Bruselloz Tanısında Kullanılan...Rose Bengal Rose Bengal oyalı B. abortus süspansiyonu pH 3.6-3.7 Özgül olmayan reaksiyonları önler DSÖ R (+) ise başka bir test ile doğrulanmalı

Bruselloz Tanısında Kullanılan Mikrobiyolojik Testler ve Teknik Değerlendirme

David Bruce, 1887

Bruselloz

Kesin tanı ◦ Kan kültürü pozitifliği %15-70

Akut dönemde %40-90, kronik veya fokal enfeksiyonda %5-20

◦ Kemik iliği ile duyarlılık daha yüksek (+%15-20) ◦ Rölapsda pozitiflik daha düşük

Ateş ile izolasyon olasılığı artar. ◦ Yüksek ateşte pozitif kan kültürü %86.5 ◦ Düşük ateşte %75 ◦ Ateşsiz %28.5

Lancet Infectious Disease 2006

Tanı (DSÖ) Olgu Sınıflaması

Şüpheli: Klinik + epidemiyolojik ilişki / kontamine gıda

Olası: Şüpheli olgu + RB ve SAT pozitif

Kesin: ◦ Şüpheli / olası olgu +

◦ Kültür / aglütinan ab (RB – SAT) + non-aglütinan ab (ELISA IgG/Coombs IgG)

Laboratuvar

Tarama: RB ◦ Poz ise doğrulama testi

Doğrulama ◦ Kültür

◦ Aglütinan + non-aglütinan antikorların saptanması RB, SAT Coombs IgG, ELISA IgG

SAT

- Titre ??

- 1/160 : klinik var ise aktif enf tanısında anlamlı

- Aktif enf kriteri: 1/40-1/320

PCR ve yeni hızlı testlerin yeri kesin değil.

Sunum Planı

Serolojik testler

◦ RB

◦ SAT

◦ AHG’li testler İmmunyakalama (Brucellacapt)

Brusella Coombs jel testi

◦ EIA

UMS Tanı şeması

Kalite kontrol

Brusella antijenleri

Yüzey antijenleri

◦ LPS: S-LPS veya R-LPS

Lipid A, kor oligosakkarid, O-zincir polisakkarid

A ve M epitopları

RB, SAT, CFT

◦ Dış membran pr (OMP)

Grup 1: 94 veya 88 kDa

Grup 2: 36-38 kDa

Grup 3: 25-27 ve 31-34 kDa

B. melitensis: M & A (20:1)

B. abortus: A & M (20:1)

B. suis: A & M (2:1)

B. canis: R

B. ovis: R

Sıvısal Bağışık Yanıt S-LPS

IgM (akut) IgG ve IgA (kronik)

Enfeksiyon ilerledikçe ◦ Non-aglütinan ab (AHG) > aglütinan ab (SAT)

Antijen

Tam bakteri kullanan testler (RB, SAT)

S-LPS veya PS antijenlerini kullanan testler ◦ ELISA

◦ Brucellacapt (immuncapture)

Protein yapıda antijen kullanan testler

Serolojik Testler Aglütinan Ab Saptama

Rose Bengal Standart tüp

aglütinasyon (STA) ◦ Yalancı pozitiflik ◦ Yalancı negatiflik

Erken dönem enfeksiyon Blokan antikor Prozon Erken tedavi

Mikroaglütinasyon 2ME ile aglütinasyon

(IgG)

Non-Aglütinan Ab Saptama

AHG ile tüp agglütinasyon İmmunyakalamalı

agglütinasyon (Brucellacapt)

Coombs jel testi ELISA (S–LPS veya pr) İmmunelektroforez (pr)

Rose Bengal Rose Bengal ◦ Boyalı B. abortus

süspansiyonu

◦ pH 3.6-3.7 Özgül olmayan

reaksiyonları önler

DSÖ RB (+) ise başka bir test ile doğrulanmalı

Olası sorunlar ◦ Yalancı neg

Kr olgularda

Prozon

Fokal enf

◦ Endemik bölgelerde özg

UMS, 2015

208 kültür (+) : Tümü (+)

20 mesleki temas veya aşı

◦ 19 (+) ; 1 serokonversiyon

11 prozon: Tümü (+)

1559 sağlıklı

◦ 1558 neg; 1 poz (geçirilmiş bruselloz)

Rose Bengal - 1

Antijenin kalitesi

◦ Kolonilerde S R dönüşümü ile S-LPS kaybı

Testin yapılışı ve değerlendirilmesi ◦ Blokan ab ve prezon yok ise 4 dk.

◦ Blokan IgA (+), AHG ile (+) örneklerde (kr olgularda) 8 dk.

◦ Farklı aglütinasyon paternlerinin tanınması

Diaz et al, PLoS Negl Trop Dis, 2011

Rose Bengal - 2 Özgüllük ◦ Ateşli hst (tbc, sıtma, tifo, lupus, RA, sarkoidoz,

aktif lenfoma) reaksiyon yok.

◦ V. cholerea, F. tularensis, Y. enterocolitica 0:9 Kolera aşılılarda bazen pozitiflik (enfeksiyonda yok)

Tularemi 3/5 olguda pozitiflik

◦ Geçirilmiş brusellozda pozitiflik saptanır. Özgüllük çalışmalarının sonuçları %92-97

Klinik olmadan sadece agg. testleri ile tanı konmamalıdır.

Anti-protein ab testleri 5/20 mesleki temas olgusunda pozitiflik

D: %95, Ö:%96

Tüm

S-LPS

testleri

Diaz et al, PLoS Negl Trop Dis, 2011

Liang et al, PLoS Negl Trop Dis, 2010

30 hemokültür (+) 280 taklit eden hastalık

Milier tbc Sıtma Tifo Still hastalığı SLE Romatoid artrit Sarkoidoz Aktif lenfoma

RB: D ve Ö %100 SAT (1/160) : D ve Ö %100 ◦ 1/40: 1 sıtma ve 1 lenfoma

◦ 1 /20: 1 tifo

RB SAT (≥40)

Duyarlılık %100 %98.7

Özgüllük %87.5 %87.5

Pozitif prediktif değer %11.4 %11.4

Negatif prediktif değer %100 %99

• AHG ile tüp agglütinasyon • İmmunyakalamalı agglütinasyon (Brucellacapt, Vircell)

• Coombs jel testi (ISLAB)

• ELISA (S–LPS veya pr)

• İmmunelektroforez (pr)

• AHG kaplı plak

• Hst serumu + ag (B. melitensis)

• 24 saat sonra okunur

• Hst serumu + renkli ag

• AHG içeren jele eklenir

• Santrijülenir ve okunur

UMS

AHG’li TESTLER

http://www.google.com.tr/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=imgres&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjZp7n96aXSAhVG8RQKHe5mAX4QjRwIBw&url=http://www.labconsult.be/prod/brucellacapt&psig=AFQjCNHHeI7B8mke0-Inc980xtAsgscNSg&ust=1487925875418037

Brusella Coombs Jel Testi

Kaynak Referans test BCJT

İrvem ve ark

(n: 100)

Coombs SAT ≥160 PPD: 96, NPD: 100 Kappa: 0.97 Mikrobiyol Bul,

2015

Immunyakalama agg ≥160 PPD: 90, NPD: 98 Kappa: 0.90

Türk Dağı & Fındık

(n: 74)

Coombs SAT≥160 Duy: 94, Özg: 100

PPD: 100, NPD: 85

Genel Tıp Derg,

2016

Hancı ve ark

(43 hasta, 45 kontrol)

Coombs SAT?? Duy: 100, Özg: 82

PPD: 84, NPD: 86

Pak J Biol Sci,

2016

Kalem ve ark

78 (12+)

Immunyakalama agg ≥320

Duy: 100 Özg: 100 J Clin Lab Anal,

2016

82 hasta Brucellacapt ve Coombs

%100 (+) SAT %91.4 (+) 1/160 eşik olduğunda

duyarlılık ◦ Brucellacapt %95.1

◦ Coombs %91.5

◦ SAT %65.8

412 kontrol örneğinde özgüllük Brucellacapt %99

Coombs %99.8

SAT %100

Brucellacapt

Coombs’dan daha duyarlı

Coombs’a göre daha yüksek titre

IBL ve Euroimmun B. abortus W99 bkt lizatı

Vircell B. abortus S99 LPS

BioQuant LPS + OMPr

CDC Yalancı pozitiflik !!

IgM / IgG pozitiflikleri agg. testi i le doğrulanmalıdır.

Brusella Ab EIA Ref IgM IgG IgA SAT RB Kaynak Memish et al

Suudi Arabistan

n: 68 + 70 K

(Prevalans %5)

Kültür

(+)

D: 79.1

Ö: 100

D: 45.6

Ö: 97.1

D: 95.6

Ö: 100

PPV: 100

NPV:99.7

Diagn

Microbiol

Infect Dis 2002

Gomez et al

İspanya

n: 25 + 90 K

Kültür

(+) veya

STA

≥160

D: 60

Ö: 100

PPV: 100

NPV: 90

D: 84

Ö: 100

PPV: 100

NPV:96

D: 96

Ö: 98

PPV: 92

NPV: 99

MAT:

D: 92

Ö: 100

PPV: 100

NPV: 98

D:100

Ö: 97

PPV: 89

NPV: 100

Clin Vaccine

Immunol 2008

Welch et al

ABD

n:37

SAT ≥80

D: 83.3

Ö: 73.7

D: 41.7

Ö: 65

J Clin Lab Anal,

2010

Binnicker et al

ABD

n: 1091

SAT ≥80 %82.7 SAT

negatif

%54.2 SAT

negatif

Clin Vaccine

Immunol, 2012

Ciftci ve ark

TR

n: 77

Kültür

(+)

D: 71.4 D: 97.1 D 94.3 D: 94.3 D: 100 Mikr Bul, 2005

Kalem ve ark

TR

n: 78 (12+)

Immun

capture

test (+)

D: 100

Ö:89

D:92.8

Ö:79.7

D: 71.4

Ö: 100

(1/160)

J Clin Lab Anal,

2016

IgM IgG D: 60-100 D: 41-97 Ö: 71-100 Ö: 65-100

CDC: EIA pozitifliği aglütinasyon

testi ile doğrulanmalı

IgM antikorları yakalamada ve akut bruselloz tanısında hızlı bir alternatif

Geçirilmiş Bruselloz - Testler

2 yıl sonra STA ile izlem

◦ %96.6 negatif

(n:175) Int J Infect Dis, 2010

15 ay sonra Brucellacapt ile izlem

◦ %90 pozitif (< 320)

(n: 132) Comp Immunol Microbiol Infect Dis,

2010

Andriopoulos et al, Infection 2015

TR’de B. suis - B. canis

VALİDASYON VE KALİTE KONTROLÜ

Brusella serolojik testleri (CDC) FDA onaylı test veya valide edilmiş test

kullanılmalıdır.

Tanıda mutlaka klinik ve öykü de göz önüne alınmalıdır.

Kalite

Kalite Kontrol Kalite Güvencesi

Her çalışmada kontroller

kullanılmalı

◦ NK, düşük pozitif, pozitif

◦ Üreticinin kriterlerine uygun değerlendirilmeli

Son kullanım tarihine dikkat

edilmeli

Fiziksel kriterlere uyulmalı

◦ İnkübasyon süresi, ısısı vb

Test rehberi olmalı ve uyulmalı

Belgeleme: Çalışma dosyaları, sonuçlar vb izlenebilir olmalı.

Örnek kalitesi ve kimlik doğruluğu sağlanmalı

Çalışanın uygun eğitimi ve deneyimi olmalı, izlenmeli

İç ve dış kalite kontrol programları olmalı

Sekretarya hataları önlenmeli

Kurum içi ve dışı denetim

http://ahvla.defra.gov.uk/apha-scientific/services/biological-reagents/brucellosis.htm

American Public Health Association

https://www.google.com.tr/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwimmoWB-6XSAhVCshQKHRspDT0QFggZMAA&url=https://www.apha.org/&usg=AFQjCNH9r2HKITzUA75IquRO4ES1Up6GkAhttps://www.google.com.tr/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwimmoWB-6XSAhVCshQKHRspDT0QFggZMAA&url=https://www.apha.org/&usg=AFQjCNH9r2HKITzUA75IquRO4ES1Up6GkAhttps://www.google.com.tr/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwimmoWB-6XSAhVCshQKHRspDT0QFggZMAA&url=https://www.apha.org/&usg=AFQjCNH9r2HKITzUA75IquRO4ES1Up6GkAhttps://www.google.com.tr/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwimmoWB-6XSAhVCshQKHRspDT0QFggZMAA&url=https://www.apha.org/&usg=AFQjCNH9r2HKITzUA75IquRO4ES1Up6GkAhttps://www.google.com.tr/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwimmoWB-6XSAhVCshQKHRspDT0QFggZMAA&url=https://www.apha.org/&usg=AFQjCNH9r2HKITzUA75IquRO4ES1Up6GkAhttps://www.google.com.tr/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwimmoWB-6XSAhVCshQKHRspDT0QFggZMAA&url=https://www.apha.org/&usg=AFQjCNH9r2HKITzUA75IquRO4ES1Up6GkA

Özet

Serolojik tanıda ◦ Hastalığın farklı evrelerini

gösteren testler birlikte kullanılmalı

◦ Tanı: Serolojik test + öykü + klinik birlikte değerlendirilmeli

Validasyon ◦ Antijenin içeriği ve üreticisi

önemli

◦ Validasyon gerekli

Kontrollerin rutin kullanıma dahil edilmesi gerekli

Hastalığın evrelerini belirlemede kullanılacak spesifik epitoplar bilinmiyor.

Testlerin standardizasyonu ve optimizasyonu gerekiyor. ◦ EIA

◦ NAT

Referans materyal üretimi