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Facultad de Ciencias Agropecuarias
Escuela de Ingeniera Agroindustrial
CAPACIDAD FERMENTATIVA DE LEVADURA.
CURSO: BIOTECNOLOGA DE LOS PAI
DOCENTE: Ing. Guillermo Linares Lujan
INTEGRANTE: ALVARADO YUPANQUI, LUIS MIGUEL.
TACANGA CARHUALLAY, DAVID
GARCA ROSAS
CICLO: IX
Trujillo Per
2015
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Laboratorio 2: Capacidad Fermentativa- Levadura Saccharomyces
Cerevisiae
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA
I. INTRODUCCIN
La fermentacin es un tipo de catabolismo parcial, que se
caracteriza por ser un
proceso de oxidacin incompleta, tpico de los organismos
anaerbicos. Se realiza,
pues, sin la intervencin del oxgeno.
El proceso de fermentacin no slo incluye la desasimilacin
anaerbica como la
formacin de alcohol, butanol-acetona, cido lctico, etc. sino
tambin la produccin
industrial de vinagre, cido ctrico, enzimas, penicilina, etc.
Todos estos productos
son el resultado de procesos microbianos y se llaman productos
de fermentacin.
Durante la fermentacin, la energa obtenida procede, igual que en
la respiracin
aerobia, de las reacciones de xido-reduccin habidas durante el
catabolismo de la
glucosa (gluclisis), pero en la fermentacin las coenzimas
reducidas no ceden sus
electrones a una cadena cuyo aceptor final es el oxgeno, sino
que los ceden
directamente a un compuesto orgnico que se reduce y es el
producto caracterstico de
cada fermentacin.
Inculos de levaduras comerciales son ampliamente usados en la
industria de las
bebidas alcohlicas, sin embargo es preferible utilizar cepas
autctonas, las cuales
estn adaptadas a los medios de fermentacin de cada rea. Aunque
se han encontrado
muchos gneros de levaduras en fermentaciones, la especie
Saccharomyces cerevisae
es la principal responsable de la fermentacin alcohlica, as como
de la produccin
de la mayora de los compuestos aromticos. Algunos de los
criterios de seleccin de
las cepas se basan en su capacidad fermentativa, medida como
produccin de etanol,
acidez y consumo de azcares.
El objetivo de este trabajo fue seleccionar cepas nativas en
base a su capacidad
fermentativa, rendimiento y productividad.
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Laboratorio 2: Capacidad Fermentativa- Levadura Saccharomyces
Cerevisiae
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II. OBJETIVOS
Evaluar y determinar la prdida de peso y la cantidad de glucosa
consumida por
las soluciones de la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Determinar el rendimiento terico y real de la levadura durante
la respiracin y
fermentacin de ellas mismas, a diferentes concentraciones de
sustrato (sacarosa).
Determinar la eficiencia de la levadura Saccharomyces cerevisae
a
concentraciones de 10 y 20 Brix, utilizando como sustrato
sacarosa (C12H22O11).
III. FUNDAMENTO TERICO
A. Fermentacin
Son cambios qumicos en las sustancias orgnicas producidos por la
accin de las
enzimas. Esta definicin general incluye prcticamente todas las
reacciones qumicas de
importancia fisiolgica. Actualmente, los cientficos suelen
reservar dicha denominacin
para la accin de ciertas enzimas especficas, llamadas fermentos,
producidas por
organismos diminutos tales como el moho, las bacterias y la
levadura. Por ejemplo, la
lactasa, un fermento producido por una bacteria que se encuentra
generalmente en la
leche, hace que sta se agrie, transformando la lactosa (azcar de
la leche) en cido
lctico. El tipo de fermentacin ms importante es la fermentacin
alcohlica, en donde
la accin de la cimasa segregada por la levadura convierte los
azcares simples, como la
glucosa y la fructosa, en alcohol etlico y dixido de carbono.
Hay otros muchos tipos de
fermentacin que se producen de forma natural, como la formacin
de cido butanoico
cuando la mantequilla se vuelve rancia, y de cido etanoico
(actico) cuando el vino se
convierte en vinagre.
La fermentacin es un proceso que realizan muchos
microorganismos, efectuando
reacciones sobre algunos compuestos orgnicos y liberando energa.
Hay muchos tipos
diferentes de fermentacin, pero en condiciones fermentativas
solamente se efecta una
oxidacin parcial de los tomos de carbono del compuesto orgnico
y, por consiguiente,
slo una pequea cantidad de la energa potencial disponible se
libera.
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Laboratorio 2: Capacidad Fermentativa- Levadura Saccharomyces
Cerevisiae
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La primera explicacin bioqumica del proceso por el cual el azcar
en solucin acuosa
es descompuesto en alcohol y gas carbnico, en virtud de la accin
de clulas vivas de
levadura, la dio el qumico francs Louis Pasteur, el cual vio que
mientras descomponen
el azcar en ausencia de aire, las clulas de levadura viven y se
propagan en el lquido en
fermentacin y llam al proceso de la fermentacin alcohlica vida
sin oxgeno.
La explicacin de Pasteur fue modificada por Buchner, quien
demostr que poda
realizarse la fermentacin en una solucin acuosa de azcar por el
jugo obtenido
prensando clulas muertas de levadura. Se observ, entonces, que
el jugo filtrado de
clulas de levadura que haban sido molidas con arena contena una
sustancia eficaz para
descomponer los azcares, y a esta sustancia activa o mezcla
catalizadora se dio el nombre
de fermento, enzima o zimasa. De acuerdo con la interpretacin
bioqumica hecha por
Pasteur, la fermentacin se conoce como la desasimilacin
anaerbica de compuestos
orgnicos por la accin de microorganismos u otras clulas o de
extractos celulares;
adems, es un conjunto de reacciones bioqumicas a travs de las
cuales una sustancia
orgnica se transforma en otras por accin de ciertos
microorganismos (bacilos, bacterias,
clulas de levadura), que en general van acompaadas de un
desprendimiento gaseoso y
de un efecto calorfico.
El proceso de fermentacin no slo incluye la desasimilacin
anaerbica como la
formacin de alcohol, butanol-acetona, cido lctico, etc., sino
tambin la produccin
industrial de vinagre, cido ctrico, enzimas, penicilina, etc.
Todos estos productos son el
resultado de procesos microbianos y se llaman productos de
fermentacin.
Anlogamente, el trmino fermentador no slo hace referencia a los
recipientes en los
cuales se realiza la fermentacin con exclusin de aire, sino
tambin a los tanques en los
cuales se producen oxidaciones microbianas aerbicas y a los
tanques de propagacin de
levaduras y otros microorganismos en presencia del aire.
Se conocen centenares de especies de levaduras, bacterias y
mohos que producen alcohol,
pero slo dos o tres especies de levadura se aplican
industrialmente en la produccin de
alcohol; su rapidez en la fermentacin, su tolerancia de
concentraciones elevadas de
azcar y alcohol y su rendimiento elevado de alcohol, hacen que
se usen ms que las
otras. Algunos microorganismos ofrecen ms de una aplicacin
industrial. Las levaduras,
por ejemplo, producen alcohol y glicerol partiendo de azcares,
hacen subir la masa en la
fabricacin del pan y son una fuente de protenas, vitaminas y
enzimas.
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Laboratorio 2: Capacidad Fermentativa- Levadura Saccharomyces
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Todas las clulas estn capacitadas para sintetizar ATP por el
proceso de la gliclisis.
Enmuchas clulas, si el oxgeno no est presente, el piruvato es
metabolizado en un
proceso llamado fermentacin.
La fermentacin complementa a la gliclisis y hace posible
producir ATP continuamente
en la ausencia del oxgeno. Por la oxidacin del NADH producido en
la gliclisis, la
fermentacin regenera el NAD+, el cual interviene otra vez en
para producir ms ATP.
C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP 2 CH3-CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 25.5
kcal
Se puede ver que la fermentacin alcohlica es desde el punto de
vista energtico
unareaccin exotrmica, se libera una cierta cantidad de
energa.
Un clculo realizado sobre la reaccin qumica muestra que el
etanol resultante es casi
un51% del peso, los rendimientos obtenidos en la industria
alcanzan el 7%.
Figura 1. Proceso de fermentacin
En la fermentacin alcohlica, el cido pirvico de la giclisis
pierde un carbono en la
forma de bixido de carbono para formas acetaldehido, el cual es
reducido a alcohol
etlico, el NADH se convierte en NAD+ (es oxidado). Esta es la
fermentacin que ocurre
normalmente en las levaduras. Como en la fermentacin del cido
lctico, la fermentacin
alcohlica permite a la gliclis continuar y asegurar que el NADH
regresa a su estado
oxidado (NAD+).
La energa neta ganada en la fermentacin es de 2 molculas/glucosa
de ATP. En ambas
fermentaciones (lctica y alcohlica), todo el NADH producido en
la gliclisis es
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consumido en la fermentacin, por lo tanto no hay produccin neta
de NADH, y ningn
NADH entra a la CTE y forma ATP.
1. Clasificacin de las reacciones de fermentacin segn el
agente
a) Fermentacin microbiana. Promovidas o catalizadas por
microorganismos. La
reproduccin de los microorganismos conlleva a que la reaccin
tenga un
comportamiento autocataltico siendo la concentracin de los
microorganismos
variable. Dentro de este tipo de reaccin hay 2 clases bien
definidas:
Cultivos de tejidos o macroorganismos (clulas vegetales y
animales).
Reactores microbianos en s (cultivo de microorganismos).
b) Reacciones enzimticas. Catalizadas por enzimas, el agente
cataltico no se
reproduce y cuando se opera discontinuamente este permanece
constante.
2. Clasificacin de las reacciones de fermentacin segn el consumo
de oxgeno
a) Aerbicas
Aqu los microorganismos necesitan de oxgeno para poder
sobrevivir. Por ejemplo
la reaccin de transformacin de la glucosa.
O2 + C6H12O6 CO2 + BIOMASA
b) Anaerbicas
Aqu los microorganismos no necesitan de oxgeno para su
supervivencia. Por
ejemplo la reaccin de transformacin de la glucosa por va
glucoltica.
C6H12O6 2C2H5OH + CO2 + ENERGA
B. Fermentacin alcohlica
Es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de aire,
originado por la
actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos
de carbono (por regla
general azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la
fructosa, la sacarosa, el
almidn, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en
forma de etanol,
dixido de carbono (CO2) en forma de gas y unas molculas de ATP
que consumen los
propios microorganismos en su metabolismo celular energtico
anaerbico. El etanol
resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas
alcohlicas, tales como el vino,
la cerveza, la sidra, el cava. Aunque en la actualidad se
empieza a sintetizar tambin etanol
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mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para
ser empleado como
biocombustible.
La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica
proporcionar energa
anaerbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en
ausencia de oxgeno para
ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa
necesaria para sobrevivir,
produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la
fermentacin. Las
levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son
microorganismos muy habituales
en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor
de los productos
fermentados. Una de las principales caractersticas de estos
microorganismos es que viven
en ambientes completamente carentes de oxgeno (O2), mxime
durante la reaccin
qumica, por esta razn se dice que la fermentacin alcohlica es un
proceso anaerbico.
La fermentacin alcohlica se puede considerar (desde una
perspectiva humana) como
un proceso bioqumico para la obtencin de etanol, que por otras
vas se ha obtenido
gracias a procedimientos qumicos industriales, como por ejemplo
mediante la reaccin
de oxidacin de eteno. La finalidad de la fermentacin etlica
(desde una perspectiva
microbiana) es la obtencin de energa para la supervivencia de
los organismos
unicelulares anaerbicos. Las bebidas alcohlicas se producen a
partir de diferentes
sustratos, dependiendo de la regin geogrfica y sus riquezas. Las
materias primas pueden
ser azcares simples como los presentes en el jugo de uva, o de
alto peso molecular, como
el almidn de los granos de cebada.
C. Levadura
Las levaduras son los microbios que realizan la fermentacin,
transformando el mosto
azucarado en el vino que es lquido con alcohol y sin azcar. Las
levaduras viven en
nuestro ambiente y llegan a la bodega adherida a la piel de las
uvas. La levadura tiene un
enorme valor por su riqueza nitrogenada y vitamnica. El tamao de
la levadura oscila de
tres a seis micras.
Las levaduras son cuerpos unicelulares (generalmente de forma
esfrica) de un tamao
que ronda los 2 a 4 m y que estn presentes de forma natural en
algunos productos como
las frutas, cereales y verduras. Son lo que se denominan:
organismos anaerbicos
facultativos, es decir que pueden desarrollar sus funciones
biolgicas sin oxgeno. Se
puede decir que el 96% de la produccin de etanol la llevan a
cabo hongos microscpicos,
diferentes especies de levaduras, entre las que se encuentran
principalmente
Saccharomyces cerevisiae, Kluyvero mycesfragilis, Torulaspora y
Zymomonasmobilis.
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Los microorganismos responsables de la fermentacin son de tres
tipos: bacterias, mohos
y levaduras. Cada uno de estos microorganismos posee una
caracterstica propia sobre la
fermentacin que es capaz de provocar. En algunos casos son
capaces de proporcionar un
sabor caracterstico al producto final (como en el caso de los
vinos o cervezas). A veces
estos microorganismos no actan solos, sino que cooperan entre s
para la obtencin del
proceso global de fermentacin. Las propias levaduras se han
empleado a veces en la
alimentacin humana como un subproducto industrial.
Cuando el medio es rico en azcar (como puede ser el caso de las
melazas o siropes), la
transformacin del mismo en alcohol hace que la presencia de una
cierta concentracin
(generalmente expresada en Brix) afecte a la supervivencia de
levaduras no pudiendo
realizar la fermentacin en tal medio (las altas concentraciones
de azcar frenan los
procesos osmticos de las membranas de las clulas). Aunque hay
distintos tipos de
levaduras con diferentes tolerancias a las concentraciones de
azcares y de etanol, el
lmite suele estar en torno a los o de alcohol para las levaduras
del vino, por ejemplo.
Los azcares empleados en la fermentacin suelen ser: dextrosa,
maltosa, sacarosa y
lactosa (azcar de la leche). Los microorganismos 'atacan'
especficamente a cada una de
los hidratos de carbono, siendo la maltosa la ms afectada por
las levaduras. Otros
factores como el nmero de levaduras (contadas en el laboratorio,
o la industria, a veces
mediante cmaras de Neubauer).
Algunos enzimas participan en la fermentacin, como puede ser la
diastasa o la invertasa.
Aunque la nica responsable de convertir los hidratos de carbono
en etanol y dixido de
carbono es la zimasa. La zimasa es la responsable final de
dirigir la reaccin bioqumica
que convierte la glucosa en etanol. La idea de que una sustancia
albuminoide especfica
desarrollada en la clula de la levadura llega a producir la
fermentacin fue ya expuesta
en el ao 1858 por Moritz Traube como la teora enzimtica o
fermentativa y, ms tarde,
ha sido defendida por Felix Hoppe-Seyler hasta llegar al
descubrimiento de Eduard
Buchner que lleg a hacer la fermentacin sin la intervencin de
clulas y hongos de
levadura.
D. Glucolisis
La gluclisis es la primera etapa de la fermentacin, lo mismo que
en la respiracin
celular, y al igual que sta necesita de enzimas para su completo
funcionamiento
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Es una de las rutas ms importante por su frecuencia en los seres
vivos. El metabolismo
de la glucosa comienza con la gluclisis, (ciclo de Embden
Meyerhof) acoplada a la ruta
de las pentosas. Durante la gluclisis una molcula de glucosa
rinde dos molculas de
cido pirvico, es decir una molcula de seis tomos de carbono se
escinde en dos de
tres.
Se puede estructurar en 2 etapas:
1. Pasar de Glucosa a Fructosa-1,6-difosfato. Es una fase de
alteracin
qumica para dejar la molcula til para la clula.
2. Pasar de Fructosa-1,6-difosfato a dihidroxiacetona y
gliceraldehido.
La primera fase Primera fase de la gluclisis
1. La glucosa se fosforila en el alcohol por la hexoquinasa. La
hexoquinasa une el
fosfato del ATP mediante un enlace fosfoster y la transforma en
Glucosa-6-
fosfato. La Glucosa-6-P est preparada para los procesos que
continan en la
gluclisis. La fosforilacin transforma 1 molcula neutra en una
molcula cargada
negativamente. Hace que ahora, laglucosa-6-P no pueda volver a
salir por la
membrana debido a su carga negativa.
2. A la clula no le gusta la forma aldosa y hace la forma cetosa
(Fructosa-6-P). Es
realizado por la fosfoglucosa isomerasa.
3. Implica la adquisicin de un segundo fosfato que va a parar al
C1 y forma la
fructosa-1,6-bisfosfato. Lo realiza la fosfofructoquinasa-1
(PFK-1). La fructosa-
1,6-bisfosfato es completamente simtrica. La PFK-1 es un enzima
clave en la
gluclisis.
4. La fructosa-1,6-bisfosfato se parte por la mitad y da dos
molculas
(dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y gliceraldehido-3-fosfato
(G3P)). La
gluclisis se da a partir del gliceraldehido-3-P. El equilibrio
est desplazado hacia
la dihidroxiacetona-fosfato. Slo un 5% es Gliceraldehido-3-P. La
desaparicin
continua de G3P transforma la DHAP en G3P. Todo acaba siendo
G3P.
Segunda fase de la gluclisis
A partir del G3P comienzan las transformaciones que dan lugar a
Piruvato (Pyr)
(reacciones de oxidacin).
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1. La primera reaccin es que el enzima
Gliceraldehido-3-Fosfatodeshidrogenasa
oxida el grupo aldehdo a cido (gasta un NAD, que se reduce a
NADH). Produce
un enzima que escapaz de incorporar un fosfato al cido
carboxlico
correspondiente. Se forma un ster. La fosforilacin a nivel de
sustrato se consigue
porque hay ATP con un fosfato ya activado.
2. El 1,3-Bisfosfoglicerato cede 1 fosfato para sintetizar ATP.
La reaccin la cataliza
la fosfoglicerato quinasa. El producto de la sntesis de ATP es
el 3-fosfoglicerato.
Sufre transformaciones que dan lugar a la sntesis de Piruvato.
El P3 debe pasar a
la posicin 2.Se consigue mediante el enzima fosfogliceromutasa.
La mutasa tiene
un fosfato activo, que se lo da a la posicin 2. En un momento
hay dos fosfatos,
pero luego, se lo quita de la posicin 3. Todas las mutasas
funcionan as. Se hace
para liberar el OH en la posicin 3.
3. Se produce la deshidratacin del OH. Se transforma el alcohol
en enol, por la
enolasa. Es parecido a Piruvato, pero con enol y un fosfato. Se
llama fosfoenol
piruvato (PEP). Es una molcula muy inestable que se transforma
en Piruvato por
la Piruvato quinasa y se acopla la energa que se desprende para
sintetizar ATP.
ANLISIS ESTEQUIOMTRICO DE LA GLUCLISIS
La gluclisis es una va que transforma la glucosa en Piruvato y,
a su vez, reduce 2
NAD+ del citosol a NADH y usa 2 Adp para formar 2 ATP.
La clula en cuanto puede, transforma otros monosacridos a
molculas que estn en
la va de la gluclisis.
Glucosa + 2Pi + 2 ADP + 2 NAD+ 2 Pyr + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2
H2O
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Figura 2. Diagrama de la glucolisis
Limitaciones del Proceso
La determinacin de los factores que limitan la gliclisis
fermentativa del etanol son
complejos debido a la interrelacin existente y a la naturaleza
de los parmetros
intervinientes durante el proceso de fermentacin. Algunos de
ellos se deben tener en
cuenta en la fermentacin alcohlica industrial. En las
limitaciones que surgen durante el
proceso se pueden enumerar algunos de los ms importantes como
son:
Concentracin de etanol resultante. Una de las principales
limitaciones del
proceso, es la resistencia de las levaduras a las
concentraciones de etanol (alcohol)
que se llegan a producir durante la fermentacin, algunos
microorganismos como
el Saccharomyces cerevisiae pueden llegar a soportar hasta el
20% de
concentracin en volumen. En ingeniera bioqumica estos
crecimientos se
definen con las ecuaciones de crecimiento celular dadas por las
ecuaciones de
Tessier, Moser y de la ecuacin de Monod.
Acidez del substrato. El pH es un factor limitante en el proceso
de la fermentacin
ya que las levaduras se encuentran afectadas claramente por el
ambiente, bien sea
alcalino o cido. Por regla general el funcionamiento de las
levaduras est en un
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rango que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos
industriales
procuran mantener los niveles ptimos de acidez durante la
fermentacin
usualmente mediante el empleo de disoluciones tampn. Los cidos
de algunas
frutas (cido tartrico, mlico) limitan a veces este proceso.
Concentracin de azcares. La concentracin excesiva de hidratos de
carbono en
forma de monosacridos y disacridos puede frenar la actividad
bacteriana. De la
misma forma la baja concentracin puede frenar el proceso. Las
concentraciones
lmite dependen del tipo de azcar as como de la levadura
responsable de la
fermentacin. Las concentraciones de azcares afectan a los
procesos de osmosis
dentro de la membrana celular.
Contacto con el aire. Una intervencin de oxgeno (por mnima que
sea) en el
proceso lo detiene por completo (es el denominado Efecto
Pasteur). Esta es la
razn por la que los recipientes fermentadores se cierren
hermticamente.
La temperatura. El proceso de fermentacin es exotrmico, y las
levaduras tienen
un rgimen de funcionamiento en unos rangos de temperatura
ptimos, se debe
entender adems que las levaduras son seres mesfilos. Si se
expone cualquier
levadura a una temperatura cercana o superior a 55 C por un
tiempo de 5 minutos
se produce su muerte. La mayora cumple su misin a temperaturas
de 30 C.
Ritmo de crecimiento de las cepas - Durante la fermentacin las
cepas crecen en
nmero debido a las condiciones favorables que se presentan en el
medio, esto
hace que se incremente la concentracin de levaduras.
E. CICLO DE KREBS.
El ciclo de Krebs se desarrolla en las mitocondrias. El cido
pirvico formado durante la
gluclisis se convierte en acetil CoA, el cual a travs del ciclo
de krebs se transforma en
anhdrido carbnico. El paso de cido pirvico a acetil CoA tiene
lugar en la matriz
mitocondrial y es catalizado por la piruvato deshidrogenasa. El
acetil CoA ahora entra en
el ciclo de krebs unindose al cido oxalactico para formar el
cido ctrico, por medio
de una isomerasa se transforma en isoctrico, el cual por medio
de una descarboxilasa da
lugar al alfa-cetoglutrico, este paso supone la liberacin de
anhdrido carbnico y
NADH.
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Figura 3. Diagrama del ciclo de krebs
El proceso comienza con la oxidacin del piruvato, produciendo un
acetil-CoA y un CO2.
El acetil-CoA reacciona con una molcula de oxalacetato (4
carbonos) para formar citrato
(6 carbonos), mediante una reaccin de condensacin.
A travs de una serie de reacciones el citrato se convierte de
nuevo en oxalacetato. El
ciclo consume netamente 1 acetil-CoA y produce 2 CO2. Tambin
consume 2 NAD+ y 1
FAD, produciendo 3 NADH y 3 H+ y 1 FADH+.
El resultado de un ciclo es (por cada molcula de piruvato): 1
GTP, 3 NADH, 1 FADH2,
2CO2
Cada molcula de glucosa produce (va gluclisis) dos molculas de
piruvato, que a su
vez producen dos acetil-CoA, por lo que por cada molcula de
glucosa en el ciclo de
Krebs se produce: 2 GTP, 6 NADH, 2 FADH2, 4CO2.
Por cada molcula de acetil CoA se forman dos molculas de
anhdrido carbnico, una
GTP, tres NADH y un FADH2, el ciclo necesita la incorporacin de
dos molculas de
agua.
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En el ciclo de krebs se encuentran acopladas las lanzaderas, las
cuales intervienen en
diferentes procesos anablicos. De esta forma a partir del ciclo
de krebs pueden formarse
aminocidos, cidos grasos incluso glucosa (gluconeognesis).
Figura 4.Reacciones del ciclo de krebs
F. RESPIRACIN:
La reaccin qumica global de la respiracin es la siguiente:
C6 H12 O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + energa (ATP)
En este punto la clula ha ganado solo 4 ATP, 2 en la gluclisis y
dos en el ciclo de Krebs,
sin embargo ha capturado electrones energticos en 10 NADH2 y 2
FADH2. Estos
transportadores depositan sus electrones en el sistema de
transporte de electrones
localizado en la membrana interna de la mitocondria.
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La cadena respiratoria est formada por una serie de
transportadores de electrones
situados en la cara interna de las crestas mitocondriales y que
son capaces de transferir
los electrones procedentes de la oxidacin del sustrato hasta el
oxgeno molecular, que se
reducir formndose agua.
Como resultado de esta transferencia de electrones, los
transportadores se oxidan y se
reducen alternativamente, liberndose una energa que en algunos
casos es suficiente para
fosforilar el ADP y formar una molcula de ATP. Se trata de la
fosforilacin oxidativa
que permite ir almacenando en enlaces ricos en energa la energa
contenida en las
molculasNADH2, FADH2, NADPH2, que se liberan en la gluclisis y
en el ciclo de
Krebs y que ser ms tarde fcilmente utilizada. Toda cadena
respiratoria que comience
por el NAD conduce a la formacin de 3 ATP mientras que si
comienza por el FAD
produce slo 2ATP. El rendimiento energtico del NADP es similar
al del NAD, as como
el del GTP loes al del ATP.
IV. MATERIALES Y MTODOS
A. Materiales e instrumentos
Materiales
Levadura instantnea (Microorganismo: Saccharomyces
cerevisiae)
Agua destilada
Matraces 250 ml.
Algodn
Azcar
Equipos
Brixmetro
Balanza analtica Sartorius
B. Metodologa
Pesar los matraces, para sacar clculos posteriores.
Preparar dos soluciones de sacarosa al 10% y 20 %
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Luego de esto verter en las soluciones 0.3% de levadura,
diluirla en la solucin y
tapar con algodn la boca de los matraces,
Tomar peso y Brix en el tiempo 0, luego tomar peso cada 24
horas, luego de siete
pesadas tomar peso y Brix para los clculos.
Encontrar la prdida de peso y cantidad de glucosa consumida
(Brix).
Determinar el rendimiento real (g etanol/g sacarosa).
Calcular el rendimiento terico y experimental de la
levadura.
Calcular finalmente la eficiencia de las levaduras.
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Tabla 1. Datos preliminares de la Solucin de Sacarosa a
10Brix
Solucin al 10% de Sacarosa
Tiempo Brix Peso (g) pH
0 9.5 810.24 7.28
1 - 797.54 3.59
2 - 782.24 3.54
3 - 759.42 3.44
4 - 751.23 3.47
5 - 747.35 3.46
6 1 745.06 3.45
Segn Casas (1999), si las soluciones de sacarosa donde se va a
realizar la fermentacin
estn muy concentradas, las levaduras expuestas en ellas no
fermentarn, por lo que se
tendra que bajar la concentracin de slidos de la sacarosa y
glucosa. En nuestra prctica
esto se puede observar que nosotros trabajamos con concentracin
del 10 y 20% de
sacarosa y glucosa y no ha concentraciones mayores ya que las
levaduras no fermentaran
a ms de 30% de concentracin.
La fermentacin est influenciada por varios factores como la
temperatura, pH,
concentracin de azcares y otras variables que influyen en el
crecimiento de los
microorganismos (Gmez, et al 2007).
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La temperatura ptima para la formacin de alcohol se estima en el
rango de 32 C a 35
C (Navarro et al, 1986). Es por este motivo que nosotros en
nuestra prctica hemos
controlado el pH y el Brix.
Tabla 2. Resultados de la Solucin de Sacarosa a 10Brix
Solucin de Sacarosa al 10%
CO2 producido m+n 65.1800 g
Sacarosa Hidrolizada 69.5222 g
Glucosa Producida X+Y 73.1813 g
Respiracin X 30.0709 g
m 44.1040 g
Fermentacin Y 43.1105 g
n 21.0760 g
Etanol ( C2H5OH) 22.0340 g
Rendimiento Terico
(g C2H5OH /gC12H22O11)
52.6316
Rendimiento Experimental
(g C2H5OH /gC12H22O11)
31.6935
Eficiencia (n) 60.2176
Segn Jeffries (2005), a nivel industrial el contenido de alcohol
producido por las
levaduras debe estar entre 51% en peso y rendimiento de alcohol
en la fermentacin debe
ser aproximadamente de 7%. En la Tabla 2, vemos que obtuvimos
una eficiencia de
60.22% a 10 Brix, por lo que vemos que no coincide con lo
expuesto por el autor, por lo
que podemos decir que puede deberse al tipo de levadura que
utilizamos.
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Tabla 3. Datos preliminares de la Solucin de Sacarosa a
20Brix
Solucin al 10% de Sacarosa
Tiempo Brix Peso (g) pH
0 19 752.53 7.09
1 - 738.52 3.60
2 - 722.49 3.49
3 - 689.90 3.30
4 - 679.57 3.28
5 - 676.02 3.26
6 3 675.24 3.24
De acuerdo con Caon, et al (1988); las levaduras llevan a cabo
la respiracin anaerbica
en presencia de oxgeno y respiracin anaerobia en ausencia de
oxgeno, en dicha
fermentacin se produce bixido de carbono y alcohol etlico, a la
vez estas levaduras
para metabolizarlas se usarn varias soluciones de carbohidrato
para metabolizarlas. En
nuestra prctica en las tablas 1 y 3 nos demuestran que los
comportamientos de la
fermentacin son comunes en donde la cantidad de azcar es
representada por los Brix,
los cuales vemos que van disminuyendo durante el tiempo de
fermentacin (96 horas),
por lo que la levadura necesitar un sustrato para que pueda
producir su alcohol y CO2
(carbohidratos).
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Tabla 4. Resultados de la Solucin de Sacarosa a 20Brix
Solucin de Sacarosa al 10%
CO2 producido m+n 77.2900 g
Sacarosa Hidrolizada 122.7235 g
Glucosa Producida X+Y 129.1826 g
Respiracin X 16.2766 g
m 23.8723 g
Fermentacin Y 112.9060 g
n 55.1985 g
Etanol ( C2H5OH) 57.7075 g
Rendimiento Terico
(g C2H5OH /gC12H22O11)
52.6316
Rendimiento Experimental
(g C2H5OH /gC12H22O11)
47.0224
Eficiencia (n) 89.3425
Segn Gooding (1997), un incremento en la concentracin de etanol
supone un obstculo
a medida que pase la fermentacin lo cual ser un obstculo para el
crecimiento y
desarrollo microbiano por los efectos negativos, disminuyendo su
calidad y selectividad,
por lo que las levaduras en un medio con alta concentracin
alcohlica pierden
propiedades funcionales y no pueden retener cofactores y
coenzimas con alta
concentracin alcohlica. En la prctica en la obtencin del etanol
se realiz en 2
concentraciones de sustrato del 10 y 20% de sacarosa en lo cual
en las Tablas 2, 4 y se
presentan los datos obtenidos de la produccin del etanol
encontrados resultando que la
produccin de etanol mayor es en el caso de Sacarosa al 20% con
un valor de 57.7075.
Por lo que podemos decir que a un mayor contenido de sustratos
va a implicar una mayor
produccin de etanol como en el caso de la sacarosa al 20% lo
cual se dio en este caso.
Segn Navarro (1986), la Sacchormyces cerevisae para producir
etanol de sustrato del 10
y 20 % de sacarosa donde la produccin mxima de etanol es de
1.496 g/L y 1.45 g/L,
las cuales fueron obtenidas en 24 horas de fermentacin , por lo
que su rendimiento fue
de 0.26 y 0.40 de etanol producido por cada gramo de substrato
consumido. Estos
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resultados comparndolos con lo de nuestra prctica vemos que son
bajos, un indicador
de rendimiento de la produccin de etanol, es aquel referido al
rendimiento terico (0,52
g etanol/g sacarosa consumida) para nuestro caso estos son 31 y
47% aproximadamente,
donde la mayor eficiencia lo presentan las muestras que tienen
como sustrato a la sacarosa
en concentracin del 20% con un valor de 47.0224%.
Tabla 5. Comparacin de los valores encontrados en la respiracin
y Fermentacin
Valores Solucin 10Brix Solucin 20Brix
C6H12O6 consumida
en la fermentacin 43.1105 112.906
C6H12O6 consumida
en la respiracin 30.0709 16.2766
CO2 producido durante
la Fermentacin 21.076 55.1985
CO2 producido durante
la Respiracin 44.104 23.8723
En la Tabla 5, se indican los resultados de la glucosa consumida
durante la fermentacin
y respiracin, el CO2 tambin para ambos casos. Podemos darnos
cuenta que para la
solucin al 20% existe un mayor consumo de glucosa y una menor
produccin de CO2
con respecto a la solucin del 10%, este resultado indica que en
la solucin al 20% un
mayor porcentaje de la glucosa se degrado por la va fermentativa
y en menor porcentaje
por la respiracin aerobia en comparacin a la otra solucin. Esta
aclaracin se justifica
en que por cada 180g de glucosa consumida por fermentacin se
generan 88g de CO2
mientras que por respiracin se producen 264g de CO2 (Surez &
igo , 2004).
Tabla 6. Rendimiento y Eficiencia de la capacidad fermentativa
de la levadura
Variable Solucin 10Brix Solucin 20Brix
g Alcohol formado 22.034 57.708
Rendimiento (E) 0.3169 0.4702
Rendimiento (T) 0.5263 0.5263
Eficiencia 60.22 89.34
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La levadura Saccharomyces cerevisiae permite una conversin
aproximada del 85% al
cabo de 32 horas y del 90% al cabo de 75 horas en la produccin
de etanol. Sin embargo
en la prctica obtuvimos una eficiencia de 60.22% para la muestra
de 10Bx iniciales y
89.34% para la muestra de 18Bx, esto se debe a muchos factores
que limitan el proceso.
La temperatura de fermentacin se encuentra entre 10 y 35 C, en
este intervalo la
velocidad se duplica por toda elevacin de temperatura de
alrededor de 10C, para caer
espectacularmente por encima de 35C. Estos aumentos d
temperatura favorecen la
presencia de azcares residuales y de un rendimiento de alcohol
menor (Blouin &
Peynaud, 2003).
Otro factor que acondiciona el rendimiento es la concentracin de
azcares ya que una
excesiva concentracin de hidratos de carbono en forma de
monosacridos y disacridos
puede frenar la actividad bacteriana. De la misma forma la baja
concentracin puede
frenar el proceso (Surez & igo, 2004).
De acuerdo con Leveaux & Bouix, 2000 una intervencin de
oxgeno (por mnima que
sea) en el proceso lo detiene por completo (es el denominado
Efecto Pasteur). Esta es la
razn por la que los recipientes fermentadores se cierren
hermticamente.
VI. CONCLUSIONES
Se determin la glucosa consumida para ambas soluciones, siendo
para la solucin
al 10% de sacarosa un consumo de 73.1814 g de los cuales 43.1105
g fueron
consumidos por el proceso de fermentacin y 30.071g por
respiracin. Para la
solucin al 20% de sacarosa el consumo de glucosa fue de 129.1826
g, siendo
consumidos 112.906 g por el proceso de fermentacin y 16.277g por
respiracin
aerobia.
Se determin adems el CO2 producido en ambas soluciones
obtenindose para la
solucin al 10% una produccin de 65.18 g de CO2 del cual le
corresponde 21.076 g
por el proceso de fermentacin y 44.104 g por respiracin. Para la
solucin al 20%
el CO2 producido fue de 79.071 g siendo la produccin de CO2 de
55.20 g por el
proceso de fermentacin y 23.87g por respiracin.
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Tambin se determin la cantidad de alcohol producido para ambas
soluciones siendo los
valores de 22.034g en la solucin al 10% con un rendimiento
experimental de 0.3169g
OH/g Sacarosa y 57.708g en la solucin al 20% de sacarosa con un
rendimiento
experimental de 0.4702g OH/g Sacarosa. La eficiencia de las
levaduras fueron de 60.22%
en la solucin al 10% de sacarosa y 89.34% en la solucin al
20%.
VII. RECOMENDACIONES
Tapar bien los balones para que se d la fermentacin en ausencia
de oxgeno sino
se producir menos alcohol y esto influir en el rendimiento.
Es recomendable realizar un estudio para optimizar la produccin
de etanol,
modificando las condiciones de fermentacin, mediante adicin del
sustrato a
diferentes concentraciones, suplementos nutricionales y
reciclado de clulas y
utilizacin de diferentes cepas que sean tolerantes al
etanol.
La fermentacin alcohlica aparte de ser un proceso relativamente
barato para la
obtencin de alcohol, es poco susceptible a contaminacin y posee
altos
rendimientos. Es por ello que se recomienda buscar un sustrato
ms barato
proveniente de algn desecho o residuo para evitar gastar mucho
en sacarosa.
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Blouin, J., & Peynaud, B. (2003). Enologa prctica:
conocimiento y elaboracin del
vino. Madrid: Mundi-Prensa Libros.
CAN, G., ALDANA, O (1988). Estudio de la fermentacin alcohlica
por cochada
empleando reactores de lecho fijo. Proyecto de grado para optar
por el ttulo de
Ingeniero Qumico, Universidad Nacional de Colombia, Bogot.
CASAS, E. (1999). Microorganismos responsables de alteraciones
en alimentos
altamente azucarados. Universidad Complutense de Madrid. Tesis
Doctoral. Facultad
de Ciencias Biolgicas, Departamento de Microbiologa. Madrid,
Espaa.
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Cerevisiae
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Gmez, S. et at; 2007. Capacidad fermentativa de cepas de
Saccharomyces
Cerevisiaenativas de la regin productora de mezcal de Durango.
XII Congreso Naci
onal deBiotecnologa y Bioingeniera. Mxico. Navarro, A. et al;
1986. Produccin de
etanol por fermentacin con alta concentracin levaduras. Revista
Argentina de
Microbiologa 18 (1): 7-11
GOODING, N. (1997). Balance de materia. Quinta edicin,
Universidad Nacional de
Colombia, Bogot.
JEFFRIES, T. (2005). Ethanol fermentation on the move. Nat
biothec., vol. 23, n1.
Leveaux, J., & Bouix, M. (2000). Microbiologa Industrial.
Zaragoza: Editorial
Acribia.
NAVARRO, A. (1986). Produccin de etanol por fermentacin con alta
concentracin
de levaduras. Revista Argentina de Microbiologa 18 (1):
7-11.
Surez, J., & igo, B. (2004). Microbiologa Enolgica:
fundamentos de vinificacin.
Madrid: Ediciones Mundi-Prensa.
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ANEXOS
ANEXO 1.
A. Clculos para para la solucin de Sacarosa a 10Brix
Clculo del peso de CO2
CO2 producido = 810.24 745.06 =65.18 g CO2
Clculo del peso de sacarosa consumida
= (9.5(810.24) 1(745.06))/100 = 69.5222
Clculo del peso de glucosa consumida
= 69.5222 360
342 = 73.1813
Respiracin
+ +
73.1813 264 2
180 = 107.3325 2
Fermentacin
+
73.1813 88 2
180 = 35.7775 2
73.1813 92 25
180 = 37.4038 25
180g 192g 264g 108g
88g 92g 180g
-
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Clculo del porcentaje de glucosa que va a la respiracin
107.3325 2 () + 35.77752 (1 ) = 65.18 2
= 0.4109
m=44.104 ; n=21.076
Respiracin
= 73.1813 0.4109 = .
Fermentacin
= 73.1813 0.5891 = .
43.11 92 25
180 = .
Rendimiento Experimental
=22.034 25
69.5222 =
.
Eficiencia
=
=
0.3169 25
0.5263 25
100 = . %
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ANEXO 2.
Figura 1. Materiales biolgicos utilizados
Figura 2. Materiales biolgicos
utilizados
Figura 3. Soluciones de sacarosa de
10 y 20 Brix