BSc Biochemie 4.Semester VL Proteinchemie Proteasen · KATALYTISCHE TRIADE Numbering: bovine chymotrypsinogen 12 Die katalytische Triade kann von unterschiedlichen Strukturen gebildet

Proteasen

BSc Biochemie 4.Semester – VL Proteinchemie

Leipzig, 31.05.2019

Antje Garten

Titel der Präsentation | Untertitel

Einrichtungsname

LERNZIELE

2

• Klassifizierung der Proteasen

• Katalytische Mechanismen


Einrichtungsname

PROTEASEN SIND HYDROLASEN

3

Peptidbindung Stabil durch Doppelbindungscharakter Halbwertszeit Hydrolyse > 10 Jahre

Proteasen katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen

(Proteolyse)


Einrichtungsname

BEDEUTUNG VON PROTEASEN

4

Verdauungsenzyme, Spaltung von Proteinen: Chymotrypsin, Trypsin, Pepsin Biosynthese von Enzymen, Peptidhormonen: inaktive Vorläufer werden gespalten Signaltransduktion: inaktive Vorstufen Abbau von Proteinen in der Zelle: falsch gefaltet, alt, -> gezielter Abbau Immunsystem: Präsentation von bakt./vir. Fragmenten Abbau, Aktivierungskaskade Gerinngungssystem: Proteasekaskaden


Einrichtungsname

5

KLASSIFIZIERUNG VON PROTEASEN

Sechs Unterklassen (MEROPS-Datenbank) Serinproteasen Threoninproteasen (described first in 1995) Cysteinproteasen (auch “Thiolproteasen”) Aspartatproteasen Glutamatproteasen (described first in 2004) Metalloproteasen alle spalten Peptidbindungen, Unterschiede in: Struktur Katalysemechanismus meist lösliche Proteine, aber auch membranständige Proteasen bekannt

http://merops.sanger.ac.uk/index.shtml


Einrichtungsname

MEROPS

6

Datenbank aller proteolytischer Enzyme, ihrer Substrate und Inhibitoren

X12.345

S, C, T, A, G, M, U

Clan

42 Clans e.g. clan PA

Chymotrypsin type peptidase Common ancestor

Similar fold

Family

176 families e.g. family S1

Chymotrypsin A type peptidase

Sequence

1816 proteases e.g. trypsin 1

S01.151

Primary structure

Tertiary structure



Einrichtungsname

PROTEASEN HABEN UNTERSCHIEDLICHE

STRUKTUREN

7

Beispiele


Einrichtungsname

ZWEI PRINZIPIELL UNTERSCHIEDLICHE

MECHANISMEN

8 Boris Turk, Nature Reviews, 2006, 5, 785

kovalent Säure-Base


Einrichtungsname

UNTERSCHIEDLICHE SUBSTRATE

9

Cathepsin L Cathepsin H Cathepsin X

Peptid-Substrat


Einrichtungsname

SERINPROTEASEN

10

6 Unterklassen (MEROPS-Datenbank)

Serinproteasen

Threoninproteasen

Cysteinproteasen

Aspartatproteasen

Glutamatproteasen

Metalloproteasen



Einrichtungsname

SERINPROTEASEN

11

Serinproteasen – Trypsin, Chymotrypsin, Thrombin, Elastase, ....

First structures • bovine Chymotrypsin, 1967 David Blow • bovine Trypsin, Stroud & Dickerson • porcine Elastase, Shotton & Watson

-> Asp...His...Ser-Triade • untereinander mit H-Brücken stabilisiert • Asp nicht Lösungsmittel-zugänglich


Einrichtungsname

KATALYTISCHE TRIADE

12 Numbering: bovine chymotrypsinogen

Die katalytische Triade kann von unterschiedlichen Strukturen gebildet werden!


Einrichtungsname

SPEZIFITÄT DURCH SPEZIFITÄTSTASCHE

– DIVERGENTE EVOLUTION

13

Gegenwart bestimmter Aminosäureseitenketten in der Substrat-bindenden Grube -> Substratspezifität der Serinproteasen Chymotrypsin Platz für große hydrophobe Reste Trypsins negativ geladenes Asp -> basische Seitenketten (Arg, Lys), Elastase -> Grube ist durch sperrige Val- und Thr-Reste „verbaut“ -> spaltet Proteine bevorzugt an Aminosäuren mit kleinen Seitenketten.


Einrichtungsname

Konver

gente

Evolution

14

D-H-S H-D-S S-D-H D-H-S H-D-S S-D-H

D-H-S H-D-S S-D-H

D-H-S H-D-S S-D-H


Einrichtungsname

SERINPROTEASEN: S1-FAMILIE,

CHYMOTRYPSIN

15

Clan PA

≈


Einrichtungsname

SERINPROTEASEN: S8-FAMILIE,

SUBTILISIN

16

Clan SB


Einrichtungsname

SERINPROTEASEN: S10 FAMILIE,

CARBOXYPEPTIDASE Y

17

Clan SC


Einrichtungsname

CHYMOTRYPSIN

18

Topologie

Struktur weist zwei antiparallele β-Fass-Strukturen auf


Einrichtungsname

SUBTILISIN

19

andere Struktur

aber

identische

katalytische Triade

Topologie


Einrichtungsname

VORAUSSETZUNGEN

20

Chymotrypsin

Substrat in der Bindungstasche


Einrichtungsname

CHYMOTRYPSIN

21


Einrichtungsname

SERIN-PROTEASE

22

Kovalente Katalyse – 2 Schritte


Einrichtungsname

„CHARGE-RELAY“ SYSTEM

23

Asp102 Elektrostatische

Katalyse

His57 Säure/Base

Katalyse

Ser195 Kovalente Katalyse

electrons

protons


Einrichtungsname

TETRAEDRISCHER ÜBERGANGSZUSTAND

24

Nukleophile OH-Gruppe des Ser greift zu spaltendes Amid an Serin wird mit Hilfe eines Imidazols deprotoniert -> thermodynamisch ungünstig, nur möglich, da stabilisiert von deprotoniertem Asparaginsäurerest

2.Protonübergang von His57 auf Substrat bildet Amin – Gruppe ; Säurekatalyse

durch Wasserstoffbrücken

stark stabilisiert


Einrichtungsname

ACYL-ENZYM-ZWISCHENPRODUKT

25

Freisetzung der Amin-Gruppe, die durch Wasser ersetzt wird


Einrichtungsname

WIEDERHERSTELLUNG DES AKTIVEN

ENZYMS

26

Tetraedrischer

Übergangszustand

Aktives Enzym


Einrichtungsname

STABILISIERUNG DES

ÜBERGANGSZUSTANDES

27

sp2

trigonal planar

sp3

tetraedrisches Intermediat

2 x neue H-Brücken


Einrichtungsname

STABILISIERUNG DES

ÜBERGANGSZUSTANDES

28

Low Barrier Hydrogen Bond Energy 40-80 kJ

pKa < 2-3 units D A H D A H

Normale Wasserstoffbrücke Energy 12-30 kJ

pKaA ~ pKaD

In the complex enzyme-substrate

In the complex enzyme-tetrahedral intermediate


Einrichtungsname 29

ELASTASE

pH 5

pankreatische Elastase (Schwein) Substrat 7-mer YPFVEPI Struktur des Acyl-Enzyms


Einrichtungsname

ELASTASE

30

pankreatische Elastase (Schwein) Substrat 7-mer YPFVEPI

pH 9

Struktur des zweiten tetrahedrischen Übergangszustands


Einrichtungsname

NACHWEIS FUER

SERINPROTEASEN

31

-> durch aktives Ser


Einrichtungsname

ACTEYLCHOLINESTERASE

(SERINPROTEASE) INHIBITOREN I

32

Nervengift Nowitschok

2018, S. und J. Skripal

-> sind Nervengifte


Einrichtungsname

ACTEYLCHOLINESTERASE

(SERINPROTEASE) INHIBITOREN II

33

Parathion (Synonym E 605) „Rattengift, Insektizid“


Einrichtungsname

SERINPROTEASE-INHIBITOREN

34

Trypsin inhibitor:

Chloromethylketone sind stark alkylierende Agenzien


Einrichtungsname

THREONINPROTEASEN

35


Serinproteasen

Threoninproteasen

Cysteinproteasen

Aspartatproteasen

Glutamatproteasen

Metalloproteasen



Einrichtungsname

DAS PROTEASOM I

36

Family T01, clan PB

-> Molekulare Schredder für

abzubauende Proteinketten

20S - 670 kDa Catalytic subunit

19S - “Cap” Regulatory subunit

http://en.wikipedia.org/wiki/Proteasome


Einrichtungsname

DAS PROTEASOM II

37

• multimere Proteine -> 28 Untereinheiten

• Zylinderinneres -> katalytische Zentren mehrerer Enzyme

• Von Ubiquitin angeliefertes Protein wird in Oktapeptide

zerschnitten

• Ubiquitine werden nicht abgebaut

Voet Voet Pratt. Fundamentals of Biochemistry – Fig. 21-4


Einrichtungsname

DAS PROTEASOM III

38

Mechanismus


Einrichtungsname

CYSTEINPROTEASEN

39


Serinproteasen

Threoninproteasen

Cysteinproteasen

Aspartatproteasen

Glutamatproteasen

Metalloproteasen



Einrichtungsname

CYSTEINPROTEASEN (THIOLPROTEASEN)

40

Katalytische Dyade (Cys-His)

oder Triade (Cys-His-Asn/Asp/Gln/Glu)

Cathepsin B, family C1

Papain Beispiele:

Papain

Cathepsine

Caspase

Endopeptidasen


Einrichtungsname

CYSTEINPROTEASEN- AKTIVES ZENTRUM

41

Triade: Cys-His-Asn Dyade: Cys-His

C1-Papain-Familie C14-Caspase-Familie


Einrichtungsname

CYSTEINPROTEASEN- BEISPIELE

42

Papain C01.001 Fleischzartmacher Verdauungshilfe Bier-Klärung

Caspases - C14: Apoptose

Cathepsine – C01 Zell turnover

TEV – C04.004: Pflanzenpathogen Tobacco Etch Virus protease

Processing of recombinant proteins

-Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly-

-Gln-Ser-


Einrichtungsname

pH-ABHÄNGIGKEIT

43

pH-Abhängigkeit der Papain-Aktivität


Einrichtungsname

KATALYTISCHER MECHANISMUS

44

tetraedrischer Übergangszustand

N der Peptidbindung säurekatalytisch durch

His abgespalten

Intermediat wird durch H2O nukleophil am partiell positiv geladenen C1-Atom angegriffen

Thioestherbindung zwischen Enzym und und dem Rest der Peptidkette: Acylenzym

tetraedrischer Übergangszustand

Peptid mit neuer Carboxylgruppe abgespalten verbleibendes Proton von H2O protoniert freie Cys Seitenkette zum Thiol

Nukleophiler Angriff des Thiolates an C1-Atom der Peptidbindung

Cystein wird basenkatalytisch durch His aktiviert: Proton der Thiolgruppe wird auf Stickstoff des His übertragen


Einrichtungsname

ASPARTATPROTEASEN

45


Serinproteasen

Threoninproteasen

Cysteinproteasen

Aspartatproteasen

Glutamatproteasen

Metalloproteasen



Einrichtungsname

ASPARTATPROTEASEN

46

Enzym Spaltstelle Funktion

Pepsin Phe-Phe, Phe-Tyr, etc. Verdauung

Renin Leu-Val Blutdrucksteigerung

Cathepsin D Phe-Phe, Leu-Leu, etc. Gewebeabbau

Chymosin Phe-Met Milchgerinnung

HIV-Protease Phe-Pro Virusreplikation

zwei saure Aminosäuren im katalyischen Zentrum: Asp


Einrichtungsname

ASPARTATPROTEASEN-MECHANISMUS

47

• Einstufige Proteolyse • Säure/Basen Katalyse • Nukleophilie des Wassers

Tetrahedral intermediate

Substrate Hydrolyzed products

HN

O

OH

H

O

-O

O

O

HAsp Asp

Asp Asp

O

O-

O

-O

O

O

H Asp Asp

HN

OO

H H

O

O

H

N

H

H

O H

O


Einrichtungsname

ASPARTATPROTEASEN - BEISPIELE

48

Pepsin

HIV-Protease


Einrichtungsname

ASPARTATPROTEASEN A1 - PEPSIN

49


Einrichtungsname

ASPARTATPROTEASEN A2 –

HIV-PROTEASE

50

S


Einrichtungsname

METALLOPROTEASEN

51


Serinproteasen

Threoninproteasen

Cysteinproteasen

Aspartatproteasen

Glutamatproteasen

Metalloproteasen



Einrichtungsname

METALLOPROTEASEN

52

Enzym spaltet

zwischen

Funktion

Thermolysin X-Ala,

X-Val,

X-Ile

bakterielle Protease

Carboxypeptidase X-Tyr,

X-Phe

Verdauung

ACE Phe-His,

Phe-Leu,

Pro-Phe

wandelt Angiotensin I in

das blutdrucksteigernde

Angiotensin II um

NEP 24.11 Phe-Leu,

Cys-Phe

multifunktionell

(spaltet u.a. Enkephalin)

ECE Trp-Val wandelt Big-Endothelin

in blutdrucksteigerndes

Endothelin um

Collagenase Gly-Leu,

Gly-Ile

Gewebeumbau

Stromelysin Gly-Leu,

Gly-Ile

Gewebeumbau


Einrichtungsname

DAS HEXXH MOTIV

53

Enzym Position Aminosäuren

Thermolysin 142 - 146 His Glu Leu Tyr His

NEP 24.11 583 - 587 His Glu Ile Thr His

ECE 590 - 594 His Glu Leu Thr His

Astacin 92 - 96 His Glu Leu Met His

Collagenase 201 - 205 His Glu Phe Gly His

Stromelysin 201 - 205 His Glu Ile Gly His

Hisn und Hisn+4 binden Zn2+

Glun+1 polarisiert ein Wassermolekül


Einrichtungsname

AKTIVES ZENTRUM VON THERMOLYSIN

54 Thermolysin 142 -

146

His Glu Leu Tyr His

Ca2+

Zn2+

PDB 3DNZ

http://chemwiki.ucdavis.edu/Biological_Chemistry/Catalysts/Metalloproteases


Einrichtungsname

THERMOLYSIN

55

His 142Glu 143

tetraedrischerÜbergangszustand

Glu 166

His 146

His 231

His 142

Glu 143

Glu 166

His 146

His 231

H2

+

His 142Glu 143

Glu 166

His 146

His 231

H2

O

O

NH

O

O

O

N

O

O

H

O

O

N

O

O

H

Zn2+

H

O

H

Zn2+

Zn2+

Metalloendopeptidase


Einrichtungsname

METALLOPROTEASEN

56

56

Angiotensin

-konvertierendes Enzym (ACE): M2-Subfamilie

Thermolysin:

M4-Subfamilie Matrixmetalloprotease

1: M10-Subfamilie


Einrichtungsname

CARBOXYPEPTIDASE A

– EINE METALLO-EXOPEPTIDASE

57

NH

N

N

NH

Zn2+

OO

His 196

His 69

Glu 72Glu 270

O OO

H

H

PDB 1YME

Carboxypeptidase A: Verdauungsenzym, das carboxylendständige Peptidbindungen in Polypeptidketten spaltet


Einrichtungsname

CARBOXYPEPTIDASE A - MECHANISMUS

58


Einrichtungsname

TAKE HOME

59

• Kovalente vs. Säure-Base-Katalyse

• Tetrahedrischer Übergangszustand

• Katalytische Triade der Serinproteasen

• Proteasom als Threoninprotease

• Aktives Zentrum der Cysteinproteasen

(Triade, Dyade)

• Aspartatproteasen und Metalloproteasen

– Wasser als Nukleophil


Einrichtungsname

VIELEN DANK!

Nächstes Mal: Enzyminhibitoren

BSc Biochemie 4.Semester VL Proteinchemie Proteasen · KATALYTISCHE TRIADE Numbering: bovine chymotrypsinogen 12 Die katalytische Triade kann von unterschiedlichen Strukturen gebildet

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