fruto, por
no apresentarem estudos qumicos e citotxicos que garantam a
segurana
alimentar deste material. Segundo os produtores de bacuri, as
cascas apresentam
uma resina de colorao forte e sabor amargo, dificultando a
fabricao de doces e
compotas.
Em estudos referentes ao mesocarpo, verificou-se a alta
quantidade de
pectina existente, cerca de 5,0% (Paula, 1945). Quimicamente, as
pectinas
correspondem a uma cadeia linear de cido poligalacturnico, unida
por ligaes
alfa-1,4 de cido galacturnico, com grau varivel de grupos
carboxilas metil
esterificados (Chitarra e Chitarra, 2005).
-
15
Figura 02: Estrutura qumica de substncias isoladas de cascas de
bacuri
Algumas frutas so descritas como fontes de pectinas, entre elas
a ma,
goiaba e o pequi. A importncia da pectina em alimentos
geralmente atribuda
formao de gis, sendo amplamente usada para produo de gomas,
gelias,
produtos lcteos e fibra diettica solvel para reduo dos nveis de
colesterol,
lipoprotenas, cidos biliares e glicose (Thakur et al., 1997;
Anteri-Schemin et al.,
2005, Siqueira et al., 2012; Fietz e Salgado, 1999). A obteno de
fraes de pectina
pode ser ,dessa forma, uma soluo para o aproveitamento da casca
de bacuri.
Outros estudos referem-se quantificao de fenlicos e a
identificao dos
constituintes volteis. Descrevem-se o isolamento de um
biflavonoide,
morelloflavona, tipo flavanona-(38)-flavona (figura 01), isolado
da frao
metanlica das cascas, extrao de pectina em alta concentrao
(37,6%) em
oxalato de amnia, alm da identificao dos volteis linalol,
2-heptanona, 3-hexenil
e a substncia majoritria, o acetato de linalol como as
substncias responsveis
pelo aroma pareceriam ser (Batista et al., 2011a ; Batista et
al., 2011b; Brito et al.,
2011). (Souza e Chaves, 2007).
A reviso mais aprofundada desta tese sobre os estudos qumicos e
biolgicos
de P. insignis foi realizada e encontra-se publicado no artigo
de reviso da revista
Scientia Amaznia, 2015. No ANEXO 3 pode-se encontrar o resumo e
os dados
desse trabalho.
OOH
OH O
OH
O
OH O
OH
OH
pectina
morelloflavona
-
16
3.1.3 PIQUI
Caryocar villosum (piqui) uma espcie nativa da regio
amaznica,
pertencente famlia Caryocaceae. A polpa do seu fruto consumida
pelos
habitantes locais na culinria amazonense para preparar pratos
regionais com arroz
e o leo comestvel, o qual utilizado como substituto de manteiga
(Clay et al.,
2000). Esse leo utilizado pelas famlias rurais do Nordeste do
Brasil para o
tratamento de dermatofitoses, tais como micoses (Tinea capitis)
e doenas fngicas
da pele (p de atleta) (Grenand et al, 2004).
Na Guiana Francesa tradicionalmente a polpa e a casca de piqui
so
utilizadas pelos habitantes como veneno de peixe. No estudo
realizado por Magid e
colaboradores (2006), associou-se tal propriedade presena de
saponinas
isoladas.
O interesse nesse fruto est relacionado s substancias bioativas
detectadas.
Quando comparado com outras 18 frutas tropicais (nove deles da
regio
amaznica), o piqui apresentou os maiores valores de substancias
fenlicas totais,
flavonoides e atividade antioxidante (Barreto et al., 2009).
Nos estudos realizados por Chist e Mercadante (2012) e Chist
e
colaboradores (2012) foram detectadas as substncias fenolicas:
cido glico, cido
elgico e cido elgico desoxihexosido rhamnosido (HDDP-Glicose), e
os
carotenoides: lutena e zeaxantina como compostos majoritrios.
Nas cascas do
caule foram encontrados fenlicos glicosilados, saponinas
triterpenicas e
flavonoides. A partir do extrato metanlico foram isoladas cinco
saponinas
triterpnicas (cido -D-glucurnico, -D-galactose, -L-ramnose,
-D-14-glucose,
gallato (sal do cido glico)). Algumas dessas substncias podem
ser observados
na Figura 3. Saponinas triterpnicas tambm foram isoladas da
polpa, tendo como
-
17
seu componente acar: -D-glicose, -D-galactose, D-xilose e os
flavonides
glicosdeos, -D-glicopiranose, 3', 4', 5' - trimetoxifenil,
Galloil 1, galloil 2 ( Magid et
al, 2008; Magid et al, 2006a e 2006b).
Substncias fenlicas
Carotenoides
Figura 3: Substncias qumicas detectadas e/ou isoladas de
piqui.
A polpa apresentou efeitos antigenotxicos, capacidade
sequestrante das
espcies reativas de oxignio e nitrognio (Almeida et al, 2012;
Chist et al, 2012),
propriedades antifngicas contra dermotofitoses (Grenand et al,
2004) e atividade
anti-inflamatria tpica in vivo (Xavier et al, 2011).
Mesmo tendo apresentando excelentes resultados para
atividades
antioxidantes in vitro, os trabalhos cientficos envolvendo a
espcie C. villosum esto
relacionados utilizao na indstria madeireira e na polpa, sendo
reduzidas as
pesquisas sobre as partes no comestveis deste fruto.
OHO
OH
OH
OH
cido glico
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
cido elgico
OH
OHOH
OHOH
OHO
O
O
OH
OH
O
O
HDDP-Glicose
OH
OH
O
CH3 CH3
CH3
CH3 CH3
CH3 CH3
CH3
CH3CH3
anteraxantina
OH
OH
CH3 CH3
CH3
CH3 CH3
CH3 CH3
CH3
CH3CH3
zeaxantina
-
18
3.2 FENOIS E FLAVONOIDES
A) SUBSTNCIAS FENLICAS
Dentre os ativos utilizados em pesquisas de produtos naturais,
esto os
polifenlicos, substncias cada vez mais correlacionadas com a
capacidade de
diminuir os riscos para a sade relacionados ao estresse
oxidativo (Campos e
Frasson, 2011; Hirata et al., 2004).
Consideram-se substancias fenlicas, numa definio genrica,
estruturas que
possuem pelo menos um anel aromtico no qual, ao menos um
hidrognio
substitudo por um grupamento hidroxila. Podem ser classificados
de acordo com
seu esqueleto principal (tabela 2) ou segundo sua ocorrncia no
reino vegetal
(amplamente distribudos ou de distribuio restrita) (Cunha et
al., 2005).
Tabela 2. Esqueleto bsico de alguns compostos fenlicos.
Esqueleto bsico Classe de substancias fenlicas
C6 fenis simples, benzoquinonas
C6 - C1
C6 C1 - C6
cidos fenlicos
xantonas
C6 - C3 - C6 flavonoides e isoflavonoides
(C6 C3)2
(C6 C3)n
Lignanas, neolignanas
ligninas
(C6 C3 C6)2 biflavonides
(C6 C3 C6)n taninos condensados
Fonte: adaptado de Dewick, 2002 e Lobo e Loureno, 2007.
Podem ser formados atravs de duas rotas: via do cido chiqumico e
pela via
do acetato. Por meio destas pode-se determinar o padro de
substituio do
composto fenlico resultante, onde na via do cido chiqumico
obtm-se substncias
com grupos hidroxilas em posio orto, que se formam a partir do
cido cinmico e
na via do acetato originam-se substncias com grupos hidroxilas
dispostos em meta
(Lobo e Loureno, 2007; Dewick, 2002; Geissman e Crout, 1969)
(figura 4).
-
19
R
OH
OH
R
OH OH
OH
A B
Figura 4: Padro de oxidao tpicos das vias metablicas. A: via do
acetato e B) via do cido
chiqumico
Na formao de compostos fenlicos pela via do acetato (figura 5),
o bloco
constituinte fundamental o cido actico sob a forma de acetil-CoA
(acetil
coenzima A) que o iniciador direto de todo o processo. O aumento
subseqente da
cadeia realiza-se atravs de um derivado, o malonil-CoA, numa
reao anloga
condensao de Claisen. Posteriormente, ocorre a ciclizao, uma
desidratao e a
aromatizao (Lobo e Loureno, 2007; Dewick, 2002).
CH3 SCoA
O
SCoA
O
HO2C
3x+
malonil-CoAacetil-CoA
SEnz
O CH3
O
O O
H+ reao tipo aldol
ciclizao
desidratao
enolizao
hidrlise
aromatizao
cido orselnico
SEnz
CH3O
O O
CH3
O
OH
OH
OH
SEnz
CH3
OHO
O OH
Figura 5. Exemplo da biossntese de fenlicos oriundos da via do
acetato. Fonte: Dewick, 2002.
(A) (B)
-
20
O esquema biossinttico para a formao do cido chiqumico (figura
6)
envolve a adio de uma molcula de fosfoenol piruvato (PEP) a um
acar, a
eritrose-4-fosfato, originando um derivado cido com sete
carbonos, o desoxi-
arabino-heptulosonato-fosfato. Essa reao tipo aldol, seguida de
uma eliminao
do grupo fosfato e adio carbonila, originam o cido
3-desidroqunico. Em
seguida forma-se o cido 3-desidrochiqumico atravs da eliminao
cis de uma
molcula de gua. H ento a reduo da carbonila a lcool, por meio de
NADPH,
produzindo o cido chiqumico (Lobo e Loureno, 2007).
PO
CH2
CO2-
PO
OH O
OH
fosfoenolpiruvato (PEP)
eritrose-4-fosfato
DAHP sintetase
DAHP(desoxi-arabino-heptulosonato-fosfato)
OH
OH
OH
PO
CO2-
O
O
OH
OH
CO2-
O
H
CH2
O
OH
OH
CO2-
OH
H+
cido 3-desidroqunico
-HOP
NAD+
reao tipo
aldol
eliminao cis (syn)
-H2O
O
OH
OH
CO2-
NADPH
OH
OHOH
CO2-
cido chiqumico cido 3-desidrochiqumico
+
Figura 6: Formao do cido chiqumico. Fonte: Adaptado de Dewick,
2002.
Verifica-se nas pesquisas uma correlao positiva entre a
atividade
antioxidante e a quantidade de compostos fenlicos. Esta
atividade deve-se
principalmente s propriedades redutoras e estrutura qumica dos
fenlicos,
que permitem a neutralizao ou sequestro de radicais livres e/ou
quelao de
metais de transio. A ressonncia do anel aromtico presente nestes
compostos
a principal responsvel pela formao de intermedirios estveis que
aps o
-
21
processo de reduo dos radicais livres, bloqueia reaes em cadeia
(Barreiros et
al., 2006; Cerqueira et al., 2007a).
B) FLAVONOIDES
Os flavonoides so subdivididos nas principais classes: flavonas,
flavonis,
chalconas, auronas, flavanonas, flavanas, antocianidinas,
leucoantocianidinas,
proantocianidinas, isoflavonas e neoflavonoides (Dornas et al.,
2007). Representam
um dos grupos fenlicos mais importantes e diversificados entre
os produtos de
origem vegetal. De forma geral, so molculas de baixo peso
molecular
caracterizados por apresentarem dois ncleos fenlicos ligados por
uma cadeia de
trs carbonos. A estrutura bsica dos flavonoides consiste num
ncleo flavano,
constitudo de quinze tomos de carbono arranjados em trs anis
(C6-C3-C6),
sendo dois anis fenlicos substitudos (A e B) e um pirano (cadeia
heterocclica C)
acoplado ao anel A (Figura 7) (Cunha et al., 2005).
O
O
B .
C .A .1'
2'3'
4'
5'6'
12
3
410
5
6
7
89
Figura 7: Estrutura bsica dos flavonoides
Os flavonoides possuem biossntese mista, resultado da via do
cido
chiqumico e a do acetato, via cido malnico. A primeira origina
fenilalanina, o
precursor do cido cinmico, que por sua vez, origina o cido
cumrico, responsvel
por um dos anis aromticos (anel B) e a ponte de trs carbonos. A
segunda resulta
no outro anel aromtico (anel A) do esqueleto bsico dos
flavonides (Dewick, 2002)
(Figura 8).
-
22
Figura 8: biossntese geral dos flavonoides
-
23
3.3 ATIVIDADES BIOLGICAS
O uso tradicional das plantas em tratamentos de pele,
especialmente para fins
cosmticos, uma prtica comum na medicina popular de muitas
culturas. A busca
por agentes antimicrobianos, inibidores enzimticos antioxidantes
e fotoprotetores
torna-se cada vez mais frequentes e pode fornecer indcios que
estimulem estudos
para a descoberta de potenciais agentes teraputicos.
3.3.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
A pesquisa por antimicrobianos de origem natural (animal e
vegetal) tm sido
uma alternativa para a utilizao desses conservantes de origem
sintticas. As
expectativas do mercado de cosmticos buscam diminuir a incidncia
de reaes de
hipersensibilidade ao usurio, como irritao e alergia, e uma
menor toxicidade,
incentivando assim, a busca de substncias com potencial
antimicrobiano (Lundov et
al., 2009; Ostrosky et al., 2008).
Os cosmticos necessitam de conservantes em suas formulaes que
sejam
capazes de inibir o crescimento de microorganismos durante sua
fabricao e
estocagem e/ou para proteger os produtos da contaminao
inadvertida durante o
uso. Assim, os conservantes devem apresentar atividade
antimicrobiana efetiva,
sendo seletivamente txicos e eficazes contra bactrias, bolores e
leveduras
(ANVISA, 2013; Pinto et al., 2010; Kabara e Orth, 1997).
Nas varreduras, geralmente so includas os microorganismos:
Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
pneumoniae,
Mycobacterium smegmatis, Candida albicans, Cryptococcus
neoformans e alguns
fungos filamentosos. Os mecanismos de ao envolvem processos de
destruio da
-
24
estrutura proteica da parede celular; alterao da permeabilidade
da membrana;
inibio de sistemas enzimticos da clula e oxidao de componentes
celulares
(Barbosa e Torres, 2005; Rang et al., 2004; Calixto, 2001;
Trabulsi et al., 1999).
As pesquisas de substncias antimicrobianas nos vegetais
desenvolveu-se
aps a descoberta de penicilina, e os metablitos secundrios como
as substncias
fenlicas, terpenos e flavonoides esto sendo classes muito
promissoras. Segundo
Rocha Filho (1994), cosmticos contendo flavonoides apresentam
atividade
microbicida e, alm disso, so hidrossolveis e no causam irritao
cutnea, o que
facilita sua aplicao cosmtica.
Na regio amaznica verifica-se que os leos de andiroba e copaba
esto
sendo inseridos no mercado de cosmticos e apresentam atividade
antimicrobiana,
antifngica, e antissptica. Outros destaques so os frutos goiaba
(Psidium
guajava), buriti (Mauritia flexuosa) e guaran (Paullinia cupana
Kunth) que
apresentaram atividade contra bactrias gram positivas e
negativas e atividade
antifngica (Koolen et al., 2013; Leandro et al., 2012; Ribeiro,
2008; Majheni et al.,
2007).
3.3.2 ATIVIDADE ENZIMTICA
A maioria das enzimas pode ser inibida por certas substncias
qumicas. Essa
inibio por pequenas molculas e ons especficos importante nos
mecanismos
de controle em sistemas biolgicos. O estudo de inibidores de
enzimas, tambm se
constitui em uma fonte valiosa de informaes sobre os mecanismos
da ao
enzimtica (Chang et al., 2009; Champe et al., 2005).
3.3.2.1 TIROSINASE
-
25
Com o intuito de se tratar problemas dermatolgicos de
hiperpigmentao, h
uma tendncia mundial no desenvolvimento de cosmticos que
possuam
propriedades despigmentantes, os quais agem inibindo a
biossntese de melanina
(Teixeira et al., 2012). Esta desempenha um papel importante na
proteo da pele
humana contra os feitos nocivos da radiao ultravioleta (raios
UV) do sol. Verifica-
se, porm, que o acmulo de uma quantidade anormal de melanina em
diferentes
partes especficas da pele pode ocorrer, resultando em manchas
mais pigmentadas,
tornando-se um problema esttico (Chang, 2009; Adhikari et al.,
2008).
Para o tratamento desses problemas de pigmentao vrios
produtos
cosmticos e farmacuticos so utilizados, porm, no so totalmente
eficazes ou
seguros, o que justifica a intensa pesquisa na busca de novos
agentes ativos,
principalmente aqueles envolvidos na melanognese, como a
tirosinase (Silvrio et
al, 2013; Okombi et al, 2006; Grimes, 1999). A inibio da
tirosinase o principal
mecanismo de ao de agentes despigmentantes. Dentre as substncias
qumicas
despigmentantes mais utilizadas destacam-se a hidroquinona, o
arbutina, o cido
kjico e o cido ascrbico e seus derivados (Masuda et al., 1996;
Su, 1999; Zhai e
Maibach, 2001; Sato et al., 2007).
H relatos de que compostos fenlicos so potenciais agentes
despigmentantes, por possurem uma estrutura qumica semelhante da
tirosina, o
substrato da tirosinase (Boissy e Manga, 2004). Devido grande
necessidade de
novas substncias despigmentantes, que realmente sejam eficazes e
no tragam
tantos efeitos nocivos sade, torna-se interessante avaliar a
atividade de produtos
naturais, fontes de fenlicos, que possam substituir efetivamente
os compostos
sintticos encontrados no mercado.
-
26
3.3.2.2 HIALURONIDASE
A hialuronidase uma enzima que despolimeriza o cido hialurnico
(figura 9),
reduzindo a viscosidade do meio intercelular, aumentando a
permeabilidade das
membranas celulares e vasos sanguneos, tornando o tecido mais
permevel
disperso de outras substncias e promovendo a reabsoro do excesso
de fluidos,
mobilizando os edemas e infiltraes (El-Safory et al., 2010;
Hynes et al., 2000;).
Figura 9: Estrutura qumica do cido hialurnico
Os resultados dos estudos sugerem que o nvel de cido hialurnico
pode estar
correlacionado com a agressividade de clulas tumorais, de forma
que quanto maior
a quantidade de cido hialurnico encontrado nestes tecidos, mais
agressivo o
tumor. O que indica um passo importante no avano do processo
cancergeno, uma
vez que a inibio desta enzima pode estar relacionada diminuio
desse
processo patolgico (Menzel e Farr, 1998; Matousek et al., 2004;
Zhang et al.,
2004).
Alguns autores descrevem que a atividade da hialuronidase tambm
pode estar
relacionada com outros processos nos tecidos animais como a
inflamao e
envelhecimento cutneo. Dessa forma, um estudo sobre a inibio da
enzima pode
caracterizar possveis atividades biolgicas dos extratos e assim
a possvel
utilizao para formulaes cosmticas (Park et al., 1998).
-
27
3.3.3 ATIVIDADE FOTOPROTETORA
A luz solar composta por espectro contnuo de radiao
eletromagntica que
apresenta diviso e denominao em concordncia com o intervalo de
comprimento
de onda (). Os raios UV subdividem-se em: ultravioleta A (UVA)
entre 320 e 400
nm, ultravioleta B (UVB) entre 290 e 320 nm e ultravioleta C
(UVC) entre 100 e 290
nm. A incidncia dos raios UV pode ser ilustrado na figura 10
(Gonzlez et al., 2008;
Palm e O`Donoghue, 2007).
Figura 10: Representao esquemtica do poder de penetrao da radiao
solar nas camadas da pele. Fonte: adaptao de
A radiao UVC no chega superfcie terrestre, uma vez que
amplamente
absorvida pela camada de oznio. Entretanto, as radiaes UVA e UVB
atingem a
Terra e podem ser absorvidas por diferentes cromforos da pele,
como melanina,
DNA, RNA, protenas e lipdeos. A exposio solar prolongada crnica
leva uma
variedade de efeitos adversos que contribuem para formao de
espcies reativas
de oxignio e alteraes histoqumicas, incluindo fotoenvelhecimento
(enrugamento,
elastose e irregularidade da pigmentao), fotocarcinognese
(carcinoma de clulas
basais e escamosas e melanoma maligno) e a diminuio da imunidade
do indivduo
(Balogh et al., 2011; Mansur, 2011; Dal`Belo, 2008; Gonzlez et
al, 2008).
-
28
Os danos causados pela radiao UV podem ser amenizados com o uso
de
substncias denominadas filtros solares que so molculas ou
complexos
moleculares que podem absorver, refletir ou dispersar a radiao
UV (Balogh et al.,
2011). Os filtros solares orgnicos so formados por molculas
capazes de absorver
a radiao UV (alta energia) e transform-la em radiaes com
energias menores e
inofensivas ao ser humano. Estas molculas so, essencialmente,
compostos
aromticos com grupos carboxlicos ou conjugados. No geral,
apresentam um grupo
doador de eltrons, como uma amina ou um grupo metoxila, na posio
orto ou para
do anel aromtico. Existem trs categorias em que se enquadram,
sendo elas: filtros
UVB, UVA e de amplo espectro (figura 11) (Flor et al.,
2007).
OCH3
O CH3
O
CH3
metoxicinamato de oxila
OCH3
CH3
CH3
CH3
OH OH
avobenzona
OOH
OCH3
oxibenzona
(A)
(B) (C)
Figura 11: Exemplos de substncias qumicas utilizadas como
filtros solares em (A) UVB, (B) UVA e (C) amplo espectro. Fonte:
Adaptao de Silva, 2012.
O mecanismo de ao dos filtros orgnicos envolve a absoro da
radiao
UV e, em seguida, a excitao, onde os eltrons situados no orbital
HOMO (orbital
molecular preenchido de mais alta energia) so excitados para
orbital * LUMO
(orbital molecular vazio de mais baixa energia) e, ao retornarem
para o estado
inicial, o excesso de energia liberado em forma de calor (Flor
et al., 2007). O
espectros de absoro nas regies UVA e UVB esto apresentados no
grfico 2.
metoxicinamato de 2-etilhexila
-
29
Grfico 2: Espectro de absoro UV dos filtros (A) p-metoxicinamato
de 2 etil-hexila e (B)
1-(4-terc-butilfenil)-3-(4-metoxifenil)propano-1,2-dionaoxibenzona.
Fonte: Adaptao de Flor et al. (2007).
As pesquisas sobre fotoproteo da pele tm mostrado que a
incorporao de
antioxidantes tpicos nas formulaes antissolares constituem-se
numa estratgia
importante para o aumento do efeito fotoprotetor suplementar dos
filtros solares
sintticos permitidos pela lei. Aliado a isso, os entraves dos
atuais protetores solares
como a baixa resistncia a gua, pouca estabilidade, potencial
alrgico e dermatites
fotoalrgicas de contato estimulam a busca de substncias com
potencial ao
fotoprotetora (Souza, et al., 2013; Violante et al., 2009).
3.3.4 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
A pele possui a maior rea de superfcie do corpo humano, sendo o
principal
alvo dos radicais livres. Estudos sugerem uma correlao entre o
envelhecimento e
a reduo de agentes enzimticos e no-enzimticos, com consequente
aumento na
formao de espcies reativas de oxignio e nitrognio (ERO e ERN)
(Guaratini et
al., 2007; Kede e Sabatovich, 2004).
Os radicais livres so espcies qumicas que apresentam como
caracterstica a
presena de um nico eltron no-pareado em uma rbita externa.
Espcies
reativas incluem no s os radicais (O2-, OH, NO), mas tambm
intermedirios
-
30
neutros ou carregados (H2O2, ROOH e ONOO-) e outras espcies
capazes de formar
radicais livres no organismo humano (1O2, O3) (Halliwell, 1996;
Halliwell, 1994).
Desempenham um papel fundamental no metabolismo celular, porm,
quando
em excesso, esto envolvidos em danos moleculares s estruturas
celulares, com
consequente alterao funcional e prejuzos das funes vitais em
diversos tecidos e
rgos (Nordberg e Arnr, 2001, Rover Junior et al., 2001;
Halliwell, 1996).
As etapas de reao de radicais de forma geral podem ser divididas
em
iniciao, propagao e terminao. Na etapa de iniciao os radicais so
gerados.
Em seguida, ocorre a propagao, onde um radical reage para
produzir outros
radicais, formando reaes em cadeia. Quando os radicais se
combinam produzindo
uma molcula na qual os dois eltrons esto emparelhados ou uma
molcula
estabiliza o radical, ocorre a etapa de terminao (Bruice,
2006).
O equilbrio entre a formao e a remoo das espcies reativas de
radicais
livres pode ser reestabelecido pelos sistemas antioxidantes,
onde substncias
presentes em baixas concentraes comparadas do substrato oxidvel,
regeneram
ou previnem significativamente a oxidao do mesmo (Barreiros et
al., 2006;
Halliwell et al., 2000).
Verifica-se que a estabilidade dos radicais ocorre devido
principalmente s
propriedades estruturais das molculas antioxidantes. Sendo
assim, substncias
com a capacidade de produzir radicais pouco reativos e que
estabilizam-se ou
sofrem desproporcionamento so antioxidantes em potenciais. O
mecanismo
envolvendo a estabilizao de um antioxidante pode ser ilustrado
na figura 12
(Barreiros et al., 2006).
-
31
O ascorbato (forma que comumente encontrado do cido ascbico
no
organismo) um bom agente redutor que produz derivados pouco
reativos. Por
isso, pode ser oxidado pela maioria das ERO e ERN que chegam ou
so formadas
nos compartimentos aquosos dos tecidos orgnicos. O mecanismo
envolve uma
reao de oxidao e produz o radical semidesidroascorbato.
Posteriormente, o
radical formado convertido em ascorbato atravs de um sistema
enzimtico ou
oxidado irreversivelmente gerando oxalato e treonato (Barreiros
et al., 2006).
O
OH
O
OH O-
OH
ascorbato
O
OH
O
O-
OH
O
O
OH
O
OH O-
OH
O
OH
O
O
OH
O
O
O-
O-
O
OH
OH
OH
O
OH
semidesidroascorbato
ascorbatodesidroascorbato
oxalato
treonato
+ oxidao irreversvel
sistema de regenerao pela GSH
desproporcionamento
+ H+
ERO ou ERN
NADPH semideidroascorbato
redutase
Figura 12: ciclo oxidativo do ascorbato
Fonte: Adaptao de Barreiros et al. (2006).
Entre os antioxidantes mais conhecidos esto as vitaminas C e E,
carotenoides
e as substancias fenlicas. Estas apresentam propriedades
redutoras e capacidade
de estabilizao dos radicais formados devido ressonncia do anel
aromtico,
entre os quais pode-se citar a quercetina, rutina, hesperidina,
naringina, naringenina,
e sakuranetina (figura 13) (Couto e Canniatti-Brazaca, 2010;
Bruice, 2006; Melo e
Guerra, 2002, Bianchi e Antunes, 1999).
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Figura 13: Estruturas qumicas de antioxidantes fenlicos.
Presume-se dessa forma que mecanismos antioxidantes capazes
de
neutralizar os radicais livres pela administrao oral ou tpica,
protegem a pele dos
danos oxidativos e podem ter um papel importante na preveno de
doenas e no
processo de envelhecimento cutneo (Campos e Frasson, 2011;
Vieira et al., 2011;
Kang et al., 2012).
Segundo Roesler (2009), possvel classificar em quatro categorias
os
mtodos mais empregados na avaliao da atividade antioxidante
proporcionada por
extratos vegetais, sendo necessria a combinao destes para uma
anlise
completa do potencial antioxidante.
1. Mtodos que empregam modelos de radicais relativamente estveis
como o
DPPH, ABTS, 2-desoxi-D-ribose, nos quais avaliada a capacidade
do
extrato vegetal em doar hidrognio a fim de formar no radicais,
ou seja,
seqestrar os radicais livres (OH) formados durante a oxidao.
Esses
mtodos costumam ser rpidos, simples e muito convenientes para
a
varredura um de grande nmero de amostras.
O
OH
OH OH
O
OH
cido ascrbico (vitamina C)
O CH3
CH3 CH3 CH3CH3
R
OH
R
CH3 tocoferol (vitamina E)
OOH
OH O
OH
OH
OH
quercetina
O
OH
OH
O
OOH
OH
R
rutina
O
OH
OOH
O
RO
CH3
hesperidina
O
OOH
OH
OH
naringenina
CH3CH3
CH3 CH3
CH3
CH3CH3 CH3
CH3 CH3caroteno
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2. Modelos contendo lipdios ou emulses lipdicas como -caroteno,
muito
utilizado para avaliar amostras menos polares uma vez que o
substrato
empregado uma emulso lipdica.
3. Testes in vitro utilizando como substratos sistemas biolgicos
como clulas
de crtex cerebral de rato/boi, lipoprotena de baixa densidade
humana
(LDL), cultura de cl