8/18/2019 Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV … http://slidepdf.com/reader/full/buoc-dau-xay-dung-phuong-phap-xac-dinh-ham-luong-triterpenoid 1/69 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN------ BÙI THỊ NGỌC HÂNBƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRITERPENOIDTỔNG TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV – VIS LUẬN VĂN ĐẠI HỌCNgành CỬ NHÂN HÓA HỌCMã ngành: 52440112 2013 WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM óng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
69
Embed
Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV - VIS
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
8/18/2019 Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV …
Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: ...................................................................................................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế: ..................................................................................
Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: ...................................................................................................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế: ..................................................................................
Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: ...................................................................................................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế: ..................................................................................
Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: ...................................................................................................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế: ..................................................................................
Tất cả dữ liệu và số liệu sử dụng trong nội dung bài luận văn được thamkhảo từ nhiều nguồn tài liệu khác nhau và được ghi nhận từ những kết quả mà
tôi đã tiến hành khảo sát trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin cam đoancác số liệu, kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực và chưa đượccông bố trong những công trình luận văn trước đây.
Để đạt được kết quả như hôm nay, xin gửi lời cảm ơn chân thành đếntoàn thể quý thầy cô bộ môn Hóa –Khoa Khoa Học Tự Nhiên. Các Thầy Cô đãnhiệt tình truyền đạt những kiến thức chuyên ngành, cũng như những kinhnghiệm thực tế, đây là hành trang vô cùng quý báu không chỉ để hoàn thành đềtài tốt nghiệp mà còn hỗ trợ rất nhiều trên con đường sự nghiệp sau này.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Thị Ánh Hồng, cô đãhướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình làm đề tàivà đã chỉnh sửa bài viết rất cẩn thận.
Xin cảm ơn cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều
kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Cảm ơn Công ty cổ phần Dược Hậu Giang đã cung cấp mẫu để tôi thựchiện đề tài này.
Cảm ơn các thành viên của lớp Hóa học Khóa 36 đã chia sẻ và đồnghành trên những chặng đường vừa qua.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình luôn là chỗ dựa vữngchắc cả về vật chất lẫn tinh thần.
Đề tài nhằm mục đích khảo sát hàm lượng triterpenoid tổng có trong mộtsố mẫu nấm Linh chi được cung cấp bởi Công ty cổ phần Dược Hậu Giang
bằng phương pháp UV–Vis với chất chuẩn là Oleanolic acid nồng độ 100 ppm. Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích bằng cách xây dựng các thínghiệm về xác định khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát hiện
và giới hạn định lượng. Trên cơ sở đó xác định hàm lượng triterpenoid tổng sốtrong 10 mẫu nấm Linh chi đem đi phân tích. Kết quả nghiên cứu cho thấy
phương pháp đề ra là có thể được áp dụng vào định lượng triterpenoid tổngvới đường chuẩn của Oleanolic acid có hệ số tương quan R = 0,9999, độ đúngcủa phương pháp đạt 99,36%, độ lặp lại có RSD nhỏ hơn 2%, LOD và LOQlần lượt vào khoảng 0,3 và 0,9 ppm. Trong số 10 mẫu nấm Linh chi đem đi
phân tích thì mẫu số 2 chứa hàm lượng triterpenoid nhiều nhất (12361 mg/kgchiếm 1,236% trong số các thành phần có trong nấm Linh chi) và mẫu số 4chứa hàm lượng triterpenoid thấp nhất (6649 mg/kg chiếm 0,665%). Kết quảcủa đề tài làm cơ sở cho việc đánh giá chất lượng của các loại nấm Linh chi
đang bán trôi nổi trên thị trường hiện nay, đồng thời giúp ích cho việc lựachọn giống Linh chi tốt nhất để nuôi trồng ở qui mô công nghiệp trong nước tahiện nay.
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................... i
LỜI CÁM ƠN .................................................................................................... ii
TÓM TẮT ......................................................................................................... iii
ABSTRACT ...................................................................................................... iv MỤC LỤC ......................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... viii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... iix
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Chương 1 TỔNG QUAN ................................................................................... 3
1.1 Nấm Linh chi ....................................................................................... 3
1.1.1.1 Vị trí phân loại ..................................................................... 4
1.1.1.2 Đặc điểm hình thái ............................................................... 4 1.1.1.3 Tình hình phân bố ................................................................ 5
1.1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi ........ 5
a. Bảo quản tươi ............................................................................. 6 b. Bảo quản khô ............................................................................. 7
1.1.1.6 Thành phần hóa học và đặc tính dược lý của nấm Linh chi 8 1.1.2 Khả năng chữa bệnh và một số ứng dụng lâm sàng của nấm Linh chi
……………………………………………………………………… 11
1.1.2.1 Khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi ............................. 11
1.1.2.2 Một số ứng dụng lâm sàng ................................................ 14 1.1.3 Giới thiệu sơ lược về hoạt chất có trong nấm Linh chi ....................... 15
1.3 Các nghiên cứu về định lượng triterpenoid tổng .............................. 21
Chương 2 GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT VÀ PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG TRITERPENOID TỔNG ...................................................... 25 2.1 Phương pháp chiết triterpenoid trong dược liệu với sự hỗ trợ của
2.2 Định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương phápUV - Vis ....................................................................................................... 26
2.3 Thẩm định phương pháp phân tích ................................................... 27
2.3.1 Tầm quan trọng của việc thẩm định ..................................................... 27
2.3.2 Nội dung thẩm định ................................................................................ 27
2.3.2.1 Độ tuyến tính (Linearity) ................................................... 27
2.3.2.2 Độ đúng (Accuracy) .......................................................... 28
HPLC: High Performance Liquid Chromatography: Sắc ký lỏng hiệunăng cao
LOD: Limit of Detection: Giới hạn phát hiện LOQ: Limit of Quantification: Giới hạn định lượng Abs: Absorbance: Độ hấp thụ
OA: Oleanolic acid
ppm: part per million: một phần triệu
SD: Standard Deviation: Độ lệch chuẩnRSD: Relative Standard Deviation: Độ lệch chuẩn tương đối UAE: Ultrasonic –Assisted Extraction: chiết với sự hỗ trợ của sóng
siêu âm
MAE: Microwave –Assisted Extraction: chiết với sự hỗ trợ của visóng
Ngày nay, xu hướng sử dụng các loại thảo dược thiên nhiên để trị bệnhđã trở nên phổ biến, việc tìm kiếm những khả năng chữa trị từ các loại thảodược đã được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới. Trong đó, nấm Linh chi làđối tượng nghiên cứu của nhiều quốc gia. Đặc biệt là các nước vùng Châu Á:
Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,… .
Ở Trung Quốc, “Lục bảo Linh chi” đã được nghiên cứu rất nhiều và sửdụng như là thảo dược quý để trị bệnh và có tác dụng như là bổ dưỡng, điềuhòa huyết áp, chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ, tăng trí nhớ, điều hòa hoạt độngtim mạch, hô hấp, lợi tiểu, bổ thận, trị đau nhức khớp xương, gân cốt…. Các
tác dụng của nấm Linh chi đã được khẳng định và xếp vào hàng “thượng
dược”, trị được bách bệnh.
Tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ởtrong nước cũng như xuất khẩu ngày càng tăng. Các thành phần hóa học cótrong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: Acid béo, Steroid,Alkaloid, Protein, Polysaccharide,…. Trong đó thành phần có tác dụng dượchọc đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc về nhóm triterpenoid. Trong
đó, các nhà nghiên cứu đã nhận định rằng triterpenoid có các hoạt tính sinh
học đáng kể như là: chống oxi hóa, bảo vệ gan, chống dị ứng, chống khối u,làm giảm lượng cholesterol trong máu cũng như là ngăn chặn sự kết dính các
tiểu cầu,…. Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid thay đổi theo từng giống nấmLinh chi, môi trường nuôi trồng và giai đoạn bào tử của nấm Linh chi. Do đó,
cần phải có phương pháp tách chiết cũng như phương pháp định lượngtriterpnoid tổng trong nấm Linh chi một cách có hiệu quả, đơn giản, với độchính xác cao và phù hợp với từng cơ sở thí nghiệm. Trong đó phương phápUV –Vis là phương pháp được ứng dụng rộng rãi và đáp ứng được các yêu cầunêu trên.
Do vậy mà chúng tôi thực hiện đề tài “Bước đầu xây dựng phươ ng
pháp xác định hàm lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV– Vis ” nhằm đưa ra phương pháp đơn giản, hiệu quả và vớiđộ chính xác cao để xác định hàm lượng triterpenoid tổng trong 10 mẫu nấmLinh chi được cung cấp bởi Công ty Dược Hậu Giang, từ đó có thể lựa chọn, đánh giá và so sánh được chất lượng của các loại nấm Linh chi được bán trôinổi trên thị trường hiện nay, tránh hiện tượng nhầm lẫn giữa nấm Linh chi thậtvà nấm Linh chi giả ảnh hưởng đến sức khỏe mọi người.
Nấm Linh chi, viết theo kiểu phiên âm Trung Hoa là Lingzhi, tên Nhật làReishi, ở Hàn Quốc gọi là Youngzhi, tên khoa học là Ganoderma Lucidum, ởViệt Nam nấm Linh chi còn có tên gọi là nấm Lim. Nấm Linh chi còn có
những tên khác như Tiên Thảo, nấm Trường Thọ, Vạn Niên Nhung. Gọi lànấm nhưng khác với một số nấm ăn thông thường, nấm Linh chi có nhiều hình
dáng khác nhau, chẳng hạn: hình thận, gạc nai. Màu sắc của nấm Linh chi
cũng phong phú: đỏ, vàng, tím, đen, xanh, trắng. Nấm Linh chi thường phân
bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường phát triển trên giá thể là gỗmục hoặc các nguyên liệu có chất xơ [1-2]
.
Trong sách “Thần nông bản thảo” cách đây khoảng 2000 năm thời nhàChâu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân
ra thành “Lục Bảo Linh chi” (thời nhà Minh) với các khái quát công dụngdược lý khác nhau, ứng theo từng màu:
Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)
Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)
Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi) Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)
Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)
Tử chi (Linh chi tím)
Cho đến nay nấm Linh chi không còn giới hạn trong phạm vi đất nướcTrung Quốc, mà mang tính toàn cầu. Hiện tại có khoảng 250 bài báo của cácnhà khoa học liên quan đến dược tính và các ứng dụng lâm sàng của nấm Linhchi đã được công bố.
Cấu trúc độc đáo của nấm Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượngđủ loại, trong đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, chrom,….Chúng đã được sử dụng là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chốngung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫntruyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào với hàm lượng rất thấp.
Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan,…việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng nấm Linh chi đang được côngnghiệp hóa với qui mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào
chế dược phẩm. Đồng thời nghiên cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lývà phương pháp điều trị lâm sàng.
Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê HữuTrác (1720 –1791) cũng đề cập đến nấm Linh chi. Sau đó, Lê Quý Đôn cònkhẳng định, đây là nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam. Trong
quyển “Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” (1991), giáo sư Đỗ Tất Lợi còn mô tảchi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu của loài nấm này, đồng thời cho rằngđây là loại “siêu thượng dược”.
1.1.1.1 Vị trí phân loại
Nấm Linh chi có vị trí phân loại rộng rãi hiện nay [3]:
Giới: Fungi
Ngành:Basidiomycota
Lớp: Basidiomycetes
Bộ: Polyporales
Họ: Ganodermataceae
Chi: Ganoderma
Loài: Ganoderma lucidum
1.1.1.2 Đặc điểm hình thái
Nấm Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn
200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài. Nấm Linh
chi là một trong những loại nấm phá gỗ, nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa,
trên thân cây hoặc gốc cây [2]
.
Nấm Linh chi (quả thể) gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến
đối diện với mũ nấm) [4,5]. Cuống thường đơn có khi phân nhánh, thẳng ít khi
cong quẹo, hình trụ hoặc trụ dẹt, nở rộng về phía mũ nấm, thường đính vào mũ
ở bên đôi khi ở gần tâm. Lớp vỏ cuống láng bóng, màu nâu đỏ– nâu đen, phủsuốt đến một phần mặt trên mũ. Chất mô cuống chắc, dai; mặt cắt ngangcuống thường chia làm 2 vùng phân biệt rõ bằng một vòng ranh giới cứng như
gỗ, vùng trong thường xốp và đầy những lổ nhỏ li ti, khắp trong cùng mỗivùng có những vệt nâu đen cứng như gỗ.
Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có dạng thận, gần tròn, đôi khixòe hình quạt hoặc có hình dạng khác thường, dày ở gốc và mỏng dần về phía
mép, nơi đính cuống thường lõm xuống ít nhiều nhưng có khi gồ lên hay
phẳng. Mặt trên mũ nấm láng bóng khi không có bụi bào tử phủ lên, thườngmàu nâu đỏ nhưng đậm nhạt khác nhau, đôi khi màu nâu vàng, nâu đất, nâu
tím, đen ánh xanh. Các vân đồng tâm thường rõ nhưng có khi ít rõ vì rãnh giữacác vân rất cạn, đồng nhất. Mặt dưới mũ nấm màu vàng xám hơi nâu với cácvết trầy xước màu nâu đất hay vàng chanh với các vết xước mà trắng.
Bào tử nấm hình trứng hoặc hình trứng cụt đầu, có phần phụ không màu phát triển bao quanh lỗ nảy mầm có màu vàng rỉ sắt, bào tử có vỏ với cấu trúc2 lớp màng, màng ngoài nhẵn, không màu, màng trong màu nâu rỉ, phát triểnthành những gai nhọn vươn sát màng ngoài, nối liền hai lớp vỏ. Khi nấm đếntuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm
[5].
1.1.1.3 T ình hình phân bố
Nấm Linh chi có nguồn gốc từ thực vật Ganoderma lucidum. Nhóm nấm
Linh chi bao gồm các loài sống kí sinh trên cây gây mục ruỗng, trên cây chết
hoặc đã chặt hạ, trên rễ cây mục hoặc đất có mùn gỗ mục và thường là các loàicó hệ enzyme mạnh, phân hủy gỗ cây nên mục trắng gỗ, gây hại cây rừng, cây
công nghiệp, cây ăn quả.
Thời xưa người ta chỉ có thể tìm thấy trong rừng, trên những núi cao chứkhông cách gì gây giống được. Có sách nói nấm Linh chi được tìm thấy ở phíatây núi Thái Hàng, Trung Quốc, nó thường mọc ở nơi rừng rậm, ít ánh sáng vàđộ ẩm cao. Những cây thường có nấm Linh chi là cây mận, dẻ (pasania) và
guereus serrata. Tuy nhiên trong hàng vạn cây già, chỉ có hai ba cây có nấm
Linh chi. Vì thế nấm này rất hiếm ở dạng thiên nhiên [6].
Chính vì thế trong lịch sử không biết bao nhiêu người đã tìm cách gâygiống và trồng loại nấm này nhưng đều thất bại. Mãi tới năm 1971, hai nhà
bác học người Nhật tên là Yukio và Zenzaburo Kasai, giáo sư của khoa nôngnghiệp, Đại học Kyoto mới thành công trong việc gây giống và người ta mới
sản xuất được vị thuốc này một cách qui mô. Từ đó nấm Linh chi được trồngvà sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới.
1.1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm L inh chi
Để nấm Linh chi có thể phát triển tốt thì phải đầy đủ các điều kiện [1]:
Dinh dưỡng
Nguồn cacbon: chủ yếu là đường glucose, saccharose, maltose, tinh bột, pectin, lignin, cenlulose, hemicenlulose, từ đó chúng tổng hợp năng lượng và
tạo thành các chất cần thiết.
Nguồn nitơ hữu cơ: protein, pepton, acid amin, ngoài ra có thể hấp thu
ure, muối amon, sulphate amon. Tuy nhiên, Nitơ không được quá nhiều làmcho sợi nấm mọc quá nhiều khó hình thành quả thể.
Trong giai đoạn sinh trưởng sợi nấm, tỉ lệ C/N là 25/1. Giai đoạn hìnhthành quả thể, tỉ lệ là 30/1 hay 40/1.
Nguyên tố vi lượng: Ca, P, Mg, K.
Nhiệt độ Giai đoạn nuôi sợi, nấm Linh chi sinh trưởng tốt nhất ở 20– 30°C.
Giai đoạn hình thành quả thể thì nhiệt độ thích hợp nhất là 22– 28°C.
Nhiệt độ không nên thay đổi quá lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó phát triển
thành tán mà ở dạng sừng hươu, dạng đuôi ngựa.
Độ ẩm
Hàm lượng nước môi trường thường 65% là vừa, quá nhiều hoặc quá ít
sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm. Độ ẩm không khí giữ ở 85– 95%,nuôi cấy trong phòng cần giải quyết vấn đề về độ ẩm và thông thoáng gió.
Nấm Linh chi là loại háo khí vì vậy cần thông gió, giữ độ ẩm và nhiệt độthích hợp. Khi nuôi cấy nấm trong tầng lỏng cần phải lắc 100– 150 vòng/phút.
Lắc mạnh dễ làm sợi nấm đứt đoạn.
Ánh sáng
Giai đoạn nuôi sợi: không cần ánh sáng.
Giai đoạn hình thành quả thể cần ánh sáng tán xạ và cường độ ánh sáng phải cân đối từ mọi phía.
Trị số pH
pH của môi trường nuôi nấm Linh chi là 3 –7,5, thích hợp nhất là 5– 6.
Trong môi trường lỏng là 4,5–5. Trong vật liệu trồng nấm điều chỉnh pH từ
5,8 –6 là vừa.
1.1.1.5 Bảo quản
Có 2 dạng bảo quản nấm Linh chi: bảo quản ở dạng tươi và dạng khô [7].
a. Bảo quản tươi
Nấm Linh chi sau khi đã được thu hoạch, rửa bề mặt nấm bằng nướcsạch không cho mùn cưa bám lại thân nấm. Để đưa đến tay người tiêu thụ, cầnmột thời gian bảo quản thích hợp để giữ được độ dinh dưỡng và sự thơm ngon
của nấm trước khi tung ra thị trường tiêu thụ.
Vớ i nấm tươi, chỉ giữ được thời gian ngắn, bằng cách làm chậm sự phát
triển, giảm cường độ hô hấp, chống thoát nước và bảo quản ở nhiệt độ thấp.
Thời gian bảo quản có thể kéo dài và trọng lượng không giảm, nếu nấmđược bảo quản lạnh ở nhiệt độ 0– 12°C. Ngoài ra người ta cũng thử bảo quảnnấm bằng chiếu xạ hoặc bằng các loại hóa chất khác nhau, kể cả chất chốngoxi hóa…. Nhưng thường ít hiệu quả và nhất là không kinh tế.
Ưu điểm:
Giữ được màu sắc, mùi vị, sự thơm ngon, độ dinh dưỡng tối ưu nhất của
nấm trước khi đưa ra thị trường.
Không mất nhiều công sức, nhiều thời gian cho việc bảo quản, nên tiết
kiệm được chi phí bảo quản sau thu hoạch.
Nhược điểm:
Thời gian lưu giữ, bảo quản rất ngắn, muốn duy trì sản phẩm có tuổi thọ sửdụng tươi được cao hơn phải dùng hóa chất bảo quản, điều đó không tốt chosức khỏe người tiêu dùng và đôi lúc có sự biến đổi về chất và lượng của nấm .
Dễ bị sinh vật, côn trùng và các vi sinh vật xâm nhập và gây hại.
b. Bảo quản khô
Cũng giống như một số loại nấm khác, có thể bảo quản nấm Linh chi khô
trong thời hạn từ 6 tháng trở lên trong điều kiện khô ráo ở nơi thoáng mát.
Có 2 phương pháp để làm khô nấm Linh chi đó là phương pháp “phơinắng” và phương pháp “sấy khô” (dùng hơi nóng) để bảo quản.
Phương pháp phơi nắng
Là phương pháp làm khô nấm để bảo quản sử dụng nguồn năng lượng từtự nhiên là năng lượng mặt trời.
Ưu điểm:
Tiết kiệm chi phí và công sức
Giảm tải cho máy sấy
Bảo quản nấm lâu hơn, từ đó kéo dài thời gian sử dụng nấm
Là giai đoạn làm khô nấm hiệu quả trước khi đưa vào máy làmkhô nấm hoàn toàn.
Nhược điểm:
Nấm Linh chi phơi nắng không tốt bằng sấy cả về màu sắc vàmùi vị
Nấm phơi nắng dễ bị nhiễm mốc
Phụ thuộc vào thời tiết, nắng phơi nấm phải là nắng gắt, nên phơi không đủ nắng hay đôi lúc có những cơn mưa bất chợt dễ
làm cho nấm bị ẩm mốc, sẽ làm cho nấm trở nên độc hại hoặclàm giảm tính năng và tuổi thọ sử dụng của nấm.
Phương pháp sấy khô bằng máy
Là phương pháp làm khô nấm để bảo quản sử dụng hơi nóng từ máy sấy nấm. Để cho khỏi mục nát, cần phải sấy khô nhưng phương pháp sấy, tàng trữvà bảo quản phải được thi hành đúng cách. Phương pháp mới nhất là sấy nấm
Linh chi bằng lò sấy. Để sấy nấm người ta dùng tủ nhiều ngăn và cung cấpkhông khí nóng để làm khô. Nấm được làm mất nước từ từ, kéo dài 4 giờ.
Nấm sấy giữ được mùi vị và màu sắc tốt hơn phơi nắng. Thường cứ khoảng 3kg nấm tươi được 1 kg nấm khô.
Để bảo quản nấm, người ta thường dùng túi nilon 2 lớp, sau đó dùng tay
vuốt ngược từ đáy túi lên miệng túi để không khí ra hết, cho nấm vào rồi buộckín từng lớp một. Dùng bao tải để đựng và bảo quản nơi khô ráo. Thời gian bảo quản có thể từ 12– 18 tháng.
Ưu điểm:
Giữ được màu sắc và mùi vị tốt hơn phương pháp phơi nắng
Tiết kiệm thời gian và hiệu quả cao
Bảo quản được lâu nhất trong các phương pháp đồng thời tránhđược những rủi ro từ phương pháp phơi nắng.
Nhược điểm: Tốn kém chi phí vì phải mua máy sấy.
Chính những ưu điểm mà nó mang lại, phương pháp sấy khô bằng máyngày càng được sử dụng rộng rãi, phổ biến trong các cơ sở trồng và sản xuất
các loại nấm nói chung và nấm Linh chi nói riêng.
Lưu ý: Cần bảo quản nấm Linh chi ở nơi khô thoáng, không ẩm mốc tránhtrường hợp nấm hút ẩm trở lại.
1.1.1.6 Thành phần hóa học và đặc tính dược lý của nấm L inh chi
Viện nghiên cứu tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc nghiên cứu thành phầnhóa học của nấm Linh chi mọc hoang dại thấy
Viện nghiên cứu kháng sinh Tứ Xuyên tìm thấy acid amin, protein,
saponin, steroid.
Học viện Y học Bắc Kinh phát hiện đường khử và đường kép acid amin,
dầu béo.
Theo những công trình nghiên cứu mới nhất của Viện nghiên cứu nấm
Linh chi hoang dại của toàn Trung Quốc trong hỗn hợp 6 loại nấm Linh chi có
hàm lượng Germanium cao hơn lượng Germanium có trong nhân sâm từ 5 đến
8 lần. Germanium giúp khí huyết lưu thông, các tế bào hấp thu oxi tốt hơn.
Lượng polysaccharide cao có trong nấm Linh chi tăng cường sự miễn dịch củacơ thể, làm mạnh gan, cô lập và diệt tế bào ung thư. Acid ganoderic có tácdụng chống dị ứng và chống viêm.
Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiên đại: phổ kếUV (tử ngoại), IR (hồng ngoại), phổ kế khối lượng– sắc ký khí (GC–MS), phổ
cộng hưởng từ hạt nhân và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC)cùng phổ kế Plasma (ICP), đã xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫnxuất trong nấm Linh chi.
Bảng 1.1. Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi [8]
Thành phầnhoạt chất
Nhóm chất Hoạt tính dược lý
Cyclooct asulsus Ức chế giải phóng Histamine
Adenosine NucleotideỨc chế kết dính tiểu cầu, thưgiãn cơ, giảm đau
Dẫn xuất ProteineChống dị ứng phổ rộng, điềuhòa miễn dịch
D – Glucans PolysaccharideChống ung thư, tăng tính miễndịch
D – 6 PolusaccharideTăng tổng hợp protein, tăngchuyển hóa acid nucleic
Ganoderic acid R, S Triterpenoid Ức chế giải phóng Histamine
Ganoderic acid B, D, F,
H, K, YTriterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE
Ganoderic acids TriterpenoidỨc chế sinh tổng hợpcholesterol
Ganodermadiol Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE
Ganodemic Acid T – O Triterpenoid Ứng chế tổng hợp Cholesterol
Ganodemic Acid Mf Triterpenoid Ứng chế tổng hợp Cholesterol
Lucidone A Triterpenoid Bảo vệ gan
Lucidenol Triterpenoid Bảo vệ gan
Ganosporelacton A Triterpenoid Chống khối u
Ganosporelacton B Triterpenoid Chống khối u
Oleic acid dẫn xuất Acid béo Ức chế giải phóng Histamine
Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpenoid mới, bao gồmLucidumol A và B, các Ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R. Trong đókiểu Lanostane triterpenoid có thành phần chính là lipophilic. Có khoảng 130hợp chất được ly trích từ quả thể, hệ sợi và bào tử nấm Linh chi. Triterpenoid
có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn bệnh HIV, thành phần và hàmlượng triterpenoid phụ thuộc vào nguồn giống và yếu tố môi trường[2]
.
Hàng loạt các nghiên cứu của Shufeng Zhou chứng minh rằng polysaccharide và triterpenoid của nấm Linh chi có khả năng chữa trị bệnh
viêm gan mãn tính, bệnh đái tháo đường loại 2 (type II diabetes mellitus) [9]
.He, Y.et al (1992) đã khảo cứu các BN3B –gồm 4 polysaccharide đồng
nhất có hoạt tính tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là Glucan
(chỉ chứa Glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kếtglucoside.
Hikino, H.et al từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyếtcủa nhiều polysaccharide. Các heteroglycan có hoạt tính chống ung thư, cácganoderan B có tác dụng làm tăng mức insulin trong huyết tương, giảm sinh
tổng hợp glycogen và giảm hàm lượng glycogen trong gan. Đây chính là cơ sởtrị liệu trên các bệnh nhân đái tháo đường.
Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm bằng phương phápdung hợp Protoplast giữa chủng G.lucium với G.applanatum, thậm chí với cảnấm Hương (Lentinus edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u củacác phức hợp polysaccharide–protein lên đáng kể.
Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợpIL – 2 (Interleukine –2) và hoạt tính AND polymerase ở chuột già bởi
polysaccharide, càng tăng khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của nấm Linh chi.
Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứngtỏ hiệu lực chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỉ lệ ¾ ở các loàiG.lucium và G.applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993).
Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine,
triterpenoids và các acid ganoderic. Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chếgiải phóng Histamine, ức chế Angiotensine Conversino enzyme (ACE), ức chếsinh tổng hợp Cholesterol và hạ huyết áp.
1.1.2 Khả năng chữa bệnh và một số ứng dụng lâm sàng của nấm Linh chi
1.1.2.1 Khả năng chữa bệnh của nấm L inh chi
Nấm Linh chi được dùng như một thượng dược khoảng từ 4000 năm
trước ở Trung Quốc đã khẳng định nấm Linh chi là nhân tố quan trọng chonhiều phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch,
giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào. Giá trịdược liệu của Nấm Linh chi càng được khẳng định khi Hội nghị Nấm học thếgiới thành lập Viện nghiên cứu nấm Linh chi Quốc tế tại New York [10-12]
.
Bảng 1.2. Lục bảo Linh chi và các tác dụng trị liệu [4]
Tên gọi Màu
sắc Đặc tính dược lý
Thanh chi(Long chi)
Xanh Vị chua, tính bình, không độc, chữa trị sáng mắt, bổ gankhí, an thần, tăng trí nhớ.
Hồng chi (Xích chi) Đỏ Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡng tim,
bổ trung, trị tức ngực.
Hoàng chi (Kim chi) Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần.
Bạch chi (Ngọc chi) Trắng Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông mũi, anthần, chữa ho nghịch hơi.
Hắc chi (Huyền chi) Đen Vị ngọt, tính bình, không độc, trị bí tiểu, ích thận khí.
Tử chi Tím Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị đau nhức xương khớp.
Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụngcụ thể của nấm Linh chi được tập hợp vào những mặt tác dụng lớn như sau
[13]:
Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn). Bảo can (bảo vệ gan).
Cường tâm (thêm sức cho tim).
Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá). Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp). Giải độc (giải toả trạng thái nhiễm độc).
Giải cảm (giải tỏa trạng thái bị cảm). Trường sinh (sống lâu, tăng tuổi thọ).
Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm Linh chi,
người ta thấy nấm Linh chi có tác dụng rất tốt với một số bệnh [1-2]
:
Đối với các bệnh tim mạch: Hàng loạt các hoạt chất của nấm Linh chi được chứng tỏ có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cholesterol, kìm hãm quátrình kết tụ tiểu cầu. Các nghiên cứu này được củng cố để có kết quả trị liệucho các bệnh nhân cao huyết áp, nhiễm mỡ xơ mạch, bệnh mạch vành tim,.. ..
Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố khoáng vết hiếm.Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng cholesterol trên thành mạch. Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô.
Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm nấm Linh chi được xem như là một
chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệuung thư. Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh chi có tác dụnggiảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỉ trọng cao trong máu,
làm giảm hệ số sinh bệnh. Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu,giảm nồng độ mỡ trong máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim.
Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất làvới những ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụnggiảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn.
Khả năng miễn dịch: nấm Linh chi chứa một lượng lớn Germanium hữucơ, polysaccharides và triterpenoids. Những thành phần này đã được chứngminh là tốt hơn cho hệ miễn dịch và cải thiện hệ miễn dịch của chúng ta.
C hữa bệnh gan: Ở Trung Quốc, nấm Linh chi thường được kê vào đơnthuốc cho những bệnh nhân bị viêm gan mãn tính. Trong điều trị lâu dài từ 2đến15 tuần thì tỉ lệ chữa hiệu quả là từ 70,7–98 %. Ở Nhật, phần chiết nấm
Linh chi đã được báo cáo là có hiệu quả đối với những bệnh nhân suy gan.
Hiệu quả chống ung thư: Trong một nghiên cứu cho thấy nấm Linh chicó thể ngăn chặn sự bám dính và sự di căn của những tế bào ung thư tuyến vú
và tuyến tiền liệt. Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải phẫuvới trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dàycó thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm.
Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long
não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt–khối u tiêu biến hoàn toàn.
Khả năng kháng HIV: để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợpchất trong nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thểtrong thử nghiệm kháng virus HIV– 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sựnhân lên của virus được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt
các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV–1. Kết quả cho thấy có sự ứcchế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virus này (Gau J.P, 1990; Kim,
1996). Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh
chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001).
Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV– 1.
Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV – 1.
Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth– A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma).
Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane Triterpenoid với
nhóm hydroxol (-OH) ở vị trí C25 có khả năng chống HIV– 1,Meth –A và LLC ở chuột.
Khả năng antioxidant: nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các
saponine và triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quảnhất (Wang C.H, 1985).
Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu
Selenium –một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxidant rất mạnh– vào nấm Linh
chi. Chính vì vậy con người có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ,trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và nấm Linh chi Việt Nam nói riêng.
Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốctự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay sau khi bị nhiễm xạ. Chúnglàm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ nào cho cơthể. Ngoài ra nấm Linh chi còn có tác dụng chữa trị chứng bí tiểu, bổ thận khíchữa trị đau nhức khớp xương, gân cốt,….
Một số các kết quả lâm sàng từ việc sử dụng nấm Linh chi [1-2]:
Trị suy nhược thần kinh: Bệnh viện Hoa Sơn thuộc Viện Y học số 1
Thượng Hải báo cáo: Dùng cả 2 loại nấm Linh chi nhân tạo và nấm Linh chi hoang dại chế thành viên (mỗi viên tương đương 1 g thuốc sống), mỗi lầnuống 3 viên, ngày 3 lần, một liệu trình từ 10 ngày đến 2 tháng. Trị 225 ca, tỷ lệ
đạt được 83,5 –86,3%, nhận xét thuốc có tác dụng an thần, điều tiết thần kinh
thực vật và tăng cường thể lực (theo báo Tân y học, số phụ chuyên đề về bệnhhệ thống thần kinh 1976,3:1440).
Trị chứng cholesterol máu cao: Báo cáo của Sở nghiên cứu kháng
khuẩn tố công nghiệp Tứ Xuyên, dùng liên tục từ 1 đến 3 tháng cho 120 ca
thuốc có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh rõ rệt, tỉ lệ kết quả 86% (theo báocáo đăng trên báo thông tin Trung thảo dược 1973,1:31).
Trị viêm phế quản mạn tính: Tổ nghiên cứu nấm Linh chi tỉnh Quảng
Đông báo cáo dùng siro nấm Linh chi và đường nấm Linh chi, tr ị 1.110 ca cókết quả và có nhận xét là thuốc có tác dụng đối với thể hen và thể hư hàn (theo
tờ báo cáo tư liệu Y dược Quảng Đông 1979,1:1).
Trị viêm gan mãn tính: Dùng polysaccharide chiết xuất từ nấm Linh chi hoang dại chế thành thuốc bột hòa nước uống, trị các loại bệnh viêm gan mạn
hoạt động, viêm gan mạn kéo dài và xơ gan.
Trị chứng giảm bạch cầu: Dùng polysaccharide chế thành viên (mỗiviên có 250 mg thuốc sống) cho uống, theo dõi 165 ca, ghi nhận tỷ lệ có kếtquả 72,57% (Báo cáo của Lưu Chí Phương đăng trên tạp chí Trung Hoa Huyếtdịch bệnh 1985,7:428).
Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc: Dùng
nấm Linh chi chế thành dịch, tiêm bắp và viên uống. Trị xơ cứng bì 173 ca, tỷ
lệ kết quả 79,1%, viêm da cơ 43 ca, có kết quả 95%, Liput ban đỏ 84 ca có kếtquả 90%, ban trọc 232 ca, có kết quả 78,88% (thông tin nghiên cứu Y học1984,12:22).
Theo sách Trung dược ứng dụng lâm sàng: thuốc có tác dụng đối với bệnh loét bao tử, rối loạn tiêu hóa kéo dài, thường dùng phối hợp với Ngũ bộitử, Đảng sâm, Bạch truật, Trần bì, Kê nội kim, Sa nhân, Sinh khương.
T rị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch máu não: thường phối
hợp với Kê huyết đằng, Thạch xương bồ, Đơn bì, Cẩu tích, Đỗ trọng, Thỏ ty
tử, Hoàng tinh. Thuốc còn dùng chữa bệnh động mạch vành, đau thắt ngực.
Dùng giải độc các loại khuẩn: Phối hợp với cam thảo, gừng, táo.
Ngoài ra, sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Đỗ Tất Lợi
có ghi: Thuốc chữa bệnh phụ nữ thời kì mãn kinh, giúp thông minh và trí nhớ,dùng lâu ngày giúp cho nhẹ người, tăng tuổi thọ. Nhiều người mua nấm Linh
chi về nấu canh, nấu súp làm món ăn cao cấp.
1.1.3
Giới thiệu sơ lược về hoạt chất có trong nấm Linh chi
1.1.3.1 Ganoderma polysacchar ides (GLPs)
Polysaccharide là một trong những thành phần hữu hiệu nhất chứa trong
Nấm Linh chi, rất được các nhà y dược học coi trọng. Thành phần polysaccharide ở nấm Linh chi (Ganoderma lucidum polysaccharide) nay đã
được phân ly thành hơn 200 loại, trong đó phần lớn là chất thuộc loại kết cấu,tồn tại ở thành tế bào, và một số ít là chất tồn trữ, tồn tại ở trong tế bào.
Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh
chi. Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn
ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trênkhung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100.000 – 1.000.000, đa số chúng tồntại phía trong vách tế bào. Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan
trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng [2,14]
.
Hoạt tính dược lý của polysaccharide ở nấm Linh chi có liên quan đếnkết cấu lập thể, cấu hình lập thể dạng xoắn ốc bị phá hủy thì hoạt tính của
polysaccharide giảm đi nhiều. Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trườngdịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị.
Vai trò dược học của polysaccharide:
Kích thích hệ miễn dịch cơ thể
Gia tăng khả năng dung nạp oxygen
Giảm gốc tự do hydroxyl Ức chế khối u phát triển
Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ
Tăng chức năng gan
Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường
Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc
nucleic acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều cóhoạt tính dược liệu mạnh
[6].
Chức năng của adenosine:
Giảm độ nhớt máu
Ức chế kết dính tiểu cầu
Ngăn chặn hình thành cục nghẽn
Tăng lượng lipoprotein 2– 3 phosphoricglycerin
Tăng khả năng vận chuyển oxy và làm tăng lưu lượng máu cung
cấp cho não
Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể.
1.1.3.3 Alkaloid
Alk aloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng,có phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đadạng. Tuy nhiên cũng có một số alkaloid không có nhân dị vòng với nitơ vàmột số alkaloid không có phản ứng kiềm. Một số alkacoid còn có thể có phảnứng acid yếu do có nhóm chức acid trong phân tử
[1-2].
Đa số alk aloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn. Một vài alkaloid ởdạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng và có màu.
Các alk aloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường
tan trong dung môi hữu cơ: chloroform, ether diethyl, alcol bậc thấp. Các muốicủa alkaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môihữu cơ như: chloroform, ether, benzen. Chính vì thế, tính hòa tan của cácalk aloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích alkaloid ra khỏi nguyên
liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống.
Alkaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong
ngành y dược và nhiều chất rất độc. Các alkaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alkaloid.
Tác dụng lên hệ thần kinh
Tác dụng lên huyết áp
Tác dụng trị ung thư.
1.1.3.4 Hợp chất saponin
Saponin là một nhóm chất trao đổi thứ cấp quan trọng trong thế giới thựcvật. Tên gọi saponin bắt nguồn từ từ Sapo trong tiếng Latinh, có nghĩa là xà
phòng. Saponin có tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụnglàm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt. Saponin thường ởdạng vô định hình, có vị đắng
[1-2].
Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao từ 200°C trở lên và có
thể trên 300°C. Saponin bị tủa bởi chì acetate, hydroxide barium, sulfateamonium nên lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. Saponin là một loạiglycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon và phần khôngđường gọi là aglycon.
Về phương diện hóa học, saponins được xác định gồm những cấu trúckhác nhau: triterpenoids, glycosylated steroids và steroidal alkaloids.
Saponin tri terpenoid : Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30
cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm: Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này
có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean,ursan, lupan, hopan. Phần lớn các saponin triterpenoid trong tựnhiên đều thuộc nhóm olean.
Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan,
cucurbitan.
Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spiroalan, spirostan, furostan,
aminofurostan, solanidan.
Vai trò dược học.
Trị long đờm, chữa ho.
Là chất phụ gia trong một số vắc xin.
Tác dụng thông tiểu.
Tác dụng kháng viêm, chống khối u.
1.1.3.5 Germanium hữu cơ
Germanium là nguyên tố hiếm, do nhà hóa học người Đức khám phávào năm 1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thếchức năng của oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoànmáu trong cơ thể lên đến 1,5 lần. Vì thế làm tăng mức độ trao đổi chất và ngănchặn quá trình lão hóa
[3].
Gemanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường
trong cơ thể và bảo vệ sức khỏe. Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo
trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hòa và kiểm soát quá trình này,từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển.
Chức năng của Germanium:
Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện
ung thư.
Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ
Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ.
1.2 Triterpenoid
Triterpenoid được phân bố rộng rãi trong giới thực vật, động vật. Chúng
tồn tại dưới dạng tự do như các ester hoặc dạng glucosid.
Triterpenoid được phân lập lần đầu tiên vào năm 1982 bởi Kubota et al.,sau đó hơn 130 loại triterpenoid được phân lập từ quả thể, bào tử và sợi nấmLinh chi.
Triterpenoid có tác dụng sinh học trong giảm nguy cơ ung thư, làm giảm
cholesterol, giúp máu lưu thông tốt, làm giảm huyết áp, nếu dùng lâu dài nóđược coi là kháng sinh tự nhiên, chống oxi hóa.
Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Cáctriterpenoid có bộ khung chính từ 27–30 nguyên tử carbon (C18H48) rất thường
gặp trong thực vật. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phầnđường), cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; ether -O-;
Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trongether dầu hỏa, hexan, etherethyl, chloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khichúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid.
Có thể chia triterpenoid thành 3 nhóm dựa vào cấu trúc: không vòng, 4
vòng và 5 vòng. Nhiều triterpenoid chuyển hóa từ nhóm nọ sang nhóm kia. Sựchuyển hóa bao gồm việc thay đổi nhóm – COOH thành nhóm – CH3 tương
ứng thành nhóm – CH2OH [15].
Tr iterpenoid không vòng: Squalen (cấu hình trans hexane), Ambrein.
Squalen được phát hiện lần đầu từ gan cá mập Squalus, ngoài ra còn
được tìm thấy trong một số loại nấm, dầu olive.
Tr iterpenoid 4 vòng: thuộc loại squalenoxid (mọi vòng 6C đều ở cấuhình trans với nhau): Lanosterol, Protosterol, Agnosterol, Cycloaudinol.
Thuật ngữ saponin chỉ một nhóm glycosid có đặc tính chung là khi hòa
tan vào nước sẽ có tác dụng giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều
bọt. Dưới tác dụng của các enzyme thực vật hoặc vi khuẩn, hoặc acid loãng,saponin thủy phân tạo thành genin và phần đường gồm 1 hoặc nhiều phân tử
oza. Genin do saponin thủy phân gọi là sappogenin.
Có thể chia làm 2 nhóm lớn là sapogenin triterpen và sapogenin steroid.
Về phần đường, các oza phổ biến là D– Glucoza, D – Lactoza, L – Arabinoza,
L – Ramnoza, acid galacturonic, acid D –Glucuronic….Đại đa số các oza gắnqua nhóm – OH ở C3 của sapogenin, một số khác gắn ở C16 hoặc qua COOH(ở vị trí C28).
Nhóm sapogenin triterpen 4 vòng chiếm số lượng không nhiều trong tựnhiên, nhưng điều là những sapogenin quan trọng. Đáng chú ý nhất là các chất
Panaxozid trọng họ Nhân Sâm Panax gingseng C.A. Meyer, các Cururbitacin
trong họ bầu bí (Cururbitaceae).
Tr iterpenoid 5 vòng: được chia làm 3 nhóm dựa trên quan hệ đã được
xác định với một trong 3 chất tiêu chuẩn là myrin, myrin và Lupeol.
Triterpenoid 5 vòng có tính acid tồn tại phổ biến hơn trong thực vật.
Bảng 1.3. Các hoạt chất Triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh
chi (Lê Xuân Thám, 1996)
Hoạt chất Hoạt tính
Ganoderic acid R, S Ức chế giải phóng histamine
Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp
Ganodermadiol Hạ huyết áp
Ganoderic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol
Ganoderic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol Ganoderic acid Ức chế tổng hợp cholesterol
Chú ý: Nhóm hoạt chất dược lý triterpenoid là sử dụng từng triterpenoidtinh khiết riêng rẽ thì hoạt lực thấp hơn khi dùng các phân đoạn tách chưa tinhchế. Có nghĩa là khi sử dụng tổ hợp các đồng phân của chúng sẽ có hiệu quảhơn. Nên việc sử dụng nấm Linh chi thường dùng toàn bộ dịch chiết từ nấm.
1.3 Các nghiên cứu về định lượng triterpenoid tổng
Triterpenoid là một nhóm chất rất đa dạng, chúng được phân bố rộng rãi
trong nhiều loài động, thực vật khác nhau. Chúng có nhiều tác dụng dược họcđáng quý mà khoa học đã chứng minh được, vì thế đã có rất nhiều các công
trình nghiên cứu định lượng cũng như nhận biết các hoạt chất thuộc nhóm
triterpenoid trên thế giới đã được thực hiện bằng nhiều phương pháp bởi nhiềunhà khoa học khác nhau.
Trong đó, để xác định hàm lượng triterpenoid tổng thì phương pháp đượcsử dụng phổ biến nhất đó là phương pháp so màu, trong nhiều công trình củanhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này thì có một số điểm khác
biệt giữa các qui trình như là: khác nhau về bước sóng hấp thụ, khác nhau vềchất chuẩn, chất hiện màu, thời gian cũng như là dung môi chiết mẫu.
1. Theo Xiang và các cộng sự (2001) đã sử dụng phương pháp so màu đểđịnh lượng triterpenoid tổng số trong lá Ceriops Decandra với chất chuẩn làOleanolic acid (nồng độ gốc là 604 g/L). Đường chuẩn được xây dựng với cácống nghiệm 10 mL chứa lần lượt 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 và 0,6 mL dung dịchchuẩn gốc, thêm vào 0,2 mL hỗn hợp 5% vanillin– acetic acid (w/v) và 1,2 mL
acid perchlor ic, ủ trong bể điều nhiệt ở 70°C trong khoảng 15 phút, sau đó làmlạnh trong chậu nước đá khoảng 2 phút. Cuối cùng thêm ethyl acetate vào đểtổng thể tích đạt được 5 mL, để nguội ở nhiệt độ phòng. Mẫu trắng được
chuẩn bị là dung dịch acetic acid. Độ hấp thụ được quét trên máy UV– Vis
trong vùng bước sóng 200–700 nm. Độ hấp thụ A của chất chuẩn sẽ được xác
định ở bước sóng 550 nm trong curve dày 1 cm. Hàm lượng triterpenoid tổngsẽ được xác định dựa vào đường chuẩn. Cũng theo Xiang và các cộng sự đãkhảo sát thì khoảng thời gian cho phản ứng lên màu tốt là 15– 25 phút
[16].
Trong nghiên cứu có bước khảo sát thời gian cho phản ứng lên màu tốiưu và khảo sát vùng bước sóng hấp thụ cực đại giúp cho việc xác định chínhxác hàm lượng chất cần phân tích. Tuy nhiên, trong phương pháp cuối cùng lạithêm vào ethyl acetate thay vì thêm vào dung dịch đệm acetic acid, cũngkhông có bước cho bay hơi hết dung môi trong dung dịch chuẩn gốc và trongdịch chiết mẫu điều này có thể làm ảnh hưởng đến nền mẫu trong quá trình
định lượng (vì đường nền có thể bị nhiễu bởi các dung môi).
2. Theo X. Bai và các cộng sự (2007), định lượng triterpenoid tổng trong
thân của cây Actinidia deliciosa dựa trên phản ứng màu với vanillin và ursolic
acid là chất chuẩn. Lấy một lượng dịch chiết, thêm vào đó 0,3 mL hỗn hợp 5%
vanillin –acetice acid và 1 mL acid perchloric, cho phản ứng trong vòng 15 phút ở 60°C, sau đó làm lạnh trong chậu nước đá. Độ hấp thụ của mẫu sẽ đo ở
bước sóng 520 nm. Hàm lượng triterpenoid tổng sẽ được xác định dựa theo
đương chuẩn của ursolic acid đã xây dựng (Cursolic acid (g)).
Với các điều kiện được sử dụng trong nghiên cứu này thì: đường chuẩn
được xây dựng trong khoảng 0– 16,5 g, độ lệch chuẩn bé hơn 4%, hiệu suất
thu hồi (độ đúng) đạt từ 93– 115%, hệ số tương quan R 2 = 0,9937[17]
.
Đường chuẩn của ursolic acid trong phương pháp được xây dựng bằng
cách cân khối lượng (Cursolic acid (g)) dễ gây sai số, không chính xác, không
cho bay hơi dung môi trong dịch chiết làm ảnh hưởng tới tín hiệu đường nền.
3. Theo Jie – Ping Fan và Chao –Hong He (2006), trong “Simultaneous
quantification of three major bioactive triterpene acids in the leaves of
Diospyros kaki by high- performance liquid chromatography method” cũng đã
sử dụng phương pháp so màu để xác định hàm lượng triterpenoid tổng . Lấymột lượng dịch chiết phù hợp thu được sau khi chiết mẫu hòa tan trong 25 mLethanol, lấy 0,2 mL dịch chiết sau đó làm bay hơi hết dung môi trong bể điều
nhiệt, thêm vào 0,3 mL hỗn hợp 5% vanillin– acetic acid và 1 mL acid
perchloric, mẫu được gia nhiệt trong vòng 45 phút ở 60°C sau đó làm lạnhtrong chậu nước đá. Độ hấp thụ của mẫu được đo ở 548 nm sau khi thêm vào5 mL acetic acid băng. Ursolic acid được sử dụng làm chất chuẩn.
Sau khi tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm được sử dụng trong qui
trình: đường chuẩn được xây dựng nằm trong khoảng 0– 0,0126 mg/mL.Phương trình hồi qui được tính toán như sau: y = 0,0167x – 0,0015 (trong đó ylà nồng độ của ursolic acid (mg/mL) và x là độ hấp thụ của mẫu) với hệ sốtương quan R 2=0,9995. Độ lệch nhỏ hơn 4%. Hiệu suất thu hồi củatriterpenoid tổng được thực hiện bằng cách thêm vào một lượng chất chuẩn đạt94 – 112%
[18].
Thời gian cho phản ứng lên màu là quá dài 45 phút thay vì 15 – 25 phút
như đã khảo sát bởi Xiang et. al (2001) điều này làm cho cường độ màu của
dung dịch có thể không tối ưu, khoảng xây dựng đường chuẩn nhỏ 0– 0,0126mg/mL. Ưu điểm của phương pháp là đã cho bay hơi hết dung môi không gâyảnh hưởng đến tín hiệu nền.
4. Theo Jiewen Zhao (4 – 2011) đã mô tả qui trình định lượng triter penoid
tổng bằng phươ ng pháp UV –Vis với vanillin–perchloric acid làm chất hiệnmàu trong “The extraction of high value chemicals from heather (Callunavulgaris) and bracken (Pteridium aquilinum)” cụ thể: 10 mg Oleanolic acid
được hòa tan trong 50 mL methanol, sau đó chuẩn bị một dãy chuẩn làm việc
với tám ống nghiệm lần lượt chứa 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, va 0,7 mL
dung dịch chuẩn và cho bay hơi hết dung môi trong bể điều nhiệt. Thêm vàoống nghiệm 0,3 mL hỗn hợp 5% vanillin– acetic acid và 1 mL acid perchloric,
đem ủ trong bể điều nhiệt ở 70°C trong vòng 25 phút. Sau đó làm lạnh trongchậu nước đá và thêm vào 10 mL acetic acid băng. Độ hấp thụ của dung dịch
được đo ở bước sóng 550 nm và tạo ra đường chuẩn.
Tiến hành đo trên mẫu: 10 mg của dịch chiết CO2 siêu tới hạn (hoặc dịchchiết hexan) hòa tan trong 1 mL dichloromethane trong ống nghiệm. Cho dungmôi bay hơi trong bể điều nhiệt. Tương tự cũng cho 0,3 mL hỗn hợp 5%vanillin –acetic acid và 1 mL acid perchloric trước khi đem ủ ở 70°C trong 25
phút. Dung dịch được làm lạnh trong bể nước đá và sau đó thêm vào ống
nghiệm 10 mL acetic acid băng. Độ hấp thụ của dịch chiết cũng được đo ở 550nm và hàm lượng triterpenoid tổng trong mẫu được xác định dựa theo đường
chuẩn Oleanolic acid đã xây dựng [19].
Quá trình chiết mẫu của phương pháp là chiết với CO2 siêu tới hạn điềunày không thể áp dụng trong làm việc ở phòng thí nghiệm, do đó kết quả thựcnghiệm của đề tài làm ra không thể so sánh được. Phương pháp trong nghiên
cứu này đã được cải tiến nhiều so với các nghiên cứu trước.
5. Trong “In vitro inhibitory effects of Pithecellobium dulce (Roxb.)Benth. seeds on intestinal α-glucosidase and pancreatic α-amylase” củaDnyaneshwar Madhukar Nagmoti, Archana Ramesh Juvekar (28 – 4 – 2013)
cũng đã xác định được hàm lượng triterpenoid tổng bằng cách: 250 L dịch
chiết được trộn với 0,25 mL hỗn hợp 5% vanillin– acetic acid và 0,5 mL acid
perchloric. Hỗn hợp được ủ trong trong 10 phút, làm lạnh trong bể nước đá 15 phút và sau đó thêm vào 2,5 mL acetic acid băng. Sau 6 phút, độ hấp thụ đượcđọc ở 538 nm. Oleanolic acid làm chất chuẩn và hàm lượng triterpenoid tổng
được xác định thông qua đường chuẩn của Oleanolic acid (OAE, mg/g dịchchiết) [20]
.
Thời gian cho phản ứng lên màu là không tối ưu, trong khi đó thời gianlàm lạnh lại dài hơn.
Theo mục tiêu của đề tài thì phương pháp được sử dụng để định lượngtriterpenoid tổng phải là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, với độ chính xáccao và phù hợp với từng cơ sở thí nghiệm. Trong điều kiện trang thiết bị hiệncó của phòng thí nghiệm có thể định lượng triterpenoid tổng bằng 2 phương
pháp: phương pháp HPLC và phương pháp UV–Vis. Trong đó, phương phápHPLC là phương pháp thực hiện với độ chính xác cao, độ nhạy tốt, có thể
phân tích nhiều hợp chất, tuy nhiên, phương pháp này lại ít chọn lọc nên khóloại bỏ hết ảnh hưởng của nền mẫu, phải lựa chọn dung môi và phải khảo sát
Chương 2 GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT VÀ PHƯƠNGPHÁP ĐỊNH LƯỢNG TRITERPENOID TỔNG
2.1 Phương pháp chiết triterpenoid trong dược liệu với sự hỗ trợ của
sóng siêu âmCó rất nhiều kỹ thuật chiết tách hoạt chất trong dược liệu được thực hiện
vào từng thời điểm khác nhau. Theo k ỹ thuật chiết truyền thống thì có các phương pháp chiết như là: chiết ngấm kiệt, chiết lôi cuốn hơi nước, chiết vớisự hỗ trợ của nhiệt độ, chiết soxhlet. Tuy nhiên, các phương pháp này thường
cho hiệu suất chiết thấp, thường sử dụng một lượng lớn dung môi để chiết,thời gian chiết kéo dài không thật sự thuận lợi về mặt hiệu quả kinh tế.
Để có thể khắc phục các nhược điểm trên, ngày nay, người ta đã phát
triển các phương pháp chiết khác mang lại hiệu quả kinh tế hơn, rút ngắn thờigian chiết và hiệu suất chiết cao như: phương pháp chiết với sự hỗ trợ củasóng siêu âm (UAE), chiết với sự hỗ trợ của vi sóng (MAE), chiết bằng CO 2
siêu tới hạn, chiết dưới áp suất cao,…. Trong đó, chiết băng CO2 siêu tới hạnvà chiết dưới áp suất cao là 2 kỹ thuật chiết hiện đại nhất, mang lại hiệu quả
chiết cao nhất. Tuy nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm hiện tại thì chỉ có
thể áp dụng phương pháp chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm là phù hợp nhất.
Theo Schinor EC và các đồng nghiệp (2004) đã sử dụng phương pháp
chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm để chiết steroid và triterpenoid trong thân,lá và hoa của Chresta exsucca, C. scapigera và C. sphaerocephala và đồngthời cũng sử dụng phương pháp chiết cổ điển để so sánh
[21]. Theo Soponrat
Rattanasombat, Chayanoot Sangwichien (2011) đã chiết triterpenoid trongGymnema inodorum Decne bằng cách sử dụng 2 phương pháp chiết: chiết soxhlet và chiết có sự hỗ trợ của sóng siêu âm
[22]. Cũng theo như Hua Yao và
các đồng nghiệp (tháng 2–2013) đã chiết triterpenoid từ rễ của cây Euphorbia
pekinensis với sự hỗ trợ của sóng siêu âm [23]. Đã đồng thời cho thấy, phương
pháp chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm mang lại hiệu suất chiết cao hơn sovới các phương pháp chiết thông thường, tiết kiệm được thời gian và dung môicho quá trình chiết.
Nguyên tắc: khi sóng siêu âm truyền trong dịch chiết lỏng, theo trình tự
và với tốc độ rung cao làm cho dung môi tại các hốc nhỏ dược liệu sẽ có hiệntượng sủi bọt. Khi những bọt bong bóng này vỡ ở những nơi gần thành tế bào,thì sóng xung kích sẽ làm vỡ thành tế bào và giải phóng các thành phần hoạtchất vào dung môi.
Cách tiến hành: cân một lượng nguyên liệu cần thiết, cho vào một dụngcụ chứa có sẵn một lượng dung môi phù hợp (thường là methanol hoặcethanol), cho vào bể chiết, chiết ở nhiệt độ 60°C trong khoảng thời gian từ 30– 45 phút, lọc lấy cắn (có thể ly tâm), hòa tan cắn trong một lượng dung môi
thích hợp, định mức. Thu được dịch chiết có một nồng độ Cm.
Một số điều cần lưu ý trong quá trình chiết: nhiệt độ trong bình chiết phải phù hợp đảm bảo hoạt chất được chiết ra không bị biến tính ở nhiệt độchiết, đảm bảo rằng số lần chiết và thời gian chiết đủ để chiết kiệt hoạt chấttrong dược liệu và lượng dung môi chiết phải vừa đủ để có thể ngấm hết mẫu.
2.2 Định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương
pháp UV – Vis
Nguyên tắc: phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại–khả kiến là phương pháp dựa trên việc đo độ hấp thụ bức xạ đơn sắc của dung dịch nghiêncứu ở bước sóng xác định trong vùng tử ngoại khả kiến, rồi so sánh với độ hấp
thụ bức xạ đơn sắc của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định, từ đó tínhtoán được hàm lượng chất nghiên cứu dựa theo đường chuẩn của chất chuẩn.
Theo các công trình nghiên cứu về định lượng triterpenoid tổng thì có thểrút ra các kết luận chung: hỗn hợ p vanillin – acetic acid băng và acid perchloric
thường được dùng làm chất lên màu trong phản ứng tạo phức, bước sóng hấp
thụ cực đại nằm trong khoảng 520–550 nm, để chính xác hơn trong đề tài sẽtiến hành khảo sát lại bước sóng hấp thụ cực đại trong vùng 190– 1100 nm,
thời gian cho phản ứng lên màu tối ưu là 15– 25 phút (theo Xiang et.al (2001)),
một điểm cần lưu ý là phải cho bay hơi hết dung môi trong dịch chiết mẫu vàdung dịch chuẩn vì dung môi làm ảnh hưởng đến nền mẫu khi phân tích, chấtchuẩn có thể sử dụng là oleanolic acid hoặc là ursolic acid.
Cách tiến hành: Lấy một lượng dịch chiết mẫu (sau khi thực hiện quátrình chiết mẫu) có nồng độ Cx, cho bay hơi hết dung môi, thêm vào hỗn hợp
5% vanillin – acetic acid băng và acid perchloric để thực hiện phản ứng lênmàu, ủ hỗn hợp một thời gian để bền màu, định mức bằng acetic acid băng,
sau đó đo độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng thích hợp trên máy UV – Vis,
dựa vào phương tr ình đường chuẩn của chất chuẩn xác định nồng độ của mẫu,
từ đó suy ra hàm lượng triterpenoid tổng có trong mẫu ban đầu.
Một số điều cần lưu ý trong quá trình định lượng:
Cần phải loại bỏ các yếu tố làm ảnh hưởng đến nền mẫu: dung môi,
Xác định được bước sóng tối ưu để độ hấp thụ đạt cực đại.
Phải thẩm định phương pháp trước khi đo mẫu.
2.3
Thẩm định phương pháp phân tích
2.3.1
Tầm quan trọng của việc thẩm định
Thẩm định phương pháp phân tích là một quá trình tiến hành thiết lập
bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minhrằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Nói cách khác, việcthẩm định một phương pháp phân tích yêu cầu chúng ta phải chứng minh mộtcách khoa học rằng khi tiến hành thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ vàchấp nhận được.
2.3.2
Nội dung thẩm định Cơ sở để thẩm định một quy trình phân tích dựa vào các cơ sở sau
[25]:
Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
Độ đúng (accuracy)
Độ lặp lại
Giới hạn phát hiện (limit of detection)
Giới hạn định lượng (limit of quantitation).
2.3.2.1 Độ tuyến tính (Linearity) Độ tuyến tính diễn tả sự tương quan giữa nồng độ chất khảo sát trong các
dung dịch đo của mẫu thử với kết quả phân tích của phương pháp. Sự tươngquan tuân theo phương trình bậc 1: y = f(C) = ax + b.
Độ tuyến tính thể hiện qua hệ số tương quan tuyến tính (R).
R càng gần bằng 1 thì phương pháp thử có độ tuyến tính càng cao.
Cách xác định:
Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trước cácgiá trị đo được y. Như ta đã biết nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x có nghĩa làtrong khoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn của y theo x theo mộtđường thẳng (đoạn thẳng) theo phương trình sau: y = ax + b.
Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệsố tương quan:
Nếu R = 1: có tương quan tuyến tính rõ rệt. R > 0: có tương quan đồng biến.
R < 0: có tương quan nghịch biến. R < 0,5: coi như không có tương quan tuyến tính. R > 0,5: có phụ thuộc tuyến tính.
Sau khi đã xác định được khoảng tuyến tính của phương pháp, ta có thểxây dựng được phương trình hồi quy của khoảng này tức là đi tìm được hệ sốa và b của phương trình trên:
2
2
(X ) i i
i i
i i
X Y Y
na
X X
n
b = y – ax
Như vậy sau khi đã xây dựng được phương trình đường chuẩn, khi biếtđược x thì suy ra y.
Yêu cầu: Tùy theo hoạch định mà chọn giá trị R. Nói chung R > 0,999
2.3.2.2 Độ đúng (Accuracy)
Độ đúng là độ sát gần của giá trị tìm thấy với gái trị thực khi áp dụng
quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được làm đồng nhất trong cùngđiều kiện xác định.
Đại lượng đặc trưng cho độ đúng: BIAS, tỉ lệ phục hồi.
BIAS: là hiệu giữa hàm lượng thêm vào và hàm lượng tìm lại được bằngqui trình.
Độ đúng biểu thị bằng tỉ lệ phần trăm (%) phục hồi của giá trị thêm vào
mẫu thử bằng phương pháp xây dựng.
Cách thực hiện:
Xác định hàm lượng của chất cần thử trong mẫu đem thử bằng phương pháp dự kiến.
Cho vào mẫu thử một lượng chất chuẩn của chất cần thử có hàm lượng
bằng 80%, 100%, 120% so với hàm lượng chất đó có trong mẫu thử, rồi tiếnhành bằng phương pháp đề xuất.
Giới hạn phát hiện được xác định dựa vào phương trình hồi qui tuyến
tính của mẫu thử và các thông số thống kê (trắc nghiệm F–phân phối Fischervà trắc nghiệm t –phân phối Student).
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection = LOD) được tính theo côngthức:
2.3.2.5 Giới hạn định lượng (LOQ) (Limit of quantification)
Giới hạn định lượng là một thông số của phương pháp phân tích địnhlượng các hợp chất có trong một khung mẫu với lượng thấp nhất như nhữngtạp chất trong nguyên liệu làm thuốc và sản phẩm phân hủy có trong chế
phẩm.
Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trongmột mẫu thí nghiệm còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác cóthể chấp nhận được.
Giới hạn định lượng có thể được biểu thị bằng nồng độ phần trăm, phần
ngàn, phần tỷ có chất cần phân tích có trong mẫu.
Xác định: Giới hạn định lượng được xác định dựa vào phương trình hồiqui tuyến tính của mẫu thử và các thông số thống kê (trắc nghiệm F–phân phối
Fischer và trắc nghiệm t–phân phối Student).
Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation = LOQ) được tính theo công
Vanillin (Pháp): Pha hỗn hợp vanillin – acetic acid băng 5%. Cân chínhxác 2,5 g vanillin dạng bột (màu trắng), thêm vào một lượng nhỏ acetic acid
băng, khuấy đều cho đến khi vanillin tan hoàn toàn. Chuyển sang bình địnhmức 50 mL, định mức tới vạch bằng acetic acid băng. Dung dịch tiếp tục được
lắc cho đến khi phân bố tốt. Hỗn hợp được bảo quản ở điều kiện thoáng mát,trong bóng tối.
Chuẩn Oleanolic acid 10 mg (Merk): Pha dung dịch chuẩn có nồng độgốc 100 ppm. Từ ống chuẩn 10 mg chuyển qua bình định mức 100 mL, cẩnthận tráng ống chuẩn nhiều lần với methanl, định mức tới vạch bằng methanol.Bảo quản ở nhiệt độ từ 2– 8°C, tránh ánh sáng. Lưu ý methanol dễ bay hơi, quathời gian methanol bay hơi sẽ làm cho nồng độ của chất chuẩn tăng lên gây saisố, cần phải bịt kín khi bảo quản.
3.1.4
Thu mẫu
Sau đây là 10 mẫu nấm Linh chi được cung cấp bởi Công ty Dược HậuGiang và một số mẫu mua trên địa bàn Thành phố Cần Thơ.
Địa điểm nhận mẫu: Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang. Địa chỉ: 288
Bis, Nguyễn Văn Cừ, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ.
Mẫu đem về được chứa trong túi nilon, sau đó cắt nhỏ mẫu sao cho kíchthước gần bằng nhau với đường kính khoảng 1 mm. Khi cắt nhỏ từng mẫuxong, trộn đều mẫu, chia mẫu làm thành 4 phần bằng nhau một cách ngẫu
nhiên theo hình chữ thập, sau đó lấy hai phần mẫu đối diện nhau, trộn lại, tiếptục chia thành 4 phần bằng nhau, lấy hai phần đối diện trộn lại, tiếp tục làmnhư thế cho đến khi lấy được một lượng mẫu đủ để đem đi phân tích. Mẫuđược bảo nơi khô thoáng, tránh ẩm mốc.
Trước khi đem đi phân tích mẫu được xay nhuyễn thành bột để dễ dàng
chiết hoạt chất. Cần lưu ý bột mẫu dễ dàng hút ẩm trở lại nên cần bảo quảncẩn thận bằng túi nilon hai lớp.
Trong 10 mẫu được cung cấp bởi Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang có 2
mẫu đã được định danh và 8 mẫu còn lại được Công ty mua trôi nổi trên thịtrường thành phố Cần Thơ:
Mẫu 6: Ganoderma lucidum VINA (VINA: Việt Nam)
Mẫu 10: Ganoderma lucidum TG (TG: Tiền Giang)
3.1.5
Qui trình chiết mẫu Qui trình cụ thể: Cân chính xác 1 g bột mẫu (đã được sấy khô đến khối
lượng không đổi) cho vào cốc đã chứa sẵn 30 mL ethanol 96%. Đặt cốc vào
bình chiết siêu âm, chiết trong vòng 30 phút, lặp lại quá trình chiết nhiều lầncho đến khi chiết kiệt mẫu (đến khi dịch chiết cuối không còn màu). Cho bay
hơi dung môi trong bể điều nhiệt ở 60– 65°C đến cắn. Dùng pipet hút chínhxác 10 mL methanol để hòa tan cắn trở lại, sau đó cho vào bình định mức 50
mL và định mức tới vạch bằng methanol. Bảo quản trong tủ lạnh, để sau này
định lượng.
Sơ đồ tổng quát của qui trình chiết triterpenoid tổng bằng phương phápchiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm:
Hình 3.3. Qui trình chiết triterpenoid tổng bằng sóng siêu âm
3.1.6 Qui trình chuẩn bị mẫu phân tích
Hút một lượng chính xác 250 L dịch chiết mẫu chuyển sang bình định
mức 10 mL, cho bay hơi hết methanol trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ từ 60– 70°C. Sau đó thêm tiếp 0,3 mL thuốc thử hiện màu vanillin – acetic acid băng5% và 1 mL HClO4 . Đem ủ trong bể điều nhiệt ở 70°C trong 25 phút, sau đó
làm lạnh trong chậu nước đá khoảng 2 phút. Cuối cùng định mức tới vạch bằng acetic acid băng, đem đi đo ở bước sóng đã khảo sát.
Sơ đồ tổng quát:
Hình 3.4. Qui trình định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi
Mẫu chuẩn và mẫu trắng chuẩn bị tương tự như hình 3.4 nhưng không cómẫu thử thay vào đó là chất chuẩn (đối với mẫu chuẩn).
Thẩm định các phương pháp phân tích. Tiến hành các thí nghiệm sau:
Thí nghiệm về xác định khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn
Thí nghiệm về xác định độ đúng
Thí nghiệm về xác định độ lặp lại
Thí nghiệm về xác định giới hạn phát hiện
Thí nghiệm về xác định giới hạn định lượng
Áp dụng phương pháp đã đề ra đưa vào phân tích triterpenoid tổng trong
10 mẫu nấm Linh chi ở phòng thí nghiệm.
3.2 Kết quả thực nghiệm
Khảo sát bước sóng hấp thụ của dung dịch chuẩn Oleanolic acid.
Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn như đã xây dựng ở mục 3.1.6. Tiến hànhquét phổ mẫu chuẩn với bước sóng từ 190– 1100 nm trên máy UV – Vis 6800
JENWAY. Kết quả được trình bày như sau:
Hình 3.5. Đồ thị khảo sát bước sóng hấp thụ của dung dịch chuẩn OA
Từ kết quả khảo sát bước sóng hấp thụ của dung dịch chuẩn OA–đồ thịHình 3.5 –cho thấy trong khoảng bước sóng 450–650 nm độ hấp thụ của hợp
chất phức màu có sự thay đổi rõ rệt và đạt cực đại ở bước sóng 544 nm. Kếtquả này khá phù hợp theo nghiên cứu của Jie – Pang Fan va Chao – Hong He
(2006) với kết quả khảo sát bước sóng là 548 nm và Jiewen Zhao (4–2011) với bước sóng là 550 nm. Do đó, sử dụng bước sóng 544 nm đã khảo sát để địnhlượng triterpenoid tổng trong 10 mẫu nấm Linh chi.
3.2.1.1 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
a. Thí nghiệm về xác định khoảng tuyến tính
Để xác định khoảng tuyến tính ta tiến hành pha một dãy dung dịch chuẩnOleanolic acid ở các nồng độ khác nhau (tăng dần) từ dung dịch chuẩnOleanolic acid có nồng độ 100 ppm theo qui trình đã xây dựng ở mục 3.1.6.
Sau đó khảo sát sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ. Kết quả đo đượctrình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1.
Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
STT Nồng độ (ppm) Độ hấp thụ
1 1 0,108
2 2 0,2113 5 0,50954 9 0,922
5 13 1,2792
6 17 1,669
7 21 2,052
8 25 2,384
9 30 2,676
10 35 2,879
11 40 3,033
12 50 3,2613 60 3,44
14 70 3,52
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ OA
Kết quả cho thấy, nồng độ từ 1–25 ppm nồng độ hoạt chất có 1 tươngquan chặt chẽ với độ hấp thu, R
2 = 0,9997. Từ đó chúng tôi tiến hành xây
dựng đường chuẩn trong khoảng nồng độ này.
b. Xây dựng đường chuẩn Dựa vào khoảng tuyến tính đã xác định, ta tiến hành xây dựng đường
chuẩn trong khoảng nồng độ từ 0 – 14 ppm. Từ dung dịch chuẩn ban đầu cónồng độ 100 ppm theo qui trình đã xây dựng ở mục 3.1.6, ta tiến hành pha dãychuẩn theo Bảng 3.2:
Bảng 3.2. Dãy dung dịch chuẩn làm việc của Oleanolic acid
Để xác định độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi chuẩn bị song song 10
dung dịch chuẩn Oleanolic acid 2 ppm theo qui trình đã xây dựng ở 3.1.6, kếtquả được trình bày trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp
Mẫu Nồng độ (ppm) 1 1,882
2 1,869
3 1,878
4 1,888
5 1,856
6 1,886
7 1,891
8 1,8759 1,863
10 1,883
X SD 1,8771 0,0114
Tính toán độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):
0,0114100 100 0, 607% 2%
1,8771
SD RSD
X
Với kết quả RSD tính toán được là 0,607% nhỏ hơn 2%, một mức lệch
phù hợp với lý thuyết đã đưa ra để thẩm định phương pháp trước khi phương pháp được áp dụng để định lượng hoạt chất.
3.2.1.4 Giới hạn phát hiện (LOD) – Giới hạn định lượng (LOQ)
Để xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp,chúng tôi tiến hành thêm dung dịch chuẩn Oleanolic acid 2 ppm vào 10 mẫuthử và tiến hành xử lý theo qui trình đã xây dựng ở mục 3.1.6. Kết quả đượ ctrình bày trong Bảng 3.6.
Theo kết quả thu được trong đồ thị hình 3.8, ta có thể thấy hàm lượngtriterpenoid trong 10 mẫu nấm Linh chi không chênh lệch nhau quá nhiều,trong đó mẫu số 2 (M2) có hàm lượng triterpenoid cao nhất (12361 mg/kg )
chiếm 1,236% trong số các thành phần có trong nấm Linh chi, 2 mẫu chứa
hàm lượng triterpenoid thấp nhất là mẫu số 3 (M3)và số 4 (M4) (lần lượt,7698 mg/kg và 6649 mg/kg) chiếm 0,7698% và 0,6649% trong nấm Linh chi.
Trong 2 mẫu đã được định danh bởi Công ty cổ phần Dược Hậu Giangthì mẫu số 6 (M6) chứa hàm lượng triterpenoid tổng 10505 mg/kg và mẫu số10 (M10) có hàm lượng triterpenoid tổng trong mẫu 8588 mg/kg. nằm trongkhoảng dao động trung bình của các mẫu.
Do không có tiêu chuẩn nào đưa ra qui định về hàm lượng triterpenoidtổng có trong nấm Linh chi cụ thể là bao nhiêu, nên đề tài chỉ giới hạn trongviệc định lượng triterpenoid tổng có trong mẫu rồi so sánh hàm lượngtriterpenoid giữa các mẫu với nhau, có thể trong quá trình làm có thể khôngchính xác tuyệt đối 100% nhưng cũng có thể dựa vào đây để đánh giá đượcchất lượng của các mẫu nấm Linh chi đem đi phân tích, so sánh và lựa chọn
Sau khoảng thời gian thực hiện luận văn, chúng tôi đã được một số kết
quả như sau:
Kết quả thẩm định phương pháp đã xây dựng:
Độ tuyến tính của phương pháp R = 0,9999
Độ đúng của phương pháp đạt 99,36%
Độ lặp lại của phương pháp với RSD = 0,607% < 2%
Giới hạn phát hiện của phương pháp LOD = 0,273 ppm
Giới hạn định lượng của phương pháp LOQ = 0,91 ppm.
Áp dụng phương pháp phân tích đã xây dựng để xác định hàm lượngtriterpenoid trong nấm Linh chi. Kết quả đạt được như sau: hàm lượngtriterpenoid trong mẫu 2 là cao nhất 12361 mg/kg chiếm 1,2361% trong số cácthành phần có trong nấm Linh chi, ở mẫu số 4 hàm lượng triterpenoid là thấpnhất 6649 mg/kg chiếm 0,6649%.
4.2 Kiến nghị
Tiến hành định danh toàn bộ 10 mẫu nấm Linh chi trước khi đem đi phântích thành phần các hoạt chất.
Qua các kết quả nghiên cứu về thành phần hoạt chất có trong các mẫu
nấm Linh chi, xác định được mẫu nào có chứa hàm lượng hoạt chất có tácdụng dược học quý báu nhiều nhất sẽ được lựa chọn để phục vụ cho mục đích
nuôi trồng ở qui mô công nghiệp ở nước ta.
Áp dụng phương pháp này như là một tiêu chuẩn cho các nghiên cứu tiếp
1. Nguyễn Như Quỳnh, 2006. Tìm hiểu về một loại nấm Linh chi thu hái tạiThủ Đức – Tp. Hồ Chí Minh. Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Nông
lâm Tp. Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Vũ Duy Khanh, 2013. Đề tài Xây dựng quy trình sản xuất sinhkhối sợi nấm Ganoderma lucidum. Luận văn tốt nghiệp, trường cao đẳngKinh tế - Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh.
3. Mr. Leow Soon Seng. Mushroom of Immortality – Ganoderma lucidum.
4. GS. TS. Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà
xuất bản Y học.
5. Trương Thị Đẹp, Liêu Hồ Mỹ Trang, Nguyễn Thị Thu Ngân, Nguyễn ThịThu Hằng, nghiên cứu Y học Phân biệt đặc điểm hình thái – cấu trúc của
một số nhóm nấm “Nấm Linh chi” trên thị trường thành phố Hồ Chí Minh,
Y học thành phố Hồ Chí Minh – tập 15 – phụ bản số 1 – 2011.
6. http://www.namlinhchihanoi.com.
7. Lê Công Doanh, 2011. Kỹ thuật bảo quản và chế biến nấm Linh chi . Luận
văn tốt nghiệp trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ thành phố Hồ ChíMinh.
8. Medline, 1993; Kino và CTV 1989.
9. Shufeng Zhou. A clinical Study of a Ganoderma luidum extract in patients
with type II diabetes mellitus. Division of Pharmacology and Clinical
Pharmacology , Faculty of Medicine and Health Science, Auckland
University, Auckland, New Zealand.
10. Công Diễn, 2005. Nấm Linh chi phòng và trị bệnh. Nhà xuất bản Mũi CàMau.
11. DS. Trần Xuân Thuyết. Bài viết: Thực hư về nấm Linh chi.(www_vietlinh_com_vn nong nghiep & nong thon -agriculture & rural rau
an toan, rau sach - safe vegestable). Tạp chí Sức khoẻ và đời sống (số 224,225).
12. Magazine Khoa học Công nghệ Việt Nam (số ngày 20/09/2013). Bài viết: