CAMPUS DE MARECHAL CÂNDIDO RONDON CLEONICE LUBIANtede.unioeste.br/bitstream/tede/4707/5/Cleonice_Lubian... · 2020. 2. 13. · Tabela 7 - Número de massas de ovos basais (MB), massas

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ

CAMPUS DE MARECHAL CÂNDIDO RONDON

CLEONICE LUBIAN

POTENCIAL NEMATÓFAGO DE ESPÉCIES DE Hohenbuehelia spp. E DE

Trichoderma koningiopsis SOBRE Meloidogyne javanica NA CULTURA DO

FEIJOEIRO CV. IPR UIRAPURU

MARECHAL CÂNDIDO RONDON – PARANÁ

2019

CLEONICE LUBIAN

ii

POTENCIAL NEMATÓFAGO DE ESPÉCIES DE Hohenbuehelia spp. E DE

Trichoderma koningiopsis SOBRE Meloidogyne javanica NA CULTURA DO

FEIJOEIRO (CV. IPR UIRAPURU)

Dissertação apresentada a Universidade

Estadual do Oeste do Paraná, como parte

das exigências do Programa de

PósGraduação em Agronomia, para

obtenção do título de Magister Scientiae.

Orientador: Odair José Kuhn

Coorientadores: José Renato Stangarlin

Roberto Luis Portz

MARECHAL CÂNDIDO RONDON – PARANÁ

2019

iii

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

C785m

Lubian, Cleonice

Potencial nematófago de espécies de Hohenbuehelia spp. e de

Trichoderma koningiopsis sobre Meloidogyne javanica na cultura do feijoeiro (Cv.

IPR Uirapuru). / Cleonice Lubian. Marechal Cândido Rondon, 2019. 62 f.

Orientador: Prof. Dr. Odair José Kuhn

Coorientadores: José Renato Stangarlin

Roberto Luis Portz

Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Campus

de Marechal Cândido Rondon, 2019.

Programa de Pós-Graduação em Agronomia

1. Fitopatologia. 2. Nematologia. 3. Controle Biológico. II. Universidade Estadual

do Oeste do Paraná. III. Título.

CDD 21.ed. 631.83

CIP-NBR 12899

Ficha catalográfica elaborada por Helena Soterio Bejio – CRB 9a/965

iv

AGRADECIMENTOS

v

À Deus, Senhor de todas as coisas, pela vida e suas virtudes, pela onipresença e

por me fazer compreender fatos pessoais nos caminhos que escolhi trilhar.

À minha família compreensiva, cujos esforços facilitaram nossa conquista.

À excelente orientação do Prof. Dr. Odair José Kuhn, sempre presente, criativo e

encorajador em todos os momentos de dúvida e novas ideias. À excelente coorientação

do Prof. Dr. José Renato Stangarlin e em especial ao Prof. Dr. Roberto Luis Portz que

concordou com a parceria de pesquisa entre universidades, acompanhou o experimento

e forneceu boas alternativas. Pela amizade e experiências profissionais compartilhadas.

Ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia (PPGA), à Universidade Estadual

do Oeste do Paraná – UNIOESTE – Campus Marechal Cândido Rondon e aos seus

profissionais pela instrução teórica e prática, pela estrutura física, aparelhos e materiais.

À Assistente de Coordenação do PPGA, Leila Werlang, por sua atenção,

dedicação e disposição em informar e facilitar todas as etapas do processo do mestrado.

À Universidade Federal do Paraná – UFPR – Setor Palotina pela parceria na

pesquisa, pelo acesso do laboratório de Fitopatologia e da casa de vegetação de

Fitopatologia. Aos técnicos do departamento de Agronomia da UFPR – Setor Palotina,

pelo auxílio na condução do experimento, preparo de materiais e avisos diversos sobre

o funcionamento do laboratório, horários e serviços.

Ao Instituto Agronômico do Paraná – IAPAR, especialmente à Dr.ª Vânia Cirino

Moda, pela gentileza em ceder e enviar sementes de feijão suscetíveis ao patógeno em

questão.

Aos demais colaboradores Danielle Mattei, Nicanor Henkemeier, Jefferson

Carvalho e Bruna Zago, pela ajuda na avaliação do experimento, conselhos experientes

e dicas facilitadoras no processo do bioensaio. Em especial a Bióloga e amiga Andressa

Maiara Agustinha, pelas três semanas consecutivas de auxílio generoso.

A todos os envolvidos minha sincera gratidão!

vi

“A maior recompensa para o trabalho do homem não é o

que ele ganha com isso, mas o que ele se torna com isso”.

(John Ruskin)

RESUMO

LUBIAN, Cleonice. M. S. Universidade Estadual, do Oeste do Paraná, dezembro de

2019. Potencial nematófago de espécies de Hohenbuehelia spp. e de Trichoderma

vii

koningiopsis sobre Meloidogyne javanica na cultura do feijoeiro Cv. IPR Uirapuru.

Orientador: Odair José Kuhn. Coorientadores: José Renato Stangarlin, Roberto Luis

Portz.

As medidas de controle de nematoses são limitadas e há demanda por produtos

biológicos alternativos. O gênero Trichoderma tem sido amplamente investigado, mas

para Hohenbuehelia são raras as pesquisas voltadas ao manejo de nematoides. O

principal objetivo foi avaliar o potencial nematófago de H. mastrucata, H. barbatula, H.

bullulifera, H. portegna, H. petaloides, H. paraguayensis e T. koningiopsis contra M.

javanica na cultura do feijão Cv. IPR Uirapuru, em casa de vegetação. Foram avaliados

o número galhas e massas de ovos na raiz em três regiões da raiz: basal, intermediária

e da extremidade; o fator de reprodução (FR) do nematoide; parâmetros de

desenvolvimento vegetal (altura das plantas nos estágios V1, V2, V4 e R5, comprimento

de raiz, massa seca de parte aérea e de raiz); a dosagem de inóculo e a melhor técnica

de preparo. Os tratamentos foram compostos da interação individual de cada isolado

fúngico com 4000 ovos de M. javanica, tendo uma testemunha absoluta (feijão) e uma

testemunha parcial (feijão + nematoide), dispostos em delineamento inteiramente

casualizado, com quatro repetições. Os dados foram testados por Scott-Knott (5%). A

dose de 0,23 g de arroz colonizado garantiu a permanência do fungo no substrato, sendo

melhor colonizados com adição do fungo no arroz, que o inverso. Apenas a massa seca

de raiz apresentou diferença significativa, com destaque para H. mastrucata, H. portegna

e H. paraguayensis. Maior redução de massas de ovos foram através de H. mastrucata,

H. portegna e H. petaloides, e de galhas, por todas as espécies de Hohenbuehelia. Para

ambos os parâmetros houve controle na região basal, não sendo tão evidente nas

demais porções. Na contagem de número de ovos na raiz, houve destaque para H.

mastrucata com FR de 0,41, seguido por H. portegna (0,76), H. paraguayensis (0,96) e

H. petaloides (1,03).

Palavras-chave: Nematoctonus. Biocontrole. Fitonematoide

ABSTRACT

LUBIAN, Cleonice. M. S. Paraná Western State University, in December 2019.

Nematophagous potencial of Hohenbuehelia spp. and Trichoderma koningiopsis

viii

species over Meloidogyne javanica in bean crop Cv. IPR Uirapuru. Advisor: Odair

José Kuhn. Co-advisors: José Renato Stangarlin, Roberto Luis Portz.

Nematoses controlling strategies are limited and there are demand for alternative

biological products. Trichoderma genus has been widely explored but for Hohenbuehelia

researches are rare for nematode management. The main aim was to evaluate

nematophagous potential of H. mastrucata, H. barbatula, H. bullulifera, H. portegna, H.

petaloides, H. paraguayensis and T. koningiopsis against M. javanica in bean crop Cv.

IPR Uirapuru, in greenhouse. It was evaluated number of galls and eggs masses on root

in three root regions: basal, intermediate and tip; nematode reproduction factor (RF);

vegetal development parameters (plants height on V1, V2, V4 and R5 growth stages, root

length, aerial part and root dry weight); inoculum dose and the best preparation technique.

Treatments were composed by individual interaction of each fungal isolate with 4000 eggs

of M. javanica, having a total control (bean) and a partial control (bean + nematode)

arranged in completely randomized design with four repetitions. Data were tested by

Scott-Knott (5%). The dose of 0,23 g of colonized rice enabled fungi permanency in

substrate, being better colonized by fungal addition to rice than the opposite. Only dry

weight of roots had significant difference, mainly for H. mastrucata, H. portegna and H.

paraguayensis. Higher egg mass reductions were through H. mastrucata, H. portegna and

H. petaloides, and for galls, by all Hohenbuehelia species. For both parameters there was

control at basal portion not being evident to the others root portions. For egg counting on

root, H. mastrucata highlighted with RF of 0.4, followed by H. portegna (0.76), H.

paraguayensis (0.96) and H. petaloides (1.03).

Keywords: Nematoctonus. Bicontrol. Phytonematode.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Perfil de crescimento de isolados de espécies de Hohenbuehelia em extrato

de malte em nove dias de colonização. 528: H. bullulifera, 581: H. paraguayensis, 631:

H. portegna, PET: H. petaloides, 461: H. barbatula e 436: H. mastrucata. .........................

31

Figura 2 - Perfil de colonização de isolados de espécies de Hohenbuehelia e Trichoderma

koningiopsis. 631: H. portegna, 461: H. barbatula, 528: H. bullulifera, 436: H. mastrucata,

581: H. paraguayensis e TLB17: T. koningiopsis, em arroz autoclavado, em diferentes

tempos. ..........................................................................................................................

32

ix

Figura 3 - Colonização de substrato por Hohenbuehelia barbatula inoculado em três

grãos de arroz. Colonização superficial em substrato intacto (A) e interna em substrato

desmanchado (B). ..........................................................................................................

33

Figura 4 - Hohenbuehelia petaloides parasitando plântula (A) e grão de feijão (B), após

14 dias. ...........................................................................................................................

34

Figura 5 - Média de leituras de temperatura (barras) e umidade (linhas), máximas e

mínimas, durante a condução do experimento, atribuída por estádio fenológico.

Experimento conduzido na Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina, de 27/04 a

16/07. .............................................................................................................................

36

Figura 6 - Galhas formadas por Meloidogyne javanica em feijoeiro Cv. Uirapuru no

tratamento com Hohenbuehelia mastrucata após 64 dias de ação do nematoide. ........

46

Figura 7 - Relação indireta entre galhas e massa de ovos de Meloidogyne javanica em

feijoeiro. A = galhas em massas de ovos. B = duas galhas com uma massa de ovos cada

e uma galha com quatro massas de ovos. C = uma galha grande com 10 massas de

ovos

visíveis. ..........................................................................................................................

51

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Diâmetro do crescimento micelial radial (cm) de espécies de Hohenbuehelia

cultivadas em extrato de malte, incubadas em BOD à 25 ºC por 42 dias. ..................... 30

Tabela 2 - Teste de germinação de sementes de feijão em rolo de papel úmido.

Avaliações ao quinto e nono dia de incubação. ............................................................. 33

Tabela 3 - Efeito dos tratamentos na altura de plântulas (cm) e nas porcentagens de

atraso de germinação (% V1), formação de plântulas normais (% PN), folhas muito

pequenas (% FP), folhas deformadas (% FDF), sementes mortas (% SM) e germinação

total (% GT), mensuradas ao 11º dia após a semeadura (V2), onde % PT = porcentagem

de plântulas transplantáveis. Experimento conduzido na Universidade Federal do Paraná

– Setor Palotina, de 27/04 a 16/07. ................................................................................ 37

Tabela 4 - Efeito dos tratamentos na altura de plântulas (cm) nos estágios de

desenvolvimento V2, V3, V4 e R5. Experimento conduzido na Universidade Federal do

Paraná – Setor Palotina, de 27/04 a 16/07. ................................................................... 39

Tabela 5 - Massa seca de raiz de feijoeiro (MSR). Experimento conduzido na

x

Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina, de 27/04 a 16/07. ........................... 40

Tabela 6 - Contagem de galhas basais (GB), galhas intermediárias (GI), galhas

extremidade da raiz (GP) e galhas totais (GT) em função dos tratamentos e respectivos

índices percentuais de redução por região da raiz em comparação com a testemunha de

nematoide. Experimento conduzido na Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina,

de 27/04 a 16/07. ........................................................................................................... 42

Tabela 7 - Número de massas de ovos basais (MB), massas de ovos intermediárias (MI),

massas de ovos da ponta (MP) e massas de ovos totais (MT) e respectivos índices

percentuais de redução por região da raiz em comparação com a testemunha de

nematoide. Experimento conduzido na Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina,

de 27/04 a 16/07. ........................................................................................................... 46

Tabela 8 - Relação entre massas de ovos totais (MT) e massa seca de raiz (MSR) e entre

galhas totais (GT) e MSR em função dos tratamentos e respectivos índices percentuais

de redução em comparação com a testemunha de nematoide. Experimento conduzido

na Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina, de 27/04 a 16/07. ...................... 49

Tabela 9 - Contraste entre massas de ovos totais (MT), galhas totais (GT) e relação entre MT

e GT para os tratamentos. Experimento conduzido na Universidade Federal do


Tabela 10 - Número de ovos, fator de reprodução de Meloidogyne javanica e percentual

de redução do número de ovos para os respectivos tratamentos comparados a

testemunha parcial (nematoide). Experimento conduzido na Universidade Federal do


SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 14

2.1 MELOIDOGINOSES: SINTOMATOLOGIA E DIAGNOSE ........................ 14

2.2 MÉTODOS DE CONTROLE ...................................................................... 16

2.4 SOBREVIVÊNCIA E DESEMPENHO DE FUNGOS NO SOLO ................ 20

3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 22

3.1 OBTENÇÃO E MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS FÚNGICOS ................. 22

3.2 OBTENÇÃO E INOCULAÇÃO DE Meloidogyne javanica ......................... 22

3.3 COLONIZAÇÃO IN VITRO DE HOHENBUEHELIA SPP .......................... 23

3.4 PREPARO DO INÓCULO ......................................................................... 23

3.5 TESTE DE GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE FEIJÃO .......................... 24

xi

3.6 COLONIZAÇÃO RADICULAR ................................................................... 24

3.7 ANÁLISE DE SOLO .................................................................................. 25

3.8 CONTROLE DE Meloidogyne javanica POR ISOLADOS FÚNGICOS E

PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DO FEIJOEIRO ................................................... 26

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 29

4.1 AVALIAÇÕES PRELIMINARES ................................................................ 29

4.1.1 Colonização In Vitro de Hohenbuehelia spp ........................................ 29

4.1.2 Preparo do Inóculo ................................................................................. 30

4.1.3 Teste de Germinação de Sementes de Feijão ...................................... 31

4.1.4 Colonização Radicular ........................................................................... 32

4.2 EXPERIMENTO EM CASA DE VEGETAÇÃO .......................................... 34

4.2.1 Controle de Meloidogyne javanica por Espécies Fúngicas e ............ 36

Promoção de Crescimento do Feijoeiro .................................................................. 36

4.2.2 Avaliação da Altura de Plantas ............................................................. 37

4.2.3 Massa Seca de Raiz e de Parte Aérea e Comprimento de Raiz 39 ... 38

4.2.4 Análises de Galhas e de Massa de Ovos ............................................. 40

4.2.5 Número de Ovos na Raiz e Fator de Reprodução ............................... 48

5 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 52

REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 53

13

1 INTRODUÇÃO

As doenças de plantas causadas pelo parasitismo de fitonematoides acarretam

severas perdas em áreas agricultáveis, com redução de produtividade que pode atingir

níveis alarmantes. Fitonematoides são vermes microscópicos presentes em

praticamente todos os solos, tendo várias plantas como hospedeiras, inclusive plantas

daninhas. Seu ciclo de vida dura em média três semanas, com a geração de centenas

de ovos por fêmea. Sua disseminação ocorre com o transporte de solo e raízes e seu

controle é dificultoso.

O gênero mais preocupante é o Meloidogyne, com mais de 90 espécies polífagas

que causam galhas nas raízes. Galhas são engrossamentos radiculares que debilitam a

absorção de água e nutrientes, enfraquecem a sustentação das plantas e predispõemnas

ao ataque de outro patógenos de solo e aos efeitos dos veranicos. Bebber et al. (2014)

apontam que as espécies M. incognita, M. javanica e M. arenaria estão entre os

patógenos que ganharam mais expressão.

Os agricultores geralmente notam a presença destes patógenos somente em

fases avançadas de parasitismo, quando a produção já está comprometida, pois

atribuem os sintomas indiretos de ataque a outros problemas como compactação do solo

e deficiências nutricionais. Estes sintomas ocorrem em reboleiras com aspecto de

murcha, desfolha e amarelecimento da parte aérea. As reboleiras sinalizam sobre a

possível presença de nematoides.

Em regiões com regularidade pluviométrica, com solos que tenham bons teores

nutricionais e porosidade adequada, a presença dos nematoides permanece mascarada

até que se observem perdas catastróficas e ampla disseminação na propriedade. Por

esta razão análises periódicas de solo são necessárias para determinar a densidade

populacional e diversidade de espécies presentes.

Diversos métodos são recomendados para o controle de nematoides, porém,

existem muitas limitações de uso. O método químico é o mais recorrido, no entanto

apresenta alto custo. Por outro lado, em sistemas de produção orgânica outros métodos

são utilizados, como a solarização. Este, por sua vez, demanda muita mão-de-obra,

sendo inoperante para extensas áreas de cultivo.

14

Atualmente, muitos esforços estão sendo direcionados na busca por alternativas

eficientes e viáveis de controle, como pela investigação de agentes antagonistas

potenciais para o controle biológico, bem como, os procedimentos de formulação de seus

produtos e técnicas de aplicação.

Dentre os agentes de biocontrole, destacam-se os fungos, que são encontrados

naturalmente no solo. Resultados promissores no controle de M. javanica têm sido

comprovados para espécies de Trichoderma. Poucos trabalhos relatam potencial para

espécies de Hohenbuehelia.

O objetivo geral foi investigar o potencial nematófago das espécies H. mastrucata,

H. barbatula, H. bullulifera, H. paraguayensis, H. portegna, H. petaloides e T. koningiopsis

contra M. javanica, na cultura do feijão em casa de vegetação.

Os objetivos específicos incluíram comparar a eficiência de controle entre os

isolados; verificar a atividade dos isolados em diferentes regiões da raiz; averiguar se as

espécies supracitadas causam efeito positivo, negativo ou nulo no desenvolvimento da

cultura do feijão Cv. IPR Uirapuru; registrar a velocidade de colonização das espécies de

biocontrole em questão em meio de cultivo extrato de malte e avaliar o efeito da

associação das espécies fúngicas no índice de germinação da cultivar IPR Uirapuru;

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 MELOIDOGINOSES: SINTOMATOLOGIA E DIAGNOSE

O feijão é uma cultura praticada em todos o Brasil devido a sua adaptabilidade

climática, constituindo-se em importante fonte de renda e de oferta para o mercado

interno (MOURA; BRITO, 2015). Entretanto o ataque de nematoides compromete sua

produtividade.

O gênero Meloidogyne, conhecido como nematoide das galhas, abrange espécies

polífagas e cosmopolitas, adaptadas às regiões temperadas do Brasil (MACHADO,

2014). São reconhecidas mais de 90 espécies, com destaque para M. arenaria, M.

incognita, M. javanica e M. hapla (FERRAZ, 2018).

Neste gênero, os juvenis de segundo estádio (J2) constituem o estádio infectante,

penetrando a parede celular das raízes das plantas através de estilete bucal para

15

secretar substâncias que induzem a formação de células gigantes (BRASS;

VERONEZZE; PACHECO, 2008).

Como resultado do ataque de Meloidogyne spp. em plantas suscetíveis surgem

galhas como sintomas diretos, salvo casos específicos (FERRAZ; BROWN, 2016). No

local de penetração do J2, as galhas são formadas juntamente com um sítio de

alimentação, o cenócito, um dreno metabólito essencial ao desenvolvimento do

nematoide, diferentemente das galhas, que são apenas deformações de hiperplasia e

hipertrofia (FERRAZ, 2018). Enquanto que, a anatomia dos cenócitos compreende várias

células multinucleadas de parede celular espessa e citoplasma denso com grânulos

(WESTERICH et al., 2012).

Em outras palavras, o ataque do J2 em plantas suscetíveis obrigatoriamente induz a

formação do cenócito, podendo ocorrer galhas, sendo ambos resultantes de uma mesma

causa, secreções esofagianas, mas totalmente independentes. Ainda, as galhas podem

surgir precocemente à maturidade das fêmeas (FERRAZ; BROWN, 2016). A

compreensão de tal fato auxilia na diagnose, especialmente na projeção de quadro

epidemiológico.

Com a maturidade da fêmea ocorre a deposição na média de 400 ovos (FERRAZ, 2018)

e exposição de uma massa de ovos que representam a conclusão do ciclo reprodutivo.

A contagem de massas de ovos e fator de reprodução é estudada em diversos

patossistemas para análise de reprodução de Meloidogyne spp. e para avaliar reação de

diversas espécies de importância comercial, como olerícolas (ROSA; WESTERICH;

WILCKEN, 2013), maracujazeiro (GARCIA et al., 2011), batata-doce (CHAVES et al.,

2013), algodoeiro (GALBIERI et al., 2009) e muitas outras.

Sem dúvidas, as massas de ovos são muito mais relevantes no quesito epidemiológico

que as galhas, estas, auxiliares para a diagnose, uma vez que as galhas não são

exclusividade do gênero Meloidogyne (BEDENDO, 2018), para o qual a identificação

taxonômica perineal de fêmeas (TAYLOR; NETSCHER, 1974) e eletroforese da enzima

esterase (CARNEIRO; ALMEIDA, 2001) são de indispensável aplicação, devido a

variabilidade morfológica e mistura de espécies (INÁCIO et al., 2018).

Outro sintoma é a clorose da parte área das plantas devido ao comprometimento de

absorção de água e nutrientes, expresso em reboleiras, podendo ser confundido com

16

deficiências nutricionais (INÁCIO et al., 2018). Neste ponto, o arranquio de raízes para

visualização de galhas se faz útil.

2.2 MÉTODOS DE CONTROLE

Existem vários métodos para o controle de fitonematoides, classificados como

químico, físico, cultural, genético e biológico. Alguns métodos têm aplicação mais ampla,

enquanto outros não podem ser aplicados em qualquer situação. Sempre que possível é

preferível optar pelo manejo integrado de métodos (BEDENDO, 2011; AL-HAZMI;

TARIQJAVEED, 2016).

Em relação ao método químico, Haydock et al. (2006) salientam que mais de 50%

do uso de nematicidas é destinado ao controle de Meloidogyne. Dentre os nematicidas,

o brometo de metila é um fumigante que foi amplamente usado por 40 anos

(TRIKYDOTAN et al., 2016). Entretanto, seu uso foi banido devido a seu amplo espectro

de ação e toxicidade, o que de acordo com Agrios (2005), gera resíduos tóxicos que

podem reprimir a atividade de outros microrganismos edáficos não-alvos, em casos de

uso contínuo, pode causar o chamado “vácuo biológico” do solo (BEDENDO; MASSOLA

JUNIOR; AMORIM, 2011).

Vang et al. (2016) alertam que alguns produtos como Spirotetramat reduzem a

população de nematoides, mas não impedem a formação de galhas e lesões às raízes.

Produtos de contato pouco controlam Meloidogyne spp. que permanecem protegidos

dentro dos tecidos das raízes (FERRAZ; BROWN, 2016). Organofosforados e

carbamatos, não-fumigantes de ação sistêmica, são capazes de controlar nematoides

dentro dos tecidos das plantas, são pouco fitotóxicos, mas afetam mamíferos. Ainda, os

produtos químicos podem ter ação nula nas camadas profundas do solo, onde há

nematoides (BLACHINSKY et al., 2007).

No caso de tratamento de sementes, que reduz a introdução de produto químico

no solo, a capacidade de proteção é pouco durável, limitada, geralmente, a 30 dias após

a emergência de plantas ou a degradação natural do produto (CABRERA et al., 2009).

A rotação de culturas é a principal técnica do método cultural e visa a introdução

de plantas antagonistas ou não hospedeiras no sistema produtivo, na tentativa de reduzir

a população de fitonematoides (RAHMAN; CHAN; HEENAN, 2007). Contudo, Ferraz et

17

al. (2010) advertem que este método por si só pouco resolve tal questão, devido a

polifagia dos fitonematoides e pelo desconhecimento sobre a hospedabilidade das

culturas que resulta num planejamento inadequado de rotação. Além disto, segundo

Lamas et al. (2016), é válido salientar que o esquema predominante é o de sucessão de

culturas, que prioriza o cultivo de poucas culturas comerciais.

O plano de rotação deve considerar variáveis que possuem relação com o ataque

de Meloidogyne, pois estas interações podem potencializar os danos no sistema pela

predisposição das plantas a outras doenças de patógenos de solo, facilitadas pelos

danos físicos às raízes devido ao ataque de Meloidogyne, sendo reconhecido seu

complexo patogênico com Fusarium spp. (SIMÃO et al., 2010).

Portanto, as espécies cultivadas, eventualmente são prejudicadas, como no caso

de rotação entre trigo (F. avenaceum, F. graminearum) e feijão (F. oxysporum f. sp.

tracheiphilum), especialmente quando a espécie de Meloidogyne em questão parasita

ambas as espécies vegetais.

O emprego do controle genético através do uso de cultivares resistentes

representa boa opção. Os nematoides podem ser atraídos por elas e até mesmo

infectálas, porém, tais plantas são capazes de reagir a ação destes patógenos, causando

necrose ou reação de hipersensibilidade que se manifesta no local de alimentação

(RALMI; KHANDAKER; MAT, 2016). Assim, o sítio nutricional torna-se inexplorável,

prejudicando ou impedindo sua reprodução (KIM; KIM; RIGGS, 2012). Todavia, Davies

e Elling (2015) concluem que a durabilidade dos genes de resistência na agricultura

moderna pode ser afetada, devido à redução de variabilidade genética das principais

cultivares introduzidas no sistema de cultivo.

As pesquisas voltadas ao desenvolvimento de materiais geneticamente tolerantes

ou resistentes ao nematoide das galhas enfrenta os desafios da variabilidade de raças

existentes. Geralmente as cultivares apresentam baixo fator de reprodução, mas não

resistência (SANTIN, 2014), além de muita divergência na classificação de cultivares. A

suscetibilidade do feijoeiro (FERRAZ, 2018) ocorre tanto em cultivares da espécie

Phaseolus vulgaris como em P. coccineus, embora haja enxertia de materiais resistente

de P. coccineus em cultivares suscetíveis (PIRES et al., 2016).

Quanto ao método físico, a solarização do solo consiste na cobertura plástica de

uma área total ou parcial, com a finalidade de inviabilizar inóculos fitopatogênicos.

18

Embora seja uma estratégia funcional e duradoura é onerosa e inadequada para áreas

extensas (AL-HAZMI et al., 2017).

Outro problema é a redução de calor nas bordaduras das áreas tratadas que

permite a sobrevivência de nematoides (FERRAZ et al., 2010). Além disto, para ser

viável, a técnica depende de condições climáticas adequadas e de um tempo mínimo de

aplicação de um mês, período em que o solo permanece improdutivo, particularmente

significativo para o rendimento hortícola (BEDENDO; MASSOLA JUNIOR; AMORIM,

2011).

2.3 CONTROLE BIOLÓGICO

O controle biológico consiste no uso de microrganismos antagonistas no local de

infecção, antes ou depois que esta tenha ocorrido (AGRIOS, 2005). De acordo com

Chen; Dickson (2004), este método tem sido estudado desde 1937, porém, o insucesso

de sua aplicação estimulou o uso de organofosfatos e carbamatos entre as décadas de

50 e 70, tempo em que houve diminuição das pesquisas sobre controle biológico,

retomando o interesse ainda na década de 70.

O controle biológico recebe um enfoque especial na atualidade, principalmente

devido ao apelo de implementação de sistemas agrícolas sustentáveis, a fim de reduzir

a dependência de manejo químico que causa impactos negativos à biodiversidade

(MORANDI et al., 2009). Para tanto, há necessidade de crescimento micelial satisfatório

para sua introdução no solo (FERRAZ et al., 2010), além de boa multiplicação e

consistência de resultados para indicação de uso (VIERIA JÚNIOR et al., 2014).

A busca por inimigos naturais de nematoides inclui premissas básicas como a

eficiência na redução da população de diversas espécies, a não patogenicidade às

plantas, animais e seres humanos, resistência às adversidades ambientais, ser

economicamente viável para produção em massa e que permaneça infectivo durante o

período de armazenamento (FERRAZ et al., 2010).

Uma das vantagens deste método em relação aos produtos químicos é seu

limitado espectro de ação, pela especificidade em relação ao patógeno-alvo, privando

nematoides de vida livre que podem ser bioindicadores, micófagos e bacteriófagos que

auxiliam na decomposição de matéria orgânica (EKSCHMITT et al., 2001).

19

Os fungos representam o grupo com as mais interessantes características para o

controle de nematoides, incluindo parasitismo (FERRAZ; SANTOS, 1995), liberação de

enzimas, produção de metabólitos tóxicos (MORGAN-JONES; RODRÍGUEZ-KÁBANA,

1985). Assim, fungos nematófagos que possuam diversificadas habilidades são capazes

de efetuar o controle de nematoides em qualquer estágio de vida que apresentam, de

ovos à adultos (LIU; XIANG; CHE, 2009), como Pochonia chlamydosporia e Trichoderma

spp. (SILVA et al., 2017), representando ótima estratégia de substituição de nematicidas

(HAMZA et al., 2017).

Diversas espécies de fungos são encontradas em associações naturais com

massa de ovos de nematoides em galhas de plantas como Purpureocillium lilacinum (syn.

Paecilomyces lilacinus), Penicillium sp. Aspergillus flavus, A. terreus, A. nidulans, A.

niger, Acremonium strictum, Chladosporium oxysporum, Fusarium chlamydosporium, F.

dimarum, F. oxysporum, F. solani, Chetomium aubense, Mucor sp., Pochonia

chlamydosporia, Trichoderma viride e T. harzianum (SINGH; MATHUR, 2010).

O gênero Trichoderma é o mais amplamente investigado (BETTIOL et al., 2008),

inclusive, em detalhes de biologia molecular (VINALE et al., 2008), com vários estudos

relacionados ao controle de M. incognita: T. asperellum (HERNÁNDEZ-OCHANDÍA et

al., 2015), T. hamatum, T. brevicompactum, T. erinaceum (AFFOKPON et al., 2011), T.

harzianum (SAHEBANI; HADAVI, 2008), T. virides (KAVITHA; JONATHAN;

UMAMAHESWARI, 2007) e outros.

Por outro lado, pouco se sabe sobre o potencial de controle de nematoides pela

atividade do gênero Hohenbuehelia, limitando-se aos estudos de Putzke et al. (2007),

em casa de vegetação contra M. incognita.

Hohenbuehelia é um gênero de fungo do filo Basidiomicota, formadores de fíbulas

nos septos de hifas. Várias espécies deste filo desempenham atividade decompositora,

buscando nos nematoides uma fonte secundária de nutriente, especialmente o nitrogênio

(BARRON, 2003). Este gênero, cuja fase assexual é Nematoctonus, é capaz de produzir

toxinas de ação nematicida (KENNEDY; TAMPION, 1978).

Quanto as análises in vitro, Thorn e Barron (1984) citam a identificação de 108

espécies do gênero Hohenbuehelia, das quais H. atrocaerulea, H. paraguayensis, H.

portegna, H. petaloides, H. mastrucata e H. grisea são endoparasitas e possuem

habilidade nematófaga. Durschner-Pelz (1987) elucida que Nematoctonus contém

20

espécies predadoras. Lubian et al. (2018) verificaram a atividade nematófaga de H.

mastrucata, H. paraguayensis e H. portegna contra P. redivivus e fraco potencial de H.

bullulifera como endoparasita, embora tenha apresentado ação repelente.

2.4 SOBREVIVÊNCIA E DESEMPENHO DE FUNGOS NO SOLO

A capacidade de permanência de um fungo no solo varia em função de sua

preferência de colonização na rizosfera (BOURNE; KERRY; DE LEIJ, 1996), em resposta

a liberação de exsudatos radiculares (MAUCHLINE; KERRY; HIRSCH, 2004), de acordo

com a diversidade de estruturas infectivas e modo de ação que possui (LIU; XIANG;

CHE, 2009), em contraste com o veículo de inoculação (MARÍN-GUIRAO et al., 2016),

pela dinâmica hídrica do solo (MANZONI; SCHIMEL; PORPORATO, 2012), pela

temperatura do solo e qualidade do substrato (DALLEMOLE-GIARETTA et al., 2008;

FREY et al., 2013) entre vários outros fatores.

Devido a inexistência de produtos comercializados à base de Hohenbuehelia para

o controle de fitonematoides é necessário encontrar fontes de nutrientes viáveis e que

proporcionem um bom crescimento micelial, para em perspectiva futurista, otimizar sua

produção em escala comercial. Precedendo as tentativas com resíduos industriais, testes

preliminares como a influência na germinação e outros devem ser feitos. Segundo Silva

et al. (2017) o estabelecimento do agente de biocontrole na rizosfera é o principal passo

para garantir a interação com o nematoide.

Barron (2003) investigou a capacidade de decomposição de madeira por

espécies de Hohenbuehelia. A alta relação carbono nitrogênio das madeiras seria

insuficiente para atender a demanda nutricional e de sobrevivência dos fungos. Embora

tivesse detectado a produção de celulases e lignases por tais espécies, o que o

conduziu a isola-las e testálas contra nematoides, obtendo resultados positivos in vitro.

Então concluiu que tal capacidade nematófaga é uma habilidade secundária, porém,

essencial.

Segundo Drechsler (1941) conídios da fase assexual das espécies endoparasitas

Nematoctonus leiosporus e N. tylosporus germinam e produzem substâncias adesivas

que se aderem ao corpo do nematoide. As espécies N. leptosporus e N. pachysporus

também são endoparasitas. Já N. haptocladus, N. concurrens, N. campylosporus, N.

21

robustus, N. lignicola e N. tripolitanius são predadoras, formando armadilhas e alças

adesivas, sendo capazes de capturar vários nematoides através de uma única hifa.

Kennedy; Tampion (1978) observaram produção de enzima nematotóxica em N.

robustus, mas não para N. haptocladus.

Chen e Dickson (2004) frisam que a atividade saprofítica de Nematoctonus não

está claramente elucidada, característica esta, importante para esclarecer sua

permanência no solo, podendo se tratar de um endoparasita facultativo, como Barron

(2003) sugeriu, ou um endoparasita obrigatório. Neste último caso, o fungo pode

desaparecer do solo se lhe faltar uma quantidade mínima de nematoides, assim como

ocorre para Hirsutella rhossiliensis, que nas observações de Jaffee e Zehr (1985)

demonstrou ser um fraco competidor saprófita, também influenciado pelo substrato e

temperatura.

Thorn e Barron (1986) presumem que a produção de esporos de Nematoctonus

ocorra em locais com alta atividade microbiológica e que germinem rapidamente para

formar alças adesivas para o parasitismo, muito embora nunca tenha visto nematoides

serem controlados mediante esta suposta situação. A frequência e quantidade de

conídios produzidos também são detalhes desconhecidos.

Além de pouca informação, a literatura apresenta controvérsia sobre a ação de

espécies, como no caso de isolados de Hohenbuehelia nigra que difeririam de modo

discrepante, um com potencial nematófago e outro não (THORN; BARRON, 1986).

Hohenbuehelia bullulifera pertence à mesma chave taxonômica que H. nigra (FAZIO;

ALBERTÓ, 2001), sem relatos sobre seu desempenho.

Agbenin (2011) alerta que o desconhecimento sobre características básicas para

fundamentar a recomendação de bionematicidas constitui um dos principais obstáculos

de seu uso por parte dos agricultores. Para Morandi et al. (2009), esta é uma evidência

sobre a demanda por pesquisas relacionadas aos procedimentos para a formulação de

produtos.

Esta pesquisa foi conduzida a fim de determinar parâmetros importantes na

interação de biocontrole, justificada pela(os): a) constatação in vitro do potencial de

controle de espécies do gênero Hohenbuehelia; b) desconhecimento sobre o

desempenho de espécies do gênero contra M. javanica em casa de vegetação; c) relatos

22

sobre a dificuldade de controle de M. javanica; e d) crescente requisição por agentes

biológicos alternativos. Pela primeira vez será relatado o potencial de H. mastrucata e H.

petaloides contra um fitonematoide em casa de vegetação.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 OBTENÇÃO E MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS FÚNGICOS

As espécies do gênero Hohenbuehelia utilizados foram coletados em fragmentos

de Floresta Estacional Semidecidual do município de Palotina – PR. Os basidiocarpos

destas espécies foram mantidos no herbário do Laboratório de Taxonomia de

Criptógamas e Fungos da Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina, enquanto

que seus micélios foram conservados em Castellani (CAPRILES et al., 1989), mantidos

em câmaras de crescimento (BOD) à 23,3º C no Laboratório de Fitopatologia da

Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina sendo identificados como: 436 – H.

mastrucata, 461 – H. barbatula, 528 – H. bullulifera, 581 – H. paraguayensis, 631 – H.

portegna e H. petaloides (VG Cortez/sn).

O isolado TLB17 Trichoderma koningiopsis foi obtido em solos agrícolas do

Município de Entre Rios do Oeste – PR e pertence a Micoteca da Universidade Estadual

do Oeste do Paraná – campus Marechal Cândido Rondon.

3.2 OBTENÇÃO E INOCULAÇÃO DE Meloidogyne javanica

Raízes de quiabo sintomáticas foram coletadas em propriedade de manejo

orgânico e submetidas ao processo de extração de nematoides, através de peneiramento

e flutuação centrífuga em solução sacarose, segundo a metodologia de Jenkins (1964).

Para a identificação da espécie, fêmeas foram transferidas para uma gota de

solução de ácido lático a 45%. Cortes da região perineal foram montados em lâmina com

glicerina e avaliados por meio de microscópio ótico (TAYLOR; NETSCHER, 1974). A

análise morfológica foi baseada na chave taxonômica proposta por Chitwood (1949).

Paralelamente à identificação taxonômica, os nematoides foram calibrados em

solução resultante da extração adicionada em Câmara de Peters para contabilização do

23

número de ovos e eventuais juvenis de segundo estágio (J2). De tal modo, foi estimada

a população de 4000 ovos/J2, sendo preparados para a inoculação dos tratamentos

Decorridos cinco dias da transferência das plântulas aos vasos, os ovos foram

introduzidos no solo em dois pontos equidistantes próximos às raízes com auxílio de

pipeta eletrônica direcionada diagonalmente, ao final de tarde.

3.3 COLONIZAÇÃO IN VITRO DE HOHENBUEHELIA SPP.

A época de preparo de inóculo depende da eficiência de colonização in vitro. As

espécies de Hohenbuehelia foram cultivados em diferentes meios de cultivo com ágar:

batata-dextrose-ágar (BDA), estrato de malte (EM), mistura V8 e meio de cenoura.

Para esta avaliação, a repicagem dos isolados 436 – H. mastrucata, 461 – H.

barbatula, 528 – H. bullulifera, 581 – H. paraguayensis, 631 – H. portegna e H. petaloides

(VG Cortez/sn) ocorreu em 12/05/17 e consistiu na transferência de discos de micélio

jovem (2,85 mm de diâmetro) provenientes das extremidades ativas de colônias matrizes

para o centro de placas de Petri contendo extrato de malte. As placas foram vedadas

com Parafilme e incubadas em BOD à 23,3 ºC, sob condição de ausência de luz. Cada

tratamento teve cinco placas que representaram as repetições.

Para a mensuração de crescimento micelial, o verso das placas foi delimitado em

quatro quadrantes, para cada qual, a expansão do micélio foi estimada em centímetros.

As avaliações foram intercaladas em cinco dias, totalizando 13 avaliações dentre

17/05/17 a 16/07/17. Cada tratamento teve 5 repetições, com placas organizadas em

delineamento inteiramente casualizado. Os dados foram registrados em planilha de

monitoramento.

Os dados de crescimento micelial (cm) foram avaliados pelo teste de Tukey a 5%

de probabilidade através do programa SISVAR 5.6® (FERREIRA, 2011).

3.4 PREPARO DO INÓCULO

Após o crescimento micelial de Hohenbuehelia spp. e T. koningiopsis ter tido maior

êxito em EM, foi testada a maneira mais eficiente de colonização do veículo de

inoculação. Para tanto, 10 plugs de 3 mm de micélio marginal puro foram adicionados

24

em 42 gramas de arroz estéril (120 ºC, 1 atm) pré-cozido para a colonização dentro de

10 béqueres com capacidade de 100 mL, vedado, cinco deles embalados em papel

alumínio e outros cinco sem, mantidos em BOD à 25 ºC. De outro modo, 10 gramas de

arroz estéril foram dispostos acima do micélio em desenvolvimento de cada espécie

contento EM, em 10 placas de Petri cada, vedadas, cinco embaladas em papel alumínios

e cinco não embaladas, e armazenadas em BOD à 25 ºC.

A avaliação qualitativa consistiu na verificação visual de desenvolvimento micelial,

até a massa de grãos de arroz apresentar aspecto cotonoso do crescimento micelial.

3.5 TESTE DE GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE FEIJÃO

Sementes de feijão Cv. IPR Uirapuru foram submetidas ao teste de germinação

conforme as Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 2009).

A análise foi constituída da disposição aleatória de 50 sementes por meio de

placas perfuradas em rolo de papel úmido. Os rolos foram incubados em BOD, a 25 ºC,

com água na cuba inferior. As avaliações ocorreram no quinto e nono dia.

Os tratamentos foram organizados em delineamento inteiramente casualizado,

com oito repetições.

3.6 COLONIZAÇÃO RADICULAR

Para a determinação de dose mínima de inóculo que viabilizasse a inoculação

eficaz dos fungos no substrato, em teste preliminar, sementes de feijão Cv. IPR Uirapuru

foram semeadas a 2 cm de profundidade em bandejas de 128 células (uma semente por

célula) contendo substrato comercial para orquídeas, no qual grãos de arroz colonizados,

em diferentes doses, precederam a introdução da semente, em contato íntimo.

Os tratamentos consistiram em três dosagens de arroz para cada isolado,

baseado na relação de número de grãos de arroz colonizado para uma semente de feijão.

Sendo eles: T1 – um grão de arroz colonizado; T2 – dois grãos de arroz colonizado; T3

– quatro grãos de arroz colonizado; T4 – testemunha (apenas feijão).

Os tratamentos foram organizados em delineamento inteiramente casualizado,

com cinco repetições.

25

A avaliação foi através da altura das plântulas, desconsiderando aquelas com

deformação nas folhas e da ocorrência de colonização do substrato e/ou raízes, com

resultado positivo ao se visualizar a presença esbranquiçada do micélio no substrato.

Caso algum isolado manifestasse dano ao processo de emergência ou não

conseguisse estabelecer colonização no substrato, este poderia ser eliminado dos

próximos testes.

3.7 ANÁLISE DE SOLO

A análise física do solo Latossolo Vermelho Eutroférrico revelou a composição de

13,60% de argila, 70,63 % de silte e 15,77% de areia.

Baseada na análise química do solo e na metodologia de Novais, Neves e Barros

(1991), específica para condução de experimento em vasos, uma vez que o

aproveitamento de nutrientes em vaso difere daquela à campo, a adubação foi corrigida

para alcançar 100 mg dm3 de nitrogênio, 300 mg dm3 potássio e 150 mg dm3 de fósforo,

correspondendo, por vaso, às quantidades de 1,7 g de cloreto de potássio, 2,45 g de

MAP e 1,43 de sulfato de amônia.

O laudo da análise química do solo mostrou que ambos os teores de potássio e fósforo

se encontravam em nível bom, para solo com 13% de argila, segundo Vieira et al. (2015).

Nesta condição, segundo os mesmos autores, é recomendável a aplicação de 20 e 30

kg ha-1 de K2O e P2O5, respectivamente. Além de 20 kg de nitrogênio em cobertura para

melhor estabelecimento do feijoal. Como fonte nutricional foram utilizados o cloreto de

potássio (60% de K2O), MAP (44% de P2O5) e sulfato de amônia (21% de N), sendo

considerada uma população de 200.000 plantas por hectare.

Para a adubação potássica, considerando 68,2 kg MAP ha-1 foi adicionado 0,34 g de

MAP ao vaso. Enquanto que para a adubação nitrogenada, considerando 95,23 kg de

(NH4)2SO4 ha-1 foi adicionado 0,476 g de sulfato de amônia ao vaso. Quanto ao

incremento de matéria orgânica foram adicionados 45 g de pó de serragem (massa

úmida) autoclavado por 2 horas (120 ºC, 1 atm). Não foi necessário ajustar pH e

saturação de bases, nem adicionar os micronutrientes, cobre, zinco, ferro e manganês.

26

3.8 CONTROLE DE Meloidogyne javanica POR ISOLADOS FÚNGICOS E

PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DO FEIJOEIRO

As espécies H. mastrucata, H. portegna, H. petaloides, H. paraguayensis e T.

koningiopsis foram purificadas em Placas de Petri contendo EM e mantidos em BOD à

25 ºC para a colonização do meio. Dez plugs de oito mm de diâmetro de micélio puro

foram transferidos para Béqueres contendo arroz parboilizado estéril (2h, 120 ºC, 1

atm).

Sementes de feijão da cultivar IPR Uirapuru foram semeadas em bandejas

contendo substrato comercial para orquídeas autoclavado por duas horas (120 ºC, 1

atm) em 26/04/2018. Houve a adição imediatamente prévia de três grãos inteiros de

arroz inoculado, separado do feijão por fina camada de substrato. Treze dias após sua

emergência, as plântulas foram transplantadas para os vasos (uma plântula por vaso),

cujo solo foi forrado com camada de feno autoclavado por duas horas (120 ºC, 1 atm).

Vasos com capacidade de 3 L foram preenchidos com LATOSSOLO

VERMELHO Eutroférrico (SANTOS et al., 2018) e areia, na proporção 2:1,

respectivamente, contendo 45 gramas de pó de serra úmidos. O substrato foi

autoclavado por duas horas a 120 ºC e 1 atm. Uma amostra composta dos 45 vasos foi

coletada, analisada e interpretada, sendo os vasos adubados de acordo.

Uma amostra homogênea e representativa do substrato foi encaminhada a análise

química de macro e micronutrientes no Laboratório de Química Ambiental e Instrumental

da UNIOESTE – Campus Marechal Cândido Rondon.

O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado em casa

de vegetação e a parcela experimental representada por uma planta mantida em vaso

na Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina, com cinco repetições por

tratamento. Os tratamentos foram: T1 – M. javanica + H. mastrucata; T2 – M. javanica +

H. paraguayensis; T3 – M. javanica + H. portegna; T4 – M. javanica + H. petaloides; T5

– M. javanica + T. T. koningiopsis; T6 – testemunha parcial, apenas com M. javanica e

T7 – testemunha absoluta, sem tratamento e sem patógeno.

A irrigação de 100 mL de água foi manual de acordo com a necessidade, com

monitoramento diário. Não foi necessária adubação complementar.

27

As leituras de temperatura e umidade, máximas e mínimas, foram coletadas

diariamente com uso de termo-higrômetro, em final de tarde. Ao final de cada leitura o

aparelho foi resetado para nova leitura.

Dos resultados foram extraídas as respectivas médias para cada estádio

fenológico de desenvolvimento, a fim de compreender a interferência em cada período.

Para a análise de promoção de crescimento do feijoeiro, com auxílio de trena

foram mensuradas as alturas de plantas em diferentes fases de estádio fenológico,

emergência/emissão dos cotilédones (V1), emissão da primeira folha trifoliolada (V3),

emissão da terceira folha trifoliolada (V4) e formação de vagens (R7).

As avaliações de raiz foram realizadas 82 dias após a inoculação dos nematoides,

durante a fase de enchimento de grãos (R8). Os parâmetros avaliados foram a contagem

de galhas, contagem de massa de ovos, massa seca de raiz, massa seca de parte aérea,

comprimento de raiz, altura de plantas. As análises de massa seca foram determinadas

em estufa de ar forçado.

Em casa de vegetação, as raízes foram destacadas da parte aérea, embaladas e

identificadas. Em laboratório foram submetidas a tríplice lavagem em água, secas em

papel absorvente e em seguida adicionadas em solução corante (1 mL fucsina + 30 mL

de água destilada), separados por tratamento, por 1 h para a exposição de massas de

ovos. Na sequência procedeu-se a mensuração de comprimento de cada raiz e a

contagem de galhas, feita em três regiões distintas da raiz, a basal, a intermediária e a

extremidade.

Para a contabilização das massas de ovos, a mesma a raiz foi separada em três

regiões. Assim, fragmentos de raiz das respectivas regiões foram removidos e analisados

em lupa sob objetiva de 4 x. Para ambos os parâmetros as raízes foram analisadas

integralmente. Na sequência as raízes, totalmente secas foram pesadas e então sujeitas

à técnica de extração de Jenkins (1964) para a contagem de ovos de nematoides, através

de Câmara de Peters.

A contabilização de ovos da raiz foi utilizada para estabelecer o fator de

reprodução de M. javanica, de acordo com a metodologia de Ferraz (1996).

Para a análise estatística, os dados foram processados pelo teste de médias

ScottKnott a 5% de probabilidade, utilizando o programa SISVAR 5.6® (FERREIRA,

2011).

28

29

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 AVALIAÇÕES PRELIMINARES

4.1.1 Colonização In Vitro de Hohenbuehelia spp.

O desenvolvimento das seis espécies de Hohenbuehelia avaliadas foi melhor em

extrato de malte (EM) e variou entre si ao longo dos dias de avaliação (Tabela 1), de

modo que, H. mastrucata e H. barbatula apresentaram melhor desempenho, com a mais

rápida colonização em sete dias, seguidos de H. petaloides e H. portegna. As demais

espécies apresentaram raio micelial reduzido e em tempo de colonização muito

estendido.

Tabela 1 - Crescimento micelial radial (cm) de espécies de Hohenbuehelia cultivadas em extrato

de malte, incubadas em BOD à 25 ºC por 42 dias. Avaliações

Espécie

7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias

H. barbatula 4,500 e 4,500 e 4,500 d 4,500 d 4,500 d 4,500 e

H. bullulifera 0,00 a 0,420 a 0,740 a 1,080 a 1,335 a 1,735 b

H. mastrucata 4,500 e 4,500 e 4,500 d 4,500 d 4,500 d 4,500 e

H. petaloides 1,535 d 2,355 d 2,770 c 2,945 c 3,040 c 3,340 d

H. portegna 0,455 c 0,670 c 1,175 b 1,545 b 1,925 b 2,220 c

H. paraguayensis 0,370 b 0,540 b 0,790 a 0,975 a 1,120 a 1,205 a

C.V. (%) 3,27 4,84 6,07 7,68 10,14 12,8

* Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey a 5%

de probabilidade de erro.

O melhor desenvolvimento micelial, em sete dias, foi atingido por H. barbatula e

H. mastrucata com 4,5 cm de raio à 25 ºC, seguidos de H. petaloides com 1,5 cm. As

demais espécies não atingiram 1,0 cm de raio de colônia em sete dias (Tabela 1).

Aspectos de inibição foram visualizados em meio V8.

Nas coletas de Thorn e Barron (1986), os melhores substratos para Nematoctonus

(Sin. Hohenbuehelia) foram resíduos de serrarias e madeira podres, onde há intensa

competição entre microrganismos por nitrogênio. Assim, a utilização de pó de serra, de

alta relação C/N, considerou a assimilação simultânea de nitrogênio e de carbono pelos

microrganismos decompositores (RECOUS et al., 1995).

30

Conhecer o desempenho vegetativo das espécies permitiu a programação do

experimento com inóculo colonizado em quantidade adequada e com micélio jovem, nas

condições de cada espécie (Figura 1).

Figura 1 - Perfil de crescimento de isolados de espécies de Hohenbuehelia em extrato de malte

em nove dias de colonização. 528: H. bullulifera, 581: H. paraguayensis, 631: H. portegna, PET:

H. petaloides, 461: H. barbatula e 436: H. mastrucata.

4.1.2 Preparo do Inóculo

Das tentativas de promoção de crescimento, maior quantidade de arroz

colonizado em menos tempo, a adição de micélio em arroz no béquer se destacou,

especialmente quando embalado em papel alumínio. A figura 2 mostra o

desenvolvimento micelial das espécies em blocos de arroz desmanchado.

31

Figura 2 - Perfil de colonização de isolados de espécies de Hohenbuehelia e Trichoderma

koningiopsis. 631: H. portegna, 461: H. barbatula, 528: H. bullulifera, 436: H. mastrucata, 581: H.

paraguayensis e TLB17: T. koningiopsis, em arroz autoclavado, em diferentes tempos.

Na separação dos grãos de arroz foi visualizado perfil de coloração diferencial das

espécies, o que sugere a ocorrência de atividade enzimática. Além disto, os isolados

mais eficientes no desenvolvimento micelial em extrato de malte (Tabela 1), H. barbatula

e H. mastrucata, resultaram em grãos de arroz desintegrados com bordas indefinidas e

de consistência pastosa, mesmo em menor tempo de colonização (Figura 2).

4.1.3 Teste de Germinação de Sementes de Feijão

32

As sementes de feijão submetidas ao teste de germinação em rolo de papel úmido

apresentaram máxima normalidade de plântulas ao nono dia de incubação com índice

de 70%. Não houveram sementes mortas (Tabela 2).

Tabela 2 - Teste de germinação de sementes de feijão em rolo de papel úmido. Avaliações ao

quinto e nono dia de incubação.

Tratamento 5º Dia 9º dia Média geral

Normal 27,00 69,60 48,30

Anormal 67,00 30,40 48,70

Morta 0,00 0,00 0,00

C.V. (%) 20,30 11,70


de probabilidade de erro.

4.1.4 Colonização Radicular

A análise visual de presença de micélio em substrato autoclavado e na superfície

das raízes de plântulas de feijão indicou que a dosagem de três grãos de arroz

colonizados foi o suficiente para garantir a permanência do fungo (Figura 3),

assegurando, assim, sua transferência ao solo do vaso no momento de transplante.

Figura 3 - Colonização de substrato por Hohenbuehelia barbatula inoculado em três grãos de

arroz. Colonização superficial em substrato intacto (A) e interna em substrato desmanchado (B).

O micélio dos isolados de Hohenbuehelia spp. permaneceram no substrato

autoclavado após 18 dias de introduzido. Dallemole-Giaretta et al. (2014) verificaram que

A B

33

a introdução de P. chlamydosporia através de grãos de arroz colonizado por micélio e

conídios, sem clamidósporos, foi eficiente na redução de M. javanica em tomateiro. Do

mesmo modo, Lopes et al. (2007), consideram o arroz uma fonte de energia que garante

o estabelecimento do fungo no solo.

Em alguns casos, H. petaloides se beneficiou de algumas plântulas devido ao

atraso da germinação de sementes devido ao baixo vigor, colonizando o tegumento das

sementes e sementes mortas (Figura 4). Em teste preliminar, H. barbatula e H. petaloides

permaneceram ativos em substrato autoclavado por 15 dias.

Figura 4 - Hohenbuehelia petaloides parasitando plântula (A) e grão de feijão (B), após 14 dias.

A inoculação de apenas um ou dois grãos de arroz colonizados não manifestaram

desenvolvimento micelial no substrato, sendo considerados tratamentos arriscados

considerando que deveriam permanecer no solo por tempo superior a 60 dias.

Esta pesquisa atentou à vários fatores, pois pouco se sabe a respeito do

desempenho do gênero Hohenbuehelia em bioensaios em casa de vegetação. Assim,

durante a etapa de testes, o máximo de características e resultados foram levantados.

Estes testes preliminares nortearam a condução do experimento. Alguns isolados

apresentaram micélio branco visível a olho nu, colonizando a rizosfera ou abundante no

substrato, como o H. barbatula e H. mastrucata (Figura 4). Outros cresceram

preferencialmente sobre pedaços de madeira presentes no substrato comercial, o que é

esperado, pois Hohenbuehelia decompõe madeiras (BARRON, 2003).

A B

34

Muitas espécies do filo Basidiomicota apresentam lento desenvolvimento, ao

contrário de espécies de Trichoderma (VINALE et al., 2008) e são influenciadas pelo

meio artificial ao qual estão sujeitas, embora a inclusão de lignina não tenha

proporcionado melhor crescimento (VOŘÍŠKOVÁ et al., 2011). Segundo Pereira e

Soares (2012), fungos do filo Basidiomicota podem apresentam três tipos de micélio,

primário, secundário (mais vigoroso) e terciário, além de que, nem todos possuem fíbulas

nos septos. O que justifica o desenvolvimento micelial diferenciado das espécies de

Hohenbuehelia no presente trabalho.

No solo, pouco se sabe sobre permanência de espécies de Hohenbuehelia e sua

atividade nematófaga, diferentemente de outros gêneros de agentes de biocontrole, para

os quais várias informações importantes são conhecidas. Verticillium, por exemplo, não

reduz a invasão inicial do J2 e atua melhor no solo quando as galhas são pequenas,

abaixo de 30 °C (BOURNE; KERRY, 2000; KERRY, 2001), enquanto que, Pochonia

chlamydosporia e Trichoderma spp. predam nematoides em qualquer estádio (SILVA et

al., 2017).

4.2 EXPERIMENTO EM CASA DE VEGETAÇÃO

O experimento foi desenvolvido no período de abril a julho de 2018, conduzido

em período de inverno, os dados de temperatura variaram entre 19,40 (R5) a 37,75 (V0),

com valores acima de 30 ºC atingidos em V0, V1, R7 e R8 (Figura 5).

As leituras de umidade variaram de 32,2% (R8) a 90,0% (V0). A temperatura

máxima teve queda acentuada em V8 (13,9 ºC) e outra em R5 (13,8 ºC). A média geral

de temperatura variou entre 16,85 ºC a 29,21 ºC enquanto que a média geral de umidade

variou entre 45,6% a 82,3%.

35

Figura 5 - Média de leituras de temperatura (barras) e umidade (linhas), máximas e mínimas,

durante a condução do experimento, atribuída por estádio fenológico. Experimento conduzido na

Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina, de 27/04 a 16/07.

De acordo com Lopes et al. (2007), em temperaturas do ar próximas a 30 ºC, os

juvenis escapam do parasitismo do fungo, uma vez que os ovos eclodem

antecipadamente, reduzindo tempo e possibilidade de contato e fungos como P.

chlamydosporia não ataca a fase móvel (DALLEMOLE-GIARETTA et al., 2008). A

variação geral da temperatura durante o experimento foi de 16,85 ºC a 29,21 ºC (Figura

5), com média de 22 ºC. Valores estes ideais considerados para a ocorrência do processo

infeccioso (PINHEIRO; AMARO; PEREIRA, 2010). Também ideal ao desenvolvimento

do feijoeiro (ANDRADE et al., 2015).

Segundo Alves e Campos (2003) a reprodução de M. javanica aumenta em solo

com maior temperatura. Portanto, a eficiência dos agentes de biocontrole deve ser

interpretada considerando a temperatura dos ambientes e sua influência sobre fatores

importantes, como a taxa de eclosão de ovos. Além disto, RINALDI, NUNES e Montecelli

(2014) alegam que outras condições de campo, como a textura arenosa do solo,

favorecem a reprodução de M. javanica que em alta densidade populacional tende a ser

pouco reduzida.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

V0 V1 V2 V3 V4 R5 R6 R7 R8

º C MAX º C MIN UR MAX (%) UR MIN (%)

36

, 0 21 150,96 , 13 01 , 72 34 , 27 96 , 34 4 101,72 314,42

4.2.1 Controle de Meloidogyne javanica por Espécies Fúngicas e

Promoção de Crescimento do Feijoeiro

Cada tratamento foi composto por semeadura de oito sementes para os quais a

altura de plântulas no momento do transplante não constituiu fator crucial de seus efeitos

sobre elas (Tabela 4). Assim, a porcentagem de plântulas aptas ao transplante referente

a cada tratamento demonstrou o real efeito destes. No geral, os tratamentos resultaram

em número satisfatório de plântulas (mínimo 5) para o transplante, com maior efeito

causado por Hohenbuehelia bullulifera e menor por H. petaloides, cujo principal

inconveniente foi o atraso da germinação em 10 dias, permanecendo as plântulas em

estágio V1 (emergência e hipocótilo curvado, embora com altura de V2).

Tabela 3 - Efeito dos tratamentos na altura de plântulas (cm) e nas porcentagens de atraso de

germinação (% V1), formação de plântulas normais (% PN), folhas muito pequenas (%

FP), folhas deformadas (% FDF), sementes mortas (% SM) e germinação total (% GT),

mensuradas ao 11º dia após a semeadura (V2), onde % PT = porcentagem de plântulas

transplantáveis. Experimento conduzido na Universidade Federal do Paraná – Setor

Palotina, de 27/04 a 16/07.

Altura % %

Tratamento % FP % V1 % PN % GT % PT

(cm ) FDF SM

H. barbatula 9,87 20,83 4,17 0,00 100,00 0,00 100,00 75,00

H. bullulifera 10,35 0,00 0,00 0,00 95,83 0,00 95,83 95,83

H. mastrucata 9,31 29,17 8,33 0,00 100,00 0,00 100,00 62,50

H. paraguayensis 10,54 29,17 8,33 0,00 87,50 0,00 87,50 50,00

H. petaloides 9,45 16,67 4,17 16,67 87,50 4,17 66,67 45,83

H. portegna 9,62 29,17 4,17 0,00 91,67 0,00 91,67 58,33

T. koningiopsis 10,33 0,00 8,33 0,00 95,83 4,17 91,67 83,33

TestAbs 10,09 12,50 0,00 0,00 100,00 4,17 95,83 83,33

Nematoide 9,40 4,17 0,00 8,33 100,00 0,00 91,67 87,50

C.V. (%)

Média Geral 9,88 15,74 4,17 2,78 95,37 1,39 91,20 71,29 TestAbs = testemunha absoluta.

As plântulas foram escolhidas segundo a melhor proporcionalidade morfológica,

de modo que, plântulas mais altas com folhas pequenas foram evitadas (estiolamento).

37

Ensaios preliminares são importantes no que concerne a escolha de agentes de

biocontrole inócuo a saúde da planta, primeiramente. Assim, Santin (2008) descartou a

espécie Trichoderma harzianum no ensaio in vivo de controle de M. incognita em

feijoeiro, pois esta demonstrou efeito negativo sobre a germinação.

Segundo BRASIL (2009), o índice de germinação requerido para comercialização

deve ser superior a 80%, de modo que o resultado obtido se refere a sementes com

baixo vigor (Tabela 2). Isto pode explicar o fato de H. petaloides ter deteriorado algumas

sementes lentas na germinação (Figura 5). Caso de patogenicidade também foi relatado

por Marín-Guirao et al. (2016) com T. saturnisporum.

Chacón et al. (2007) relatam que Trichoderma tem efeito benéfico para as plantas,

sem lhes causar danos. Para Vinale et al. (2008), a competição é benéfica quando

desfavorece patógenos de solo e a interação entre Trichoderma e a planta é simbionte e

não parasítica.

4.2.2 Avaliação da Altura de Plantas

A altura das plantas mensuradas em V1, V3, V4 e R5 não diferiram entre os

tratamentos, de modo que nenhum deles promoveu crescimento das plantas.

Por outro lado, em teste preliminar, observou-se que a maioria dos tratamentos

não diferiram entre si para o parâmetro altura. Entretanto, Trichoderma harzianum (TI2)

causou redução na altura das plântulas em V2 e R5, diferindo de H. portegna em V2.

Tabela 4 - Efeito dos tratamentos na altura de plântulas (cm) nos estágios de desenvolvimento

V2, V3, V4 e R5. Experimento conduzido na Universidade Federal do Paraná – Setor


Tratamento 13 DAS

(V2)

19 DAS

(V3)

24 DAS

(V4)

32 DAS

(R5)

38

T. harzianum 8,71 b 10,78 a 13,84 a 18,60 b

TestAbs 10,41 ab 12,32 a 16,04 a 28,00 a

Nematoide 9,66 ab 13,40 a 17,66 a 20,40 ab

H. mastrucata 11,50 ab 12,94 a 16,72 a 22,20 ab

H. paraguayensis 10,21 ab 13,60 a 17,14 a 23,20 ab

H. barbatula 11,33 ab 13,44 a 17,12 a 24,60 ab

H. bullulifera 10,11 ab 11,62 a 16,60 a 23,80 ab

T. asperellum 10,35 ab 11,76 a 16,12 a 24,80 ab

H. portegna 11,88 a 12,80 a 16,46 a 24,20 ab

C.V. (%) 15,75 12,92 13,24 17,71

Média Geral 10,46 12,52 16,41 23,31


de probabilidade de erro. TestAbs = testemunha absoluta.

No momento de transferência de plântulas para os vasos, plântulas

remanescentes foram levadas à laboratório onde o substrato foi analisado e plaqueado,

a fim de confirmar a presença dos isolados nele introduzido há 14 dias (realizado dia

31/10/17).

4.2.3 Massa Seca de Raiz e de Parte Aérea e Comprimento de Raiz

Em relação a massa seca de raiz, a testemunha parcial (M. javanica) obteve

índices superiores que a testemunha absoluta (sem adição do nematoide ou de fungo) e

apenas dois tratamentos, H. petaloides e T. koningiopsis, se igualaram à testemunha

absoluta, com menor massa de raiz (Tabela 5).

Tabela 5 - Massa seca de raiz de feijoeiro (MSR). Experimento conduzido na Universidade

Federal do Paraná – Setor Palotina, de 27/04 a 16/07.

Tratamentos MSR

TestAbs 0,35 a

H. mastrucata 0,55 b

H. paraguayensis 0,59 b

H. petaloides 0,26 a

H. portegna 0,45 b

39

T. koningiopsis 0,25 a

Nematoide 0,54 b

C.V. (%) 38,35

Média Geral 0,43

* Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Scott-Knott

a 5% de probabilidade de erro. TestAbs = testemunha absoluta.

Os demais tratamentos obtiveram maior massa seca de raiz, sem relação com o

desempenho dos fungos no controle dos nematoides (Tabela 8), uma vez que H.

petaloides apresentou redução de massas de ovos superior a H. paraguayensis, mas

menor massa. Isto pode ser devido ao aumento de massa de raiz proporcionado pela

formação de galhas, mais abundantes em H. paraguayensis, mas o mesmo fato não se

justifica para H. mastrucata.

Quanto aos resultados de massa de parte aérea e do comprimento de raiz de

feijoeiro, nenhuma diferença foi verificada entre os tratamentos.

A massa seca da parte aérea não foi afetada por nenhum tratamento. Porém,

estímulo no crescimento do feijoeiro era esperado, especialmente em função de relatos

literários para espécies de Trichoderma. No mesmo sentido, não houve promoção de

crescimento em feijoeiro (SANTOS; MORANDI; COSTA, 2008; SANTIN, 2008; BORGES

et al., 2013; AGUIAR; BONALDO; MORAES 2014). Neste estudo, o comprimento de raiz

não foi promovido, cuja elongação é dependente de conteúdos hormonais, como a

auxina (PILET; ELLIOTT; MOLONEY, 1979). De qualquer forma, ao menos não foi

observada influência negativa na planta, assim como para Fernandes et al. (2014).

Putzke et al. (2007) verificaram redução na massa fresca de tomate tratado com

H. paraguayensis comparado a H. portegna. Este, por sua vez, não diferiu dos

tratamentos testemunhas. Igualmente, Marín-Guirao et al. (2016) constataram redução

na altura de plântulas de tomate tratado com T. saturnisporum. Silva et al. (2017) não

notaram acréscimo na massa fresca e altura de tomateiro tratado com Trichoderma spp.

Estas constatações não são exclusividade do gênero Trichoderma, pois P.

chlamydosporia var. chlamydosporia também não promoveu crescimento em tomateiro

(DALLEMOLE-GIARETTA et al., 2008), nem Bacillus subtilis (VAZ et al., 2011) e Bacillus

sp. em tomateiro (SILVA et al., 2017).

Sobre a massa seca de raiz, as espécies H. mastrucata, H. paraguayensis e H.

40

portegna proporcionaram valores superiores pelo aumento da raiz, embora não tenham

diferido da testemunha inoculada apenas com M. javanica (Tabela 6) devido ao excesso

de galhas (Tabela 7). Campos (1994) também relatou aumento da massa fresca da raiz

de feijoeiro tratado com Arthrobotrys conoides e P. lilacinum. Embora Lopes et al. (2007)

e Fernandes et al. (2013) não tenham verificado tal acréscimo em feijoeiro tratado com

Bacillus spp. Ainda, no estudo do patossistema M. javanica em feijoeiro, Pires et al.

(2016) relacionam a não alteração da massa de raiz em plantas infectadas devido ao

tamanho das galhas, pequenas no geral (Figura 6).

4.2.4 Análises de Galhas e de Massa de Ovos

A contagem de galhas e de massas de ovos separadas por região radicular foi

assim feita a fim de verificar ação diferencial dos isolados por região de raiz, atentando

para além da contabilização de raiz inteira, com efeito diluído, onde possivelmente os

isolados pudessem apresentar efeito mínimo.

Os tratamentos diferiram para o critério de contagem de galhas basais,

intermediárias e totais, contudo, sem efeito na extremidade da raiz (Tabela 6). Tal

resultado sugere ação diferenciada não apenas entre os tratamentos, mas também na

habilidade do fungo em colonizar e atuar nas diferentes partes da raiz.

Tabela 6 - Contagem de galhas basais (GB), galhas intermediárias (GI), galhas extremidade da

raiz (GP) e galhas totais (GT) em função dos tratamentos e respectivos índices percentuais de

redução por região da raiz em comparação com a testemunha de nematoide. Experimento

conduzido na Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina, de 27/04 a 16/07.

Tratamento GB Inibição

(%) GI

Inibição

(%) GP GT

Inibição

(%)

TestAbs 0,00 a * 0,00 a * 0,00 0,00 a *

H. mastrucata 51,33 a ↓ 86,72 23,33 a ↓ 71,07 10,00 84,66 a ↓ 81,42

H. paraguayensis 54,00 a ↓ 86,03 26,33 a ↓ 67,36 19,00 99,33 a ↓ 78,20

H. petaloides 97,00 a ↓ 74,91 27,00 a ↓ 66,53 6,66 130,66 a ↓ 71,32

H. portegna 79,33 a ↓ 79,48 34,00 a ↓ 57,84 19,66 126,33 a ↓ 72,27

41

T. koningiopsis 287,00 b ↓ 25,77 72,66 b 11,66 309,00 b ↓ 32,18

Nematoide 386,67 c 80,66 b 29,66

79,72

455,66 c

C.V. (%) 26,38 81,07 41,51

Média Geral 136,48 37,71 13,81 172,23 * Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Scott-Knott


Os resultados demonstram grande capacidade das espécies de Hohenbuehelia

em causar redução na formação de galhas de M. javanica em feijoeiro, seguido de T.

koningiopsis, na dosagem individual de 3 grãos de arroz colonizados. Tal efeito foi

superior na região basal da raiz, próxima a superfície e menor na região intermediária

onde T. koningiopsis não foi eficaz (Tabela 6).

Relatos da influência de dosagem de inóculo mostram melhores resultados para

a maior concentração de inóculo de Trichoderma spp. (MARÍN-GUIRAO et al., 2016;

ALHAZMI; TARIQJAVEED, 2016) e de P. chlamydosporia (DALLEMOLE-GIARETTA et

al., 2014).

Nunes, Monteiro e Pomela (2010) observaram efeito moderado dos agentes P.

chlamydosporia e Purpureocillium lilacinum sobre a redução de M. incognita em soja, em

contraste com outros pesquisadores o que, possivelmente, se deve às diferentes

concentrações de suspensão de esporos, isolados e planta hospedeira. Assim, o

sucesso do controle biológico não depende exclusivamente do agente de biocontrole em

questão.

Portanto, o desempenho dos agentes fúngicos deste estudo poderia variar com a

incorporação de maiores doses, mas não necessariamente, uma vez que

DallemoleGiaretta et al. (2008) relataram que o tempo de exposição de P.

chlamydosporia var. chlamydosporia aos ovos de M. javanica foi mais eficiente em

termos de controle que o aumento da dose do agente. A contagem de massas de ovos

e de galhas evidenciou efeito diferencial dos tratamentos ao longo da raiz (Tabelas 7 e

6), sugerindo limitação de desenvolvimento dos fungos nestas regiões, possivelmente

por falta de aeração, do pouco tempo de estabelecimento previamente à inoculação do

nematoide ou, ainda, como frisa Lopes et al. (2007), devido ao desencontro entre o pico

de crescimento dos fungos e o pico de eclosão dos nematoides, problema para o qual,

Kerry (2001) sugere a reinoculação dos agentes.

42

Quando isto acontece, ano após ano, os agentes de biocontrole se estabelecem

no solo e se reproduzem, aumentando a supressividade deste (SILVA et al., 2017).

Embora Kerry (2001) tenha relatado melhor efeito de Verticillium sobre M. incognita em

feijoeiro quando este foi aplicado apenas uma vez.

Quanto a isto, Blachinsky et al. (2007) atentam para a importância da persistência

dos isolados, a exemplo de B. firmus que por possui endósporos exibe ampla vantagem

de uso. Embora o feijoeiro inoculado com Bacillus spp., analisado por Fernandes et al.

(2013), não teve seu índice de galhas reduzido. Enquanto que Kerry (2001) recuperou

Verticillium em solo após três anos, proveniente de uma única aplicação, pois de acordo

com Bueno, Ambrósio e Souza (2007) seus microescleródios são persistentes.

As pesquisas de biocontrole de meloidoginoses geralmente consideram a

introdução do agente antagonista previamente ao transplante da planta hospedeira

(DALLEMOLE-GIARETTA et al., 2008; AL-HAZMI; TARIQJAVEED, 2016), o que lhes

confere certo tempo de interação para a redução do inóculo de nematoide. Tal método

apresenta vantagem para antagonistas ovicidas, como Trichoderma (SZABÓ, et al. 2012)

e P. chlamydosporia (NUNES; MONTEIRO; POMELA, 2010). Entretanto, neste estudo,

os fungos foram adicionados no momento da semeadura, tendo 19 dias para se

estabelecer no substrato e rizosfera até a adição de M. javanica.

A tabela 8 mostra que a redução de galhas não é diretamente proporcional a

redução de massas de ovos, a exemplo de H. paraguayensis, para o qual os nematoides

podem ter otimizando os pontos de infecção, de modo que algumas galhas tenham

comportado várias fêmeas (Figura 7). No geral houveram mais massas de ovos que

galhas, caso oposto foi verificado por Marino e Silva (2013).

Por outro lado, independentemente da cultura e do agente de biocontrole, existe

relação dependente entre a redução do número de ovos e da expressão de galhas

(LOPES et al. 2007; PUTZKE et al. 2007; SANTIN, 2008; DALLEMOLE-GIARETTA et

al., 2008; NUNES et al., 2010; MACHADO et al., 2013; PINHEIRO et al., 2013).

Um tempo mínimo de 25 dias de interação entre planta hospedeira e patógeno é

essencial para examinar os efeitos do agente de biocontrole (WESTERICH et al., 2012).

Santin (2014) verificou formação de massas de ovos a partir de 30 dias de inoculação de

M. incognita em feijoeiro e Ferreira (2017) notou galhas causadas por M. javanica após

25 dias de sua inoculação em soja.

43

No presente estudo o tempo de interação foi de 64 dias, tornando segura a análise

da doença. Contrariamente, após 60 dias, Lopes et al. (2007) registraram nenhuma

redução no número de galhas através de isolado de P. chlamydosporia, de modo que a

atividade do fungo está relacionada aos momentos de pre infecção, possivelmente

devido a sua atividade ovicida (NUNES; MONTEIRO; POMELA, 2010).

Em relação à expressão de galhas, Santin (2008) registrou menor expressão em

feijoeiro tratado com T. harzianum e Sharon et al. (2001), um índice de 0,5 galhas em

tomateiro tratado com um isolado selvagem de T. harzianum. Contudo, T. koningiopsis

teve a quinta posição na redução de galhas, com 32,18% de redução (Tabela 6).

Quanto a isto, Vinale et al. (2008) reconhecem a existência de cepas de

Trichoderma mais ou menos efetivas. Enquanto que Al-Hazmi e Tariqjaveed (2016)

relataram desempenho diferenciado entre espécies, justificado pelas habilidades

patogênicas do isolado ou por sua origem. Ainda, segundo Inglis et al. (2001), uma cepa

mais virulenta requer menos propágulos para ser eficiente.

Borges et al. (2013) relataram ineficiência de Trichoderma sp., tanto na redução

do número de galhas, como de ovos e de juvenis na raiz em feijoeiro, em comparação a

testemunha inoculada com M. incognita, embora tenha reduzido o número de juvenis no

solo. De fato T. koningiopsis não se comportou como o melhor tratamento na redução de

galhas (Tabela 6), mas diferiu da testemunha inoculada com M. javanica.

Em experimento conduzido em tomateiro infectado com M javanica, Putzke et al.

(2007) observaram que o tratamento H. paraguayensis resultou em maior expressão de

galhas comparado a espécies de Pleurotus. Embora o número de galhas deste

tratamento no feijoeiro não tenha sido superior às demais espécies do gênero (Tabela

6), foi verificado maior expressão de massas de ovos (Tabela 7).

Ao analisar o percentual de redução de galhas e de massas de ovos de M.

javanica (Tabelas 6 e 7), verifica-se que H. mastrucata, H. portegna e H. petaloides

apresentaram potencial de controle superior a vários produtos comerciais a base de

antagonistas, como Rizotec® em pepino (VIGGIANO; FREITAS; LOPES, 2014), Rizotec®

e Onix® SC + Quality® WG em tomateiro (CARVALHO, 2017), Nemix® TS em soja

(NUNES; MONTEIRO; POMELA, 2010), Trichodermil® SC 1306® e Quality® em feijoeiro

(AGUIAR; BONALDO; MORAES, 2014), revelando ótimo potencial de uso comercial,

especialmente ao considerar que tal efeito foi obtido com baixa dosagem de inóculo.

44

Aplicada uma suspensão de esporos de T. harzianum em concentração de 106,

Sahebani e Hadavi (2008) observaram redução no índice de galhas em tomateiro em

torno de 44% e na severidade da doença, com acréscimo nos níveis de fenilalanina

amônia liase, peroxidase e polifenol oxidase, sugerindo indução de resistência.

Ao avaliar o patossistema M. incognita e alface, Marino e Silva (2013) confirmaram

a eficiência de quatro isolados de Pleurotus osteatrus, um gênero pertencente à família

Pleurotaceae, assim como o gênero Hohenbuehelia. Segundo eles, todos os isolados

reduziram os índices de galhas e massa de ovos em relação a testemunha, variando de

74% a 89% para número de galhas e de 87 a 98% no número de massas de ovos,

embora as espécies tenham sido estatisticamente iguais entre si. Tais resultados são

muitos similares ao presente estudo, onde Hohenbuehelia spp. reduziu o índice de

galhas de 74,9% a 86,72% e de massas de ovos em 39% a 74,8%, sem diferença

significativa entre as espécies, exceto para H. paraguayensis, inferior às demais para o

parâmetro de massas de ovos.

A formação de galhas no feijoeiro foi de tamanho pequeno (Figura 6), variando de

0,2 a 0,7 mm mesmo sendo a cultivar suscetível e a pressão de inóculo de nematoide

alta.

Figura 6 - Galhas

formadas por Meloidogyne javanica em feijoeiro Cv. Uirapuru no tratamento com Hohenbuehelia

mastrucata após 64 dias de ação do nematoide.

A atividade dos fungos para o parâmetro massa de ovos apresentou uma

tendência similar, tanto para àquelas contabilizadas na parte basal da raiz quanto para a

quantidade total destas, evidenciando melhor ação de H. mastrucata, H. portgena e H.

45

petaloides (Tabela 7). Os percentuais de redução excederam 39%.

Tabela 7 - Número de massas de ovos basais (MB), massas de ovos intermediárias (MI), massas

de ovos da ponta (MP) e massas de ovos totais (MT) e respectivos índices percentuais

de redução por região da raiz em comparação com a testemunha de nematoide.

Experimento conduzido na Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina, de 27/04 a

16/07.

Tratamento MB Inibição

(%) MI MP MT

Inibição

(%)

TestAbs 0,00 a * 0,00 0,00 0,00 a *

H. mastrucata 137,50 b ↓ 74,80 61,75 36,00 235,25 b ↓ 66,39

H. paraguayensis 329,75 c ↓ 39,56 81,25 39,75 450,75 c ↓ 35,60

H. petaloides 188,75 b ↓ 65,41 77,50 14,75 281,00 b ↓ 59,85

H. portegna 160,00 b ↓ 70,68 68,25 48,50 276,75 b ↓ 60,46

T. koningiopsis 278,50 c ↓ 48,96 66,00 14,75 359,25 b ↓ 48,68

Nematoide 545,75 d 110,75 43,50 700,00 d

C.V. (%) 44,06 90,92 109,01 45,91

Média Geral 234,32 66,50 28,18 329,00

* Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Scott-

Knott a 5% de probabilidade de erro. TestAbs = testemunha absoluta.

Os melhores percentuais de redução de massas de ovos na parte basal foram

proporcionados por H. mastrucata, H. portegna e H. petaloides em 74,80%, 70,68% e

65,41%, respectivamente.

As massas de ovos na região intermediária e ponta de raiz não apresentaram

efeito significativo, sugerindo uma limitação de atuação do fungo em profundidade,

enquanto que, a redução de massas de ovos totais denota um efeito diluído, embora

significativo, com redução de 66,39%, 60,46%, 59,85% e 48,68% por H. mastrucata, H.

portegna, H. petaloides e T. koningiopsis, nesta ordem.

Na tentativa de controle de M. javanica em tomateiro utilizando Arthrobotrys spp.,

Monacrosporium thaumasium e P. chlamydosporia, Lopes et al. (2007) não verificaram

efeito na população do nematoide com Arthrobotrys spp. e M. thaumasium ao passo que

os isolados de P. chlamydosporia promoveram redução de ovos entre 75,3% a 85,6%.

Por outro lado, Dallemole-Giaretta et al. (2008) observaram redução no número de ovos

de M. javanica de 34% a 60% tratado com P. chlamydosporia var. chlamydosporia,

entretanto, sem redução de galhas em tomateiro.

46

A relação entre massa de ovos por massa seca de raiz representa bem a

reprodução do nematoide no hospedeiro (PIRES et al., 2016), assim, foi verificado melhor

resultado para H. mastrucata, H. paraguayensis e H. portegna (Tabela 8), pois o sistema

radicular ao qual estava vinculado se desenvolveu melhor comparado a H. petaloides

(Tabela 5). Em tomateiro inoculado, ou com P. chlamydosporia ou com a mistura de B.

methylotrophicus e T. asperellum, a relação entre ovos por grama de raiz não diferiu da

testemunha inoculada apenas com M. incognita ou M. javanica (CARVALHO, 2017).

O fator de reprodução (FR) diz sobre a relação da população final e inicial de

nematoides, indicando índices de reprodução destes. Ferraz (1996) adaptou uma escala

de redução de valores de FR, a qual considera que reduções variando de 0 a 25%

classifica a cultivar como altamente suscetível, de 26 a 50% como suscetível, de 51 a

95% como pouco ou moderadamente resistente e acima de 95% como resistente ou

altamente resistente. Nesta lógica, o feijoeiro tratado com T. koningiopsis resultou em

reação suscetível enquanto que o feijoeiro tratado com as espécies de Hohenbuehelia

foi moderadamente resistente. A testemunha parcial atingiu o maior índice de 2,72 na

reprodução do nematoide (Tabela 10).

Mesmo as maiores concentrações de T. harzianum e T. viride, de melhor controle

de M. javanica em tomateiro, o FR foi superior a 5,0, evidenciando alguma limitação da

ação do agente (AL-HAZMI; TARIQJAVEED, 2016).

Plantas de soja tratadas com P. chlamydosporia, P. lilacinum, Coprinus comatus

e com mistura a P. chlamydosporia + P. lilacinum para controle de M. incognita não

exibiram redução significativa no FR (2,20 a 4,69) nem no número de ovos na raiz, devido

a proteção dos nematoides dentro das galhas (HAHN et al., 2015). Os resultados

sugerem que as espécies de Hohenbuehelia apresentam rápida ação no controle de

nematoides. O ágil parasitismo deste gênero também foi demonstrado por Lubian et al.

(2018).

O FR de M. incognita relacionado a atividade de P. chlamydosporia foi reduzido

em 61,22% em tomateiro (CARVALHO, 2017). Neste estudo, as espécies de

Hohenbuehelia reduziram o número de ovos entre 31,34% e 84,86% enquanto que T.

koningiopsis proporcionou redução de 45,47% (Tabela 10).

Coutinho et al. (2009) registraram redução no número de ovos de M. javanica e

de galhas em tomateiro pela ação de P. chlamydosporia, em 60% e 36%,

47

respectivamente, via incorporação homogênea de 1500 clamidósporos por grama de

solo, em contraste com a metodologia deste trabalho, pois as espécies de Hohenbuehelia

não produzem esporos (KENNEDY; TAMPION, 1978). Também, a velocidade de

colonização in vitro de algumas espécies é lenta (LUBIAN et al., 2018). Ainda assim, a

redução de galhas por qualquer espécie de Hohenbuehelia ultrapassou 74% (Tabela 6).

Muito embora o efeito geral dos tratamentos, evidente na análise da parte basal

da raiz, mas indiferente na região intermediária e na ponta da raiz (Tabelas 5 e 6), não

tenha nenhuma relação direta ao crescimento do isolado (Tabela 1), sugerindo pouca

influência da extensão do micélio no controle, à exemplo de H. portegna.

De acordo com Bourne, Kerry e De Leij (1996), a redução de M. incognita é

limitada devido a conservação das massas de ovos dentro das galhas, estando estas

protegidas do parasitismo. Para os autores, a eficiência de V. chlamydosporium variou

entre planta hospedeira, com melhor resultado para a batateira, cujas galhas são

menores, que em tomate. Neste estudo, as galhas formadas em feijoeiro foram, em sua

maioria, pequenas (Figura 6) com elevado índice de controle de massas de ovos (Tabela

7), corroborando com tal relação.

A redução de massas de ovos (Tabela 7) implica no impedimento da conclusão

do ciclo de vida das fêmeas, seja através da captura do juvenil ou do ovo. Muito

possivelmente, no momento em que o ovo recebeu estímulo externo (FERRAZ, 2018) e

o J2 foi atraído por exsudatos radiculares (PINHEIRO; AMARO; PEREIRA, 2010) os

fungos mais eficientes realizaram o parasitismo.

A respeito da distribuição de galhas e de massas de ovos por grama de raiz

(Tabela 8) houve destaque para os isolados de H. mastrucata, H. portgena e H.

paraguayensis, apenas.

Tabela 8 - Relação entre massas de ovos totais (MT) e massa seca de raiz (MSR) e entre galhas

totais (GT) e MSR em função dos tratamentos e respectivos índices percentuais de redução em

comparação com a testemunha de nematoide. Experimento conduzido na Universidade Federal

do Paraná – Setor Palotina, de 27/04 a 16/07.

Tratamento

Inibição

MT/MSR

(%)

GT/MSR

Inibição

(%)

TestAbs 0,00 a * * *

H. mastrucata 374,41 a ↓ 73,35 202,41 a ↓ 78,46

48

H. paraguayensis 751,44 a ↓ 46,52 190,11 a ↓ 79,77

H. petaloides 1274,12 b 757,11 b

H. portegna 666,10 a ↓ 52,59 323,14 a ↓ 65,62

T. koningiopsis 1336,60 b 1103,52 b

Nematoide 1405,02 b 939,87 b

C.V. (%) 53,82 39,63

Média Geral 967,95 586,03 * Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Scott-


Os tratamentos com melhor desempenho foram H. mastrucata, H. petaloides e H.

portegna, capazes de reduzir ambas, massas de ovos e galhas (Tabela 9). A tabela 9

também mostra que a redução de galhas não implica, necessariamente, na redução de

massas de ovos, caso de H. paraguayensis. Todas as espécies de Hohenbuehelia

tiveram desempenho superior que T. koningiopsis na redução de galhas totais.

Tabela 9 - Relação entre massas de ovos totais (MT), galhas totais (GT) de Meloidogyne javanica

em feijoeiro Cv. Uirapuru e relação entre MT e GT para os tratamentos. Experimento

conduzido na Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina, de 27/04 a 16/07.

Tratamentos MT GT MT/GT

TestAbs 0,00 a 0,00 a *

H. mastrucata 235,25 b 84,66 a 2,78

H. paraguayensis 450,75 c 99,33 a 4,54

H. petaloides 281,00 b 130,66 a 2,15

H. portegna 276,75 b 126,33 a 2,19

T. koningiopsis 359,25 b 309,00 b 1,16

Nematoide 700,00 d 455,66 c 1,54

C.V. (%) 58,60 41,51 1,42

Média Geral 383,83 200,94 2,39 * Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Scott-


4.2.5 Número de Ovos na Raiz e Fator de Reprodução

Em relação ao número de ovos extraídos da raiz (Tabela 10), observa-se que o

melhor tratamento foi H. mastrucata, igualado a testemunha absoluta. Na sequência as

espécies de destaque são H. mastrucata, H. paraguayensis, H. petaloides e H. portegna.

Um terceiro grupo é composto por H. mastrucata e T. koningiopsis. Por fim, o tratamento

49

inoculado apenas com M. javanica apresentou maior número de ovos e, por

consequência, maior fator de reprodução de nematoides.

Tabela 10 - Número de ovos, fator de reprodução de Meloidogyne javanica e percentual de

redução do número de ovos para os respectivos tratamentos comparados a testemunha

parcial (nematoide). Experimento conduzido na Universidade Federal do Paraná – Setor


Tratamento Nº de ovos FR Inibição (%)

TestAbs 0,00 a *

H. mastrucata 1644,50 a 0,41 ↓ 84,86

H. paraguayensis 3845,36 b 0,96 ↓ 64,60

H. petaloides 4103,46 b 1,03 ↓ 62,22

H. portegna 3021,63 b 0,76 ↓ 72,18

T. koningiopsis 5900,99 c 1,48 ↓ 45,67

Nematoide 10862,20 d 2,72

C.V. (%) 39,64 0,66

Média Geral 4896,36 1,23 * Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Scott-Knott


A figura 7 revela a não proporcionalidade direta entre galhas e massas de ovos, onde há

formação de galhas, mesmo sem a presença de massas de ovos (A), ocorrência de uma

a três massas de ovos por galha (B) e várias massas de ovos presentes em única galha

(C).

50

Figura 7 - Relação indireta entre galhas e massa de ovos de Meloidogyne javanica em feijoeiro.

A = galhas em massas de ovos. B = duas galhas com uma massa de ovos cada e uma galha

com quatro massas de ovos. C = uma galha grande com 10 massas de ovos visíveis.

Como se pode observar, a figura 7 mostra que não há relação direta entre o

número de galhas e de massas de ovos. O mesmo foi averiguado por Pires et al. (2016)

em feijoeiro infectado por M javanica. De acordo com os mesmos, as cultivares com

maior número de galhas não foram as que apresentaram maior abundância de massas

de ovos. Ainda, as massas têm impacto epidemiológico inegável, cuja redução tende a

minimizar a população de nematoides em ciclos subsequentes (MARINO; SILVA, 2013).

Em termos de perfil de solo, Persmark, Banck e Jansson (1996) registraram maior

abundância de nove espécies de fungos parasitas formadores de armadilhas aos 10 e

20 cm de profundidade, decrescendo com a profundidade. Clemmensen et al. (2013)

avaliaram solos de diversas florestas e identificaram a presença preferencial de fungos

saprófitas nos 10 primeiros centímetros de solo.

De qualquer forma, análises in vitro mostram a inexistência de relação entre o

crescimento de isolado de Hohenbuehelia e o parasitismo de nematoides (THORN;

BARRON, 1986, LUBIAN et al., 2018).

No trabalho de Mauchline, Kerry e Hirsch (2004), o isolado de P. chlamydosporia

com melhor desempenho saprófita no solo foi o que menos parasitou ovos de

nematoides. Também, Persmark, Banck e Jansson (1996) não observaram correlação

entre número de nematoides e a densidade e frequência de fungos parasitas.

C A

B

51

Em estudo de interação isolada entre 19 espécies vegetais e V.

chlamydosporium, Kerry (2001) observou graus de compatibilidade, de modo que, a

hospedabilidade interferiu na abundância do fungo. No mesmo sentido, Bourne, Kerry e

De Leij (1996) notaram melhor desenvolvimento deste fungo na rizosfera de plantas

mais suscetíveis a M. incognita, bem como, maior redução do nematoide em plantas

más hospedeiras deste. Bourne e Kerry (1999) observaram que maiores doses de

inóculo de V. chlamydosporium resultaram em aumento de sua densidade no solo, mas

não na superfície da raiz. Além disto, tal aumento foi capaz de reduzir o número de

nematoides em apenas duas, das quatro plantas hospedeiras avaliadas. Para Viggiano,

Freitas e Ferreira (2012), a dose de propágulos de fungo pode prejudicar o

desenvolvimento de plantas, como relatado para P. chlamydosporia var. chlamydosporia

em mudas de alface.

As plantas também influenciam o comportamento dos nematoides, a exemplos

dos J2 de M. hapla, que são sensivelmente afetados pela liberação de etileno em raízes

de tomate (FUDALI; WANG; WILLIAMSON, 2013).

Embora fungos endoparasitas obrigatórios, como espécies de Nematoctonus (Sin.

Hohenbuehelia), possuam alta especificidade em relação ao nematoide hospedeiro

(KUMAR; SINGH; SINGH, 2011), não há amparo literário para alguma exclusividade,

tendo Hohenbuehelia spp. controlado M. javanica (PUTZKE et al., 2007), Panagrellus

redivivus (LUBIAN et al., 2018), Panagrolaimus spp. (DRECHSLER, 1946).

Paralelamente, estudos genéticos de Holterman et al. (2009) remetem a possível

evolução dos nematoides de galhas a partir de um ancestral comum pertencente ao

gênero Pratylenchus, podendo tal gênero ser também controlado por Hohenbuehelia

spp.

Outra questão remete a influência do estádio fenológico da planta na associação

de fungos ao sistema radicular. Durante a floração do feijoeiro há realocação de

fotoassimilados que deixam de ser direcionados às raízes (TANAKA; FUJITA, 1979), com

eventual modificação na composição de exsudatos, assim como ocorre para Arabidopsis

(CHAPARRO et al., 2013). Assim, a manutenção de alguns fungos pode ser prejudicada

(BOURNE; KERRY; DE LEIJ 1996). Como no caso da lise da massa micelial e rápida

esporulação de T. harzianum na ausência de planta hospedeira (CHACÓN et al., 2007).

52

Segundo Hamlen, Lukezic e Bloom (1972), a exsudação decrescente em relação

ao desenvolvimento da planta sugere uma interrupção no estímulo de associação entre

fungos e raízes velhas. Embora fungos parasitas possam apresentar maior colonização

de galhas em raízes em estado avançado de decomposição (KUMAR; SINGH; SINGH,

2011). Além disto, a idade e estágios de desenvolvimento das plantas alteram a

composição e quantidade de exsudatos e, consequentemente, o estímulo à microbiota

da rizosfera (HAMLEN; LUKEZIC; BLOOM, 1972).

Dentre as descobertas sobre as características da raiz, a coifa pode repelir

agentes de biocontrole (HUMPHRIS et al., 2005), o que pode, em parte, corroborar com

a ausência de efeito dos tratamentos na ponta da raiz (Tabelas 5 e 6).

Segundo Mauchline, Kerry e Hirsch (2004), fungos de ótima habilidade saprofítica

dependerão menos de nematoides como fonte nutricional, portanto, fungos com menor

habilidade saprofítica podem desempenhar melhor papel como agentes de biocontrole.

5 CONCLUSÕES

A redução de massas de ovos e de galhas em feijoeiro Cv. Uirapuru revelou o

potencial de controle sobre M. javanica por todas as espécies testadas, com destaque

para H. mastrucata, H. portegna e H. petaloides.

53

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