AO DE LA INTEGRACIN NACIONAL Y EL RECONOCIENDO DE NUESTRA
DIVERSIDADUNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTINFACULTAD DE INGENIERA
AGROINDUSTRIAL
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
DETERMINACIN DE BIO-MOLCULAS DE PLANTAS MEDICINALES
EJECUTORES: CASTAEDA GARCIA, ELVIS ESTUARDO CLAVO CAMPOS, WILSON
GONZALES SEGURA, RONAL LABN ARANDA, LUIS FERNANDO LAOS PEREIRA,
PEDRO. A PINEDO MACEDO, CELIA TAPULLIMA PASHANARI, JHONATAN
DURACIN ESTIMADA:90 das calendarioFECHA DE INICIO: 08 de
MayoFECHA DE TRMINO: 07 de Agosto
INTRODUCCIN
Las plantas han sido desde la antigedad un recurso al alcance
del ser humano para su alimentacin y la curacin de sus
enfermedades; estas ltimas plantas, veneradas por sus
virtudes.Cientos de plantas son utilizadas en la medicina, la
ciencia moderna analiza y estudia los efectos teraputicos de las
plantas con el objeto de precisar, comparar y clasificar las
diversas propiedades de las plantas, asimismo conocer los
principios activos responsables de cortar, aliviar o curar
enfermedades, separarlos de las plantas que lo contienen,
determinar sus estructuras qumicas, procurar sus sntesis.La
utilizacin de las plantas en la medicina no ha perdido inters, segn
lo demuestra el hecho que durante alrededor de quince aos, en el
mercado de Estados Unidos, el 25% de las prescripciones mdicas
contenan principios derivados de plantas y extractos crudos de
plantas en un 2.5%.Un gran porcentaje de los principios activos de
plantas esta comprendido dentro de los llamados productos naturales
o metabolitos secundarios, que son compuestos qumicos de estructura
relativamente compleja y de distribucin ms restringida y de
caractersticas de fuentes botnicas, los cuales no son
indispensables en las plantas ya que no se ha descubierto una
funcin metablica en la cual ellos intervienen; son considerados
como artculos de lujo de la planta.
NDICECAPITULO I1.- JUSTIFICACIN...072.- PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA...083. OBJETIVOS....083.1.- OBJETIVOS GENERALES...083.2.-
OBJETIVOS ESPECFICOS..084.- HIPTESIS...084.1.- SISTEMA DE
HIPTESIS08
CAPITULO II1.- PLANTAS MEDICINALES.092.- PRINCIPIOS
ACTIVOS.......092.1.- CLASIFICACIN SEGN SU ORIGEN
METABLICO....093.- ESTUDIO FITOQUMICO PRELIMINAR....114.- MTODOS
SEPARATIVOS Y DE PURIFICACIN...134.1.- CROMATOGRAFA
LQUIDA...134.2.- CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA..144.3.- CROMATOGRAFA
CENTRFUGA EN CAPA DELGADA...144.4.- CROMATOGRAFA EN
COLUMNA..144.5.- CROMATOGRAFA GASEOSA..144.6.- CROMATOGRAFA DE
CONTRACORRIENTE A GOTA A PRESIN.155.- MTODOS FSICOS EN LA
DETERMINACIN DE ESTRUCTURAS ORGNICAS.155.1.- ESPECTROFOTOMETRA
ULTRAVIOLETA VISIBLE..155.2.- ESPECTROSCOPIA INFRARROJA...165.3.-
ACTIVIDAD PTICA Y DISPERSIN PTICA ROTATORIA165.4.- ESPECTROMETRA DE
MASA.176.- ESTUDIO FITOQUMICO EN EL PAS: IMPORTANCIA Y
PERSPECTIVAS..18
CAPITULO IIII.- TERPENOIDES Y ESTEROIDES1.- DEFINICIN....192.-
BIOSNTESIS...193.- ACEITES ESENCIALES.....223.1.- DEFINICIN.223.2
TCNICAS RECOMENDADAS...233.2.1.- GENERAL..233.2.2.- ANLISIS
ESPECTROMTRICOS....243.2.3.- DETERMINACIN DE LOS ACEITES
ESENCIALES....243.3.- EJEMPLO DE APLICACIN.244.-
SESQUITERPENLACTONAS...254.1.- TCNICAS RECOMENDADAS.....254.1.1.-
GENERAL..254.1.2.- ANLISIS ESPECTROMTRICOS....265.-
DITERPENOS..265.1.- DEFINICIN265.2.- EJEMPLO DE APLICACIN...276.-
TRITERPENOIDES Y ESTEROIDES.276.1.- DEFINICIN.276.2.- TCNICAS
RECOMENDADAS......286.2.1.- GENERAL...286.2.2.- ANLISIS
ESPECTROMTRICOS.....296.3.- ANLISIS CUANTITATIVO DE
DIOSGENINA.29
II.- COMPUESTOS FENLICOS1.- DEFINICIN....302.-
FLAVONOIDES...302.1.- DEFINICIN.302.2.- TCNICAS
RECOMENDADAS..312.2.1.- DE EXTRACCIN.312.2.2.- REACCIONES DE
COLOR...312.2.3.- TCNICAS CROMATOGRFICAS.....312.3.- EJEMPLOS DE
APLICACIN.323.- CUMARINAS....323.1.- DEFINICIN..323.2.- TCNICAS
RECOMENDADAS...333.2.1.-DE EXTRACCIN...333.2.2.-DE SEPARACIN
CROMATOGRFICA Y DE DETECCIN.333.2.3.-TCNICAS
ESPECTROMTRICAS..333.3.- EJEMPLOS DE APLICACIN.....344.- CROMENOS Y
BENZOFURANOS....344.1.- DEFINICIN..344.2.- TCNICAS
GENERALES.....354.3.- EJEMPLO DE APLICACIN...355.-
XANTONAS..365.1.- DEFINICIN..365.2.- TCNICAS GENERALES.366.-
QUINONAS....376.1 DEFINICIN.376.2.- TCNICAS
RECOMENDADAS....376.2.1.- DE EXTRACCIN...376.2.2.- DE SEPARACIN
CROMATOGRFICA Y DE DETECCIN..386.2.3.- TCNICAS
ESPECTROMTRICAS......386.3.- EJEMPLO DE APLICACIN.....38
III.- ALCALOIDES
1.- DEFINICIONES..402.- TCNICAS RECOMENDADAS....412.1.- DE
EXTRACCIN..412.2.- REACCIONES DE COLORACIN Y DE
PRECIPITACIN....412.3.- TCNICAS CROMATOGRFICAS..422.4.- TCNICAS
ESPECTROMTRICAS..422.5. EJEMPLO DE APLICACIN...43
CAPITULO IV4.- MTODOS PARA EL DESARROLLO DE LA
INVESTIGACIN...45CAPITULO V5.- CRONOGRAMAS DE
ACTIVIDADES...45CAPITULO VI 6.- PRESUPUESTO Y
FINANCIAMIENTO.....46CAPITULO VII7.-BIBLIOGRAFIA......47CAPITULO
VIII8.-ANEXOS......48
CAPITULO I1.- JUSTIFICACINEl conocimiento emprico acerca de las
plantas medicinales y sus efectos curativos se acumul durante
milenios. Aunque a partir del siglo pasado el empuje de la
industria farmacutica hizo que la teraputica fundamentada en el
empleo de plantas viniera a verse como una prctica "primitiva" e
irracional.Hoy da se reportan numerosos descubrimientos cientficos
que confirman el enorme potencial curativo que posee el mundo
vegetal. En aos recientes, las investigaciones permitieron el
descubrimiento de aplicaciones insospechadas para muchas plantas y
sustancias derivadas de estas. Tambin han surgido nuevas formas de
preparacin y de disponibilidad. Hoy encontramos extractos de
plantas medicinales en forma de cpsulas, tabletas y otras formas
desconocidas para nuestros antecesores. Estos descubrimientos
presentan nuevos retos. El estudio cientfico moderno de las
propiedades curativas de las plantas promete descubrir propiedades
que incluso van ms all de los usos tradicionales conocidos. Sin
embargo, la falta de incentivos para este estudio ha sido hasta
ahora un escollo formidable. Algunas universidades y entidades
gubernamentales han comenzado a responder a la necesidad de
estudios cientficos sobre las propiedades curativas de las
plantas.
2.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Desconocimiento de las propiedades e importancia de sus
principios activos de cada planta con influencias al campo
farmacutico.
3. OBJETIVOS 3.1. Objetivos generales: Determinar la importancia
de sus principios activos de cada planta para poder ser aplicado al
campo medicinal de una forma natural. 3.2. Objetivos especficos:
Evaluar las diferentes propiedades que proporciona cada planta.
Verificar las diversas aplicaciones curativas. Conocer los diversos
procesos necesarios para que sea aplicado al campo medicinal.4.-
HIPTESIS
Ho: Como y porque una determinada planta tiene propiedades
curativasHi: Una determinada plantas no tienen propiedades
curativas
CAPITULO II1.- PLANTAS MEDICINALES La OMS defini en un congreso
realizado en China en 1980 la PLANTA MEDICINAL como todo vegetal
que contiene en uno o ms de sus rganos, sustancias que pueden ser
utilizadas con fines teraputicos o preventivos o que pueden ser
precursores de hemisntesis quimio-farmacutica Son aquellas plantas
que elaboran productos llamados PRINCIPIOS ACTIVOS, o sustancias
que ejercen una accin farmacolgica sobre el organismo vivo. Su
utilidad es servir como droga o medicamento. Constituyen
aproximadamente la 7 parte de las especies conocidas.
2.- PRINCIPIOS ACTIVOS - Son substancias que se encuentran en
las distintas partes de las plantas y que alteran o modifican el
funcionamiento de rganos y sistemas del cuerpo humano y
animal.2.1.- CLASIFICACIN SEGN SU ORIGEN METABLICO Metabolito
primario: Producto del metabolismo general. Ampliamente distribuido
en plantas y microorganismos. Ejemplo: aminocidos, nucletidos,
cidos carboxlicos del ciclo ctrico, lpidos, carbohidratos y fibras,
vitaminas, minerales, antibiticos etc. Metabolito secundario: No
son esenciales para el metabolismo sino son sintetizadas como
defensa, adaptacin Producto del metabolismo especial.
Bio-sintetizados a partir de metabolitos primarios. Con distribucin
restringida a ciertas plantas y microorganismos (a veces es
caracterstico de un gnero dado o de una especie.) Ejemplo:
alcaloides, terpenoides, flavonoides, oligosacridos, etc.
CO2
cido shiqumicoligo y polisacridosHidratos de carbono (aldosas,
cetosas, etc.)
Anlogos del fenilpropano
Carotenoides Piruvato
ACETOGENINAScidos grasos, Antraquinonas, Fenoles, Macrlidos,
Tropolonas, etc.
EscualenoAcetatocido mevalnico
Geraniol Genaril geraniol Ciclo de krebs
TriterpenosFarnesol
ProtenasAminocidos
MonoterpenosDiterpenos
FlavonoidesSesquiterpenosPorfobilingenoEsteroides
Porfirinas
Alcaloides
ESQUEMA GENERAL DE LAS RUTAS BIOSINTTICAS
3.- ESTUDIO FITOQUMICO PRELIMINARSe ha desarrollado una serie de
mtodos para la deteccin preliminar de los constituyentes qumicos de
las plantas, basados en la extraccin de stos con solventes
apropiados y en la aplicacin de pruebas de coloracin.ESQUEMA PARA
LA DETERMINACIN DE ALCALOIDES, SAPONINAS Y FLAVONOIDES,
ANTRAQUINONAS, ETC. CUADRO. 01Muestra seca y molida 50 g
Etanol 95% reflujar 1 hora. Filtrar.
Extracto etanlico
10 g pptar. Con Pb (anhidro actico) 5%.Concentrar
20 g extraer con ter de petrleo.15 g extraer HCl 5%Alcanizar
NaOH 20%Extraer con CHC y CHC: etanol (3:2)
Filtrado
Ppto.Residuo
Extraer con CHC, secar (), concentrar. CC almina neutra
activada, eluir con CHC (90:10)Extraer con etanol: H (1:7), 60C
SolucinExt. Clorofrmico, y ext. Etanlico.(Por separado)
Extracto
Concentrar, extraer con HCl 5%, filtrar.
Saponinas: Prueba de la espuma.CCD silicagel: acetona (90:10).
Rev. Hidroxamato frrico.Rev. Vainillina-ac.
Ortofosforico.Sesquiterpenlactonas y cumarinas.
CCD silicagel: Metanol: H (87:12:1). Rev. R Raymond
Cardiotnicos.
Antraquinonas: Borntrager Solucin cida Alcaloides Dragendorff,
Mayer, Reineckato de amonio, otros.
Flavonoides: Shinoda
CCD: cromatografa de capa delgada. CC: cromatografa de
columna.
Taninos: gelatina. FeC
CUADRO 02Muestra seca y molida 50 g
Taninos: R. gelatina y R. FeC+50 ml metanol, macerar 20 horas a
temperatura ambiente, reflujar 4 horas, filtrar en caliente, lavar
con metanol y llevar a 50 ml.
Separar 2 ml
Aminocidos: R de ninhidrina Flavonoides: R. shinodaExtracto
metanlico
El resto, llevar a sequedad/rotavapor, extraer con 15 ml HCl 1%
a 50 C, filtrar sobre celita.
Solucin cidaInsoluble
Filtrar, enfriar, alcalinizar con N, extraer en CHC (225ml)Lavar
con H, secar, agregar, 5 ml CHC, calentar, filtrar, secar (),
llevar a 5 ml.
Fase acuosa
Fase clorofrmicaFraccin b
Saturar con (0.1 g sal anhidra por ml de solucin) extraer con
CHC: etanol (3:2), (225)Lavar con H, secar (), filtrar; a 50 ml
CHC.Esteroides: R. Liebermann-Burchard.Quinonas: R. Borntrager.
Cardenolidos: R. KeddeEsteroides: R. Liebermann-
BurchardEvaporar a sequedad + 2 ml HCl 1%. Filtrar.
Fraccin c
Evaporacin + 2 ml de CHCFase clorofrmica: etanlica Fase acuosa
remanente
Filtrado: Alcaloides
Concentrar, extraer con HCl 5%, filtrar.
Fraccin eLavar con sol. (10 ml) secar , filtrar, llevar a 50
ml
Flavonoides: R.ShinodaLeucoantocianidina R. Rosenheim
Fraccin d
Evaporar a sequedad +2,5 ml etanol
Alcaloides: R. mayer.R. DragendorffEsteroides,Triterpenos. R.
Liebermann- BurchardCardenlidos, Anillos lactona. R.
Kedde.Leucoantocianidina R. RosenheimFlavonoides: R. Shinoda
4.- MTODOS SEPARATIVOS Y DE PURIFICACINEn los trabajos de
investigacin sobre productos naturales (metabolitos secundarios) es
preciso extraer cuidadosamente los componentes de vegetal en
estudio para en seguida aislar y purificar los compuestos presentes
en los extractos obtenidos.Luego los compuestos puros se analizan
con tcnicas espectroscpicas y mtodos qumicos, lo que permite
obtener las estructuras qumicas correspondientes.Los mtodos
cromatogrficos son los procedimientos separativos ms utilizados. La
cromatografa es la distribucin de los componentes de una muestra
entre dos fases, una mvil (gas o lquida) y una fija o estacionaria
(liquido o solida). 4.1.- CROMATOGRAFA LQUIDA (CL)1) Cromatografa
de particin: Es la separacin de los componentes de una mezcla a
base de los coeficientes de particin de cada uno de ellos entre dos
solventes inmiscibles, uno fijo (fase estacionaria) y el otro mvil.
2) Cromatografa de adsorcin: Depende de la adsorcin del soluto
sobre sobre absorbentes polares, tales como: gel de slice o almina.
La cromatografa en capa delgada es una forma de cromatografa de
adsorcin.3) Cromatografa de intercambio inico: Se aplica tanto a
aniones como cationes, se basa en e intercambio (adsorcin) de iones
entre la fase mvil y los sitios inicos del relleno. Muchas de las
resinas usadas derivan de co-polmeros de estireno y divinilbenceno
a los cuales se han agregado grupos funcionales, las resinas del
tipo de cido sulfnico y las de amonio cuaternario se usan n la
mayora de las aplicaciones. Se usan en la separacin de
aminocidos.4) Cromatografa de exclusin: La separacin se basa en el
tamao molecular del soluto que pasa a travs de un gel que posee una
superficie porosa inerte. Las molculas pequeas pueden penetrar en
los poros y quedar retenidos en ellos, mientras que las molculas
grandes al no poder introducirse en los poros, son arrastrados por
la fase mvil. Se usa con frecuencia el gel SEPHADEX (nombre
comercial) para la separacin de metabolitos secundarios.Las cuatro
formas de cromatografa liquida pueden efectuarse en capa delgada.
4.2.- CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA (CCD)La fase estacionaria es una
capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual
puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. Se usan como
adsorbentes: Sustancias inorgnicas: gel de slice, almina, cido
silcico (diatomita), silicato de magnesio y calcio.Los adsorbentes
inorgnicos (excepto diatomita) se usan principalmente para separar
compuestos lipoflicos. Sustancias orgnicas: celulosa y derivados,
almidn, sacarosa, manitol y geles de dextrano.La celulosa y
derivados se aplican exclusivamente a compuestos hidroflicos como
aminocidos, azucares, glucsidos, etc.La sacarosa y manitol se usan
para separar pigmentos de plantas.4.3.- CROMATOGRAFA CENTRFUGA EN
CAPA DELGADA (CCCD)Desde aos se ha intentado aumentar la velocidad
de separacin acelerando la velocidad de flujo de la fase mvil
mediante centrifugacin; se ideo un aparato cromatfugo para aplicar
esta tcnica de separacin en escala preparativa, su utilidad se
demostr en la separacin de purinas, cafena, teobromina, teofilina y
xantina.4.4.- CROMATOGRAFA EN COLUMNA (CC)Es la ms usada en la
separacin de productos naturales, se emplean absorbentes: gel de
slice, almina, celulosa, florisil, poliamida, variados sephadex; se
usan ms y ms materiales de relleno que permiten trabajar en fase
inversa. 4.5.- CROMATOGRAFA GASEOSA (CG)Posee como fase mvil un gas
inerte que generalmente es nitrgeno. La fase estacionaria puede ser
un lquido o un solido. Puede usarse combinada con tcnicas
espectroscpicas, como espectrometra de masa, la cual necesita de
una interfase para adaptar las condiciones del cromatgrafo gaseoso
a las de vaco del espectrmetro de masa y eliminar el gas portador.
4.6.- CROMATOGRAFA DE CONTRACORRIENTE A GOTA A PRESINEs un mtodo de
separacin reciente y consiste en cromatografa de particin lquido
lquido que se efecta pasando en forma continua, mediante bombeo
gotas de fase mvil a travs de un nmero de columnas conectadas en
serie llenas con la fase estacionaria.Como la mayora de los
solventes apropiados para la CCCGP contienen agua, esta tcnica se
usa preferentemente para compuestos polares como: saponinas,
ginsensidos, glicosidos de catequinas y flavonas; tambin se utiliza
para separar compuestos no polares. 5.- MTODOS FSICOS EN LA
DETERMINACIN DE ESTRUCTURAS ORGNICAS5.1.- ESPECTROFOTOMETRA
ULTRAVIOLETA VISIBLELos extractos en diferentes etapas de
purificacin pueden ser analizados con el fin de buscar absorciones
caractersticas en la regin UV y visible. El espectro UV, junto con
otras constantes fsicas de un compuesto (punto de fusin, poder
rotatorio, etc.), es parte integrante de la descripcin y
caracterizacin del mismo. Mas an, en algunos casos como:
carotenoides, porfirinas, corrinas, etc. La absorbancia a una
longitud de onda dada es un indicio de la pureza del compuesto.En
la determinacin de detalles estructurales, la absorcin en el UV
visible puede, una vez determinado el esqueleto carbonado y el tipo
de compuesto (flavonoide, carotenoide, esteroide, etc.), brindar
informacin sobre la presencia de ciertos grupos funcionales.
5.2.- ESPECTROSCOPIA INFRARROJA (EI)El espectro infrarrojo de la
mayora de los compuestos orgnicos puede dividirse en dos partes:
Las bandas de vibracin de sustituyentes especficos entre 1300 y
4000 Las bandas de vibracin del esqueleto hidrocarbonado (C-C y
C-H) entre 650 y 1400 En el anlisis estructural, la zona entre 1400
y 4000 es de gran utilidad. Las bandas entre 1650 y 1800 indican
C=O y en estos ltimos, segn el valor exacto, puede inferirse el
tipo el grupo de tipo funcional del que forma parte el carbonilo,
si se encuentra conjugado. La presencia de dobles enlaces y de
sistemas aromticos, al igual que los distintos tipos de sustitucin
sobre anillos bencnicos. 5.3.- ACTIVIDAD PTICA Y DISPERSIN PTICA
ROTATORIA (DOR)La actividad ptica de un compuesto es una
caracterstica de su estructura molecular. La posibilidad de medir
la actividad ptica en la regin UV ha permitido obtener curvas de
rotacin ptica en funcin de la longitud de onda de la luz
polarizada, las cuales han sido aplicadas con xito en la resolucin
de problemas estructurales.Las curvas de DOR se usan para
determinar si un compuesto con rotacin nula (extremadamente pequea)
en la lnea D (589nm) es pticamente activo, ya que los compuestos
con curvas simples presentan mayor rotacin en la regin UV que a 589
nm.Con otros mtodos es en general fcil distinguir steres y cetonas,
las curvas de DOR son un arma adicional pues las cetonas tienen un
efecto CATTON alrededor de 300 nm, en tanto que los steres poseen
curvas simples en esa zona.
5.4.- ESPECTROMETRA DE MASA (EM)En un espectro de masa
convencional cada pico indica solo la masa total del fragmento, ste
puede contener distintos tipos de tomos y diversas estructuras.Con
frecuencia se intenta primero localizar el ion molecular y luego
caracterizar las distintas rupturas a base de los picos mas
intensos. Dada una estructura probable deben analizarse sus
rupturas principales y buscarlas luego en el espectro. Los mtodos
instrumentales que comprende la espectrometra de masa pueden
adaptarse al comportamiento qumico de la sustancia.Las sustancias
sometidas a este tipo de anlisis se clasifican en: Sustancias
voltiles mediante una derivatizacin: Los iones son generados en la
fase gaseosa en forma uni-molecular por impacto con un haz de
electrones de alta energa (20 a 70 eV) (ionizacin de campo o por
impacto electrnico) o en forma bimolecular por reaccin con otros
iones orgnicos. Sustancias polares y sales termolbiles:Los iones
son generados a partir de la sustancia depositada sobre una
superficie de donde es desorbida en forma de iones por accin de un
campo elctrico muy intenso o bien disuelta en una matriz solida o
liquida que es bombardeado por un haz de iones de alta energa que
erosiona la superficie y desprende las partculas en forma de iones
llamados iones secundarios Sustancias de elevado peso
molecular:Biopolmeros como cidos nucleicos, polisacridos, etc. En
este caso el estudio en general consiste en degradaciones muy
suaves y en el anlisis de fragmentos estructuralmente exactos.
6.- ESTUDIO FITOQUMICO EN EL PAS: IMPORTANCIA Y PERSPECTIVASEl
Per es un pas exportador de algunas plantas medicinales; sin
embargo, debido a la competencia creciente de otros pases
productores, su posicin como exportador tiende a decrecer en
beneficio de ciertos pases de Asia, frica y Europa; estos pases han
tomado conciencia del potencial de sus productos naturales y han
favorecido mucho sus programas de desarrollo agrcola e industrial:
La India es el principal abastecedor de gran variedad de plantas a
Europa. Zaire produce papana y quinina.El pas posee gran riqueza en
su flora, de la cual varios miles de especies son conocidas, con
varios de cientos por descubrir y con menos del 10% estudiadas
desde el punto de vista qumico y farmacolgico, un anlisis
fotoqumico sistemtico dar a conocer nuevas drogas importantes. El
anlisis fotoqumico podra ser orientado aprovechando las
experiencias de investigaciones reportadas en la literatura. La
literatura reporta varias especies de DIOSCOREA, especialmente en
la regin de la Selva, y de su contenido en diosgenina, de gran
importancia como materia prima para la produccin de hormonas
esteroidales. Debe propiciarse y buscarse la tecnologa para la
produccin de diosgenina a escala industrial. La literatura reporta
varias especies de gnero Werneria en los andes peruanos, que la
medicina tradicional hace uso de ellas para el tratamiento de cncer
al tero, como febrfuga, para el tratamiento de reumatismo, de dolor
de garganta, etc. Hay pocos trabajos realizados en la parte qumica
y farmacolgica. La literatura reporta la presencia de lactonas
sesquiterpnicas principalmente en los gneros Ambrosia y Artemisia,
las que por ensayos biolgicos se han demostrado que presentan accin
antitumoral y citotxica, podran constituir un grupo de plantas de
estudio en la bsqueda de sesquiterpenlactonas biolgicamente
activas.
CAPITULO IIII.- TERPENOIDES Y ESTEROIDES1.- DEFINICIN El trmino
terpenoide se refiere a un grupo de sustancias que tienen un origen
biosinttico comn y que siguen la llamada regla del isopreno
esbozado por WALLACH en 1866. ESTRUCTURA DEL ISOPRENO
Se clasifican segn el nmero de unidades de isopreno (2,3,4,) que
lo forman. Monoterpenos () - Sesquiterpenos () - Diterpenos ()
Sesterpenos () - Triterpenos () - Tetraterpenos ()
El amplio uso de los terpenoides, tanto en la industria como en
la medicina, ha despertado el inters por encontrar nuevas fuentes y
por el conocimiento de nuevas estructuras qumicas.
2.- BIOSNTESISAunque se seala la unin de unidades de isopreno
como ruta biogentica se destaca que el verdadero precursor de los
terpenoides es el pirofosfato de -- isopentilo, el cual es formado
del acetato va cido mevalnico. El gran nmero de terpenoides aislado
de plantas ha sido originado por la facilidad con que estos
esqueletos carbonados sufren reacciones de ciclacin y
reordenamiento del tipo ion carbonio, hidrataciones y oxidaciones,
dando as lugar a compuestos de estructura cclica y aciclica,
saturados o insaturados, con uno o mas grupos funcionales.
cido ActicoMevalonato o cido mevalnico
IsomerizacinPirofosfato de -- isopentiloCaucho
(poli-cis-isopreno)
Pirofosfato de dimetilalilo
Pirofosfato de geranilo ( )
Pirofosfato de farnesilo ( )
Monoterpeno
DimerizacinSesquiterpenosPirofosfato de geranilgeranilo ( )
EscualenoDimerizacinGutapercha Poli isoprenoUbiquinonas
Diterpenos
Triterpenos (lanosterol)
Carotenoides
Esteroides
ESQUEMA GENERAL DE LA BIOSNTESIS DE TERPENOIDES Y ESTEROIDES
3.- ACEITES ESENCIALES3.1.- DEFINICINSon los constituyentes
odorferos o esencias de una planta. El trmino aceite, probablemente
se origina del hecho que el aroma de una planta existe en las
glndulas o entre las clulas en forma lquida, el cual al igual que
los aceites grasos son inmiscibles en el agua.Presentes en especias
de las familias de las: Umbeliferae (apio, comino, perejil, ans)
Rutaceae (limn, naranja, lima, mandarina) Labiateae (lavanda,
romero, timol, organo) Piperaceae (pimiento, matico)Pueden estar
ubicados en las diferentes partes de la planta; en las conferas
esta en todo el tejido; en la rosa, slo esta en el ptalo; en el
comino, en las semillas; en el clavo de olor, en el brote o yema;
en la lima, en el fruto; en la menta, en los pelos glandulares de
la planta y hojas.Los aceites esenciales qumicamente estn formados
por la mayora de los monoterpenos y algunos sesquiterpenos y
compuestos aromticos.Las aplicaciones de los aceites esenciales son
muy variadas: Utilizadas en perfumera Saborizante de alimentos
Medicina, los aceites esenciales del ans, menta y canela son
carminativos y soporferos; el de clavo de olor es analgsico dental,
el de eucalipto es expectorante.
3.2 TCNICAS RECOMENDADAS3.2.1.- GENERAL Los aceites esenciales
son obtenidos del material fresco que los contiene, utilizando
principalmente el clsico procedimiento de destilacin por arrastre
de vapor, obtenido el aceite esencial ste es secado con sulfato de
sodio anhidro.
DESTILACIN POR ARRASTRE DE VAPOR
Otros mtodos son: expresin, extraccin con solventes lipofilicos
y el enflorado; el ltimo usado en perfumera, consiste en que los
ptalos de una flor se colocan y presionan entre dos lminas
impregnadas de grasa en las cuales se absorbe el aceite, el que
luego es extrado con alcohol. Las reacciones de color y de
precipitacin pueden ser utilizadas para determinar la presencia de
determinados grupos funcionales: - Los alcoholes pueden
determinarse por la aparicin de un precipitado amarillo debido a la
formacin de xantato cuando la muestra es tratada con CS2 y KOH. -
Los aldehdos y cetonas por la formacin de precipitado rojo,
anaranjado o amarillo por reaccin de la muestra con 2,4-DNFH.
3.2.2.- ANLISIS ESPECTROMTRICOS El anlisis por mtodos
espectromtricos de un aceite esencial constituido por una mezcla de
compuestos puede ser utilizado para obtener una informacin sobre su
posible composicin y asumir la ausencia o presencia de determinado
grupo funcional. En el espectro UV, absorciones intensas entre 202
y 210 nm seria indicativa de compuestos saturados; entre 215 y 250
nm presencia de compuestos insaturados y entre 250 y 270 nm de
compuestos aromticos. 3.2.3.- DETERMINACIN DE LOS ACEITES
ESENCIALES Las caractersticas de un aceite esencial son dadas en
forma general mediante valores de ndices de: Refraccin Gravedad
especifica Rango de temperatura de ebullicin Punto de cristalizacin
o congelacin, ndice a acidez del aceite esencial (IA): Es el nmero
de mg de hidrxido de potasio necesarios para neutralizar los cidos
libres contenidos en 1g de aceite esencial. ndice de ster (IE) de
un aceite esencial: Es el nmero de mg de hidrxido de potasio
necesarios para neutralizar los cidos liberados por hidrolisis de
los esteres contenidos en 1g de aceite esencial.3.3.- EJEMPLO DE
APLICACIN Aceite esencial de Eucalipto De la destilacin por
arrastre de vapor de hojas frescas de eucalipto se obtuvo un aceite
esencial de IA 0.4902 e IE 1.4039.El CGL presento dos picos
principales con tiempos de retencin de 194 y 320 segundos
correspondientes a o -pineno y cineol respectivamente.De la
destilacin al vaco (5 mm Hg) del aceite de eucalipto se separ el
cineol con una pureza no menor de 98%.
ANEXO 01 Aceite esencial de comino, organo, pimienta,
hierbaluisa, palillo Los aceites fueron obtenidos por destilacin
por arrastre con vapor de agua.
4.- SESQUITERPENLACTONASDerivadas biogenticamente de los
sesquiterpenos, son substancias amargas que se encuentran en todas
partes de la planta (familia Asteraceae: gnero: artemisia y
ambrosia), en concentraciones que varan entre 0.01 % y 8% del peso
seco, son bastantes solubles en cloroformo y ter etlico. Presentan
gran importancia por la variada accin biolgica: Accin citotxica
Antitumoral Analgsica Inhibidores del crecimiento de bacterias.Son
de estructuras muy diversas, resultados de una variedad de
ciclaciones, fusiones de anillo, esterificaciones; pero con un
anillo caracterstico de -lactona-,-insaturada.
4.1.- TCNICAS RECOMENDADAS4.1.1.- GENERAL El procedimiento
general para la extraccin y separacin de las sesquiterpenlactonas
se indica a continuacin: A 100 gr de hojas secas y molidas se le
agrega 500 ml de CHCL3 grado tcnico, y se deja en reposo durante
una noche. El extracto clorofrmico se filtra, el filtrado verde
oscuro se evapora a una masa resinosa, la cual es disuelta en
etanol 95% (250 ml). Si el jarabe espeso no se disuelve fcilmente
la solucin se calienta a bao de vapor por 5 minutos, y se deja
luego a temperatura ambiente.Se adiciona 250 ml de solucin acuosa
de acetato de plomo al 4% para precipitar los compuestos ms
polares. Se filtra la solucin a travs de Celita, el filtrado se
concentra al vaco y luego se extrae 3 veces con 75 ml de cloroformo
cada vez; los extractos clorofrmicos se renen, se secan sobre MgSO4
anhidro y se concentran. Este extracto clorofrmico contiene las
sesquiterpenlactonas y en algunos casos triterpenos y flavonoides
altamente metilados.El nmero de lactonas se determina por CCD
usando Silicagel G con sistemas como benceno: acetona (4:1) o
CHCter etlico (5:1) y revelando con vapores de yodo o con solucin
acuosa de KMn al 5%. La separacin de las lactonas puede hacerse por
CC disolviendo 5 g del extracto en benceno: acetona (2:1) y
cromatografiando sobre gel de slice empacada de benceno, por elucin
con benceno y mezclas de benceno: acetona de polaridad creciente.
Cada fraccin se lleva a sequedad y se comprueba por CCD. Tambin se
usan las reacciones qumicas de color para detectar el anillo
lactona, entre ellas la reaccin con cloruro de hidroxilamina y
cloruro frrico para producir los hidroxamatos frricos coloreados, o
las pruebas de Baljet y de Legal.
4.1.2.- ANLISIS ESPECTROMTRICOS.Debido a la gran variedad de
esqueletos carbonados no es posible dar caractersticas espectrales
de un nico esquema; sin embargo algunos valores pueden ser
caractersticos como la absorcin UV entre 205-212 nm, la seal a 1750
en el IR para el anillo -lactona-,-insaturada.
5.- DITERPENOS5.1.- DEFINICIN Comprende un grupo de compuestos
de 20 tomos de carbono que puede presentarse en forma de
hidrocarburos, alcoholes, cetonas, lactonas y cidos carboxlicos,
siendo estos ltimos conocidos desde tiempo atrs como cidos resnicos
y obtenidos como componentes de las oleorresinas exudadas por
cortes en los troncos de pinos y abetos. Se subdividen atendiendo
al tipo de esqueleto carbonado: Bicclicos (labdano y clerodano)
Tricclicos (abietano, cassano, totarona y podocarpano)
Tetraciclicos (tipo kaurano, bayerano, atisano, giberalano) Son
clasificados en base a sus propiedades como: cido abitico y agtico
tienen una funcin protectora en la planta. Giberalinas hormonas
(cido giberlico) que estimulan el crecimiento vegetal Estos
compuestos pueden ser separados por las tcnicas cromatogrficas para
los terpenos menores y triterpenos.
5.2.- EJEMPLO DE APLICACIN Diterpenos xido de manoilo de
Werneria dactylophylla 550 g de la parte area de W. dactylophylla o
Conuca, fueron extrados en un Soxlhet sucesivamente con ter de
petrleo (6 g) y cloroformo (36 g). 3g del extracto clorofrmico fue
cromatografiado en una columna de silicagel usando cloroformo con
cantidades crecientes de metanol como solventes de elucin. Las
fracciones colectadas fueron reunidas de acuerdo a su
comportamiento cromatogrfico en capa delgada y posteriormente
purificada por HPLC (columna de fase reversa, metanol: agua,
(17:3). Obtenindose cuatro diterpenos xidos diferentes.
6.- TRITERPENOIDES Y ESTEROIDES6.1.- DEFINICIN Los
triterpenoides son compuestos con un esqueleto carbonado basado en
seis unidades de isopreno que derivan biogenticamente del
escualeno, hidrocarburo acclico de 30 carbonos. Son de estructura
relativamente compleja generalmente tetracclicos o pentacclicos, y
pueden contener grupos hidroxilo, cetona o aldehdo y cido
carboxlico. Muchos se encuentran como glicsidos formando las
llamadas saponinas triterpenoides. Lanosterol - Escualeno -
Arborano Tirucalol - Eufol - Damnarano Los esteroides,
biogenticamente muy relacionados a los triterpenoides, y con un
esqueleto cclico base al igual que los triterpenoides tetracclicos,
de ciclopentanoperhidrofenantreno, pueden ser clasificados como
esteroles (),saponinas esteroidales, glicsidos cardiacos,
esteroalcaloides y las llamadas hormonas esteroidales, Sitosterol -
Colesterol - Estigmasterol Progesterona - Testosterona -
Androsterona Estriol - Estrona - Cortisona Triterpenoles y
esteroles son slidos incoloros, cristalinos, de alto punto de fusin
de fusin; los esteroles, generalmente tienen punto de fusin menor
que 200 C y los triterpenoles mayor de 200 C. Las saponinas son
glicsidos de ambos, triterpenos y esteroles, dan soluciones
jabonosas, y algunos extractos crudos de plantas han encontrado uso
como detergentes. Causan hemolisis de la sangre an en soluciones
muy diluidas.Las saponinas no son fciles de aislar por ello muchas
veces se prefiere hidrolizar el extracto crudo de la planta y
aislar la sapogenina libre de azcar. Las sapogeninas del grupo
triterpeno se encuentran extensamente distribuidas en la
naturaleza; una gran variedad de ellas difieren difieren nicamente
en el nmero y tipo de unidades de azcar unidas a las sapogeninas,
las fuentes de saponinas triterpenoidales y sus geninas son:
Ginseng - Alfalfa - Avena Quinua - Soya, etc.Las saponinas
esteroidales son materia inicial para la preparacin de productos
muy potentes y ampliamente usados como productos farmacuticos,
entre ellos: Cortisona - Anticonceptivos Estrgenos - Testosterona
6.2.- TCNICAS RECOMENDADAS6.2.1.- GENERAL Triterpenos y esteroides
pueden ser separados por procedimientos muy similares utilizando
tcnicas cromatogrficas de columna, de capa delgada, de gas lquido y
de lquida de alta performance. Las identidades deben ser
confirmadas por punto de fusin, rotacin especifica, infrarrojo y
espectrometra de masas. Se han propuestos muchas reacciones de
color para detectar la presencia de estos compuestos, siendo los ms
usuales: Reaccin de Noller: Especfica para triterpenos (muestra +
0.2 ml de reactivo: cloruro de tionilo conteniendo 0.1 % de Fe),
por los de color producidos en los 60 minutos siguientes Otras
reacciones de coloracin usuales son aquellas usando cido
fosfomolbdico (solucin etanlica al 10% de acido de cido
fosfomolbdico.
6.2.2.- ANLISIS ESPECTROMTRICOS El espectro UV es muy til para
deducir la presencia y ubicacin de grupos cromforos por aplicacin
de reglas de WOODWARD.Compuestos triterpenoides y esteroides en
general muestran en IR seales a 3650-3590 y a 1055 correspondientes
a OH secundarios. Las sopogeninas esteroidales son adems
caractersticas las absorciones del espiroacetal en forma de 4
bandas llamadas A, B, C y D, aproximadamente a 980, 920, 900, 860
respectivamente. La espectrometra de masas ha sido la herramienta
ms fuerte y usual para elucidar el esqueleto y especialmente la
localizacin del doble enlace en los triterpenos.
6.3.- ANLISIS CUANTITATIVO DE DIOSGENINASe usa para evaluar el
contenido de diosgenina en tubrculos de Dioscorea y consiste
bsicamente en 3 pasos: Maceracin del Tubrculo, Hidrolisis cida y
extraccin. 50 g de material fresco se macera con igual peso de agua
y se homogeniza en una licuadora; cuando esta macerado, se le
coloca en un baln, al cual se le agrega 115 ml de HCl 3,5 N de tal
manera que la mezcla es aprox. 2N. Se refluja durante 3 horas, se
le agrega 250 ml de agua y se enfriar para luego filtrarlo.El
residuo se lava de 8 a 10 veces con porciones de 50 ml de agua y se
deja secar durante toda la noche a 65-70 C. El residuo seco se
coloca en un Soxlhet y se extrae durante 8 horas con 100 ml de ter
de petrleo; despus de la extraccin se reduce el volumen del
solvente a aproximadamente 10 ml y se deja en reposo a temperatura
ambiente durante 2 horas, tiempo en el cual los cristales de
diosgenina deben precipitar.Se filtra, seca y pesa. Se debe
determinar la humedad de la muestra. II.- COMPUESTOS FENLICOS
1.- DEFINICINLos compuestos fenlicos se refieren a un grupo de
substancias que poseen en comn un anillo aromtico con uno o ms
sustituyentes hidroxilos, y que ocurren frecuentemente como
glicsidos, combinados con unidades de azcar. Pueden ser detectados
por el intenso color verde, prpura, azul o negro, que produce
cuando se les agrega una solucin acuosa o alcohlica al 1% de
cloruro frrico. Dada la naturaleza aromtica de estos compuestos
fenlicos, ellos muestran intensa adsorcin en la regin UV del
espectro, siendo este mtodo espectral especialmente importante para
su identificacin y anlisis cuantitativo. Los compuestos fenlicos
son: Flavonoides Cumarinas Cromenos Benzofuranos Xantonas
QuinonasAlgunos compuestos podran no contener el OH fenlico libre.
Varios grupos de materiales polimricos de plantas como las ligninas
y taninos son polifenlicos.
2.- FLAVONOIDES2.1.- DEFINICIN Se conoce como diez clases de
flavonoides, todos contienen quince tomos de carbono en su ncleo
bsico y estn arreglados bajo un sistema - - , en el cual dos
anillos aromticos llamados A y B estn unidos por una unidad de tres
carbonos que pueden o no formar un tercer anillo, que en caso de
existir es llamado anillo C. Se forman biogenticamente a travs de
la ruta de Shikimato y del acetato malonato, siendo la chalcona el
flavonoide inicialmente. Los flavonoides se emplearon durante mucho
tiempo como colorantes de lana, actualmente se usan en la
conservacin de grasas o jugos de frutas debido a las propiedades
antioxidantes de algunas polihidroxiflavonas.
2.2.- TCNICAS RECOMENDADAS2.2.1.- DE EXTRACCINLos solventes
empleados son muy variados y pueden ser muy polares como el agua y
etanol para glicsidos o agliconas muy hidroxiladas, hasta menos
polares como como ter y cloroformo para flavonas. 2.2.2.-
REACCIONES DE COLOR Para determinar flavonoides en un extracto de
planta es necesario la reaccin de Shinoda: Al extracto alcohlico
incoloro o ligeramente amarillo se le coloca un pequeo trozo de
magnesio y unas pocas gotas de HCl conc., el desarrollo inmediato
de coloracin es indicativo de la presencia de: Flavonas y
flavonoles (amarillo a rojo), flavanonoles (rojo a magenta),
flavanonas (rojo, magenta, violeta, azul), isoflavonas (amarillo);
isoflavononas, chalconas y auronas no dan coloracin. En algunos
casos puede hacerse pruebas directamente sobre el material; por
ejemplo, si los ptalos blancos de una flor en presencia de vapores
de amoniaco se ponen amarillos es indicativo de flavonas y/o
flavonoles, si viran de amarillo a rojo hay presencia de chalconas
y auronas.2.2.3.- TCNICAS CROMATOGRFICASLa deteccin de los
flavonoides en cromatografa de capa delgada, puede hacerse por el
color que desarrollan en visible o en el UV, apareciendo como
manchas fluorescentes azules, naranjas, prpuras y otras; las cuales
se intensifican o cambian de color luego de su exposicin a vapores
de amoniaco.
2.3.- EJEMPLOS DE APLICACIN Flavonoides de Andira inermis 1.750
kg de corteza seca y molida fue macerada en 4 L de metanol durante
30 das. El extracto fue concentrado a sequedad (13.9 g) y disuelto
en 160 ml Metanol: agua (2:3). Esta solucin acuosa-metanlica se
someti a una extraccin exhaustiva con CHC obtenindose despus de
concentrar el extracto clorofrmico 1.6 g (E1). E 1 fue
cromatografiado por CCDP en Benceno: acetona (2:1), separndose
entre otros, formometina y pseudobaptigenina (9.0 mg), gensteina
(28.0 mg), 3-metoxidaidzena (4.0 mg) y daidzena (3.0 mg).
3.- CUMARINAS3.1.- DEFINICIN Son compuestos ampliamente
distribuidos en las plantas, principalmente en las familias
Umbelferas y Rutaceae; se encuentran en todas las partes de la
planta, desde la raz a flores y frutos siendo ms abundantes en
estos ltimos. Se presentan a menudo como mezclas, en forma libre o
como glicsidos.IMAGEN DE ESTRUCTURA CUMARINA
Se denomina cumarina a todas aquellas que tienen como base la
estructura sealada. Las cumarinas de las cuales el 5% aprox. Carece
de oxigeno en la posicin -7-, pueden clasificarse como: Simples
Furanocumarinas Piranocumarinas Cumarinas preniladas Cumarinas
substituidas en el anillo pirona Todas las cumarinas se
caracterizan por el sistema benzo--pirona y su carcter lactnico que
hace que sean solubilizadas por soluciones alcalinas con la
aparicin de un color amarillo en la solucin; el hecho de que
aproximadamente el 95 % de las cumarinas poseen substituyente
oxgeno en el C-7 hace que se considere a la 7-hidroxicumarina o
umbeliferona como el compuesto padre, mejor que la cumarina misma.
Estn biogenticamente relacionadas a los fenilpropanoides como
flavonoides y ligninas as como a las substancias derivadas de
acetato, como esteroides y terpenoides, ya que su biosntesis
transcurre por ambas vas: va Shikimato y va polictico del
acetato
3.2.- TCNICAS RECOMENDADAS3.2.1.-DE EXTRACCINLa extraccin de las
cumarinas puede realizarse sobre el material vegetal fresco o seco,
con solventes de diferentes polaridades dependiendo de la
estructura de las cumarinas. Las cumarinas oxigenadas, son
ligeramente solubles en solventes poco polares y a menudo pueden
cristalizar directamente de un extracto de ter de petrleo, ya sea
por enfriamiento o por concentracin del extracto. Solventes usuales
son el ter de petrleo y ter etlico o sus mezclas, acetona, metanol
y etanol.Si una cumarina se encuentra en cantidades apreciables en
una fuente natural es posible separarla por cristalizacin
directamente del extracto.3.2.2.-DE SEPARACIN CROMATOGRFICA Y DE
DETECCINLa cromatografa de columna ha sido ampliamente usada, ya
sea utilizando silicagel o almina neutra o cida como adsorbentes;
la almina bsica no es muy recomendable pues se ha observado que
produce una degradacin de las cumarinas. Como sistema de elucin han
sido utilizadas mezclas variadas de solventes en diferentes
proporciones como:- hexano: ter etlico- hexano: acetato de etilo-
ter de petrleo: ter etlico
3.2.3.-TECNICAS ESPECTROMTRICASLas cumarinas muestran bandas de
absorcin ultravioleta caractersticas a 274 y 311 nm, las cuales son
atribuidas a los anillos del benceno y pirona respectivamente.
3.3.- EJEMPLOS DE APLICACIN Umbeliferona de lepidophyllum tola,
tola 600 g de ramas secas y pulverizadas de L. tola, son extradas
con cloroformo en un extractor Soxlhet durante 50 horas. El
extracto clorofrmico se concentro y el residuo obtenido fue lavado
repetidas veces con etanol; las soluciones etanlicas se reunieron y
trataron con una solucin de acetato de plomo al 7% hasta la no
formacin del precipitado; luego de la filtracin la solucin
acuosa-etanlica fue liberado del exceso del acetato de plomo,
concentrada y extrada con cloroformo. La CC de este extracto
clorofrmico en silicagel G 60, por elucin con tolueno: acetato de
etilo (3:2) separ un slido que luego de repetidas
recristalizaciones en metanol y sublimacin posterior entre 160-170C
dio agujas incoloras, que producen intensa fluorescencia azul
celeste, caracterstica como las 7-hidroxicumarina o umbeliferona.
En base a los resultados espectroscpicos.
4.- CROMENOS Y BENZOFURANOS4.1.- DEFINICINLos cromenos y
benzofuranos son productos naturales que se han encontrado en
algunas especies de: Rutaceae Liliaceae CiperaceaeEstos compuestos
se encuentran presentes generalmente en hojas y tallos, y menos en
races habindose encontrado en los primeros hasta un 5% sobre el
peso seco.Son biogenticamente formados por combinacin de una unidad
de isopreno y un sistema fenlico.Muchos cromenos y benzofuranos han
demostrado ser biolgicamente activos como el toxol y la
dehidrotremetona y la hidroxitremetona son txicos a los peces; el
toxol y el angelato de toxilo exhiben una dbil actividad antitumor
contra la leucemia linfoctica; el encecalin, el 7-hidroxiencalin y
la 6-metoxieuparina son fototxicos a varios hongos y bacterias.
4.2.- TCNICAS GENERALES Varios cromenos y benzofuranos son
voltiles y pueden ser extrados por destilacin por arrastre de
vapor, sin embargo un procedimiento ms efectivo y ms suave es la
extraccin de plantas frescas con solventes orgnicos como benceno,
ter de petrleo: ter etlico (2:1), diclorometano o cloroformo. La
cromatografa en columna o cromatografa en capa delgada preparativa
en silicagel o cido silcico con fases mviles como diclorometano o
mezclas de ter de petrleo: ter etlico, C: metanol son mtodos muy
usuales para el aislamiento de cromenos y benzofuranos. Son tambin
mtodos muy efectivos la utilizacin de CC usando SEPHADEX LH-20 con
metanol como eluente.
4.3.- EJEMPLO DE APLICACIN Benzofuranos de Werneria ciliolata
Las hojas, races y tallos secos y molidos (230 g) fueron extrados
con cloroformo (2 L) en un Soxlhet. El extracto fue concentrado al
vaco y el residuo gelatinoso agitado con etanol (250 ml) y
filtrado. A esta solucin etanlica se le agrego solucin acuosa de
acetato de plomo al 4% formndose un precipitado, el que fue
separado por filtracin. El filtrado se concentr y agit con acetato
de etilo; el extracto de acetato de etilo se concentro y el residuo
96,71 g se cromatografi sobre silicagel. La elucin con benceno:
acetato de etilo dio cristales incoloros, por recristalizacion en
ter de petrleo, de dihidroeuparina, de punto de fusin 68C. Otra
muestra de 100 g de material seco y molido se macer por 30 das en
una mezcla de ter de petrleo: ter etlico (2:1), obtenindose 3,2 g
de extracto seco. Este extracto fue cromatografiado en columna de
Silicagel y eluda en mezcla de polaridad creciente de ter de
petrleo: ter etlico. La segunda fraccin se someti a CCDP en
benceno: C (1:1) separndose 15 mg de cristales de color amarillo
palido de 2,5-diacetil-6-hidroxibenzofurano de punto de fusin 134
C.5.- XANTONAS5.1.- DEFINICINSon pigmentos fenlicos amarillos;
qumicamente son diferentes a los flavonoides, pero son muy
similares en sus reacciones de coloracin y en su movilidad
cromatogrficas. Se presentan especialmente en ciertas familias:
Gutiferae Gentianaceae Moraceae PoligonaceaeLa gentisena es
probablemente formada a partir del cido 4-hidroxibenzoico y de tres
unidades de malonil CoA. Para otras Xantonas se propone que se
originan a partir de las antraquinonas; por ruptura oxidativa en el
anillo B se forma derivados de benzofenona que luego son
transformados en Xantonas.
5.2.- TCNICAS GENERALES Las Xantonas pueden ser extradas del
material que las contiene con solventes como C o metanol, y ser
separadas con CCD sobre gel de slice utilizando sistemas como:
Benceno: C (3:7) C: metanol (7:3)Para glicsidos puede utilizarse
acetato de etilo: metanol: (100: 16,5: 7). Para algunas xantonas
solubles en agua como la mangiferina, puede utilizarse la CP.Otras
tcnicas cromatogrficas son tambin muy usuales como la filtracin en
Sephadex LH-20 con metanol o C: metanol (1:1).Pueden ser detectadas
en una cromatografa por su coloracin al UV con y sin amoniaco; con
solucin de KOH al 5% en metanol, o en general usando reveladores
para grupos fenlicos. Entre las propiedades espectrales sealaremos
que en le UV presentan mximos de absorcin a 230-245, 250-265,
305-330 y 340-400 nm.
6.- QUINONAS6.1.- DEFINICIN Las quinonas naturales son un grupo
de compuestos cuya coloracin puede ser desde amarillo plido hasta
casi negro. Se encuentran frecuentemente en la corteza, en el
corazn de la madera o de la raz, y en algunos casos en las hojas,
donde su color esta enmascarado por otros pigmentos. Para confirmar
su presencia puede ser til una simple reaccin de color basado en
las propiedades redox de las quinonas; as, la reduccin a un
producto incoloro y la fcil regeneracin de su color por oxidacin es
caracterstico y distintivo de ellas (en comparacin a otros
compuestos naturales coloreados). La reduccin puede efectuarse con
solucin neutra o alcalina de ditionito de sodio u otros agentes
reductores, y la oxidacin con perxido de hidrogeno o la simple
agitacin al aire de la solucin. Las quinonas se sub-dividen en:
Benzoquinonas - Naftoquinonas Antraquinonas - Quinonas
isoprenoidesLas quinonas son conocidas por sus propiedades
tintreas. Algunas presentan otras propiedades como la emodina que
es catrtica; shikonina, antimictica; rhein, bajo la forma de
diacetato, antirreumtico; etc.
6.2.- TCNICAS RECOMENDADAS6.2.1.- DE EXTRACCINDe acuerdo a su
solubilidad y polaridad pueden ser extradas en solventes de
diferente polaridad, por lo que generalmente se utiliza la
extraccin secuencial con solventes de polaridad creciente y luego
los extractos se fraccionan y purifican por las diversas tcnicas
cromatogrficas.Otro mtodo es la extraccin en medio alcalino
aprovechando la presencia de grupos hidroxilos fenlicos; as las
naftoquinonas y antraquinonas -hidroxiladas en el anillo bencnico
son solubles en solucin de bicarbonato de sodio.
6.2.2.- DE SEPARACIN CROMATOGRFICA Y DE DETECCINLa CCD en gel de
Silice es un procedimiento general para la separacin de quinonas,
aunque dada la variedad de estructuras no hay un sistema de
solvente nico; por lo general las benzo- y naftoquinonas son
liposolubles y para ellas pueden utilizarse solventes puros como:
benceno, cloroformo, ter de petrleo o mezclas de ellos; en el caso
de antraquinonas o quinonas ms hidroxiladas son usuales sistemas
como:- Acetato de etilo: metanol: (100:16,5:13,5): ter de petrleo:
formiato de etilo: cido frmico (90:40:1).Desde que las quinonas son
coloreadas, ellas son detectadas a la luz visible; pero tambin
pueden ser examinadas a la luz UV o utilizar reactivos cromogenicos
como el azul de leucometileno que produce en la benzo y
naftoquinonas manchas azules sobre un fondo blanco, o KOH metanlico
al 10% que producen cambios de color de las manchas originales, de
amarillo a rojo, violeta, verde o prpura.
6.2.3.- TCNICAS ESPECTROMTRICAS Las mediciones espectrales son
esenciales para la identificacin de las quinonas. El espectro
UV-Vis indica la clase de quinona presente, desde que el nmero y
posicin de las bandas de absorcin aumenta con la complejidad de la
estructura.
6.3.- EJEMPLO DE APLICACIN Lapachol de especies de Tabebuia 50 g
de madera seca y molida de lapacho fue macerado durante 24 h con
300 ml de NaOH al 1%; al cabo de ese tiempo se le agreg HCl 6N
hasta la formacin de un precipitado (pH 7) el que fue separado por
filtracin, lavado con etanol varias veces, luego disuelto en C y
dejado recristalizar. El proceso se repite varias veces hasta
obtener cristales amarillos de lapachol (400 g) de punto de fusin
137-139 C. Quinonas de Pseudocalymma alliaceum 130 g de corteza y
tallo de ajo sacha se extrajo con 700 ml de metanol; el extracto se
concentro a sequedad (9,0 g) y fue sometido a una particin con
acetato de etilo: (1:1). El extracto acetato de etilo (0,41 g) se
someti a una CC de silicagel 60 eluyendo con cloroformo con
cantidades crecientes de metanol, obtenindose luego de la
purificacin de las diversas fracciones, cuatro compuestos quinnicos
de color amarillo, para los que se propone las siguientes
estructuras en base a sus datos espectroscpicos. 6-hidroxi-
-lapachona (1,7 mg. Fusin 118,5-119,5 C) 4,6-dihidroxi- - lapachona
(1,44 mg p. fusin 123-127,5 C) 6-hidroxi-9-metoxi- -lapachona
(1,1mg) 4,6-dihidroxi-9-metoxi- -lapachona (1mg p. fusin 152-156
C)
III.- ALCALOIDES
1.- DEFINICIONES Substancias bsicas que contienen uno o ms tomos
de nitrgeno como parte de un sistema cclico, que manifiestan
actividad farmacolgica.Los alcaloides constituyen el grupo ms
grande de metabolitos secundario de plantas. Se encuentran en las
semillas, races, cortezas y hojas; al estado libre o como
glicsidos, o formando sales con cidos orgnicos.Los alcaloides
derivan principalmente de los aminocidos ornitina, lisina,
fenilalanina, triptfano y del cido antranlico, a travs de una serie
de reacciones.PRINCIPALES ALCALOIDES EN EL COMERCIO. SU ACCIN
FISIOLGICA
PLANTAALCALOIDESACCIN FISIOLGICA
Belladona (Atropa belladonna)AtropinaAntiespasmdico,
estimulante, analgsico
Coca(Erythroxylum coca)CocanaEstimulante, analgsico local,
sedante
EmetinaEmtico, expectorante, antipirtico, amebicida
Mandragora (Mandragora autumnalis)EscopolaminaHipntico,
sedante
Hesperolaburnum
EspartenaEstimulante cardiaco, diurtico
Hierba loca(Hyoscyamus niger)HiosciaminaHipntico, sedante
cerebral, midritico
Adormidera(Papaver somniferum)MorfinaNarctico, sedante hipntico,
analgsico
ChinchonaQuininaTnico, emenagogo, antisptico, antipirtico
Efedra (Ephedra distachya)EfedrinaAsma, insuficiencia
circulatoria
Adormidera (Papaver somniferum)CodenaAnalgsico, sedante,
hipntico
Adormidera(Papaver somniferum)PapaverinaRelajante muscular
2.- TCNICAS RECOMENDADAS Debido a la gran diversidad de
estructuras que pueden presentar los alcaloides, el tener como
referencia la planta (familia y gnero) del cual ha sido aislado
reduce el problema de identificacin y clasifica al alcaloide dentro
de un determinado tipo; la posterior aplicacin de pruebas de
cromatografa de capa delgada en combinacin con reacciones
especificas de coloracin hace posible en muchos casos la
identificacin de un alcaloide conocido. La cual puede ser
comprobada con un registro UV e IR. En el caso de alcaloides
desconocidos, son indispensables mtodos espectrales como
ESPECTROMETRA DE MASAS. 2.1.- DE EXTRACCINDada la importancia de
los alcaloides se ha desarrollado diversos mtodos para obtenerlos
los cuales se sealan a continuacin. Usando una solucin acuosa o
alcohlica dbilmente acida (HCl 1N o 1N, o de cido actico o tartrico
10%), el extracto es luego alcalinizado con amoniaco, hidrxido de
calcio o carbonato de sodio y los alcaloides as liberados, son
extrados finalmente con solventes orgnicos como cloroformo,
diclorometano, ter etlico; obtenindose extracto crudo de
alcaloides. Liberando antes los alcaloides: humedeciendo el
material con soluciones diluidas de amoniaco o carbonato de sodio,
secado al aire, y extrado con solventes orgnicos como cloroformo,
diclorometano, ter etlico. El extracto orgnico se concentra y se
trata con cido diluido formando las sales de los alcaloides; se
alcaliniza este extracto cido y los alcaloides liberados se extrae
con uno de los solventes inmiscibles sealados antes, teniendo el
extracto crudo de alcaloides. Es preferible desengrasar el material
antes de iniciar el proceso.
2.2.- REACCIONES DE COLORACIN Y DE PRECIPITACINPara determinar
la presencia de alcaloides se ha desarrollado un gran nmero de
reactivos de coloracin y de precipitacin; algunos de ellos son
considerados de aplicacin general mientras que otros de usos
especifico y sirven para clasificaciones parciales de estas
substancias; se considera que hay presencia de alcaloides si dan
reaccin positiva a por lo menos a cuatro reactivos: DRAGENDORFF,
MAYER, WAGNER, SONNESCHEIN.
2.3.- TCNICAS CROMATOGRFICASLa cromatografa de capa delgada es
la mas usual utilizando principalmente silicagel G; otros
absorbentes usuales son: poliamida, celulosa o la silicagel G hecha
alcalina por preparacin de la placa con una solucin de KOH 0.5 N o
NaOH 0.1 N en vez de agua. Los sistemas de solventes son tambin muy
variados, al igual que las reacciones de coloracin y de
precipitacin.La CCDP y LA CC siguen constituyendo las tcnicas ms
comunes para la separacin de los alcaloides de los extractos
crudos.
2.4.- TCNICAS ESPECTROMTRICASEl UV, siendo uno de los mtodos
espectromtricos ms antiguos, es an una herramienta til en la
identificacin y elucidacin estructural de los alcaloides. Hay
grupos de alcaloides que no absorben esta regin como los alcaloides
de pirrolidina, de piperidina y los esteroalcaloides.En el IR los
alcaloides carecen de absorciones que permiten identificarlos, pero
proporciona informacin sobre la presencia o ausencia de ciertos
grupos sustituyentes, las absorciones usualmente tiles son de 3700
3200 para determinar presencia de grupos hidroxilo o amino; 3060
2800 grupos metilo, metileno o vinlico; 1780 1620 grupos carbonilo;
1600, 1550, 1500 sistemas aromticos.
VALORES DE ABSORCIN EN EL UV
ALCALOIDE mx. nm (en )
Berberina Quinina Estricnina Atropina Coniina Mezcalina Cocana
Morfina Codena228250254258268268275284284
2.5. EJEMPLO DE APLICACIN Determinacin de alcaloides en las
hojas de coca Se pesa 10 g de muestra seca y pulverizada, se
humedece con una solucin saturada de NC y se extrae en un Soxlhet
con una mezcla de ter de petrleo: ter etlico (1:1), durante
8horas.El extracto ter de petrleo: ter etlico, se extrae con S 2N
(140 ml, 130 ml,120 ml). Los extractos cidos reunidos se
alcalinizan con una solucin saturada de NCy se extraen con hexano
(140ml, 130ml, 125ml). Los extractos hexnicos, que contienen los
alcaloides, se renen, se secan con S anhidro y se concentran a
sequedad.La mezcla slida de alcaloides se disuelve en 30 ml de S
0,1 N se agrega indicador rojo de metilo y se titula con NaOH 0,1
N.El resultado se expresa como porcentaje de cocana.
Alcaloide oxindlico pentacclico de Uncaria guianensis, ua de
gato o garabato colorado Las hojas secas y molidas de U. guianensis
fueron desengrasadas con benceno, luego humedecidas con N al 10%
(72 horas), y finalmente maceradas con acetato de etilo (72
horas).El extracto acetato de etilo se concentr, se extrajo con S
al 2% y se alcalinizo con N hasta pH 11. El precipitado formado se
separ y se trato con cloroformo; el extracto clorofrmico obtenido,
de color amarrillo verdoso, fue concentrado y el residuo
recristalizado por varias veces por una mezcla de CHC: metanol,
obtenindose agujas cristalinas de punto de fusin 262-263 C
identificadas como: mitrafilina, alcaloide oxindlico
pentacclico.
CAPITULO IV
4.- METODOS PARA EL DESASRROLO DE LA INVESTIGACION
Los mtodos empleados durante esta investigacin fueron los
siguientes: Mtodo analtico. Mtodo experimental. Mtodo
deductivo.
CAPITULO V
5.- CRONOGRAMAS DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADESMESES
AMJJ
Revisin bibliogrficaxx
Recoleccin de datosxX
Redaccin e impresin del proyectoXx
Levantamiento de observaciones finalesx
Sustentacin del proyectox
CAPITULO VI
6.- PRESUPUESTO Y FINANCIAMIENTO
DESCRIPCIONUNIDADCANTIDADVALORUNITARIO (S/.)TOTAL (S/.)
A. Costos directos
MATERIAL DE OFICINA
Papel bond A-4Unidad600.053.00
LapiceroUnidad31.003.00
LapizUnidad21.002.00
CorrectorUnidad13.003.00
BorradorUnidad21.002.00
Libreta de apuntesUnidad13.003.00
MANO DE OBRA
Mano de obra20.00
SERVICIOS
FotocopiasHojas400.104.00
ImpresinHojas500.2010.00
MovilidadPasajes15.00
CdUnidad11.001.00
B. Costo indirecto
Imprevistos15.00
TOTALS/. 81.00
CAPITULO VII
7.-BIBLIOGRAFIA
Dominguez, X. A. Mtodos de investigacin Fitoqumica. Limusa.
Mxico.
Lock de Ugaz, Olga. (1994). INVESTIGACION FITOQUMICA. Mtodos en
el estudio de productos naturales. Pontificia Universidad Catlica
del Per. Seg. Edic. Fondo Editorial. Per. (1973).
Pomilicia, Eduardo. Introduccin al estudia de los Productos
Naturales. Universidad de Buenos Aires. Argentina.
Valencia Ortiz, Ciria. Fundamentos de Fitoqumica. Mxico. Trillas
1995.
CAPITULO VIII8.-ANEXOS
ANEXOS 01. DETERMINACION DE BIOMOLECULAS DE EUCAPILTO
ANEXOS II: REACCIONES DE COLORACIN O PRECIPITACIN PARA ALGUNOS
PRODUCTOS NATURALES
MTODOPROCEDIMIENTOCOLORAPLICACIN Y COMENTARIO
TRITERPENOIDE
Ac. tricloroacticoMs. + cristales de c. TricloroacticoNaranja,
rojo, rojo oscuro.Triterpenos tetracclicos y esteroides desarrollan
color a 60 C, triterpenos pentacclicos 110 C.
Carr Price1 mg Ms/CH + 2 ml Sb al 30% en CHAzul Originalmente
para vitamina A; positivo: derivados de colestano con dieno o
trieno potencial en anillos A y B.
KeddeA: c. 3,5 dinitrobenzoico 2% en Metanol.B: KOH 5,7% en R:
mezclar A+B, volmenes iguales 1mg Ms+2 gotas R.Prpura o
violceoPositivo: glicsidos cardiacos, para anillos
-lactona-,-insaturado.
Liebermann-Burchard1mg Ms/pocas gotas cido actico + 3ml anhidro
actico/ (50:1)Verde, azul verdoso (va rojo o azul)Positivo:
esteroides conteniendo 2 C=C conj. O formados por deshidratacin
con
NollerR: anh. 0,1 % /SO.Ms+0.2 ml RCambios de coloracin/60
CTriterpenoide
RosenthalerMs/sol. Etanlica de vainillina al 1%+1gt HCL
conc.variosPara sopogeninas esteroidales y triterpenoidales
Salkowski1-2 mg Ms (seco o 1ml CH) + 1ml + anhidro
acticoAmarillo-rojo sangreAplicacin como
paraLiebermann-Burchard
Tortelli-Jaff0.5 mg Ms/0.2 ml anhidro actico (+gotas de CH para
disolver). Agregar cuidadosamente 0.1 ml 2% / CHVerde en la
interfasePara esteriodes, dobles enlaces terciarios o
potenciales.
FLAVONOIDES Y OTROS COMPUESTOS FENLICOS
BorntragerMs/benceno+NaOH 5% acuosoRojo en fase acuosoPositivo:
antraquinonas y naftoquinonas
Cloruro frricoR: 1 gt 100 ml de .Ms+1 gt RAzul, verde
negroPositivo: comp. Fenlicos, taninos
Dimroth (c. Brico)Ms/acetona+c. Brico y c. Ctrico.Amarillo o
amarillo verdePositivo: 5-hidroxiflavona
Gelatina-cloruro de sodioR: 1 g gelatina/100 ml +10 g
NaCl.Ms+1gt RPpdo.Positivo: taninos
Marini-Bettolo5 mg Ms/5ml + 1 ml Sb 2%/ CPpdo. Amarillo
Ppdo. Rojo a violetaPositivo: flavonas, flavonoles,
flavanonas.Positivo: chalconas
ShinodaMs+limadura de Mg+HCl con.Tonos rojosPositivo: ncleo de
-benzopirona
Rosenheim Ms+HCl 2N/1-propanol. Hervir 15-30 min.RojoPositivo:
catequinas
ALCALOIDES (reacciones de coloracin)
DMBR: 4-dimetil-amino-benzaldehido al 5% en
c.Ortofosfrico/metanol.Ms+1 gt R.VioletaAcido lisrgico y sus
amidas.
Ehrlich0.5 mg Ms/1 ml etanol +1ml 4-dimetil-amino-benzaldehido
5%/HCLvioleta
ErdmannA: 6 gotas HN/100 ml .R: 10 gtas. A+20gtas .1-2mg Ms+8-10
gtas RRojo, otros coloresBrucina, tebana, veratrina, morfina,
codena, colchicina, atropina.
FrohdeR: 5 mg c. Molibdico o molibdato de sodio/1ml . Fresco
Ms+2-3 gotas RRojo,verde, azulBrucina, tebana, veratrina; morfina,
codena, papaucrina; apomorfina, berberina emetina.
KellerMs/cido actico+trazas de anh/Azul intenso en
interfaseAlcaloide ergot
MandelinMs +10 mg vanadato de amonio en 2 ml Violeta, azul
rojoSolanina, estrictina
MarquisA: 8-10 gtas de aldehdo frmico al 40% en 10 ml de cido
actico glacial.B: Ms+1 gt A+3gtas BNaranja,violeta, prpuraMezcalina
y anfetamina; alcaloide del opio; herona, morfina.
MeckeA: 0,25 g de c. Selenioso en 25 ml de cido actico
glacial.B: Ms+1 gt A+3gtas BAzul-verdosoMorfina y herona
OttoMs/80% + 1gt diluido.Rojo-violeta a azul prpuraEstricnina;
alcaloides indolicos.
ShaerR: 1ml 30% +10 ml .0,1 mg + 2-3 gotas RverdeAlcaloide del
tropano
Tiocinato de cobaltoR: 0,8 g tiocianato de cobalto+1ml c.
Ortofosforico/100 ml metanol: (2:3).Ms+1gt RAzul-turquesaCocana.
Otros anastsicos.
REACCIONES DE PRECIPITACIN
Dragendorff (yoduro de bismuto y potasio)A: 8 g Bi.5/20 ml HN.B:
27,2 g KI/50 ml .Mezclar, reposar, decantar super- nadante. Diluir
a 100 ml.Rojo a naranjaAgregar a solucin cida de alcaloide.
Mayer (yoduro de mercurio y potasio)A: 1,36 g Hg / 60 ml B: 5 g
KI/ 10 ml de Mezclar. Diluir a 100 ml.
Blanco a cremaAgregar a la solucin acidulada, precipita solo en
exceso de reactivo.
Sonneschein (c. fosfomolbdico)Sl. cida de molibdato de amonio,
agregar sl. c. Saturada de , hasta formacin de pptdo. Filtrar,
lavar ppto. y disolver en sol. Saturada de . Evaporar a sequedad.
Disolver 10 g de residuo en 100 ml de HN
Naranja
General
Wagner (yodo-yoduro de potasio)1,27 g + 2 g KI/5 ml . Diluir a
100 ml.Marrn
General
DETERMINACIN DE BIO-MOLCULAS EN PLANTAS MEDICINALESPgina 12