Buku Praktikum Histo

8/17/2019 Buku Praktikum Histo

http://slidepdf.com/reader/full/buku-praktikum-histo 1/112

ASAM AMINO

Terdapat lebih kurang 20 macam asam L- α amino yang menyusun

protein.L- α amino dibagi menjadi 7 golongan berdasar struktur rantaisamping (R)1. Alifatik : glisin, alanin, valin, leusin,

isoleusin.2.

Gugus OH : serin, treonin .3. Asam sulfur : sistein , metionin.Gugus COOH atau C = O : aspartat, asparagin, glutamat,

NH2 Glutamin.5. Gugus NH2 : arginin, lisin , hidroksilisin.6. Cincin aromatik : histidin, fenilalanin, tirosin,

triptofan.7. Asam amino : prolin, 4-hidroksiprolin.

Asam amino yang tidak terdapat dalam molekul protein tetapi penting :a. β alanin d. ornitin, sitrulin.

b. taurin e. tirosinc. γ-amino butirat f. D-alanin , D-glutamat

Sifat-sifat asam amino1. Kristal putih larut dalam air (kecuali sistein dan tirosin), asam kuatdan basa kuat

2.

(NH4)2 SO4 dan NaCl tidak mengendap.3. Rasa : - Manis : glisin, serin, alanin , prolin .

- Tawar : triptofan, leusin.- Pahit : arginin .

4.

Atom C asimetris (kecuali glisin) menimbulkan keaktifan optis :- + ( d )- - ( l )

5. Amfoter : COO- , NH3 + .

6. Membentuk garam dengan alkali atau asam.7.

Pada pH tubuh (7,4) membentuk “ZWITTER ION “8. Pada pH= pI, muatan + sama dengan muatan - sehingga diam

pada medan listrik

1



Reaksi kimiaReaksi kimia asam amino membentuk senyawa berwarna yang dapatdigunakan untuk identifikasi asam amino secara kualitatif maupunkuantitatif. Hal ini dapat terjadi oleh karena adanya :- Gugus atau rantai samping (R) yang menimbulkan reaksi khusus.

- Gugus NH 2 dan COOH, positif untuk semua asam amino.Contoh : Reaksi Ninhidrin

Ninhidrin + asam amino(triketohidrinden hidrat)

OOH

CC

COH

O

H O+ R – C – C

NH2 OH

1. H H

R – C = N – COOHO

NH3 + R – C

COOH

OR – C + CO2

HGasometris

2. H2O

3. Hidridantin + NinhidrinO O

C OH H H HO CC + N + C

C H HO CH

O O

2



-3 H2OO

OC

C N = CC C

C HO

O

Senyawa berwarna merah

+ NH3

O – NH4 O

C CC – N = C

C C

O O

SENYAWA BERWARNA BIRU

KESIMPULAN- Semua asam amino bereaksi dengan Ninhidrin dan hasilnya :

CO2 NH3 Aldehid yang lebih kecil 1 atom C

Terbentuk kompleks berwarna biru (prolin dan hidroksiprolinmembentuk warna kuning). Intensitas warna biru digunakan untukdasar pemeriksaan kuantitatif.

- Amina bereaksi dengan Ninhidrin membentuk kompleks biru, tidakmenghasilkan CO2.

- NH3

dan pepetida juga bereaksi dengan Ninhidrin walau lambat.

3



PEPTIDA

O OR 1 – C – C R 2 - C - C

NH2 OH NH2 OH

H2O

OR 1- C – C

R 2 N - C O

Ikatan peptida COH

2 asam amino : dipeptida3 asam amino : tripeptida4 asam amino : tetrapetida8 asam amino : octapeptida10 asam amino : decapeptida

Lebih kecil sama dengan 100 asam amino : polipeptidaLebih besar 100 asam amino : protein.

NOMENKLATUR PEPTIDA- Nama dimulai dengan residu asam amino dengan gugus NH2

bebas.- Semua residu asam amino diberi akhiran IL, kecuali yang terakhir.

Contoh :

O

CH2 –C

CH2

C-NH2

HCOOH

OH H

N – C - C

CH2

SH

H

N – CH2-COOH

Glutation : glutamil –sisteinil- glisin

4



- Gramisidin S : 10 asam amino- Tirosidin : 110 asam amino

REAKSI BIURETReaksi terhadap ikatan peptidaBiuret : zat yang terbentuk pada pemanasan urea sampai ± 180O C

++ NH3

+

NH2

C = O

NH

C = O

NH2

NH2

C = O

NH2

NH2

C = O

NH2

2 molekul urea

dengan larutan CuSO4 alkalis, biuretmemberi warna lembayung.

- Larutan CuSO4 disebut pereaksi biuret.- Reaksi dengan pereaksi biuret disebut test / reaksi Biuret.- Semua zat dengan 2 atau lebih ikatan peptida memberi reaksi +

CSNH2, CNHNH2 dan CRHNH2 memberi reaksi sama.- Dipeptida dan asam amino (kecuali histidin, serin dan treonin)

tidak memberi reaksi +.- Merupakan reaksi umum protein.

Analisa larutan asam amino :1. Kolorimetri2. Kromatrografi : - kertas saring

- thin layer kromatografi- ion exchange kromatografi

3. Biologis

5



Asam amino dalam tubuh :1.

esensiil2. non esensiil

Komposisi kimia protein

C : 50 – 55 %H : 6 – 7,3 %O : 19 –24 %

N : 13 – 19 % ( = 16 % untuk penetapan kadar protein dalam zatmakanan/ cairan biologis).

Unsur lain : S, P, Fe, Mn , I, Cu, Zn dsb).

PROTEIN

- Zat organik yang tersusun dari asam amino- Zat organik yang merupakan makromolekul- Asam amino – asam amino terikat pada ikatan peptida disebut

polipeptidaO

- C N

α Asam amino : R – C - C - C = O

NH2 OHBasa

Dalam protein : L -α - amino

Protein : asam amino-asam amino –asam amino

H O H O H

- N - C - C - N - C - C - N - C -

R1 R2 R3

3 asam amino membentuk tripeptida, mempunyai 2 ikatan peptida.

Protein mempunyai struktur :- primer- sekunder 1 rantai polipeptida- tertier- kwartener mempunyai > dari satu rantai

polipetida

6



Kadar protein = kadar N x 6,25Misal : 10 N Protein : 10 x 6,25 = 62,5 gram

100 gram protein = 100/ 6,25 N= 16

Protein bersifat amfoter : - asam

ZWITTER ION- basa lemah

R - C - COOH

NH 2

Dalam larutan: R - C - COO-

NH3 Pada pH = pI : Muatan + dan - sama banyak ( netral )

mudahMengendap

pH < pI pH > PIHCl NaOH

R - C - COOH PI R - C - COO Na|

NHCl NH ClMuatan + muatan -

Larut mengendap larut

PADA ELEKTROFORESA- pH > p I : protein bermuatan –

bergerak ke anoda ( +)- pH < p I : protein bermuatan +

bergerak ke katoda (-)- pH = p I : muatan + = muatan –

tidak bergerak

KESIMPULAN- Protein pada pH = pI :1. Protein : muatan + = muatan – (tidak bermuatan)2.

Mudah mengendap.3. Pada elektroforesa tidak bergerak

- Dalam darah : pH = 7,4 pH albumin = 4,7 (pI)

Albumin dalam darah bermuatan -.- Test umum protein : TEST BIURET .

7



Protein membentuk larutan koloid ELMUSOID(KOLOID HIDROFILIK).

Kelarutannya dipertahankan oleh : muatan dan mantel air

- Larutan koloid : larutan yang mempunyai fase dispersi antara 1

mµ - 200 mµ - Larutan biasa : < 1 mµ - Larutan suspensi : > 200 mµ

KLASIFIKASI PROTEIN- Rumus bangun ; sukar- Daya larut dan komposisi kimia

1.

SIMPLE PROTEINa. albumin e. albuminoid ( skleroprotein)

b. globulin f. histonc. glutelin g. protamind.

prolamin2.

CONJUGATED PROTEINa. nukleoprotein d. kromoprotein

b. glikoprotein e. lipoproteinc. fosfoprotein

SIFAT -SIFAT UMUM PROTEIN1. MakromolekulDalam larutan membentuk koloid liofil (emulsoid).Koloid adalah larutan yang mempunyai fasa dispersi 1 - 200 mµ .

Besar partikel : antara partikel larutan biasa dan partikel suspesnsi

SIFAT -SIFAT LARUTAN KOLOID

- Tidak menembus membran semipermiabel. Dapat dipisahkan darilarutan biasa dengan cara dialisa.

- Tidak mudah mengendap- Diendapkan dengan cara khusus (ultarasentrifugasi).

KOLOID LIOFIL (EMULSOID)

- Mempunyai daya tarik yang kuat terhadap media dispersinya, tiap partikel koloiddilindungi oleh media dispersi tersebut.

- Tiap partikel mempunyai muatan listrik yang berlawanan denganmuatan dispersinya.

- Stabil, partikel-partikel dengan muatan sama saling tolak –menolak

8



Stabilitas koloid liofil oleh 2 faktor :- lapisan media dispersi : > tidak mudah diendapkan oleh elektrolit- muatan listrik :

Bila jumlah elektrolit di + cukup banyak, koloid liofil mengendap.

Elektroloit menghilangkan lapisan media dispersinyaSALTING OUT.Juga pada penambahan alkohol / aseton pada larutan protein.

dehidrasi

hidrasi

emulsoid suspensoid

(koloid liofil) (koloid liofob)

dinetralkan olehsuatu elektrolit

dehidrasi

elmusoid tidak endapan koloid bermuatan

2. Hidrolisa proteinMenjadi asam L α aminoCaranya : - Dengan asam HCl 6 N / H2SO4 8 N disertai

pemanasansehingga asam amino banyak yang rusak.

- Dengan basa : asam amino banyak yang rusak.

- Enzim proteolitik :- asam amino tidak rusak- lambat dan kurang lengkap- mudah terkontaminasi oleh kuman, oleh karena

suhunya 250 C - 400 C

9



Protein mengandung gugus asam dan basa

ZWITTER ION punya pI

3.

Molekul protein menurut bentuk : - globuler- fibrous

Struktur protein : primer, sekunder, tertier, kwartenerDenaturasi protein: - Definisi

- Disebabkan oleh- Akibat yang terjadi

PERCOBAAN TERHADAP PROTEIN

REAKSI BIURET:

Merupakan test umum untuk protein /ikatan peptida. Reaksi biuret terjadi karena adanya molekul-molekul yang mengandung 2 ataulebih gugus karbamil (-CONH2 ) yang berikatan langsung ataumelalui atom nitrogen (N) atau karbon (C).

Test ini juga positip untuk gugus-gugus -CSNH2, -C(NH)NH2 atau - CH2 NH2

Protein akan memberikan hasil positip sebab mengandunggugus -CONH.

Menurut Schiff reaksi akhir dari test Biuret tergantung pada pembentukan kompleks tembaga-kalium-biuret.

OH NH2

O=C. NH2 -- Cu – NH2 . C = O C = O

NH NH NH

O= C. NH2 K K – NH2.C = O C = O

OH OH NH2

Kompleks tembaga –kalium-Biuret Biuret

10



Adanya magnesium sulfat yang cukup banyak mengganggu testini, sebab terbentuk endapan magnesium hidroksida. Jika terdapatamonium sulfat cukup banyak, maka harus ditambahkan alkali

berlebih.

Cara :a.

Tambahkan setetes larutan CuSO4 pada campuran 2 mllarutan protein yang akan diperiksa. Kocok baik-baik sampaitimbul warna lembayung atau merah jambu. Jika belumtimbul warna,tambahkan lagi setetes CuSO4 (maksimum 10tetes )

b. Masukkan sedikit bubuk urea kedalam tabung reaksi.Panaskan dengan api kecil sampai urea mencair dan timbulgelembung-gelembung gas. Perhatikan bau gas tadi !Larutkan isi tabung

dengan air dan kerjakan test Biuret seperti pada a !

REAKSI MILLON

Reaksi ini positif untuk protein yang mempunyai gugus hidroksifenil (-C6H4OH) dan senyawa-senyawa fenolik seperti tirosin dan timol . Testini kurang positif dengan adanya garam-garam anorganik dalam

jumlah besar, sebab merkuri dari Millon akan diendapkan . Jikalarutan yang diperiksa bersifat alkalis, harus dinetralkan untukmenghindarkan terbentuknya endapan kuning atau hitam dari merkurioksida. Oleh sebab itu test ini tak berguna untuk pemeriksaan urine.

Dasar reaksi :

Tyrosin (monofenol) mengalami nitrasi dan hasilnya akan bereaksi dengan ion Hg+ / Hg++ yang akan menghasilkan garam berwarna merah.

Cara :Campurkan 2 ml albumin dengan beberapa test larutan

Millon. Terbentuk endapan putih . Panaskan dengan hati-hati.Test positif jika timbul warna merah. Lakukan hal yang sama

pada :- larutan gelatin- larutan kasein- larutan fenol 2 %

11



Hasil : Albumin :Gelatin :Larutan fenol :

Kesimpulan :

REAKSI XANTHOPROTEIN

Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung gugus fenil ( -C6H5), yang dengan asam nitrat akan membentuk senyawa nitro.Asam-asam amino yang memberikan reaksi positif dalam hal iniadalah tirosin, triptofan dan fenil alanin.

Dasar :

Nitrasi inti benzen yang terdapat pada molekul protein yangmenghasilkan senyawa berwarna kuning.

Cara :Tambahkan 1 ml HNO3 pekat pada 2 ml larutan albumin 2 %.Terbentuk endapan putih. Panaskan perlahan-l0ahan, endapanlarut lagi dan larutan menjadi kuning. Dinginkan dibawahkran. Tambahkan tetes demi tetes larutan NaOH pekat atau

NH4OH pekat . Amati perubahan warnanya !Lakukan percobaan yang sama untuk :

- larutan gelatin- larutan kasein- larutan fenol 2 %

Hasil :Albumin : +Casein : +Gelatin : hampir -, oleh karena yang terbanyak aa glisinPepton : +Phenol : merah coklat

Catatan : bila ditambahkan basa kuat ------------ maka protein menjadiorange (suasana alkali).

12



TEST HOPKINS COLE

Test ini khusus untuk triptofan.Pereaksi yang dipakai mengandung asam gliooxilat (CHO.COOH).Test ini tidak berhasil bila terdapat oksidator kuat seperti nitrat,

chlorat. Asam sulfat yang digunakan harus sangat murni yang tidakmengandung bahan-bahan yang dapat bertindak sebagai oksidator.

Dasar reaksi :Triptofan diduga berkondensasi dengan asam glioksilat dandengan asam pekat membentuk kompleks berwarna ungu(cincin ungu dari jenis asam 2.3.4.5 tetrahidro karbolin – 4karboksilat.)Bila ada oksidator , maka glioksilat menjadi oksalat.

H H H

COOH NH

H R

Asam 2.3.4.5 tetra hidro β karbolin –4 karboksilat

Cara :Tambahkan 2 ml larutan Hopkins Cole pada 2 ml larutanalbumin 2 %. Teteskan dengan hati-hati H2SO4 pekat melaluidinding tabung sampai terjadi dua lapisan cairan Setelahdidiamkan sebentar akan tampak cincin ungu pada perbatasankedua lapisan bila test positif.Lakukan hal yang sama untuk : - larutan gelatin

- larutan kasein

Hasil :

Kesimpulan :

13



ZAT –ZAT YANG MENGENDAPKAN PROTEIN :

1. Asam : pada pH = pI ; protein mudah mengendap.Bila pH larutan lebih besar dari PI , maka pada

penambahan asam menyebabkan pH turun = pI makaakan terjadi pengendapan. Pada penambahan asam yangsangat berlebihan maka protein akan larut kembalikarena pH menjadi lebih kecil dari pI.

2. Basa : Bila pH larutan lebih besar dari pI, maka penambahan basa tidak menimbulkan terjadinya endapan. Bila pHlarutan lebih kecil dari pI., pada penambahan basa ---

pH = pI, protein akan mengendap tetapi bila penambahan basa berlebihan, protein akan mengendaptetaapi bila penambahan basa berlebihan , protein akan

laarut kembali.Selain itu basa dapat menyebabkan dekomposisi(protein hancur) sehingga tidak terjadi endapan.Pada penambahan asam nitrat (HNO3) berlebihan ,endapan tidak larut kembali.Ini merupakan dasar dari Test Heller, yaitu

pemeriksaan protein dalam urin .

3. Logam Berat :Logam berat : Ag, Hg ,Pb, Au , As, PtProtein dapat mengendapkan logam berat , oleh sebabitu dapat dipakai sebagai antidotum. Tetapi hal inihanya berguna bila racun (logam berat) masih dalamlambung (kurang dari 2 jam ). Pasien diberi Emetik /rangsangan yang menyebabkan refleks muntah.Ikatan logam berat dengan protein tidak cukup kuat,sehingga bila terhidrolisa di ususHalus dapat pecah lagi dan logam berat ini diserapkembali.

4. Alkaloidal reagens (pereaksi alkaloid) :Reagens alkaloidal yaitu suatu reagens yang dipakaiuntuk memisahkan protein dari alkaloid .Alkaloid adalah zat organik yang biasanya mempunyaisifat basa / alkalis dan terdapat dalam tumbuh-tumbuhan , pada umumnya mempunyai aktivitasfarmakologik.

14



Yang termasuk reagens alkaloidal ialah ;Asam tannatAsam fosfotungstatAsam fosfomoblidatAsam sulfosalisilat

Asam pikrat jenuhAsam TrichlorasetatReagens alkaloidal mengendapkan protein pada pHdibawah pI , oleh sebab itu ditambah asam asetat.

5. Alkohol :Alkohol 90 % mengendapkan protein terutama pada pH=pI, karena alkohol hanya mengambil mantel air(protein adalah suatu koloid liofil yang menpunyaimantel air).Prinsip ini dipakai pada desinfeksi dengan alkohol :

Microorganisme merupakan suatu protein.Dengan alkohol mengendap. Desinfeksi dengan alkoholini memakan waktu sebab alkohol memerlukan waktuuntuk menembus dinding sel , plasma sel. Alkoholmembunuh kuman seluruhnya dalam 24 jam.Yang efektif sebagai desinfektant adalah alkohol 70 % ,karena alkohol yang lebih pekat dari 70 % akan meng-gumpalkan dinding sel terlalu cepat & padat sehinggaalkohol tidak dapat masuk sampai

plasma sel bakteri mati

Daya difusi protein

Difusi terjadi bila besar molekul lebih kecil dari diameter pori-porimembran. Albumin dan gelatin mempunyai molekul lebih besar daridiameter pori-pori sehingga tidak berdifusi .Dialisat dengan Biuret negatif.Pepton karena meolkulnya kecil dapat berdifusi .Dialisat dengan Biuret positif.

Daya difusi protein

Lakukan test daya difusi terhadap larutan albumin dan pepton.Ambil 2 buah tabung koloidon. Kedalam kantong yang lain larutan

pepton Gantung tiap-tiap kantong dalam gelas kimia yang berisi air 2% . Gantung tiap-tiap kantong dalam gelas kimia yang berisi air.Setelah didiamkan selama lebih dari 30 menit, periksalah apakah telahterjadi difusi . Periksalah dialisat (air didalam gelas kimia ) dengan test

biuret.

15



Dasar : difusi terjadi bila molekul zat yang didalam kantong selofanlebih kecil dari diameter pori-pori membran.

Cara : Ambil 2 ml dari dialisat albumun dan pepton kedalam 2 buah

tabung reaksi dan tambahkan 2 ml Biuret kedalam masing-masing tabung.

Hasil : Albumin :

Pepton :

Kesimpulan :

Titik koagulasi dan denaturasi :

Titik koagulasi adalah temperatur terendah dimana proteinmulai mengalami koagulasi. Titik koagulasi albumin : 68 o C.Protein paling mudah /cepat terkoagulasi pada pH = pI.Koagulasi adalah perubahan intramolekuler dari protein yang biasanyadisebabkan oleh pemanasan. Protein yang mengalami koagulasimempunyai sifat-sifat fisik yang berbeda dengan protein yang belumterkoagulasi dalam sifat kelarutannya dengan asam . basa encer.

Protein yang terkoagulasi tidak larut dalam asam dan basaencer.

Dalam praktek sering terjadi protein seakan-akan larut dalam basaencer yang sebenarnya telah terjadi dekomposisi. Pada pH dibawah pI

bila protein dipanaskan akan mengalami denaturasi dan akan melanjutmenjadi flokulasi pada pH = pI.

Denaturasi dapat terjadi dengan :- pemanasan di luar pI

-

penyinaran/ radiasi- pengocokkan / fibrasi- pemberian : asam , basa, garam , logam berat.

Flokulum adalah gumpalan protein yang terjadi bila protein yangmengalami flokulasi.Flokulum : larut dalam asam dan basa encerKoagulum : tidak larut dalam asam dan basa encerPerubahan yang terjadi pada denaturasi : - ikatan S-S

- ikatan hidrogen- bentuk molekul

16



Percobaan denaturasi, flokulasi dan koagulasi dari albumin telur

a. Sediakanlah 3 tabung reaksi, masing-masing berisi 9 ml larutan jernih albumin telur yang bebas

garam.Tabung 1 tambahkan 1 ml larutan HCl 0,1 N.Tabung 2 tambahkan 1 ml larutan Na-asetat dan asam asetat(pH = 4,7).Tabung 3 tambahkan 1 ml larutan NaOH 0,1 N

b.

Panaskan ketiga tabung tersebut dalam penangas air mendidihselama 15 menit , sambil diamati dalam tabung mana mulaiada penggumpalan (koagulasi) . Perhatikan dan catat suhu

permulaan terjadi koagulasi . Suhu ini disebut titik koagulasi .Setelah 15 menit angkat ketiga tabung dan dinginkan.

c. Pada tabung 1 dan 3 tambahkan 10 ml larutan buffer asetat pH4,7 . Apa yang terjadi ?Bila ada endapan , saring dan cuci endapan pada kertas saringdengan air. Endapan ini disebut flokulum.

d. Presipitat dari tulang tabung-tabung 1 dan 3 yaitu albumin teluryang terdenaturasi. Prespitat dai tabung 2 yaitu albumin teluryang mengalami koagulasi.

e. Suspensikan setiap presipitat kedalam 10 ml air dan setiapsuspensi dibagi menjadi 3 bagian.Bagian 1 tambahkan HCl encer tetes demi tetes. Apakahendapannya larut ? Bagian II tambahkan NaOH encer tetesdemi tetes.Larutkan endapannya . Panaskan bagian III dari suspensi

presipitat tabung 1 dan 3 dalam penangas air mendidih selama15 menit. Dinginkan dan lakukan test kelarutan dalam asamdan alkali encer. Apakah endapannya larut ?Kesimpulan apakah yang dapat ditarik dari percobaan diatasmengenai titik isoeletrik , pengaruh pemanasan protein pada

titik isoeletrik, diatasnya dan dibawahnya. Pengertiandenaturasi, flokulasi, koagulasi dan titik koagulasi.

17



A B CAlbumin + HCl 0,1 Albumin + buffer Albumin + NaOH

0,1 N

……………….? ………………..? …………………..?+ buffer + buffer

saring saring saring

suspensi suspensi suspensi

Kesimpulan :Titik isolelektrik ialah :

Pengaruh pemanasan pada titik isoelektrik :

Pengaruh pemanasan diatas titik isoelektrik :

Pengaruh pemanasan dibawah titik isoelektrik :

Denaturasi :

Flokulasi :

18



Koagulasi :

Titik koagulasi :

Perlukah air pada koagulasi dengan pemanasan ?

Masukkan sedikit bubuk albumin kedalam 2 tabung reaksi. Tambahkan5 ml air pada salah satu tabung . Letakkan kedua tabung tersebut pada

penangas air mendidih sambil sering dikocok. Dinginkan keduatabung.Tambahkan 5 ml air pada tabung yang berisi albumin kering,

kemudian kocok kedua tabung . Saring masing-masing tabung , lalulakukan test untuk protein pada filtrat. Pemanasan harus berlangsunglama, supaya albumin mengalami koagulasi.

Cara :Tabung A : bubuk albumin + air panaskan dalam penangas

air, sambil sering dikocokTabung B : bubuk albumin Dinginkan

Tabung A saring , pada filtrat masing-masingTabung B 2 ml air , kocok , lakukan test Biuret.

Hasil :Tabung A :Tabung B :

Kesimpulan :

“Salting out “ protein

Campurkan bagian putih telur mentah dengan 4 bagian NaCl 1 % , lalusaring . Gunakan filtratnya.Pada sebagian filtratnya tambahkan larutan ammonium sulfat jenuhdalam jumlah yang sama , apakah terbentuk endapan ? Encerkansebagian campuran ini dengan air sedikit. Apakah endapannyareversibel ( larut kembali ) ?

19



Saringlah sisanya dan kerjakan :

a. test Millon untuk presipitat b. test Biuret untuk filtrat. Untuk test ini tambahkan sedikit NaOH

padat untuk menguraikan (NH4)2 SO4 yang berlebih yang dapat

menghalangi pembentukan Biuret

Dasar reaksi : mengendapkan protein dengan larutan garam. Untukmemisahkan fraksi-fraksi protein (secara Cohn).

Cara: lihat skemaHasil : Endapan reversibel :

Endapan globulin + Millon :Presipitat + Millon :Filtrat + Biuret :

Kesimpulan :

Pada serum : (NH4)2 SO4 : ½ jenuh mengendapkan globulin jenuh mengendapkan albumin.

Pada plasma : (NH4)2 SO4 : ¼ jenuh mengendap kan fibrinogen½ jenuh mengendapkan globulin

jenuh mengendapkan albumin

Jika plasma ditambahkan ammonium sulfat padat sampai jenuh.Yang mengendap ialah : fibrinogen

globulinalbumin

20



21



Pengaruh alkohol pada proteinA. Campurkan 5 ml alkohol 95 % dengan 1 ml larutan albumin 2 %

Amati! Jika timbul endapan , apakah endapannya larut dalam air ?Ulangi percobaan ini terhadap : - larutan gelatin 2 %

- larutan pepton 2 %

B. Sediakan 4 tabung reaksi kosong dan bersih.

No. tabung reaksi I II III IVLarutan putih telur ( 1 : 4 ) 5 ml 5 ml 5 ml 5 mlHCL 0,1 N 1 ml - - -

NaOH 0,1 N - 1 ml - -Buffer asetat pH 4,7 - - 1 ml -H2O - - - 1 mlEtanol 95 % 6 ml 6 ml 6 ml 6 ml

Amati apa yang terjadi pada masing-masing tabung !

Dasar: Alkohol mengendapkan protein dengan menarik mantel airnyaCara : Lihat halaman sebelumnya

Hasil: Tabung I : pH ………….

Tabung II : pH …………Tabung III : pH …………Tabung IV : pH …………

Kesimpulan :

22



LIPID

Definisi:Segolongan senyawa organik yang terdapat di alam dan mempunyai

sifat-sifat:1.

Tidak larut dalam air, larut dalam pelarut lemak: eter, kloroform,alkohol panas, dan benzene

2. Berhubungan erat dengan asam lemak3. Dapat digunakan oleh organisme hidup

Klasifikasi:1. Simple lipid: ester asam-asam lemak, macam-macam alkohol

- lemak netral dan minyak- waxs

2.

Compound lipid: - fosfolipid: * asam lemak* gliserol / alkohol lain* asam fosfat

contoh: - fosfatidil gliserol (asamfosfatidat)

- fosfatidil kolin- fosfatidil etanolamin- fosfatidil inositol- fosfatidil serin

- glikolipid

3. Derived lipid: bila dihidrolisa menghasilkan simple dan compoundlipid

• Asam lemak : - rantai C jenuh- rantai ada ikatan rangkap

•

Alkohol (BM tinggi ): - alifatik- sterol- ada cincin karoten: vit A

• Hidrokarbon: - alifatik- karotenoid- skualene

contoh: Vit D ; vit E ; vit K

23



Sifat-sifat umum lemak

-

Bila murni tidak mempunyai rasa, tidak berbau, dantidak bewarna

- Bentuk-bentuk kristal lemak tergantung asalnya- Masing-masing punya titik lebur tergantung asalnya

-

Asam lemak tidak jenuh mudah dioksidasi menjadizat yang berbau tengik (rancid). Untukmencegahnya ditambahkan anti oksidan(hidrokuinon).Asam lemak tidak jenuh dapat menghilangkanwarna yodium karena adisi yodium pada ikatanrangkap sehingga bisa dipakai untuk menentukan

banyaknya ikatan rangkap di dalam sejumlahtertentu lemak .

Angka yodium: jumlah gram yodium yang dapat

diadisi oleh 100 gram lemak.

I I

- C = C - + I2 C - C

CholesterolInti: siklo pentano perhidrofenantren atau sterol

OH

Yang intinya serupa adalah vitamin D dan asam empedu.Kristalnya mirip ubin pecah

Asam lemak tidak jenuh

Sifat: - Mudah mengalami oksidasi menjadi tengik (rancid). Asamlemak yang tengik tidak dapat dicerna usus dan merupakanracun. Untuk mencegah rancidity diberikan antioksidan

- Dapat menghilangkan warna iodium oleh daya adisi iodium pada ikatan rangkap

Angka Iodium (Iodium number)Gram iodium yang dapat diadisi dengan 100 gram lemak

24



Bilangan penyabunanJumlah mg KOH yang dibutuhkan untuk menyabunkan 1 gramlemak

Acid number

Jumlah mg KOH yang dibutuhkan untuk menetralkan asamlemak bebas

Polenske numberJumlah ml KOH 0,1 N yang dibutuhkan untuk menetralkanasam lemak yang dapat larut yang terdapat dalam 5 gram lemak

Reichert-Meissl numberMenentukan asam lemak yang dapat larut (sesuai Polenskenumber)

Acetyl numberJumlah mg KOH yang dibutuhkan untuk menetralkan gugusacetyl pada penyabunan 1 gram lemak setelah menjalaniasetilasi.

Test Kholesterol

a. Kristal kholesterol Setetes larutan kholesterol padat dalam alkohol panas ditaruh pada kaca obyek

dan didiamkan sampai alkoholnya menguap.Amati bentuk kristalnya dengan mikroskop !

b. Test Liebermann-BurchardAlat-alat yang dipakai harus kering !

Dasar : reaksi warna

Cara : Campurkan 10 tetes asam asetat anhidrida dengan 2 mlkholesterol 0,05 % dalam kholoroform. Kemudiantambahkan dengan hati-hati 2 - 3 tetes asam sulfat

pekat.

Campuran dikocok perlahan-lahan dan amati warna yang terbentuk .Akan terjadi perubahan warna dari merah-biru-hijau dan perhatikan waktu perubahannya .

Hasil :

Kesimpulan :

25



c. Test SalkowskiAlat-alat yang dipakai harus kering benar.

Dasar : reaksi warna

Cara : Campurkan secara hati-hati 1 ml kholesterol 0,05 %dalam kholoform dengan 1 ml asam sulfat pekat.Dalam lapisan kholoroform akan tampak perubahan warna berturut-turut dari merah-biru – ungu , sehingga fluoresensi kuning akantampak pada lapisan asam.

Tabung jangan dikocok !

Hasil :

Kesimpulan :

Test Absorbsi iodium

Dasar : Adisi iodium pada ikatan rangkap asam lemak tidak jenuh

Cara : Larutkan 15 tetes minyak kelapa dalam 2,5 khloroform.Tambahkan larutan Iodium Hubl tetes demi tetes pada saatitu, sambil dikocok . Warna akan hilang jika terdapat asam-asam lemak tidak jenuh. Hitung Banyaknya tetesan iodiumsampai warna tidak hilang setelah dikocok 1 menit. Lakukantest yang sama terhadap minyak jagung, minyak kacang danminyak wijen.Bagaimana hasilnya?Minyak yang mana mempunyai ikatan rangkap terbanyak ?

Hasil :

Kesimpulan:

26



PERCOBAAN TERHADAP KARBOHIDRAT

TEST MOLISCH :

Test ini merupakan test umum untuk karbohidrat. Karbohidrat dalam

bentuk bebas atau terikat memberi hasil positip.Dasarnya: Karbohidrat dengan asam pekat membentuk furfural. Ini

adalah akibat dehidrasi dengan asam pekat. Furfural inikemudian dengan alfa naftol membentuk senyawa

berwarna ungu.Hasil negatip bearti tidak adanya karbohidrat.

Cara : 3 ml larutan yang akan diperiksa dimasukkan ke dalamtabung reaksi. Kemudian tambahkan 3 tetes pereaksiMolisch (mengandung α naftol), Kocok supaya tercampur.Tambahkan dengan hati-hati (tabung dimiringkan) 2 ml

asam sulfat pekat. Bila timbul cincin ungu di perbatasanantara kedua lapisan cairan, berarti reaksi positip.

TEST BENEDICT

Larutan Benedict terdiri dari:Cupri sulfat, Na sitrat dan Na carbonat (campuran ini bersifatalkalis)

Dasarnya: Gugus aldehid / keton bebas dari gula dapat mereduksicupri oksida dalam larutan tembaga alkalis menjadi cuprooksida yang bewarna merah (berupa endapan)

Caranya: Kedalam tabung reaksi dimasukkan 2 ½ ml larutanBenedict (ambil dengan pipet Mohr 10 ml) dan 4 teteslarutan yang akan diperiksa. Campur dan panaskan! Biladipakai api langsung maka pemanasan cukup 2 menitdihitung pada saat mulai mendidih. Bila memakai penangasair mendidih maka diperlukan waktu 5 menit. Kemudiandinginkan perlahan-lahan.

Perhatikan apakah terbentuk endapan serta warna endapantersebut. Perubahan warna larutan tanpa endapan belumdapat dianggap positip.

TEST IODIUM :

Ambil test plate. Letakkan sejumlah kecil pati dalam salah satu lekuk.Tambahkan 1 tetes larutan Iodium . Akan terlihat warna biru.Inulin (fruktosan ), selulosa dengan test Iodium tak berwarna.Glikogen dengan test Iodium memberi warna merah

27



PATI (C6H10O5)- Polisakarida tumbuh-tumbuhan.- Cadangan makanan : gandum , kacang , umbi dsb.- Dalam alam tidak larut dalam air.

- Dengan I2 memberi warna biru.- Tergantung sumber bentuk butir-butir pati secara

mikroskopis berlainan.- Ada 2 bagian :

1 . Amilosa ( 15 - 20 %)Rantai panjang tidak bercabangTerdiri dari : D- glukopiranosa ikatan 1 - 4

2. Amilopektin ( 80 –85 % )Rantai bercabang : 24 – 30 molekul D glukopiranosa yang

bersambungan dengan ikatan 1 - 4 dan 1 - 6- Berat molekul : 50.000- jutaan

asam encer- Pati amilodekstrin + dengan Iod : biru

eritrodekstrin + dengan Iod : merah

achrodekstrin

maltosa dengan Iod tidak memberiwarna biru

glukosa

GLIKOGEN

Glikogen merupakan polisaksarida yang terdapat dalam hewan, olehsebab itu disebut “ animal starch “. Molekulnya lebih kecil dari patidan merupakan struktur bercabang dengan unit rantai lurus 11-18

molekul α-D-glukopiranosa (ikatan 1-4) dan bercabang dengan ikatan1-6. Glikogen tidak mereduksi larutan Benedict dan memberi warnamerah dengan test Iodium.

Pada hidrolisa dengan asam dihasilkan glukosa sedangkan hidrolisadengan enzim amilase menghasilkan maltosa.

Glikogen bersifat larut dalam air dan akan membentuk larutan yangopalescent dalam air panas. Glikogen juga larut dalam asam encer danlarutan NaCl. Untuk mengendapkan glikogen dipakai alkohol 95%atau larutan basa encer.

28



Dalam tubuh, glikogen ditemukan terutama di hati, otot, ginjal danlain-lain. Tidak ditemukan di otak. Pada penyakit Von Gierke, terjadi

penimbunan glikogen dalam sel-sel tubulus kontortus ginjal dan selhati karena kekurangan enzim glukosa –6- fosfatase.

Pada penyakit Mc Ardle terjadi penimbunan glikogen di otot karenadefisiensi enzim miofosforilase.

Cara membuat filtrat glikogen :Kedalam sebuah kaserol masukkan 50 gr hati dan 100 ml air. Didihkandiatas api langsung . Untuk mengendapkan protein, tambahkan sedikitasam asetat encer. Aduk terus sampai volumenya tinggal separuhnya(± 20 menit). Larutan akan menjadi keruh . Saringlah selagi panas.Filtrat dibagi dua . Satu untuk percobaan A dan yang lain untuk

percobaan B.

A. 1. Uji filtrat dengan test Benedict !Dasar reaksi :

Cara : Masukkan 2 ½ ml larutan Benedict kedalam tabungreaksi dan tambahkan 4 tetes filtrat yang mengandungglikogen.Campur dan panaskan dalam penangas air mendidihselama 5 menit. Kemudian dinginkan .

Hasil :

Kesimpulan :

2. Kedalam tabung reaksi masukkan 1 ml filtrat dan tambahkan 1tetes larutan lugol . apa yang terbentuk ?Bandingkan dengan air yang diberi lugol . Agar test lebihsensitif.Tambahkan 1 tetes larutan NaCl 10 % . teteskan lebih

banyak lugol.Apa yang terjadi ? Panaskan tabung ! Perhatikan apa yang

terlihat .

Dasar reaksi:

Hasil:

Kesimpulan:

29



3. Ke dalam sebuah tabung reaksi masukkan 10 ml filtrat. Campurdengan 10 tetes HCl pekat. Didihkan selama 15 menit.Dinginkan, kemudian tambahkan 45 tetes NaOH encer untuk

menetralkannya. Uji hidrolisat dengan test Benedict ! Tuliskanhasilnya.

Dasar reaksi:

Hasil:

Kesimpulan:

B. 20 ml filtrat ditambahkan alkohol 95% sebanyak 4 X volumenya(80 ml). Glikogen sukar larut dalam alkohol. Oleh sebab itu akanmengendap. Biarkan sampai seluruh glikogen mengendap,kemudian buang larutan jernih di atasnya. Sisanya (endapannya)disaring dengan kertas saring. Keringkan bubuk glikogen yangdidapat dengan kertas saring.Lakukan test terhadap bubuk glikogen !

1. IodiumKe dalam salah satu lubang piring reaksi masukkan sedikit bubukglikogen.Kemudian tambahkan 1 – 2 tetes larutan iodium. Warna apa yangterjadi ?

Dasar:

Hasil:

Kesimpulan:

30



2. Dalam tabung reaksi lakukan test daya larut glikogen dalam:

a. air b. asam encerc. basa encer

d.

NaCl 10%

Dasar :

Hasil :

Kesimpulan :

KIMIA JARINGAN

Jaringan tubuh terdiri atas 5 macam:1. Jaringan vaskuler, yaitu darah2. Jaringan epitelial3. Jaringan penyambung / ikat non vaskuler4. Jaringan otot5. Jaringan saraf

EPITELIAL

1. KERATINKeratin adalah bagian terbesar dari epidermis kulit dan derivatepidermis lainnya, misalnya rambut, kuku, tanduk dan bulu.Sifat : - merupakan albuminoid

- sukar larut- tak dapat dicerna (tahan enzim proteolitik )- mengandung banyak asam amino S, misalnya sistin.

2. MELANIN- merupakan pigmen kulit memberi warna pada

kulit- merupakan derivat tirosin Millon (+)

31



JARINGAN PENYAMBUNG :Termasuk tulang, tulang rawan , gigi , jaringan fibrous .Pembagian :A. Jaringan fibrous putih :

Misalnya tendo Achilles yang terdiri dari : 31,6 % kolagen1,6 % elastin0,5 % tendo mukoid

(glikoprotein & musin liur)

Kolagen :- merupakan albuminoid- mudah larut- dapat dicerna oleh tripsin & pepsin- asam amino terbanyak : glisin 29 %

prolin 16 %

OH-prolin 13 %- tidak mengandung triptofan Hopkins Cole (-)- dapat diubah menjadi gelatin dengan : direbus

penambahan asam >merupakan perubahanfisik

Perbedaan : kolagen keratin- mudah larut - sukar larut- dapat dicerna - tak dapat dicerna

B.

Jaringan elastik kuning :Misalnya Ligamentum Nuchae (sapi) : 31,7 % elastin

7,2 % kolagen0,5 % mucoid

Elastin : merupakan albuminoidSifat : - tidak larut dalam air

- dapat dicerna oleh enzim pepsin dan tripsin-

bila direbus tidak menjadi gelatin- asam amino terbanyak : leusin, isoleusin , glisin,

prolin dan valin.

C. Tulang rawan :Terdiri dari bahan organik & anorganik .Organik : 1. chondro mukoid

2. chondro albuminoid3. kolagen

32



ad. 1. Chondro mukoid :

Terdiri dari protein dan mukopolisakarida.Mukopolisakarida terdiri dari :

- chondroitin sulfat A

-

chondroitin sulfat B-

chondroitin sulfat C : pada tendon & tulang rawan- chondroitin sulfat D

Chondroitin sulfat terdiri dari :- N asetil heksosamin-

Asam uronat ( D glukuronat)

ad. 2. Chondro albuminoid :merupakan elastin & keratin

chondro albuminoid keratinS << S >>

larut dalam asam lambung tidak larut dalam asamlambung

Mukopolisakarida lain diluar tulang rawan :- heparin- asam hialuronat (semen )- mucoitin sulfuric acid (liur)

1. Percobaan terhadap kolagen jaringan :Percobaan dilakukan terhadap larutan yang mengandung kolagenyang telah diisolasi sebelumnya.

1.

Lakukan test Biuret :Dasar :

Cara : Ambil 1 potong kolagen dan tambahkan 1 ml Biuret.

Hasil :

Kesimpulan :

Test Xanthoprotein :

Dasar :

33



Cara : Tambahkan 1ml HNO3 pekat pada 1 potong kolagendan tambahkan 1 ml air. Panaskan perlahan-lahan.Dinginkan dibawah kran. Tambahkan tetes demi tetes

larutan NaOH pekat atau NH4OH pekat.Amati perubahan warnanya.

Hasil :

Kesimpulan :

Test Hopkins –Cole :Dasar reaksi :

Tujuan :

Cara : Tambahkan 2 ml Hopkins –Cole pada 1 potong kolagen yangakan diperiksa . Teteskan dengan hati-hati H2SO4 pekat

melalui dinding tabung sampai terjadi dua lapisan cairan .Sesudah didiamkan sebentar akan tampak cincin ungu pada

perbatasan kedua lapisan , bila test positif.

Hasil :

Kesimpulan :

Test terhadap Belerang :Masukkan 1 potong kolagen dalam tabung reaksi. Tambahkan 5 mllarutan NaOH encer dan panaskan selama 5 menit dalam penangas air .Kemudian tambahkan 1 atau 2 tetes larutan Pb asetat dan panaskansampai mendidih . Apa yang terjadi ?

34



Hasil :

Kesimpulan :

2. Pembentukan gelatin dari kolagen :Masukkan kedalam sebuah kaserol /gelas kimia sedikit kolagenyang disediakan, kemudian tambahkan air sampai dua pertigagelas tersebut . Tambahkan larutan HCl 4 N lebih kurang 1ml.Didihkan kira-kira 1 jam sampai terbentuk cairan kental,kemudian lakukan percobaan sebagai berikut :

Test Hopkins –Cole

Dasar reaksi :

Tujuan :

Cara :

Hasil :

Kesimpulan :

Test Millon :Dasar reaksi :

Tujuan :

Cara:

Hasil :

Kesimpulan :

35



II. Percobaan terhadap mukopolisakarida dari tulang rawan :

Masukkan 10 ml aquadest kedalam sebuah beker gelas 50 ml,kemudian tambahkan 2 potong tulang rawan dan 1 ml HCl .

Panaskan diatas api langsung sampai volumenya tinggal separuh .Dinginkan larutan ini , kemudian dibagi 2 bagian . Bagian pertamaditambahkan BaCl 2 1 ml.

Hasil :

Kesimpulan :

Netralkan bagian kedua dengan larutan Na2CO3 (dengan kertas

lakmus sebagai indikator) . Lakukan test Benedict.

Dasar reaksi :

Tujuan:

Cara:

Hasil:

Kesimpulan:

III. Percobaan terhadap keratin jaringan:

Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan bubuk yang berasal

dari tanduk. Lakukan reaksi-reaksi sebagai berikut:

Test Biuret: Masukkan ke dalam tabung reaksi sedikit tanduk dantambahkan 1 ml larutan Biuret.

Hasil:

Kesimpulan:

36



Test Millon: Masukkan tanduk ke dalam tabung reaksi dan

tambahkan 1 ml aquadest. Kemudian tambahkan 4tetes larutan Millon dan panaskan.

Hasil:

Kesimpulan:

Test Xanthoprotein :Cara :

Hasil :

Kesimpulan :

Test Hopkins Cole :Cara :

Hasil :

Kesimpulan :

Test terhadap belerang :- Masukkan sedikit tanduk kedalam tabung reaksi yang berisi 1 ml

air .Tambahkan 5 ml larutan NaOH encer dan panaskan selama 5menit . Kemudian tambahkan 3 tetes larutan Pb asetat dan

panaskan sampai mendidih.

Hasil :

Kesimpulan :

- Bakarlah sedikit bubuk tanduk didalam cawan penguapan (apilangsung).Perhatikan bau khas belerang yang timbul.Hal yang sama saudara lakukan terhadap potongan kukusaudara sendiri!

37



Kesimpulan :

V I T A M I N

Vitamin A

Dasar : Reaksi pembentukan warna.

Cara :I.

Percobaan CARR PRICEKedalam tabung reaksi yang kering dituangkan 2 teteslarutan minyak ikan dalam khloroform 20 %.Tambahkan 2 ml larutan jenuh Antimon–trikhlorida dalamkhloroform . Perhatikan perubahan –perubahan warna yang

terjadi

II. Percobaan kualitatif dengan pereaksi asam Trichloroasetat(TCA).Tuangkan kedalam tabung reaksi 3 ml larutan jenuhTrichloroasetat dalam khloroform . Teteskan 2 tetes minyakikan . Kocok dengan hati-hati dan perhatikan warna yangtimbul.

Hasil :I.

II.

Kesimpulan :

Piridoksin

Dasar : Reaksi warna

Cara :Pada 5 ml larutan yang hendak diperiksa, tambahkan secara

berurutan 2 ml Na-asetat 50 %, 1 ml aquadest, 0,5 ml garamdiazonium dan 1 ml Na-karbonat 5,5 %.Kocok dan perhatikanlah warna yang timbul.

Hasil :

38



Kesimpulan :

NIASIN

Dasar :Reaksi pembentukan warna yaitu niasin dan niasin-amida

bereaksi dengan sianogen-bromida dan amina primer /sekunder meng-hasilkan senyawaan yang berwarna kuningkehijauan (Reaksi K Ö NIG).

Cara :Pada 3 ml larutan asam nikotinat tambahkan 5 ml larutan Buffer(pH 6,6). Tambahkan 3 ml sianogen bromida. Sepuluh menitkemudian tambahkan 2-3 tetes aniline dan 2-3 tetes HCl pekat.

Perhatikan warna yang timbul.

Hasil :

Kesimpulan :

Vitamin C

1. Percobaan BENEDICT

Dasar: vitamin C mempunyai daya reduksi .

Cara : Lakukan percobaan kwalitatif BENEDICT terhadap larutanasam askorbat 1 %

Hasil :

Kesimpulan :

2. Percobaan dengan buah apel dan pisang

Dasar : Melihat daya antioksidan vitamin C.

oksidasiFenol fenolat ( bintik hitam)

Adanya vitamin C, merupakan antioksidan , sehinggafenol tidak dioksidasi menjadi fenolat.

39



Cara :

Ambil 2 potong apel yang masih segar. Sepotongdimasukkan beker glass berisi air dan sepotong lagikedalam beker glass yang berisi larutan vitamin C 1 %.

Diamkan selama ½ jam . Lakukan dengan cara yang samaterhadap potongan pisang. Pada potongan apel / pisangdidalam air akan timbul bintik-bintik hitam sebagai akibatoksidasi senyawa fenol., sedangkan pada potonganapel/pisang didalam larutan vitamin C tidak akan timbul

bintik hitam.

Hasil :

Kesimpulan :

Vitamin D

Percobaan Carr –Price

Dasar : Reaksi warna.Mula-mula vitamin A yang terdapat dalam minyak ikandioksidasi oleh peroksidan dan pemanasan , sehingga tinggalvitamin D yang akan ditest dengan pereaksi CARR-PRICE..

Cara :Pada 1 ml minyak ikan tambahkan 1 ml larutan hidrogen

peroksida5 % . Aduklah campuran ini secara hati –hati sampai tidak adalagi keluar gelembung-gelembung gas.

Dinginkan isi tabung dibawah aliran air, lalu teteskan beberapa tetes pereaksi CARR-PRICE pada campuran ini

Hasil :

Kesimpulan :

40



E N Z I M

Untuk percobaan enzim sebagai substrat dipakai susu.

Komponen dalam susu adalah :

1.

Karbohidrat merupakan komponen terbanyak.Karbohidrat dalam susu adalah laktosa

2. Protein berupa kasein dan enzimEnzim dalam susu ialah :1.

peroksidase dan katalase2. dehidrogenase (dalam susu sapi)3. fosfatase alkali (rusak pada susu pasteur)4. lipase5. amilase

3. Lemak

4. VitaminVitamin yang larut dalam lemak : A, D, dan ELarut air : C, B1 , B2, B3, B6 , Folic acid , dsb

5. AnorganikTerbanyak : kalsiumJuga terbanyak : P, K , Cl, Mg , S, Cu, Zn.

Pasteurisasi : adalah pemanasan pada 143 derajat F ( 61,7 O C)selama 30 menit dilanjutkan dengan

pemanasan pada 160 derajat F ( 71O C) 15menit.

Dengan pasteurisasi , kuman patogen mati (mycobacteriumtuberculosa). Kerugiannya adalah bahwa enzim dalamsusu akan rusak.

I. PENGARUH SUHU

renninDasar : Kasein Ca-parakaseinat

(menggumpal )Ca

++

Cara :Kedalam empat tabung reaksi isikan 5 ml susu ( A B C D ).Kedalam empat tabung reaksi yang lain masukkan 1 ml rennin0,5 % (abcd).

Tempatkan tabung A & a didalam beker glas ang berisi air es

tabung B & b didalam suhu ruangan

41



tabung C & c didalam penangas air bersuhu 37–40 O Ctabung D & d didalam penangas air bersuhu 75

– 80 O C

Setelah 3 menit campurkan rennin kedalam tabung reaksi yang berisi susu.Aduklah dan perhatikan waktunya.Setiap satu menit tabung diperhatikan apakah telah terjadi

penggumpalan susu, catat waktu terjadinya perubahan .

Setelah 5 menit setiap tabung yang belum mengalami penggumpalan diperhatikandengan interval tertentu untuk waktu ½ jam .Suhu manakah yang merupakan suhu optimal untuk bekerjanyaenzim ?

Hasil :

Kesimpulan :

Gambarkan grafik pengaruh suhu pada kerja enzim .Gambar :

II. PENGARUH KONSENTRASI SUBSTRAT

Dasar :Makin tinggi kadar substrat, makin besar kecepatan reaksienzimatik, sampai kecepatan maksimal.Bila kecepatan reaksi enzimatis sudah maksimal, penambahansubstrat tidak akan menambah kecepatan reaksi.

Kecepatanreaksi

Substrat

Cara :Kedalam 3 tabung reaksi masukkan berturut-turut 10 ml, 8ml dan 6 ml susu.

42



Tambahkan air secukupnya sehingga diperoleh volume 10ml. Letakkan didalam penangas air 37o C . Setelah

beberapa saat tambahkan pada masing- masing tabung reaksi2 ml larutan rennin 0,2 %. Perhatikan dan catatlah waktuyang diperlukan untuk penggumpalan susu pada masing-

masing tabung.

Hasil :

Kesimpulan :

III. PENGARUH ANTISEPTIK

Dasar :Antiseptik adalah suatu zat kimia yang berfungsi untuk

mencegah pertumbuhan kuman. Antiseptik jugamempengaruhi kerja enzim.

Cara :Pada 4 tabung reaksi ( A B C D ) yang berisikan 5 mlsusu , tambahkan 5 tetes A. toluen; B. Chloroform ; C.

phenol 5 % ; D. air.Letakkan didalam penangas air 37o C . Setelah beberapasaat, tambahkan pada masing-masing tabung 1 mllarutan rennin 0,2 %. Perhatikan perubahan masing-masing tabung setiap ½ menit , dan bandingkanterhadap tabung D selaku kontrol.

Hasil :

Pertanyaan : Antiseptik manakah yang paling sedikit

pengaruhnya terhadap kerja enzim ?

Kesimpulan :

ANALISA KUALITATIF DARAH

BERAT JENIS

Berat jenis suatu cairan dapat ditentukan dengan cara :

43



I. Menentukan Berat Jenis dengan urinometer

Di dalam klinik biasanya berat jenis diukur denganmenggunakan suatu macam hidrometer yang dinamakanurinometer.

Urinometer ditera pada suhu tertentu. Suhu peneraan dapat dibaca padaurinometer tersebut. Apabila berat jenis diukur pada suhu yang

berbeda dengan suhu penerapan , hasil yang didapat harusdikoreksi lagi.

Koreksi dilakukan dengan jalan menambah 1 angka padaangka ketiga dibelakang koma untuk setiap 3 O C di atassuhu peneraan dan dikurangi 1 angka pada angka ketiga di

belakang koma untuk setiap 3 O C dibawah suhu peneraan .Pembacaan dilakukan dengan melihat skala , angka yangditunjukkan oleh permukaan cairan yang diperiksa.

Tentukanlah berat jenis aqua destilat , air keran, larutan NaCl 3 % dan larutan NaCl 5 %

II. Larutan Tembaga sulfat Phillips van Slyke untukmenentukan Bj darah dan plasma (DEMOSNTRASI)

PrinsipBerat jenis darah dan plasma dapat ditentukan denganmeneteskan bahan yang akan diepriksa ke dalam suatularutan tembaga sulfat dengan berat jenis yang diketahui danmelihat apakah tetes tersebut naik , turun atau melayangdalam larutan tersebut.

Tiap tetes yang memasuki larutan akan terbungkus oleh suatuselaput tembaga proteinat dan tidak akan mengalami

perubahan berat jenis selama 15 – 20 detik .Berat tetesan yang dijatuhkan tidak mempengaruhi

penetapan.

Prosedur

Pertama-tama disiapkan bermacam-macam larutan tembagasulfat dengan bermacam-macam berat jenis, untuk penetapan berat jenis yang teliti dan beda berat jenis antara satu larutanyang lain haruslah 0,001. Untuk penetapan yang agak kasar

beda tersebut cukuplah 0,004 saja.

Setelah kecil darah atau plasma yang akan ditentukan berat jenisnya dijatuhkan dari tinggi 1 cm ke dalam salah satularutan yang kira-kira mempunyai berat jenis sama dengan

bahan yang akan diperiksa. Untuk pekerjaan tadi dipakai penetes obat atau alat penyuntik. Karena kecepatan jatuh ,

44



tetes tersebut akan menembus permukaan larutan dan turunsampai 2 – 3 cm dibawah permukaan . Kecepatan jatuh akanhilang dalam 5 detik. Selama10 detik setelah kecepatan jatuhhilang, harusa ditentukan apakah tetes tersebut lebih berat ,lebih ringan atau sama beratnya dengan larutan.

Setelah 10 detik , pemeriksaan akan tidak ada artinya lagi,karena berat jenis tetesan akan berubah disebabkan difusimelalui selaput tembaga – proteinat.

Apabila berat jenis tetesan lebih kecil dari berat jenis larutan ,dalam 10 detik itu tetesan akan naik (mungkin hanya

beberapa mm ) dan segera tenggelam lagi . Apabila berat jenis tetesan sama dengan berat jenis larutan , tetesan akanmelayang dan kemudian tenggelam . Sedang kalau berat jenistetesan lebih besar dari berat jenis larutan , tetesan akan

terus tenggelam selama waktu 10 detik .

Konsentrasi hemoglobin dan protein plasma berhubungandengan berat jenis plasma dan darah . Dengan diketahuinya

berat jenis plasma dan darah, hemoglobin dan protein dapatditentukan. Lihat halaman 7

Hasil :

Kesimpulan:

III. METODE TETES JATUH untuk menentukan Berat JenisDarah . Plasma atau serum ( Falling Drop Method)

45



A N A L I S A K U A L I T A T I F D A R A H

Hemolisa sel darah merah

A. Larutan hipotonis

Dasar : NaCl 0,9 % adalah larutan yang isotonis , seldarah merah tidak Mengalami perubahan

bentuk.Dalam larutan yang hipotonis, sel darah merahmengalami hemolisa. Sedangkan dalam larutanhipertonis sel darah merah akan mengkerut(crenated)

Cara :Sediakan sederetan tabung-tabung yang berisicampuran sbb:

Air (ml) NaCl 2 % (ml ) % NaCl 10,0 0,09,0 1,08,0 2,07,5 2,57,0 3,06,5 3,56,0 4,05,5 4,55,0 5,0

4,5 5,5

Campur dengan baik dan pada tiap tabung tambahkan 2tetes eritrosit yang telah dicuci. Kocok lagi, laludiamkan selama 1 jam. Catatlah derajat hemolisis padamasing-masing tabung.

Pertanyaan : Berapakah resistensi osmotik minimumdari sel darah merah?

Jawab :

Hasil :

Kesimpulan :

46



B. Pengaruh zat-zat kimiaDasar :Dinding sel darah merah adalah suatu

lipoprotein.Dalam pelarut lemak., dinding ini akan larutsehingga bila sel darah merah dimasukkan

dalam pelarut lemak akan terjadi hemolisis.

Cara : Isilah 6 tabung reaksi dengan 10 ml NaCl 0,9 %.Tabung pertama digunakan sebagai kontrol,dan 10 tetes chloroform eter, aseton, toluen,dan alkohol. Lalu tambahkan pada ke-6tabung tersebut 2 tetes eritrosit yang telahdicuci.Kocok dan biarkanlah selama ½ jam .Bandingkan dengan tabung kontrol.

Hasil :

Kesimpulan :

DERIVAT HEMOGLOBIN

Salah satu fungsi darah adalah untuk transport oksigen dari paru-paruke jaringan ke paru-paru ( respirasi ) , ikatan antara hemoglobindengan oksigen merupakan suatu ikatan yang mudah terlepas.Ikatan CO terhadap hemoglobin sangat kuat (20 kali ikatan oksigenterhadap hemoglobin).

Dalam hemoglobin , Fe terdapat dalam bentuk ion fero.Bila terdapat zat oksidator ( K-ferisianida, ozon, nitrit dsb), ion ferroini dapat dioksidasi menjadi feri ( Met-Hb ) dan warna larutan darahyang mengandung met- Hb ini berubah menjadi merah coklat.

Derivat hemoglobin mempunyai warna berlainan, yaitu :

- Oksi hemoglobin merah terang (merahkekuningan)- Reduced hemoglobin (HHb) merah gelap

- CO- Hb merah karmin ( merah cherry)- Met-Hb merah coklat

Bila dalam larutan darah dibubuhkan suatu larutan asam (HCl), akanterbentuk hematin asam yang berwarna coklat. Ini merupakan dasar

penentuan kadar hemoglobin menurut cara Sahli.

47



Suatu hematin basa (coklat) terbentuk bila dalam darah dibubuhkanlarutan basa (NaOH).

Oksihemoglobin dan Reduced-hemoglobinCara :

Buatlah stok larutan pereduksi Stokes dengan cara :Dalam sebuah tabung reaksi masukkan 2 ml pereaksi Stokes(campuran asam tartrat dengan ferro sulfat).Tambahkan 10 tetes NH 4OH untuk melarutkan presipitatyang terbentuk .Stok ini dipakai untuk semua percobaan yang menggunakan

pereaksi Stokes.

Encerkan 2 ml darah dengan 6 ml air dalam sebuah tabungreaksi. Kocok baik-baik. Perhatikan warna merah terang darioksihemoglobin. Bagilah dua isi tabung , masing-masing3 ml.

Yang pertama digunakan sebagai kontrol.Pada tabung ke-dua tambahkan 3 tetes pereaksi Stokes ( stok).Akan terbentuk “reduced”-Hb. Bandingkanlah warnanyadengan oksi-Hb.

Kocok tabung yang berisis “ reduced”-Hb dengan membalik- balik tabung. Akan terjadi oksigenisasi dengan oksigen dariudara. Deoksigenasasi dapat terjadi bila diberi reduktor danreoksigenasasi bila dikocok kembali. Kejadian faal apakahyang ditiru percobaan ini ?

Hasil :

Kesimpulan :

Karbonmonoksida- hemoglobin

Karbonmonoksida-Hb dibuat dengan cara mengalirkan gas dari keran(mengandung CO) ke dalam satu tabung yang berisi larutan darah.

48



Cara:1.

Encerkan 1 ml larutan CO-Hb dengan 1 ml air.Bandingkan warna dari larutan CO-Hb dengan larutan oksiHb. Catatlah warnanya.

2. Dalam tabung reaksi lain, tambahkan 3 tetes pereaksi

Stokes pada kira-kira 1 ml larutan CO-Hb. Bandingkan bila pada 1 ml oksi Hb saudara.Tambahkan 3 tetes pereaksi Stokes. Catatlah perubahan

pada masing-masing tabung.3. Ulangi percobaan 2) dengan menambahkan pada tabung

yang berisi oksi-HB dan tabung yang berisi CO-Hbmasing-masing 2 tetes NaOH 10 %.

Hasil :

Kesimpulan :

Methemoglobin

Cara :Encerkan 1 ml darah dengan 5 ml air. Campurkemudian dibagi 3 tabung masing –masing berisi 2 mllarutan oksi-Hb.

Tabung pertama dipakai sebagai pembanding . Catatwarna larutannya.

Pada tabung yang kedua, tambahkan 2 tetes larutan K -ferisianida 33 % .Kocok lalu catatlah warnanya. Hemoglobin akandioksidasi menjadi met-Hb . Kemudian tambahkan 2tetes pereaksi Stokes.

Apa yang terjadi ?

Bandingkan dengan tabung ketiga yang diberi 2 tetes pereaksi Stokes.

Pada tabung lain, hangatkan 1 ½ ml darah yang dicampurdengan 1 ½ ml air. Kemudian tambahkan 3 ml larutan K-ferisianida 33 %. Campur dengan membalik-balikkan tabungdan perhatikan gelembung oksigen yang terbentuk. Inimerupakan dasar penetapan oksigen dalam darah.

49



Hasil :

Kesimpulan :

Pemeriksaan hemoglobin & derivatnya secara spektrokopis(DEMONSTRASI)

Spektroskop adalah alat yang berguna dalam mempelajari pigmendarah berdasarkan perbedaan absorpsi warna-warna tertentu darispektrum cahaya putih. Bila suatu larutan suatu larutan berisi suatu zat

berwarna diletakkan antara alat tersebut dan sumber cahaya, akan

terlihat daerah (pita) hitam pada bagian spektrum dimana terjadi penyerapan warna tersebut. Dengan menentukan letak serta intensitas pita-pita absorpsi ini, sering dapat ditentukan bermacam-macam pigmen.Pada alat yang tidak diperlengkapi dengan skala panjang gelombangcahaya, letak pita absorpsi ini dibandingkan dengan garis-garisFraunhofer dari spektrum matahari.

Garis-garis Fraunhofer adalah garis-garis gelap, yang segera tampak pada spektrum matahari disebabkan adanya elemen-elemen tertentu didalam uap yang mengelilingi matahari.Seperti tampak pada gambar dibawah ini, garis –garis tadi tampak

beserta panjang gelombangnya dalam perkiraan :A. 667 mµ E. 517 mµ B. 656 mµ F. 486 mµ C. 589 mµ G. 431 mµ

D. 527 mµ

50



Panjang gelombang (µu)

Diagram menunjukkan spektrum matahariTampak garis-garis Fraunhofer

Dalam percobaan ini akan diperlihatkan spektrum absorpsi darihemoglobin dan beberapa derivatnya. Jelas tidaknya pita-pita absorpsiitu tergantung dari pengenceran zat yang diperiksa.

a. Spektrum oksihemoglobinPemeriksaan ini dilakukan terhadap darah yang diencerkan 100kali. Perhatikan 2 pita absorpsi, yang satu dekat garis D (578 µu)dan yang lain dekat garis E (542 µu). Pita absorpsi yang dekatgaris D itu, yang terletak pada bagian kuning spektrum, lebihsempit daripada pita yang terletak pada bagian hijau spektrum.(Catatan: disamping itu terdapat pita absorpsi ketiga pada bagianungu

spektrum = 415 mµ )

b. Spektrum reduced hemoglobinDarah encer yang diperiksa tadi dibubuhkan beberapa tetes

pereaksi Stokes.Oksihemoglobin akan tereduksi menjadihemoglobin dan darah akan berubah warna dari merah menjadimerah gelap. Terlihat bahwa pita absorpsi hemoglobin itu digantioleh salah satu pita yang lebih lebar dengan pusatnya pada 559

mµ. Jika larutan ini dikocok akan terbentuk oksihemoglobinkembali dengan pita absorpsinya yang khas.

c. Spektrum karbon monooksida hemoglobinPada darah yang telah diencerkan 100 kali dialirkan gas dari keran; akan terbentuk karbon monoksida hemoglobin. Denganspektroskop terlihat 2 buah pita absorpsi yang sangat mirip dengan

pita absorpsi oksi-hemoglobin yaitu pada 542 dan 570 mµ . Untukmembedakannya dari oksihemoglobin , tambahkan pada larutan ini

beberapa tetes pereaksi Stokes. Akan terlihat bahwa pita absorpsiitu tidak berubah.

d. Spektrum methemoglobinPada 10 ml darah yang telah diencerkan 40 kali bubuhkan 2 teteslarutan K-ferisianida 33 %. Campur dan biarkan 10 menit.

Dengan spektroskop akan terlihat suatu pita absorpsi yang sangat gelapdisebelah kiri garis D (634 mµ ).

51



Disamping itu larutan yang cukup encer akan memperlihatkan pula 2 pita lain yang kurang nyata pada tempat yang hampir sama dengan pita absorpsi oksihemoglobin.

Tambahkanlah beberapa tetes pereaksi Stokes pada larutan tersbut, akansegera terlihat spektrum oksihemoglobin disusul oleh spektrum

reduced hemoglobin.

(Catatan: spektrum yang diperlihatkan ini adalah spektrummethemoglobin netral ; methemoglobin alkalis mempunyai spektrumyang berbeda).

Hasil :

TEST GUAIAC

Cara ini peka dan berguna untuk menyatakan adanya darah. Jangan menggunakanlarutan guaiac yang terlampau pekat, sebab presipitasi bahan akanmenutupi warna biru yang terbentuk. Zat-zat lain seperti susu, nanahdan liur juga memberi hasil positif. Tetapi setelah 15 – 20 detik zat-zat ini tidak lagi memberi warna biru, sedangkan darah yang telahdididihkan tetap memberi hasil positif.

Cara: Pada 5 ml darah encer, tambahkan tetes demi tetes larutanguaiac 2 % dalam alkohol, sehingga timbul kekeruhan.Tambahkan H2O2 encer (3%) tetes demi tetes, akan terlihatwarna ungu.Ulangi percobaan ini terhadap darah yang telah dididihkan 30detik.Ulangi juga dengan menggunakan darah yang lebih encer untukmenentukan kepekaan test ini.

Hasil:

Kesimpulan:

52



U R I N

Sifat-sifat urin

Volume: normal antara 600 - 2500 ml / 24 jamPoliuria : bila volume urin meningkatOliguria : bila volume urin menurunAnuria : bila tidak terbentuk urin sama sekali

53



Nokturia : bila urin malam hari jumlahnya meningkatsehingga lebih banyak dari pada urin siang hari

Warna: Normal bewarna kuning muda. Terutama disebabkan pigmen

urokrom yang bewarna kuning, dan sejumlah kecil urobilindan hematoporfirin.

Berat jenis : Normal antara 1.003 –1.030.Biasa berat jenis berbanding terbalik dengan volume, kecuali

pada penyakit diabetes melitus volume urin besar dan berat jenis tinggi sebab banyak glukosa.Berat jenis berubah terutama pada penyakit ginjal.

Secara kasar penentuan total zat padat dalam urin dapat

ditentukan dengan mengalikan 2 angka terakhir BJ urin dengan2,6 (koefisien Long).

Normal total zat padat dalam urin 24 jam ± 50 g.

Reaksi : pH normal antara 4,7 – 8,0.Bila urin didiamkan 24 jam akan bersifat asam, pH juga asam

bila- banyak makan protein- demam- asidosis

Beberapa waktu sesudah makan urin bersifat netral, bahkanalkalis disebut alkaline tide.Bila didiamkan beberapa waktu urin bisa menjadi :

- asam karena acid fermentation . Urin mengandung asamurat. Ca-oxalat, jamur dan senyawa yang mengandungasam urat.

Basa karena amoniak fermentation . Ini karena bakteri.

Bau :Khas, bau amoniak.Pada ketosis urin berbau aseton.

Kekeruhan :Urin segar akan jernihBila didiamkan beberapa lama bisa keruh karena ,- nukleotprotein, mukoid dan sel epitel.- pada urin alkalis karena endapan fosfat.- Pada urin asam karena endapan urat.

54



Susunan urin normal1. Urea paling banyak . Jumlahnya kira-kira setengah dari jumlah

total zat padat pada urin.Merupakan hasil akhir metabolisme protein.

Ekskresi urea meningkat pada-

diet tinggi protein- katabolisme protein yang tinggi, misalnya pada

demam

2. Asam Urat, merupakan hasil akhir metabolisme purinEksresi meningkat pada makan banyak nukleoprotein ( daging ,kelenjar dsb) lekemia, gout (pirai). Pada urin asam , asam uratlebih mudah mengendap, sehingga pembentukan batu urat mudahterjadi. Pemberian zat-zat yang menaikkan pH urin akanmemperbesar daya larut asam urat, sehingga terbentuknya batu

berkurang.

3. KreatininEkskresi melalui urin 1,0 - 1,8 g / 24 jam.Asal dari kreatin didalam otot ( endogen).Ekskresi akan menurun pada penyakit yang berhubungan denganatrofi dan kelemahan otot.Ekskresi akan meningkat bila katabolisme kreatin di ototmeningkat.

Koefisien kreatinin = jumlah mg kreatinin yang diekskresi 24 jam Berat Badan ( Kg)

Laki-laki : 20 - 26 mg / kg BB/ 24 jamWanita : 14 – 22 mg / kg BB / 24 jam

4. KreatinJumlahnya kecil pada orang dewasa.

Banyak dalam jaringan otot dalam bentuk fosfokreatin.

5. Belerang (S)Asal dari belerang dalam protein.Ada 2 bentuk belerang di urin :A . S tak teroksidasi ( S netral )

55



Termasuk senyawa gugus –SH , -S dan –SCN, misalnya asamamino yang mengandung S, tiosulfat, tiosianat, sulfida , dll.Merupakan 5-25 % dari total S. Sumbernya endogen , makaekskresi tak terkandung intake.

B. S teroksidasi (bagian terbesar S total)a. Sulfat anorganik merupakan S terbanyak .

Asal dari metabolisme protein. b. Sulfat etherial (conjugated sulfate)

Adalah asam sulfat dengan zat organik (indol, kresol,fenol, dsb).Zat organik berasal dari metabolisme protein dan

pembusukan protein.

6. Indikan7. Amoniak

Merupakan hasil akhir metabolisme protein yang mengandung N, Nomor 2 terbanyak sesudah urea

8. Chloride dalam bentuk NaCl (nomor 3)9. Fosfat10. Vitamin, hormon dan enzim

Zat patologik dalam urin1. Glukosa : disebut glukosuria

Bisa : - fisiologik …………. Alimentary glukosuria- patologik …………. DM , dsb

2. Protein: disebut proteinuria3. Keton : disebut ketonuria

Yang termasuk zat keton: asam asetoasetat, beta hidroksibutirat,dan aseton.

Berasal dari pemecahan asam lemak. Normal asam lemak dipecahsempurna. Pada keadaan abnormal zat-zat keton ditimbun di darah(ketonemia) dan bila keluar di urin (ketonuria). Contoh padaketosiskarena kelaparan atau DM yang tak terkontrol.

4. Nanah : disebut lipiuriaKarena radang ginjal / saluran urin

5. Darah disebut hematuria

6. Lemak disebut lipiduria

7. Asam amino disebut aminoasiduria

8. Pigmen empedu disebut bilirubinuria

56



9. Batu urin

ANALISA KUALITATIF URIN

Tiap mahasiswa harap mengumpulkan urin segar sebelum praktikumdimulai !

1. Zat-zat anorganik:Garam-garam amonium:Berasal dari reabsorpsi dalam tubuli ginjal, dimana Na+ digantikanoleh NH

4+

NH4Cl + NaOH NH4OH + NaCl NH3 + H2O

K 2HgI4 + NH3 (NH4)2HgI4

Jingga kemerahan

Cara:Bubuhkan kristal NaOH pada beberapa ml urin, sehinggareaksinya menjadi alkalis. Kemudian panaskan!Perhatikan bau yang timbul dan uji uapnya dengan kertaslakmus yang telah dibasahi atau dengan setetes pereaksi

Nessler di atas kertas saring. Larutan Nessler akan berubahmenjadi jingga kemerahan oleh amoniak

Hasil:

Kesimpulan:

2.

Belerang dalam urin:a. Sulfat anorganik:Pada 10 ml urin tambahkan sedikit HCL encer dan larutanBaCl2. Presipitat putih adalah BaSO4. Saring campuran ini danuji filtratnya untuk sulfat etereal !

Hasil:

b.

Sulfat etereal:Zat ini merupakan kombinasi dari asam sulfat dengan zat-zat organik

seperti indol, fenol, dsb. Semuanya dapat diuraikan

57



pada pemanasan dengan asam. Panaskan filtrat dari a)dan didihkan 10 menit. Bila tak ada presipitattambahkan lagi HCl dan panaskan lagi. Kemungkinan

perlu menambahkan BaCl2 . Kekeruhan dari bariumsulfat menunjukkan adanya sulfat etereal.

Hasil:

c. Belerang yang tidak dioksidasiMerupakan belerang netral, termasuk sulfida-sulfida sistin dsb.Masukkan ke dalam tabung reaksi 10 ml urin, berikan sedikitkristal seng dan sedikit HCl encer. Tutuplah mulut tabungdengan sepotong kertas yang telah dibasahi dengan larutan Pbasetat. Kehitaman pada kertas saring disebabkan oleh

terbentuknya Pb sulfida oleh adanya H2S.

Hasil:

Kesimpulan:

3. Asam urat:Asam urat merupakan hasil akhir metabolisme purin. Asam urat

bersifat mereduksi, sukar larut dalam air dan asam. Larut dalam basa.

a. Test mureksidaLetakkan sedikit kristal asam urat dalam sebuah cawan

penguapan. Tambahkan 3 tetes asam nitrat pekat. Keringkan diatas api. Perhatikan warna merah yang terbentuk. Setelahdingin tambahkan 1 tetes NH4OH encer ( 1: 100 ). Terbentukwarna merah keunguan (purplish red) karena terdapatnyamureksida. Pada bercak yang lain tambahkan 1 tetes NaOH.

Terbentuk warna purplish violet.

Dasar: Asam urat dioksida oleh asam nitrat pekat membentuk asam dialuratdan aloxan. Zat-zat ini berkondensasi dengan amoniak membentukmureksida (amonium purpurat) yang berwarna ungu kemerahan.

Hasil:

58



b. Test BenedictDasar: Asam urat akan mereduksi asam fosfotungstat

membentuk zat berwarna biru (oksida tungsten =wolfram). NaCN gunanya untuk memperbesar dayareduksi.

Cara : Pada piring reaksi letakkan setetes larutan Na karbonat jenuh sedikit bubuk asam urat,setetes larutan NaCN 5% dan 1 tetes pereaksi arsenofosfotungstat Benedict.Terbentuk warna biru. Ulangi percobaan ini denganmenggunakan urin saudara sebanyak 2 tetes sebagai

pengganti asam urat !

Hasil:Asam urat:

Urin:

Kesimpulan:

4. KreatininKreatinin adalah hasil dehidrasi kreatin di otot tanpa enzim(spontan)

Reaksi Jaffe:Dasar reaksi: Suatu tautomerisasi / pergeseran.

Tautomer: rumus molekul sama rumus bangun berbeda

Cara: Kedalam sebuah tabung reaksi masukkan 5 ml larutankreatinin

0,1 %. Kemudian tambahkan beberapa tetes asam pikrat jenuh, serta beberapa tetes larutan NaOH 10%. Terbentukwarna merah Tambahkan HCl, warna merah menjadikuning. Bandingkan juga percobaan ini terhadap larutanglukosa yang ditambahkan asam pikrat alkalis. Apakah

senyawa yang terbentuk sama? Jelaskan dalam kesimpulansaudara!

Hasil: Kreatinin :

Glukosa:

Kesimpulan:

59



5. Protein:

a. Test Heller:Dasar: Protein + asam nitrat endapan cincin

putih dan pada penambahan asam tidak larut kembali

Cara: Isilah sebuah tabung reaksi dengan 3 ml HNO3 pekat.Miringkan tabung dan masukkan dengan hati-hati 3ml urin jernih, sehingga membentuk suatu lapisan diatas asam. Terbentuknya cincin putih menyatakanadanya protein. Supaya lebih jelas, gunakan dasaryang jelas.Lakukan juga test ini untuk urin yang patologis !

Hasil:

b. Test koagulasi:Panaskan 3 ml urin jernih sehingga mendidih. Presipitat yangterbentuk disebabkan oleh protein atau fosfat. Tambahkan 5tetes asam asetat 2 %. Apakah presipitat hilang atau bertambah? Fosfat larut pada pemanasan sedangkan protein tetap atau

bertambah.

Hasil: Urin sendiri:

Urin patologis:

c. Test asam sulfosalisilat:Campurkan 3 ml asam sulfosalisilat 5 % dalam Na sulfat 20%dengan 3 ml urin. Presipitat putih diantara kedua lapisan cairantersebut menyatakan adanya protein. Lakukan juga test initerhadap urin patologis.

Hasil:

d. Test Kalium ferro cyanida – asam asetatDalam 3 ml urin jernih tambahkan 3 tetes asam asetat. Campurkemudian tambahkan tetes demi tetes larutan kaliumferrocyanida 10% . Bila terdapat protein akan terdapat

presipitat putih. K-ferrocyanida harus ditambahkan sedikitdemi sedikit karena bisa melarutkan kembali albumin. Test inisangat baik. Lakukan test ini terhadap urin patologis.

60



Hasil:

Kesimpulan:

6. Zat-zat ketonAseton, asetoasetat, β-hidroksi butirat

Test nitroprusida (Rotheal):

Cara:Bubuhkan pada 3 ml urin kristal amonium sulfat sampai jenuh.Tambahkan 3 tetes Na-nitroprusida 5 % yang baru dibuat, dan1 ml ammonium hidroksida pekat. Warna permanganat

menunjukkan adanya aseton (kreatinin tak memberi warna permanganat). Asetoasetat memberi warna merah jingga.Kepekaan untuk aseton 1 : 20.000.

Hasil:

Kesimpulan:

Test lain untuk zat keton- test nitroprusida (legal)-

test ferrichlorida (Gerhardt)

61



E M P E D U

Empedu diproduksi oleh hati dan disimpan didalam kandung empedu.

Volume : 500 – 1000 ml

Volume akan meningkat pada perangsangan N. vagus dan pengaruh diet.

Volume akan berkurang oleh adanya epinefrin.

Warna : kuning kehijauan dan agak kental

Bila didiamkan kena udara, warna akan berubah menjadihijau, biru dan

coklat, karena oksidasi bilirubin.

Berat Jenis : antara 1.010 – 1.040

Empedu yang dihasilkan hepar mempunyai BJ 1.010 dan BJ ini akanmeningkat menjadi 1.040 pada empedu yang didalamkandung empedu.

pH : alkalis

Isi : - asam empedu

- pigmen empedu- konjugasi asam glukuronat dengan hormon ( tiroid dan

steroid )- bahan anorganik ( Na, K , Cl , dsb)- protein berupa musin dan enzim alkali fosfatase- dan lain-lain

Asam empedu : merupakan hasil degradasi cholesterol

Siklo pentano perhidro phenantren

Pada manusia, yang termasuk asam empedu ialah :1. cholic acid2. chenodeoxycholic acid3.

deoxycholic acid4. lithocholic acid

Garam empedu : bila asam empedu berikatan dengan Na atau K.

62



Fungsinya untuk membantu pencernaan lemak dan vitamin yang larutdalam lemak, karena :

1. garam empedu menurunkan tegangan permukaan danmembantu emulsifikasi lemak sehingga memudahkan

pencernaan.

2.

garam empedu berikatan dengan asam lemakmembentuk kompleksyang mudah larut dan diserap.

Pigmen empedu :

Berasal dari hasil penghancuran sel darah merah .Pigmen yang terbanyak adalah bilirubin dan biliverdin. Bilirubin

berwarna merah/kuning coklat dan biliverdin hijau. Oksidasiterhadap pigmen-pigmen menghasilkan sejumlah pigmen lain

dengan bermacam-macam warna.

1. SIFAT – SIFAT FISIK

Perhatikan dan catat :Warna empedu segar :

Bau empedu segar :

Konsistensi empedu segar :

Reaksi (pH) empedu segar :

Berat Jenis :

2. PIGMEN EMPEDU

Dasar :Oksidasi dari pigmen empedu oleh reagens yang dipakai menjadi

pigmen berwarna lain ; mesobilirubin ( kuning) ,mesobiliverdin ( hijau kebiruan ) dan mesobilisianin (biru

keunguan) .

Test GMELINCara :

Pada 2,5 ml asam nitrat pekat ( dari buret ) tambahkan dengan hati-hati 5 ml empedu encer sehingga kedua cairan ini tidak

bercampur. Perhatikan warna yang terbentuk pada perbatasankedua cairan tersebut. Ujilah kepekaan test ini denganmenggunakan empedu yang lebih encer.

Hasil :

63



Test SMITH

Cara :Pada 2 ml empedu yang sangat encer tambahkan beberapa tetes

larutan iodium –alkohol 0,5 % sebagai lapisan atas. Jangan

kocok. Perhatikan cincin hijau tua /hijau kebiruan dibawahlapisan iodium.

Hasil:

3. ASAM EMPEDU

Test PETTENKOFFER

Dasar:Mirip test Molisch yaitu karbohidrat dengan asam pekat (asam

sulfat pekat) membentuk furfural. Ini akibat dehidrasi denganasam pekat. Furfural ini kemudian dengan α naftol membentuksenyawa warna ungu. Pada test Pettenkoffer, α naftol digantioleh asam empedu.

Cara:Pada 5 ml empedu encer tambahkan 5 tetes larutan sukrosa 5 % .

Tuang dengan hati-hati 3 ml asam sulfat pekat sehingga terbentuk

2 lapisan, caranya dengan memiringkan tabung. Terbentuknyacincin berwarna ungu menyatakan adanya asam empedu.

Keterangan : Percobaan ini tergantung pada terbentuknya furfuralakibat hasil kerja

dari asam terhadap sukrosa.

Reaksi :

Hasil :

PENCERNAAN OLEH AIR LIUR

64



Air liur dihasilkan oleh 3 buah kelenjar liur yang besar yaitu

parotis, submaxillaris,

sublingualis dan kelenjar kecil yaitu labialis , lingualis, buccal dan

palatal.

Volume air liur per hari ± 1,0 – 1, 5 liter dan dipengaruhi olehkeadaan fisiologis, keadaan fisik dan adanya zat kimia /makanan .

pH air liur biasanya sedikit asam, kira-kira 6,8

Komposisi air liur

Kira-kira 99,5 % air dan 0,5 % benda-benda padat.Dua pertiga dari benda padat terdiri dari bahan organik, sedangyang sepertiga terdiri bahan anorganik.

Bahan anorganik- Kalium terbanyak- Cl, Na , fosfat , tiosianat, Ca, Mg, CO2, HCO3

- .Efek buffer dipengaruhi kadar HCO3

- dan fosfat.

Tiosianat meningkat kadarnya pada perokok.Kalkulus gigi (tartar) mengandung Ca fosfat dan Ca karbonat yang

bercampur dengan bakteri. Kalkulus pada kelenjar saliva (sialolithiasis) mempunyai komposisi sama dengan tartar.

Bahan organik- paling banyak protein berupa musin, juga enzim.-

urea, kolesterol, vitamin dll.- tidak terdapat glukosa.

Musin : adalah suatu mukoprotein yang berfungsi sebagai lubrican( pelumas, sehingga makanan mudah ditelan ).

Enzim :1. Amilase liur (ptialin )

amilasePati dan glikogen maltosa

Cl

-

2. Lisosim merupakan polisakaridase yang bisa merusak dinding

sel, sehingga bakteri bisa dibunuh. Lisosim ada juga didarahdan air mata.

3. Asid fosfotase4. Aldolase5. Cholinesterase

65



Cara Mengumpulkan air liur

Cucilah mulut dengan cara berkumur 2-3 kali dengan air aquadest.Kulumlah sepotong wax (lilin) sehingga lunak, kemudian dikunyah– kunyah. Gerakan mengunyah ini akan merangsang pengeluaran air liur

.Kumpulkan sejumlah 50 ml air liur dalam beker glass yang sesuai.Saringlah sebagian air liur dan lakukan percobaan dibawah ini.

Air liur yang tidak disaring

1. Tentukan pH air liur dengan menggunakan kertas indikatorlakmus dan indikator universal.

Hasil :

Kesimpulan :

2A. Test BIURETCara : Pada 1 ml air liur tambahkan tetes demi tetes pereaksi

Biuret sampai terbentuk warna lembayung ataumerah jambu ( max. 10 tetes).

Hasil :

Kesimpulan :

Test MILLONCara : Campurkan 1 ml liur dengan 2 – 3 tetes larutan Millon.

Terbentuk endapan putih. Panaskan dalam penangas airmendidih 10 menit . Jika test positif timbul endapanmerah.

Hasil :

Kesimpulan :

Test MOLISCH

66



Cara : 1 ml air liur dimasukkan dalam tabung reaksi.Tambahkan 1-2 tetes pereaksi Molisch (mengandungalfa naftol). Kocok.Tambahkan dengan hati-hati (tabung dimiringkan ) 1mlasam sulfat pekat dari buret. Bila timbul cincin ungu

diperbatasan antara kedua lapisan cairan berarti reaksi positif.

Hasil :

Kesimpulan :

3. Penentuan ChloridaCara : Ambillah 2 ml air liur , asamkan dengan 1-2 tetes asam

nitrat . LaluTambahkan 2-3 tetes AgNO3.Endapan putih menyatakan adanya chlorida.

Reaksi :

Hasil :

Kesimpulan :

4. Berat Jenis

Cara : Untuk Bj dilakukan terakhir pada sisa air liur yangmasih ada. Sisaair liur dari semua regu dikumpulkan dalam sebuah

gelas takar . UkurlahBj liur dengan memakai urinometer.

Hasil :

67



Air liur yang disaring

1. Protein

Cara : Pada 1 ml air liur tambahkan 1 tetes asam asetatencer .

Adanya endapan putih yang amorf menyatakan musin.

Hasil :

Kesimpulan :

2.

FosfatCara : Pada 1 ml air liur tambahkan 1 ml urea 10 % dan 10 ml

reagens molibdat khusus. Campur dengan membalik- balikkan tabung. Kemudian tambahkan 1 ml larutanferro –sulfat khusus. Terjadinya warna biru yangsemakin gelap bila dibiarkan menyatakan adanyaortho-fosfat.

Hasil :

Kesimpulan :

3.

SulfatCara : Dua ml air liur diasamkan dengan larutan HCl

sebanyak 2-3 tetes , lalu tambahkan larutan BaCl2.Terjadinya endapan putih menyatakan adanya sulfat.

Reaksi :

Hasil :

Kesimpulan :

68



4. Hidrolisa pati oleh amilase liurCara : Tuanglah 10 ml larutan kanji 1 % kedalam tabungreaksi .

Tambahkan 2 ml air liur yang sudah disaring . Campur,kemudian masukkan dalam penangas air 37 o C.

Perhatikan perubahan yang terjadi dengan cara :

Sediakanlah piring reaksi yang lubangnya masing-masing diisi 1 tetes larutan Iodium. Denganinterval 1 menit ambillah 1 tetes larutan dari tabungreaksi dan campur dengan tetesan Iodium dalam

piring reaksi . Lakukan test Iodium sampai pencernaan lengkap ( campuran akan tidak berwarna).Catatlah waktunya.

Setelah pencernaan selesai, lakukan percobaanBENEDICT

Dasar :

Amilase liurPati Maltosa

Pati dengan iodium berwarna biruMaltosa + iodium tak berwarna

Hasil :

Kesimpulan :

PENGARUH PH PADA KERJA AMILASE LIUR

Cara :Kedalam 4 tabung reaksi tambahkan :

a) 2 ml HCl 0, 4 % pH= 1

b) 2 ml asam laktat 0,1 % pH= 5

c) 2 ml aquadest pH= 7

d) 2 ml NaCO3 1 % pH= 9

69



Tambahkan kedalam masing-masing tabung reaksi 2 mllarutan pati 1 % dan 2 ml air liur yang tidak disaring.Campur baik-baik, kemudian letakkan didalam

penangas air 37 o C selama 15 menit.

Angkat, lalu bagilah isi masing-masing tabung reaksimenjadi 2 bagian yaitu:- pada 4 tetes larutan, lakukan test Benedict.- pada sisanya tambahkan setetes larutan iodium.Kesimpulan apa yang dapat ditarik dari percobaan ini ?

Dasar :

Hasil :

Kesimpulan :

pH Optimum Pepsin

Pepsin adalah enzim untuk pencernaan protein yangdihasilkan oleh chief cell dari mukosa lambung pHoptimum pepsin 1,2.Fibrin adalah suatu protein. Merah kongo mempunyairange pH antara 3,0 - 5,0 ( birumerah ).

Dasar :cerna

Fibrin merah Kongo proteosa pepsin

70



Cara : Siapkan 3 tabung reaksi sebagai berikut : No ml HCl 1N ml air ml pepsin pH

1 0,0 5,0 5,0 6,42 0,4 4,6 5,0 2,13 1,2 3,8 5,0 1,2

Tambahkan sejumlah kecil fibrin merah kongokedalam masing- masing tabung reaksi .Masukkan tabung reaksi dalam penangas airsuhu 37 o C . Perhatikan dan catatlah waktuyang dibutuhkan untuk pencernaan .

Hasil :

Kesimpulan :

C A I R A N L A M B U N G

Merupakan cairan bening yang bereaksi asam (pH 1,2) . Keasamandari cairan lambung disebabkan adanya HCl bebas.

Cairan lambung mengandung 0,5 % bahan terlarut yang terdiri dari :-

NaCl ( terbanyak)- KCl. Fosfat , musin , enzim- Faktor intrinsik Castle yang diperlukan untuk absorpsi B12 .

Defisiensi faktor ini dapat menimbulkan anemia pernisiosa.

Musin :Merupakan mukopolisakarida untuk melindungi mukosa lambung dari

pencernaan oleh pepsin.

Enzim :

-

Pepsin adalah suatu enzim proteolitik, yang dihasilkan darihidrolisa pepsinogen.

H+ (as. Lambung)Pepsinogen Pepsin(chief cell)

-

Rennin adalah enzim yang mengkoagulasi susu (kasein )Rennin

Kasein Parakaseinat

71



- Lipase adalah enzim lipolisis.Dalam lambung enzim belum aktif sebagai lipolisis.

PENETAPAN KEASAMAN GETAH LAMBUNG DENGANTITRASI

Cara Kerja :Kedalam tabung reaksi yang berisikan 8 tetes indikator(campuran Bromfenol dan fenol red 2:1) tuangkan 5 ml getahlambung. Lakukan titrasi dengan larutan NaOH 0,1 N hingga

pH mencapai 3,6. Untuk pembanding warna digunakansejumlah sama (5 ml ) larutan penyangga pH 3,6 dengan 8 tetes

indikator . Untuk memeriksa titik akhir titrasi sebaiknyadibandingkan warna dasar kedua tabung reaksi tersebut.Hitunglah jumlah ml NaOH yang terpakai untuk titrasi, inimenyatakan keasaman bebas.Kemudian titrasi dilanjutkan lagi hingga pH = 7 denganmenggunakan pembanding yaitu 5ml larutan penyangga pH=7 yang diberi 8 tetes indikator.Hitunglah jumlah ml NaOH yang terpakai seluruhnya , inimenyatakan keasaman total.

Keasaman total dapat dinyatakan sebagai :1.

Jumlah (ml ) NaOH 0,1 N yang diperlukan untukmenetralkan 100 ml getah lambung.

2. Berat (gram) HCl yang dinyatakan oleh keasaman total 100ml getah lambung. Nilai ini sama dengan perkalian no.1dengan angka 0,00365

Pertanyaan :- Pada keadaan apakah keasaman total dan bebas berubah ?-

Zat apakah yang dititrasi pada pH 3,6 dan pH 7.

Jawab :

Hasil :

Kesimpulan :

72



OKSIDASI BIOLOGI

I. TEST GUAIAK (peroksidase)

Dasar :

peroksidaseguaiakonat guaiak biru

2H2O2 2H2O + O2

Cara :Tambahkan pada 5 ml susu , tetes demi tetes sebanyak 10 teteslarutan Guaiak2 % dalam alkohol. Pada penambahan tiap tetes harus dikocok

. Kemudian tambahkan 5 tetes H2 O2 encer tetes demi tetes.Akan timbul warna biru.

Ulangi percobaan dengan menggunakan 5 ml susu Pasteur.Bagaimana hasilnya ? Terangkan !

Hasil :

Kesimpulan :

II. TEST SCHARDINGER ( dehidrogenase)

Dasar :

Dehidrogenase

Metilen blue leukometilen blue(berwarna biru ) (tak

berwarna )formaldehid formiat(donor H )

Cara :Kedalam 3 tabung reaksi (A, B , C) isikan 5 ml susu .Didihkan tabung A lalu dinginkan.

73



Pada setiap tabung tambahkan 1 ml larutan metylen blue 0,02%.

Pada tabung A dan B tambahkan 1 ml larutan formaldehid 0,4%

Aduklah secara hati-hati, kemudian pada setiap tabung

tambahkan ½ ml minyak parafin. Masukkan ke-3 tabung reaksikedalam penangas air 40 o C. Susu didalam tabung B lambatlaun akan menjadi putih kembali.

Hasil :

Kesimpulan :

III. PERCOBAAN TERHADAP OKSIDASE KENTANGDalam kentang terdapat enzim-enzim :1. Fenolase (katekolase)

O Ofenol katekol o.quinon

(coklat)O

pirogalol purpurogalin(coklat)

2. Sitokrom oksidasesitokrom oksidase

fenilendiamin indofenol biru+

α Naftol

3. Peroksidase peroksidase

guaiakonat guaiak biru

Pada percobaan ini, fenol dan katekol dioksidasi menjadisuatu senyawaan berwarna coklat yang susunannya tidakdiketahui . Pirogalol dioksidasi menjadi purpurogalin yang

juga berwarna coklat. Asam guaiakonat dalam larutan guaiakdioksidasi menjadi biru guaiak. Pada tabung terakhirterbentuk indofenol biru dari α naftol dan fenilen diamin .Oksidase yang berupa fenolase dan sitokrom oksidaseterdapat pada kentang tersebut.

74



Pembuatan ekstrak kentang

Kupas dan cucilah sebuah kentang , hancurkan dengan cepatdan peraslah dengan menggunakan kain kasa sebagaisaringan ke dalam gelas kimia yang berisi 200 ml air suling ,dan tambahkan 10 tetes toluen.

Kerjakan perasan itu dengan tangan secara hati-hati,usahakanlah mendapat tepungnya sebanyak mungkin .Kemudian saringlah kembali filtratnya.

Percobaan terhadap oksidase kentangDasar :Oksidasi berbagai substrat oleh enzim dalam kentang.

Cara :Ke dalam 5 buah tabung reaksi yang kering masukkanlahmasing-masing 5 ml ekstrak kentang.

Pada tabung 1. tambahkan 10 tetes larutan fenol 1 %.Pada tabung 2. tambahkan 10 tetes larutan pirokatekol 1 %.Pada tabung 3. tambahkan 10 tetes larutan guaiak 2 %.

Pada tabung 4. tambahkan 10 tetes larutan pirogalol 1 %.Pada tabung 5 tambahkan 10 tetes larutan α naftol 1 %

dalam alkohol 95 %dan 5 tetes larutan fenilendiamin

(pereaksi Nadi).

Kocoklah kelima tabung tersebut, perhatikan perubahanwarna yang timbul. Bila warna belum terjadi , simpanlahtabung-tabung tersebut sampai masa praktikum berikutnyasesudah tabung ditambah toluen sebagai pengawet.

Hasil :

Kesimpulan :

IV. PERAGIAN (demonstrasi)

Ragi roti mengandung enzim-enzim (disebut zymase)yang dapat memecah karbohidrat menjadi alkohol danCO2.Kebanyakan karbohidrat dapat diragikan, kecualilaktosa dan galaktosa.Reaksi-reaksi peragian mirip dengan glikolisis dalammamalia., hanya peragian berbeda pada beberapareaksi yang terakhir sehingga hasilnya juga berbeda.

Dasar:

75



Reaksi enzimatik.

Cara :2 gram ragi roti dihaluskan dalam mortir, kemudianditambahkan 20 ml karbohidrat sedikit demi sedikitsambil diaduk sampai rata menjadi suspensi. Setelahrata pindahkan kedalam tabung peragian sedemikian,sehingga bagian yang tertutup penuh (lengan panjang).Biarkan selama 1 jam maka akan terlihat lengan

panjang terisi gas. Uji gas tersebut denganmenambahkan NaOH encer kedalam tabung.

Bila gas tersebut CO2, maka ia bereaksi dengan NaOHmembentuk Na karbonat / bikarbonat sehinggaruangan menjadi hampa / tekanan kurang.Ini dirasakan sebagai isapan pada jari.

Lakukan test peragian ini terhadap glukosa, laktosadan sukrosa 2 %.

Reaksi :

Hasil :

Kesimpulan :

76



OKSIDASI BIOLOGI

I. TEST GUAIAK (peroksidase)

Dasar :

peroksidaseguaiakonat guaiak biru

2H2O2 2H2O + O2

Cara :Tambahkan pada 5 ml susu , tetes demi tetes sebanyak 10 teteslarutan Guaiak2 % dalam alkohol. Pada penambahan tiap tetes harus dikocok

. Kemudian tambahkan 5 tetes H2 O2 encer tetes demi tetes.Akan timbul warna biru.

Ulangi percobaan dengan menggunakan 5 ml susu Pasteur.Bagaimana hasilnya ? Terangkan !

Hasil :

Kesimpulan :

III. TEST SCHARDINGER ( dehidrogenase)

Dasar :

Dehidrogenase

77



Metilen blue leukometilen blue

(berwarna biru ) (tak berwarna )

formaldehid formiat

(donor H )

Cara :Kedalam 3 tabung reaksi (A, B , C) isikan 5 ml susu .Didihkan tabung A lalu dinginkan.Pada setiap tabung tambahkan 1 ml larutan metylen blue 0,02

%.Pada tabung A dan B tambahkan 1 ml larutan formaldehid 0,4

%Aduklah secara hati-hati, kemudian pada setiap tabung

tambahkan ½ ml minyak parafin. Masukkan ke-3 tabung reaksikedalam penangas air 40 o C. Susu didalam tabung B lambatlaun akan menjadi putih kembali.

Hasil :

Kesimpulan :

III. PERCOBAAN TERHADAP OKSIDASE KENTANGDalam kentang terdapat enzim-enzim :2.

Fenolase (katekolase)O O

fenol katekol o.quinon(coklat)

O pirogalol purpurogalin

(coklat)

2. Sitokrom oksidase sitokrom oksidasefenilendiamin indofenol biru

+α Naftol

3. Peroksidase peroksidase

guaiakonat guaiak biru

78



Pada percobaan ini, fenol dan katekol dioksidasi menjadisuatu senyawaan berwarna coklat yang susunannya tidakdiketahui . Pirogalol dioksidasi menjadi purpurogalin yang

juga berwarna coklat. Asam guaiakonat dalam larutan guaiakdioksidasi menjadi biru guaiak. Pada tabung terakhir

terbentuk indofenol biru dari α naftol dan fenilen diamin .Oksidase yang berupa fenolase dan sitokrom oksidaseterdapat pada kentang tersebut.

Pembuatan ekstrak kentang

Kupas dan cucilah sebuah kentang , hancurkan dengan cepatdan peraslah dengan menggunakan kain kasa sebagaisaringan ke dalam gelas kimia yang berisi 200 ml air suling ,dan tambahkan 10 tetes toluen.Kerjakan perasan itu dengan tangan secara hati-hati,usahakanlah mendapat tepungnya sebanyak mungkin .

Kemudian saringlah kembali filtratnya.

Percobaan terhadap oksidase kentangDasar :Oksidasi berbagai substrat oleh enzim dalam kentang.

Cara :Ke dalam 5 buah tabung reaksi yang kering masukkanlahmasing-masing 5 ml ekstrak kentang.Pada tabung 1. tambahkan 10 tetes larutan fenol 1 %.Pada tabung 2. tambahkan 10 tetes larutan pirokatekol 1 %.Pada tabung 3. tambahkan 10 tetes larutan guaiak 2 %.

Pada tabung 4. tambahkan 10 tetes larutan pirogalol 1 %.Pada tabung 5 tambahkan 10 tetes larutan α naftol 1 %

dalam alkohol 95 %dan 5 tetes larutan fenilendiamin

(pereaksi Nadi).

Kocoklah kelima tabung tersebut, perhatikan perubahanwarna yang timbul. Bila warna belum terjadi , simpanlahtabung-tabung tersebut sampai masa praktikum berikutnya

sesudah tabung ditambah toluen sebagai pengawet.

Hasil :

Kesimpulan :

79



IV. PERAGIAN (demonstrasi)

Ragi roti mengandung enzim-enzim (disebut zymase)yang dapat memecah karbohidrat menjadi alkohol dan

CO2.Kebanyakan karbohidrat dapat diragikan, kecualilaktosa dan galaktosa.Reaksi-reaksi peragian mirip dengan glikolisis dalammamalia., hanya peragian berbeda pada beberapareaksi yang terakhir sehingga hasilnya juga berbeda.

Dasar:Reaksi enzimatik.

Cara :2 gram ragi roti dihaluskan dalam mortir, kemudianditambahkan 20 ml karbohidrat sedikit demi sedikitsambil diaduk sampai rata menjadi suspensi. Setelahrata pindahkan kedalam tabung peragian sedemikian,sehingga bagian yang tertutup penuh (lengan panjang).Biarkan selama 1 jam maka akan terlihat lengan

panjang terisi gas. Uji gas tersebut denganmenambahkan NaOH encer kedalam tabung.Bila gas tersebut CO2, maka ia bereaksi dengan NaOHmembentuk Na karbonat / bikarbonat sehinggaruangan menjadi hampa / tekanan kurang.Ini dirasakan sebagai isapan pada jari.

Lakukan test peragian ini terhadap glukosa, laktosadan sukrosa 2 %.

Reaksi :

Hasil :

Kesimpulan :

80



ANALISA KUANTITATIF DARAH DAN URIN

Pengumpulan urineTiap mahasiswa harus membawa urin 24 jam untuk pemeriksaan.

Cara pengumpulan urin 24 jam :Urin pagi pertama dibuang, misalnya jam 7. 00 pagi.Urin selanjutnya dikumpulkan sampai jam 7.00 pagi keesokanharinya.Seluruh urin tersebut baik disimpan terpisah maupundikumpulkan pada satu tempat, harus disimpan dalam keadaandingin dan ditambah toluen.

Pada hari yang ditetapkan , urin 24 jam harus dibawadan semua sifat-sifat fisiknya harus dicatat dalam suatutabel.

Susunan makanan , kesehatan, suhu udara, dan sebagainya perlu diperhatikan.

Sifat-sifat fisik

Catatlah hal-hal dibawah ini :a. volume dalam milimeter

b. warna, bau dan kejernihanc.

reaksi terhadap lakmus dan kertas nitrazine. Juga reaksi terhadap

fenolftalein dan merah kongo, walaupun tidak bersifat rutind. Berat Jenis

Terlebih dulu ketelitian hidrometer urinometer yang digunakanharus diuji terhadap air suling. Koreksi dapat dilakukan bilakesalahan tidak terlalu besar. Perlu diperhatikan bahwa semuatoluen telah dibuang . Isilah sebuah gelas takar dengan urinmasukkan hidrometer urinometer didalamnya. Sebelum membaca,kita harus yakin bahwa hidrometer urinometer tidak menyentuhdinding tabung.

Catatlah suhu urin

Tiap hidrometer telah ditera pada suhu tertentu. Bila suhu urintidak sama dengan suhu tera, harus dilakukan koreksi sebagai

berikut:

Tambahkan 0,001 pada tiap penambahan suhu 3 derajat diatas suhutera atau kurangi 0,001 pada tiap penurunan suhu 3 derajat dibawahsuhu tera.

Hasil:

81



Volume : Bau :Warna : Kejernihan :Reaksi : Berat jenis :

Penentuan jumlah zat padatCara : Kalikan dua angka terakhir dari BJ urin dengan 2,6

(koefisien Long).Hasilnya menyatakan secara kasar jumlah total zat

padat dalam 1000 ml urin. Dari situ dapatdiperhitungkan jumlah total zat padat dalam urin 24 jam.

Hasil :

Glukosa dalam urin (semi-kuantitatif)Dasar :

Glukosa dalam urin akan mereduksi larutan tembagaalkalis (Benedict), sehingga terbentuk endapan Cu2Oyang berwarna kuning sampai merah.

Penilaian :1+ (+) : hijau kekuning-kuningan dan keruh(kadar glukosa 0,5 –0,1 %)2 + (++) : kuning merah (1-1 ½ %)3 + (+++) : jingga/ oranye atau warna lumpurkeruh (2-3,5 %)4 + (++++) : merah keruh / merah bata (lebihdari 3,5 %)negatif (-) : tetap biru jernih atau kehijau-hijauan danagak keruh.

Cara :Masukkan 2 ½ ml reagen Benedict dalam sebuahtabung reaksi. Tambahkan 4 tetes urin yang diperiksa.Kocok supaya bercampur.Masukkan kedalam penangas air yang mendidih selama5 menit.Angkat tabung tersebut dan kocoklah isinya lalu nilaihasilnya.

Hasilnya :

82



ANALISA KUANTITATIF URIN1. Asam urat ( Franke dan Benedict)

Dasar :Urin mengandung asam urat. Asam urat bersifatmereduksi arsenofosfotungstat menjadiarsenofosfotungstit (berwarna biru). Warna biru inimerupakan kadar asam urat. Makin tinggi kadar asamurat, makin biru warna yang didapat. Warna biru inidibandingkan dengan warna biru larutan standard yangdiperlakukan dengan cara yang sama .

Pereaksi yang dipakai :a. larutan asam arsenofosfotungstat (bersifat racun)

b.

larutan NaCN 5 % (bersifat racun) dengan 2 ml NH4OH perliter.

c. larutan standard asam urat yang mengandung 0,1 mg per 5 ml.

Cara melakukan percobaan :Masukkan 2,5 ml urin ke dalam labu takar 50 ml dan encerkanhingga 50 ml. Ambil10 ml urin encer ini ke dalam labu takar 50 ml. Tambahkan 5ml larutan NaCN5 % ( jangan dipipet, tapi dari buret) dan 1 ml larutanarsenofosfotungstat (juga dari buret ) lalu encerkan sampai 50ml.

Untuk Standard :Ambil 10 ml larutan standard asam urat., masukkan ke dalamlabu takar 50 ml . Tambahkan 5 ml larutan NaCN 5 % dan 1ml larutan arsenofosfotungstat dan encerkan hingga 50 ml.

Untuk blanko :Masukkan 5 ml larutan NaCN 5 % dan 1 ml larutanarsenofosfotungstat ke dalam labu takar 50 ml dan encerkan

hingga 50 ml.

Lakukan pembacaan dengan kolorimeter fotoelektrik dengan filter biru(420 nm).Hitung ekskresi asam urat selama 24 jam.

Keterangan :Cara ini tidak spesifik terhadap asam urat. Zat-zat lain yang mereduksi

juga memberi warna biru. Kendati demikian 80 – 90 % dari warna birudisebabkan oleh asam urat. Untuk mendapat hasil yang tepat dapatdilakukan sebagai berikut :

83



Asam urat dipecah oleh uricase menjadi allantoin. Selisih kadarsebelum dan sesudah pemberian uricase adalah kadar asam urat

Rumus :

Ru-Rb volume urin 24 jamCu = X 0,2 X

Rs-Rb 0,5

Hasil :

2. Pemeriksaan kadar kreatinin (Folin)

Dasar :Reaksi Jaffe yaitu berdasarkan tautomer kreatinin pikrat yang

berwarna merah bila kreatinin direaksikan denganlarutan pikrat alkalis.

Pereaksi yang dipakai :a. larutan asam pikrat jenuh

b. larutan NaOH 10 %c. larutan standard kreatinin yang mengandung 1 mg

kreatinin /ml

Cara melakukan percobaan :Ambillah 3 labu takar 100 ml : A, B dan CTabung A diisi dengan 1 ml urin

B diisi dengan 1 ml larutan standard kreatininC diisi dengan 1 ml air

Tambahkan pada masing-masing tabung 20 ml asam pikrat jenuh dan 1,5 ml NaOH 10 % (dipipet tepat). Kocok perlahan-lahan dan biarkan selama 15 menit . Setelah 15 menitencerkan sampai 100 ml dengan aquadest. Balik-balikkantabung supaya rata, lalu lakukan pembacaan dengankolorimeter fotoelektrik

84



( jangan lebih lama dari 15 menit ) dengan filter hijau ( 540mµ)

a.

Hitunglah ekskresi kreatinin selama 24 jam b. Hitung pula koefisien kreatinin.

Bila pembacaan standard dan unknown berbeda banyak (lebihdari 50 % ). Maka ulangi percobaan dengan urin yangdiencerkan.

Rumus :

Ru – Rb volume urin 24 jam

Cu = X 1 X

Rs – Rb 1

Hasil :

ANALISA KUANTITATIF DARAH

Pada analisa kuantitatif darah, protein harus disingkirkan karena akanmengganggu semua pemeriksaan darah. Protein diendapkan denganasam pikrat, asam fosfotungstat, Zn hidroksida , asam tungstat danasam trichlorasetat.

Persiapan filtrat bebas protein :

1. FILTRAT FOLIN WU

Folin Wu mempersiapkan filtrat yang bebas protein untuk pemeriksaan :- non protein nitrogen- urea- asam urat-

glukosa

85



- kreatinin-

asam amino- chlorida

Dasar :

Protein diendapkan dengan Na tungstat dan asam sulfat, kemudiandisaring,

Cara Kerja :Ke dalam labu erlenmeyer yang bersih dimasukkan 1 cc darah dan7 cc air suling. Labu digoyang perlahan –lahan, kemudiantambahkan 1 cc Na tungstat 10 % dan kemudian1 cc asam sulfat 2/3 N yang diberikan tetes demi tetes sambil terusmenggoyang labu itu. Gelembung tidak boleh terjadi, karena dapatmenyebabkan pengendapan protein tidak sempurna.Bila tidak terjadi perubahan warna maka hal itu biasanya

disebabkan karena terlalu banyak antikoagulan. Perubahan warnaitu akan terjadi bila ditambahkan asam sulfat setetes.Saringlah melalui kertas saring yang kering dan bila filtrat belum

jernih maka harus disaring sekali lagi dengan kertas saring yangsama.

2. FILTRAT SOMOGYI

Filtrat Somogyi dipersiapkan untuk pemeriksaan :- glukosa- urea

Dasar :Zn sulfat dan Ba hidroksida akan mengendapkan protein disampingitu dapat juga mengendapkan antikoagulan ( fluorida dan oksalatyang berlebihan )

Cara Kerja :1 cc darah dicampur dengan 15 cc air dalam labu erlenmeyer .Tambahkan 2 cc Ba hidroksida 0,3 N dan 2 cc Zn SO4 5 %.

Campuran ini dikocok dan tidak boleh terbentyuk gelembung.Saring dan filtrat yang jernih akan terdapat.

GLUKOSA

Pemeriksaan gula darah dapat diambil melalui darah vena ( pemeriksaan makro atau darah kapiler ( darah mikro) .Bahan yang dapat diperiksa dapat :- darah-

plasma- serumDasar pemeriksaaan :

86



I. Sifat mereduksi dari glukosa :1.

Penetapan kolorimetris misalnya metoda Folin Wu danSomogyi Nelson.

2. Penetapan titrimetris (iodometri) misalnya metodeHagedorn –Jensen dan Somogyi –Schaffer –Hartmann.

II. Reaksi enzimatis dengan menggunakan enzim glukosaoksidase.

III. Terbentuknya kompleks berwarna oleh glukosa dengan suatuzat misalnya o-toluidin

PENETAPAN KADAR GULA DARAH (FOLIN-WU)

Dasar : Glukosa dioksidasi oleh larutan tembaga alkalis

sehingga terbentuk kupro-oksida .Kupro-oksida direoksidasi oleh asam fosfomolibdatsehingga terbentuk oksida-oksida mobliden yang dapatlarut dan berwarna biru tua.C6 H12O6 + Cu ++ Cu+

Cu+ + NaPO4 12 Mo 6+ O 2 Cu ++ + 12Mo <6

(biru)

Pereaksi :a. larutan tembaga alkalis yang mengandung Natrium

karbonat, tembaga sulfat dan asam tartrat. b.

Pereaksi asam fosfomolibdat dan Na –tungstat.c. Glukosa standard mengandung 0,1 mg/ ml

Cara Kerja :Sediakanlah 3 tabung Folin Wu, dan masukkan ( dengan

pipet ) kedalam tabung nomor (1) 2 ml filtrat Folin – Wu

(2) 2 ml larutan standard(3)

2 ml air sulung (blanko).

Kedalam masing-masing tabung ditambahkan 2 ml larutantembaga alkalis . Letakkan tabung-tabung itu kedalamair mendidih selama 8 menit tepat dan kemudiandipindahkan kedalam air dingin tanpa dikocok selama 2

– 3 menit .Tambahkan 2 ml larutan asam fosfomolibdat ke dalam tiap-tiap

tabung. Biarkan selama 3 menit agar kuprooksida larut,kemudian encerkan sampai 25 ml dengan air suling,tutup dan bolak balik sampai isinya tercampursempurna.

87



Lakukan pengukuran dengan kolorimeter fotoelektrikdengan memakai filter biru (420 mµ).

Perhitungan :

Ru100Jumlah mg glukosa /100 ml = x 0,2x

Rs0,2

PENETAPAN KADAR GULA DARAH (SOMOGYI- NELSON)

Dasar : Protein darah diendapkan dengan ZnSO4 danBa(OH)2.

Glukosa dioksidasi oleh larutan tembagaalkalis sehingga terbentuk kuprooksida yang akan direoksidasi kembali oleh asamarseno molibdat dan terbentuk larutanyang berwarna .

Pereaksi :a). larutan tembaga alkalis ( Somogyi)

b). larutan standard glukosa (0,1mg/ml)c). pereaksi arseno moblidat (Nelson)

Cara Kerja :Sediakan 3 tabung Folin Wu , masukkan (dengan pipet)

ke dalam tabungnomor (1) 2 ml filtrat Folin – Wu

(2) 2 ml larutan standard(3) 2 ml air suling (blanko)

Kedalam masing-masing tabung ditambahkan 2

ml larutan tembaga alkalis.Letakkan tabung-tabung itu kedalam air mendidih selama8 menit tepat dan kemudian pindahkan ke dalam airdingin tanpa dikocok selama 2 – 3 menit.Tambahkan 2 ml larutan asam fosfomolibdat ke dalamtiap-tiap tabung. Biarkan selama 3 menit agarkuprooksida larut, kemudian encerkan sampai25 ml dengan air suling, tutup dan bolak balik sampaiisinya tercampur sempurna.Lakukan pengukuran dengan kolorimeter fotoelektrikdengan memakai filter biru (520 mU).

88



Perhitungan :

Ru 100

Jumlah mg glukosa / 100 ml = X 0,2 XRs 0, 1

KALSIUM

Kalsium di dalam tubuh penting untuk: pembentukan tulang dangigi, iritabilitas saraf, kontraksi otot, pembekuan darah.

Pengendapan dan pengeluaran Ca dari tulang diatur secarahormonal oleh hormon paratiroid dan calcitonin.

Di dalam plasma dan serum, Ca terdapat dalam 3 bentuk :1. terikat pada protein2.

terionisasi3. terikat pada zat-zat lain seperti sitrat

Ke tiga bentuk ini dapat ditetapkan secara sendiri-sendiri., tetapiyang sering ditetapkan

ialah Ca total.Kadar normal kalsium dalam serum adalah 9 – 11 mg % ( 4,5 -

5,5 mEk/liter).

PENETAPAN KADAR KADAR KALSIUM (KRAMER &TISDALL). Modifikasi CLARK-COLLIP

Dasar :Kalsium diendapkan dari serum sebagai garam oksalat.Endapan ini kemudian dicuci dan dilarutkan dengan asamencer, lalu dititrasi dengan KMnO4 standard.

Ca

++

+ C2O4

--

Ca C2O4 Ca C2O4 + H2SO4

H2 C2O4 + CaSO4

5 H2 C2O4 + 2 KMn O4 + 3 H2SO4

K 2SO4 + MnSO4 +10 CO2 + 8H2O

Pereaksi :1. Larutan amonium oksalat 4 %

89



2. Larutan amonium hidroksida 2 %3.

Kalium Permanganat 0,01 N : 1 ml ekivalen dengan0,2 mg Ca

4. Asam sulfat 1 N

Cara :Sediakan 2 tabung sentrifuse 15 ml. Masukkan (

dengan pipet volumetrik)2 ml serum ke dalam tabung-tabung tadi. Tambahkan 2ml air dan 1 ml larutan amonium oksalat tutup tabungdengan secarik plastik dan diikat dengan karet. Campurdengan baik dan biarkan selama 30 menit. Pusingkanselama 15 menit dengan kecepatan 1500 rpm. Buanglah

cairan diatasnya dengan hati-hati.jangan sampaiendapan terbuang. Letakkan tabung tadi terbalik diatasrak dan biarkan selama 5 menit. Keringkan muluttabung dengan kertas saring.

Cucilah endapan itu dengan larutan amoniumhidroksida encer seperti berikut: Tambahkan 3 mllarutan amonium hidroksida pada endapan ( dengan

pipet) dan campur dengan baik. Tutup lagiPusing tabung selama 5 menit dan pisahkan cairan atasseperti tadi.

Tambahkan 2 ml asam sulfat 1 N dengan meniup pipetmohr 5 ml untuk memudahkan larutnya. Letakkantabung-tabung tadi dalam penangas air mendidih selama1 menit, perhatikan bahwa semua endapan telah larut.Lakukan titrasi selagi panas dengan larutan kalium

permanganat 0,01 N sampai warna merah muda yangtampak dapat bertahan sekurang-kurangnya selama 1menit. Apabila perlu selama titrasi tempatkan tabungtadi di dalam penangas air pada suhu 70 –75 o C .

Titrasi dilakukan dengan buret mikro.

Blanko ditetapkan dengan titrasi terhadap 2 ml air dan2 ml asam sulfat 1N.

Perhitungan :

100Kadar kalsium serum ( mg%) = ( x-b ) X

0,2 X

90



2

dimana :x = jumlah ml KMn O4 yang dipakai untuk

titrasi serum ( rata-

rata) b = jumlah ml KMn O4 yang dipakai untuk

titrasi blanko.

Perhitungan Kadar Kalsium

PROTEIN

Protein total di dalam plasma kira-kira 7 – 7,5 g / ml , sehinggamerupakan jumlah yang terbesar dari zat-zat padat dalam plasma.Protein plasma ini terdiri dari :

- simple protein- conjugated protein misalnya glikoprotein dan beberapa

lipoproteinPemisahan fraksi-fraksi protein ini biasanya digunakan zat pelarut atauelektrolit dengan dasar adanya sifat kelarutan masing-masing yang

berlainan . Ini adalah dasar pemisahan secara “ salting out”.Selain itu pemisahan dapat dilakukan berdasarkan atas

perbedaan muatan listrik dalam larutan buffer dengan pH tertentu (elektroforesa).

Protein plasma dipisahkan dalam 3 kelompok utama yaituALBUMIN, GLOBULIN dan FIBRINOGEN dengan menggunakan

Na atau amonium sulfat. Karena analisa fraksi-fraksi proteindibutuhkan juga analisa nitrogen, maka lebih baik digunakan natrium

sulfat.Beberapa cara penetapan serum protein total dan fraksi-fraksinyaadalah:

1)

destruksi protein secara Kjeldahl dan kemudian ditetapkankadar nitorgen secara titrasi atau kolorimetrik.Cara ini memerlukan alat-alat yang teliti sekali danmemerlukan waktu lama .Fibrinogen plasma ditentukan dalam bentuk fibrin. Bilacara ini dikerjakan maka akan didapatkan hasil yang dapatdipercaya.

91



2) ditentukan BJ serum atau darah , kemudian kadar proteintotal plasma didapat dengan perhitungan :

Kadar protein total dalam plasma = 369 X (BJ plasma –1,007 )

( g / 100 ml )

1,007 = BJ ultra filtrat plasma bebas protein

Fraksi-fraksi perotein didapat dengan cara :Fibrinogen serum dipisahkan pada waktu pembuatanserum oleh karena terjadi endapan fibrin.Globulin dapat dipisahkan dari albumin dengan caradiendapkan dengan Ba – sulfat. Kemudian tiap fraksidiatas dapat ditentukan dengan :

1) analisa kadar nitrogen masing-masing fraksi

2)

kolorimeter direk dari albumin, sehingga didapat kadaralbumin.Kadar globulin = kadar protein total –kadar albumin

3) elektroforesa

Angka-angka normal :Protein total 7,0

– 7,5 g %Albumin 52,0 – 65 % ……………... 3,8 - 6,7g %

Globulin 29,5 – 54 % ……………... 3,2 - 5,6g %

alfa 1 2,5 - 5% …………….. 0,1- 0,4 g %

alfa 2 7,0 - 13 % …………….. 0,4

- 1,2 g % beta 8.0 - 14 % ………….…. 0,5- 1,1 g %

gamma 12,0 - 22 % …………….. 0,5- 1,6 g %

Fibrinogen 6,5 % …………….. 0,5g %

A/G ratio =1,2 : 1

92



Perubahan –perubahan abnormal pada protein plasma :1.

Albumin- kadar meninggi : hal ini jarang didapat, misalnyaterjadi pada hemokonsentrasi ataudehidrasi.

- kadar menurun : a) malnutrition b) insuffisiensi pankreas sehingga

pencernaan protein berkurang

c) absorpsi protein berkurang , mis pada diare

d) kehilangan protein yang berlebihan misalnya padasindroma nefrotik atau padakebakaran oleh karena

terjadi ekstravasasi.e) tidak dapat mensintesa albumin

misalnya pada kerusakan heparyang berat oleh karena sirosishepatis.

2.

Globulin- alfa globulin . Kadar meninggi :a) pada demam yang akut oleh karena terjadi peradangan

dan kerusakan jaringan. b) tbcc) karsinomaPada beberapa penyakit ada hubungan antara penurunankadar albumin dan kenaikan alfa globulim, misalnya :- nefrosis- sirosis- penyakit-penyakit infeksi akut, pneumonia, demam

rematik.

- beta globulin . Kadar meninggi :Biasanya berhubungan dengan akumulasi lipid yang adahubungan dengan atherosclerosis.

- gamma globulin. Kadar meninggi :Biasanya hiper gamma globulinemia disebabkan olehkarena :

- multiple myeloma- penyakit Waldenstrom- lymphoma

Kadar menurun :Hipo/ a-gamma globulinemia biasanya didapat secaraherediter dimana tubuh tidak dapat membuat zat anti bila adaantigen.

93



3.

FibrinogenAfibrinogenemia dan fibrinogenpenia terdapat secara herediterdimana dapat terjadi kematian setelah kecelakaan karena

perdarahan yang tidak dapat berhenti.

Afibrinogenemia / fibrinogenpenia juga dapat terjadi pada:1)

komplikasi kehamilan oleh karena kematian janin dalamkandungan( intrauterine fetal death)

2) komplikasi operasi toraks atau prostat oleh karena terjadiaktivitas fibrinolitik berlebihan.

PENETAPAN KADAR PROTEIN SERUM SECARA FRAKSI (KINGSLEY)

Dasar : Protein total serum ditetapkan secara kolorimetris denganmembandingkan

warna ungu dari serum yang diperiksa dengan larutanstandard. Globulin serum diendapkan dengan Na – sulfatdan sisanya yang mengandung albumin warnanyadibandingkan dengan standard.Kadar Globulin = Kadar Protein Total – Kadar Albumin

Pereaksi :1) pereaksi Biuret2) larutan standard protein mengandung 0,007 g / 2ml3) Na sulfat 23 %4) Eter USP

Cara Kerjaa) Protein Total :

Masukkan 1 ml serum dalam gelas kimia dengan pipet 1 mldan kemudian ditambahkan dengan pipet 20 ml Na sulfat 23% pada suhu 30 o C ( ambil dari penangas air dan ukurdengan termometer). Gelas kimia diputar-putar agar isinyatercampur.Ambil 2 ml campuran yang keruh ini dan masukkankedalam tabung kolorimeter.

Lakukan dalam duplo.Berikan tanda dan simpan sampai tingkatan (e).Masukkan campudan yang keruh ini yang masih adakedalam 2 tabung reaksi kering, sama banyaknya dandigunakan pada tingkatan (e)

b) Albumin:Dua tabung centrifuge yang dipersiapkan pada

tingkatan (a) ditambahkanmasing- masing 4 ml eter, kemudian ditutup dengan

tutup karet dan dikocok

94



keras-keras. Kemudian tabung-tabung ini dipusingkandengan tutupnya dengan

kecepatan 1500 rpm selama 4 menit.Diambil 2 ml cairan jernih di bawahnya yang masing-masingdimasukkan dalam 2 tabung kolorimeter dan disimpan sampai

tingkatan (e).

c) Standard :Dua ml larutan standard disimpan dalam tabung kolorimeterdan disimpan sampai tingkatan (e).

d) BlankoDua ml Na Sulfat 23 % dan 4 ml pereaksi biuret dicampurdalam sebuah tabung kolorimeter.

e) Kedalam dua tabung (a), dua tabung (b), dan satu tabung (c)

ditambahkan 4 ml pereaksi biuret dan 2 ml eter. Keenamtabung ini ditutup dan dikocok keras-keras selama 15 detik,untuk melarutkan lipid dan pigmen tertentu. Pusingkanselama 5 menit pada kecepatan 1500 rpm.

f) Pengukuran warna:Setelah dipusing maka ukurlah dengan kolorimeterfotoelektris EEL dengan filter hijau.

Hitunglah kadar protein total, albumin dan globulin dalam 100 ml serum danlakukan

koreksi terhadap blanko.Rumus:

Kadar protein total = Ru-Rb X 0,007 X 100 (g % )Rs-Rb 2/21

Kadar albumin = Ru-Rb X 0,007 X 100 (g % )Rs-Rb 2/21

Kadar globulin = Protein total (g%) - Albumin (g%)

Hitungan:

95



KOLORIMETRI

DasarBahan kimia bersifat dapat menyerap dan menghantarkan cahaya,suatu larutan mempunyai warna kecuali warna yang kita lihat.Ternyata bahwa jumlah cahaya yang diserap berbanding langsungdengan jumlah zat yang menyerapnya.Banyak cara dalam analisa kuantitatif didasarkan atas pembentukanlarutan berwarna sedemikian rupa sehingga intensitas warna tersebut

dapat digunakan sebagai ukuran konsentrasi zat yang diperiksa .Penggunaan warna sebagai indeks konsentrasi dikenal sebagaikolorimetri , dan alat yang dipergunakan untuk penilaian ini disebutkolorimeter. Cara - cara kolorimetri ini mudah, cepat dan cukup peka,sehingga memungkinkan pengukuran zat-zat dalam jumlah kecil.Kolorimetri berdasarkan atas hukum-hukum Beer dan Lambert ,menyatakan bahwa bila suatu berkas cahaya monokhromatis melaluisuatu larutan, intensitasnya akan berkurang secara exponensiil sesuaidengan panjang larutan yang dilaluinya.

Iolog = KI

(1)I

Dimana Io : intensitas cahaya datangI : intensitas cahaya keluar

K : konstanta yang tergantung dari panjang gelombang. gelombang

cahaya, sifat dan konsentrasi larutan

I : panjang larutan yang dilalui cahaya dalam cm.

Hukum Beer menyatakan bahawa intensitas cahaya berkurang sesuaidengan kenaikan konsentrasi zat penyerap cahaya yang dilaluinya.

Iolog = K’C

(2)I

Dimana K’ : konstanta yang tergantung dari panjang gelombang. gelombang

96



Cahaya, sifat larutan dan panjang kolom larutanyang dilalui cahaya.

c : konsentrasi zat dalam larutan ( g per liter, g L l/liter dsb)

Gabungan ( 1) dan (2) menghasilkan hukum Beer-Lambert :

Iolog = kcl

( 3)I

Dimana K : konstanta yang tergantung dari panjang gelombang dansifat larutan

Berdasarkan hukum tersebut diatas, jumlah atau konsentrasi sesuatuzat dalam larutan dapat ditentukan dengan membandingkannyaterhadap suatu larutan lain yang mengandung zat yang sama dalam

jumlah yang diketahui ( larutan standard) . Dalam hal ini perludiperhatikan bahwa larutan-larutan tersebut harus diperlakukan dengancara yang sama pada saat yang sama pula.

Sering terjadi beberapa macam zat yang berada dalam suatu larutanmenyerap gelombang cahaya yang sama dan dengan demikianmengganggu pemeriksaan. Peristiwa ini dikenal sebagai interferensidan dapat diatasi dengan mudah, yaitu dengan membuat suatu larutan

blanko yang mengandung semua bahan yang dipergunakan kecuali

bahan yang diperiksa tersebut. Terhadap larutan blanko ini distelsedemikian sehingga memperlihatkan pembacaan penghantaran (transmittace) 100 %.

Intensitas cahaya yang keluar dari suatu larutan dapat diukur secara :1. visuil2. fotoelektrik

KOLORIMETER FOTOELEKTRIK

97



Pada kolorimeter fotoelektrik, cahaya yang keluar dari suatularutan diukur dengan perantaraan sel-sel fotoelektrik(fotosel) yang akan menghasilkan arus listrik sebandingdengan intensitas cahaya yang mengenainya . Arus yangtimbul diukur dengan mikro ampermeter., galvanometer, atau

gabungan tahanan variabel dan galvanometer. Prinsip inidigunakan baik pada fotometer yang menggunakan filter (misalnya kolorimeter fotoeletrik Klett-Summerson) maupunspektrofotometer ( misalnya spektrofotometer ColemanJunior atau Beckman).

Sel-sel fotoelekterik walaupun tidak sepeka mata dalam mengenal (deteksi ) cahaya yang terlihat , adalah lebih baik dalamkemampuannya membandingkan atau mengadakan penilaian intesintascahaya secara kuantitatif, Keuntungan cara-cara fotoelektrik terhadapcara-cara visuil adalah:

1.

Faktor-faktor subyektif yang terdapat pada cara visuil dapatditiadakan.

2. Ketelitian lebih besar3.

Analisa juga dapat dilakukan terhadap warna-warna yangmengadakan interferensi.

Kecuali keuntungan pertama, semuanya tadi disebabkan penggunaancahaya yang hampir monokhromatis. Ini dicapai dengan menyaring

cahaya dari suatu lampu pijar melalui kaca berwarna ( filter) sehinggadiperoleh spektrum cahaya yang sempit. Pada spektrofotometer,cahaya monokromatis diperoleh dengan cahaya dengan prisma ataukisi-kisi ( grating) dan memilih panjang gelombang yang diinginkanmelalui suatu celah yang sempit, cahaya yang diperoleh lebih murnidaripada dengan menggunakan filter dan hukum Beer – Lambertdiikuti dengan lebih baik.

Transmittance adalah kemampuan larutan untuk menghantarkancahaya, yaitu perbandingan antara intensitas cahaya yang melalui danyang mengenai larutan :

IT =

(6)Io

Dengan menggunakan hukum Beer- Lamber t:

T = 10 - kclLog T = -kcl

-Log T = kcl atau

98



A = kcl(7)

dimana A : asorbance ( bukan optical density, absorbancy)

Konstante k ( persamaan 3 dan 7 ) lebih umum dikenal sebagaiabsorptivitas “a” ( bukan absorbancy index, koefisien extingsi), dimanakadar zat menyerap cahaya dinyatakan dalam g / literHasil kali absorptivitas dengan berat molekul disebut “ molarabsorptivity “ dengan simbol E dan mempunyai satuan M-1 cm -1 .Contoh suatu zat dengan E = 14.000 dan pada pembacaan denganfotokolorimeter menunjukkan A = 0,850 mempunyai kadar

AC =

E

1

0,850

= X 1 (cm)10.000 (M-1 cm –1)

= 6,07 X 10 –5 M

Pembacaan dengan kolorimeter fotoelektrik dikemukan sebagai :1 . Persentasi penghantaran ( % T)2. Log persentasi penghantaran ( log % T)3. Absorbance A = 2 – log % T = - log 1 ( 0< T < 1 )

Hubungan antara ketiga pembacaan ini adalah sebagai berikut :

T Log T % T Log % T A

Larutan encer 1 0 100 2 0

Larutan pekat 0 -2 0 0 2(0,01) (log 1) ( -

log 0,01)= 2

– log 1

99



Catatan : nilai A dapat lebih besar dari 2, mencapai tak terhingga .

Pada kolorimeter Klett-Summerson pembacaan pada skala ( R) adalah500 xA

Keuntungan daripada cara (2) dan (3) adalah dalam membandingkanhasil pembacaan terhadap konsentrasi zat diperoleh garis lurus,sehingga untuk peneraan ( kalibrasi) hanya diperlukan 2 titik saja.Dengan Cara (1) akan didapat suatu garis lengkung yang memerlukan

beberapa titik untuk membuat suatu kurve kalibrasi.

Kalau pada kolorimeter visuil pembacaan dilakukan denganmengubah-ubah panjang kolom cairan yang dilalui cahaya ( intensitascahaya keluar sama), maka pada kolorimeter fotoeletrik yang

dibandingkan adalah intensitas cahaya yang keluar ( kolom cairan yangditempuh cahaya sama ). Dengan demikian, dalam perhitungan denganmenyetel pembacaan blanko pada 100% T (A=0), diperoleh

perhitungan :

Cu Ru=

Cs Rs

atauRu

Cu = X CsRs

(8)

Dan dengan koreksi :

Ru Vu Volume tertentu atau totalCu = X Cs X X(9) Rs Vs Volume

bahan yang dipakai

100



SKEMA SPEKTROFOTOMETER

A : Sumber cahaya G : cuvetB , C, E : cermin II :

phototubeD : celah sinar masuk dan keluar I :amplifierF : prisma

Penggunaan kolorimeter fotoelektrik

Dalam mempergunakan kolorimeter fotoelektrik , pada prinsipnya alatterlebih dahulu diatur agar menunjukkan pembacaan 100 % T ( pada

panjang gelombang yang dipilih) terhadap larutan blanko dan 0 % T (atau A = 2) bila jalan cahaya ditutup.Selanjutnya dibaca larutan standard dan larutan yang diperiksa.

101



ELEKTROFORESIS

Dasar teori

Sebagian besar molekul biologis mempunyai muatan listrik. Besarnyamuatan ini tergantung pada jenis molekul , pH dan komposisi darimedium. Bila pada molekul bermuatan ini, yang terdapat dalamlarutan, diberi medan listrik maka molekul bermuatan positif akan

bergerak kearah kutub negatif dan sebaliknya. Prinsip ini digunakandalam teknik elektroforesis untuk memisahkan molekul dengan muatanyang berbeda.Kecepatan bergerak olekul tergantung pada viskositas medium ukurandan besar molekul dan muatan listrik tersebuit.

Pada mulanya elektroforesis dilakukan dengan menggunakan mediumcair ( “ moving boundary electrophoresis”) , yang pertama kalidiperkenalkan oleh Tisellius kurang lebih 50 tahun yang lalu.

Yang banyak digunakan sekarang elektroforesis dengan menggunakanmedium padat yang dicelup dengan larutan buffer ( “ zoneelectrophoresis”).

Medium yang digunakan antara lain :

1. Kertas saringCara ini cukup murah dan mudah . Kelemahan elektroforesiskertas, bercak yang didapat tidak tegas karena adsorpsi molekul

pada kertas.

2. Selulosa asetatDengan medium ini faktor adsorpsi menjadi minimal, sehingga

pemisahan berlangsung sempurna dan bercak yang didapat berbatastegas. Oleh karena itu terhadap senyawa yang telah terpisah ini

dapat dilakukan pemeriksaan kuantitatif dengan mengelusi senyawatersebut.Kelebihan medium ini, hanya diperlukan waktu yang singkat ( 1 jam)

dibandingkan dengan kertas yang memerlukan waktu 1 malam .akan tetapi selulosa asetat lebih mahal dibandingkan kertas.

3. Gel agarOleh karena medium ini transparan, maka dapat dilakukan

pemeriksaan fotometris. Agar merupakan pilihan utama untukimuno elektroforesis. Medium ini juga murah dan mudah didapat.

102



4. Gel patiButiran pati pada pemanasan akan menggembung dan terhidrolisismembentuk gel. Ukuran pori gel tergantung pada cara penyiapan ,

jenis pati yang digunakan, pH dan sifat larutan bufer yang dipakai.Diameter pori gel pati ini yang menyebabkan molekul terpisah

berdasarkan ukuran molekul, disamping juga muatan listrikmolekul tersebut. Efek ultrafiltrasi ini memberikan resolusi yangtinggi, sehingga plasma protein dengan cara ini akan terpisahmenjadi banyak pita. Diperlukan lebih banyak gel dengan cara inidibandingkan dengan agar dan penyiapannya dieprlukan latihan.

5. Butiran patiMedium ini dibuat dengancara mencetak butiran pati dalam larutan

bufer menjadi lempengan . Elektroforesis dengan cara ini sesuaiuntuk pemisahan yang memerlukan sampel yang banyak , misal

pada pemisahan dan isolasi isoenzim.

6. Gel -poliakrilamidPoliakrilamid merupakan bahan yang paling banyak digunakanakhir-akhir ini. Oleh karena transparan, pada gel ini dapat dilakukan

pemeriksaan fotometris . Selain itu dengan cara ini didapat hasildengan daya pisah yang tinggi dan ukuran pori dapat diatur.

Larutan BufferPemilihan pH larutan buffer, tergantung pada jenis campuran senyawa

yang diperiksa, tetapi pada umumnya pemisahan yang baik didapat pada titik isoelektrik (pI) salah satu senyawa. PH yang dipilih tidak boleh menyebabkan perubahan kimia atau denaturasi molekul pada pemeriksaan . Untuk pemisahan protein biasanya digunakan larutan buffer dengan ph = 8,6.

“lonic strength” larutan buffer yang digunakan berkisar antara 0,05 –0,15.

Medan listrikDiperlukan sumber listrik arus searah yang memberikan voltase atau

aliran yang konstan . Untuk pemisahan pada suhu kamar, umumnya

digunakan medan listrik sebesar 2-8 V/ cm . Medan listrik lebih besardari 10 V / cm akan menyebabkan panas sehingga terjadi penguapanair. Akibatnya larutan buffer dalam tanki buffer akan mengalir untukmenggantikan air yang hilang , sehingga dapat menyebabkan

berpindahnya zona yang telah terpisah bahkan denaturasi senyawatersebut.

Ada alat elektroforesis yang dilengkapi dengan sistem pendingin sehinggadapat digunakan medan listrik 100 V/cm . Keuntungan elektroforesisdengan voltase tinggi adalah waktu pemisahan yang cepat.

103



KROMATOGRAFI KERTAS SARING

Penggunaan kromatografi kertas saring mengalami kemajuan pesatuntuk pemisahan , identifikasi dan penentuan secara kuantitatif dariasam-asam amino , berbagai jenis gula , senyawa-senyawa steroid dan

zat-zat lainnya . Dengan metode berikut ini analisa dapat dilakukansamapai tingkat 0,1 mikrogram.

Dasar :Campuran zat-zat yang terabsorpsi pada kertas saring dapat dipisahkandengan cara melewatkan pada kertas saring suatu pelarut organik yangdijenuhkan dengan air dimana campuran zat-zat tersebut dapat larut.Ketika pelarut dialirkan melalui kertas saring , ia membawa sertacampuran zat-zat dimana masing-masing komponennya akanterdistribusi pada kertas dengan kecepatan yang berbeda-beda yang

tergantung pada beberapa faktor.Komponen-komponen tersebut akan menetap pada tempat-tempat yang

berlainan dan lokalisasinya dapat ditunjukkan dengan reaksi warnaatau dengan cahaya ultra violet jika zatnya dapat berfluoresensi.Untuk analisa kualitatif, digunakan nilai Rf yang untuk tiap jenis zat

pada kondisi tertentu mempunyai harga spesifik.

Jarak yang ditempuh suatu zat padakertas

Rf =Jarak yang ditempuh oleh kertas

Nilai Rf suatu zat tergantung pada beberapa hal, antara lain :-

sifat pelarut ( jumlah dan susunannya)- suhu-

jenis kertas saring yang dipakai- zat-zat lain yang mempengaruhi distribusi zat antara air dan

pelarut-

cara yang digunakan

Pada analisa kuantitatif, intensitas warna bercak bahan pada kertasdijadikan dasar pengukuran kolorimeter atau spektrofotometri.

Cara :a. Penyiapan kertas untuk kromatografi

Siapkan suatu kertas saring Whatman no 1 dengan ukuran lebar2,60 cm dan panjang 16 cm. Jagalah kertas tetap bersih danusahakan sentuhan jari tangan sekecil mungkin . Buatlah suatulingkaran berdiameter kira-kira 1,5 mm dengan pensil ( secarahalus) pada jarak kira-kira 2,5 cm dari ujung kertas. Jepitlah ujung

104



kertas yang lain dengan suatu penjepit pada jarak 0,6 cm dariujungnya.

b. Penyiapan tabung

Sediakan gelas kimia 500 ml yang bersih dan kering. Letakkan palang kayu diatasnya , kemudian sisipkan kertas kromatografi pada palang tersebut sedemikian rupa sehingga palang kayu berfungsi sebagai penyangga . Gelas kimia dibilas dengan beberapaml pelarut ( larutan asam asetat dalam butanol yang dijenuhkandengan air ) dan biarkan mengering. Sesudah itu masukkan 30 ml

pelarut ke dalam gelas kimia setinggi 1 cm.

c. Penyiapan dan proses khromatografiTeteskan bahan pada tanda yang telah dilingkari dengan pensil pada

jarak 1/3 dari tepi kertas, jadi pada satu kertas dapat diteteskan

dua buah bahan.Untuk penetesan bahan digunakan pipet Mohr 0,2 ml yangdicelupkan ke dalam larutan asam amino dan biarkan mengering .Kemudian usaplah ujung pipet dan sentuhkan pada lingkaran yangtelah ditandai pensil pada kertas. Diameter bercak bahan tidak

boleh dari 5 mm. Bercak dikeringkan selama 5 –10 menit padasuhu kamar. Jika bercak sudah kering, tempatkan kertas secaravertikal dalam gelas kimia dengan palang kayu sebagai penyangga.Ujung kertas yang berdekatan dengan bercak dicelupkan ke dalam

pelarut sampai menyentuh dasar bejana, tetapi ke dua sisi tepikertas tidak boleh menyentuh dasar bejana, tetapi ke pelarut tidak

boleh lebih tinggi dari bercak bahan.Catat waktunya , sesudah 1,5 jam atau setelah pelarutnya mencapai

jarak 1,25 dari ujung ketas, angkatlah kertasnya dan segeralakukan penandaan batas yang ditempuh dengan pensil. Biarkankertas mengering semalaman di udara dalam suatu ruangan ataudalam oven pada 100 o C selama 5 menit.

Pengamatan dan hasil :Gambar dan ceritakan !

105



106



107



108



109



110



111



Buku Praktikum Histo

Documents