BİYOKİMYA I 4. Peptidler F. Zihnioğlu
PeptidPeptidlerlerAmino acid Polipeptid Protein
Aminoasitlerin birinin α-karboksil grubu ile diğer aminoasidin α-amino grubu arasında 1 mol su ayrılmasıyla oluşan kovalent bağa peptid bağı
denir. Bu bağ amid bağı karakterindedir.
Karboksil grubu
Amino grubu
PeptidBağı
DipeptidAA1 AA2
PeptidPeptidlerler
<10 aminoasit : Oligopeptid
<100 aminoasit : Polipeptid
>100 aminoasit : Proteinler
Peptidler yapısına giren aminoasit sayılarına göre;
2 aminoasit : dipeptid3 aminoasit : tripeptid4 aminoasit : tetrapeptid5 aminoasit : pentapeptid
Peptidlerde adlandırma yapılırken karboksil grubu reaksiyona katılan aminoasidin adına –iltakısı eklenir.
N - terminal C - terminal
serin-glisin-tirozin-alanin-Lösin• N-ucu; Serin, C-Ucu; Lösin
• 4 peptid bağı
• 5 AA; penta peptid
• Serilglisiltirozilalanillösin
3 Harfli kısaltma
Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu
Tek Harfli kısaltma
SGYAL
Alanilglisin
AlaAla——GlyGlyNN--terterminalminal CC--terminalterminal
CHCH33
OO
AGAG
CCHH33NN++
HH
CC
OO
CCNN
HH
HH
CC OO––
HH
Alanilglisin ve Glisilalaninyapısal izomerlerdir.
CHCH33
OO
CCHH33NN++
HH
CC
OO
CCNN
HH
HH
CC OO––
HH
HH
OO
CCHH33NN++
HH
CC
OO
CCNN
HH
CHCH33
CC OO––
HH
AlanAlaniillglglisinisinAlaAla——GlyGly
AAGG
GlGlisilisilalaninalaninGlyGly——AlaAla
GGAA
• 40% çift bağı karakteri– Rezonans formülleri– Kısa bağ uzunluğu
Yaklaşık 0.133 nm uzunluğunda – tipik tek bağdan daha kısa ancak çift bağdan uzun
– Çift bağ rotasyona engel olur. Çift bağ karakterine bağlı olarak peptid bağındaki 6 atom her zaman planar(düzlemsel) yapıdadır.
Peptid Bağı ve Yapısı
• Peptid bağı ; protein yapısı ve fonksiyonunda etkin rol oynar.
• Temel özellikler:– 1. Planar(düzlemsel)– 2. Kısmi çift bağ karakterine bağlı olarak; rijit– 3. Hemen hemen her zaman trans konfigürasyonda– 4. Polar. En az 2 hidrojen bağı oluşturabilir.
Peptid Bağı ve Yapısı
Peptid Bağının Planar Yapısı(Amid Düzlemi)
Peptid Grubundaki 6 atom tek bir düzlemde yer alır!
Amid azotu ile karbonil oksijeni arasındaki rezonans nedeni ile peptid bağı planar ve sabittir.
Peptid Bağı Rezonans Formülleri
Peptid iskeleti bağ rotasyonlarındaki limitasyonlar nedeni ile rijittir.
C=O arasındaki çift bağC-N bağının rotasyonunu sağlar
C=N arasındaki çift bağC-N bağının rotasyonunu engeller, ancak O ve N üzerinde yükler oluşur.
Doğru elektron yoğunluğunun bulunduğu araürün. C-N bağırotasyonu için gerekli enerji bariyeri(88kJ/mol) amidgrubunu planar tutmak için yeterli
Peptid Bağı Uzunlukları
Bağ Açıları ve Uzunlukları
Peptid Bağı, ω, φ ve Ψ açıları
Phi, φ: N-Cα bağında rotasyon, +180 den -180°.
Psi, ψ: Cα - C bağında rotasyon, +180 den -180°.Omega, ω : peptid bağında rotasyon, Cα1-{C-N}- Cα2
ω(omega)
“Peptid bağı planar ve sabit”Sadece alfa karbona bağlı bağlar etrafında
rotasyon mümkümdür.
• ω açısı planardır (0º - cis, veya 180 º - trans)• φ ve ψ esnektir, rotasyon bu bağlarda oluşur• Ancak, bir amino asit artığı için φ ve ψ sterik
engeller ile limitlidir.
• Eğer (φ,ψ) tüm artıklar için biliniyor ise, peptidin iskelet yapısı da biliniyor demektir.
• Pozitif (φ,ψ) değerleri Cα dan bakıldığında saat yönünde rotasyonu ifade eder.
Amid Düzlemlerinin Rotasyonu
Yasaklanmış Yapılar(sterik engelleme)
(φ,ψ)=(0,180), iki karbonil oksijeni birbirine çok yakın (φ,ψ)=(180,0), iki amid grubu çakışır;(φ,ψ)=(0,0), karbonil oksijeni amid grubu ile çakışır.
Mümkün olan iki konfigürasyon vardır, her ikisi de planardır.
Trans istemli konfigürasyon; özellikle büyük R grupları ileCis çoğunlukla PRO artıkları, ancak trans form 4:1 daha istemli
Peptid konformasyonları
Trans peptid grubu Cis peptid grubu
Prolin, izleyen amino asit artığına göre trans veyacis polipeptid formu oluşturabilir. Beş üyeli halka yapısının varlığı, φ açısının(N ve Cα arasındaki açı)
yaklaşık olarak -65o dir.
Prolin izomerleri
Bağ rotasyonu; protein katlanmasıve 3 boyutlu yapı için önemlidir.
Ramachandran DiyagramlarıPhi ve psi açılarının mümkün olan tüm kombinasyonlarını içerir.
Bazı açılar proteinlerin spesifik sekonder yapılarının tayini için tanımlayıcıdır.
Φ(phi) ye karşı ψ(psi) diyagramları
Ramachandran Plot
Beyaz = sterikçe izin verilmeyen konformasyonlar(atomlar van der Waals yarıçapları toplamından daha fazla birbirlerine yaklaşırlar)Mavi = sterikçe izin verilen konformasyonlar
Peptidlerin de serbest aminoasitler gibi karakteristik bir titrasyon eğrisi ve izoelektriknoktası mevcuttur.
Örneğin; GluGlyAlaLys tetrapeptidinde çok asidik pH’da pKa nın altında tüm iyonize olan gruplar protonlanmış formda bulunur ve net yükü +2 dir. Bundan sonra NaOH ile titre edilir ve protonlar uzaklaştırılırsa farklı gruplara pH değerine göre pKa değerlerinin üzerinde protonlarını kaybederler.
Net yükün 0 olduğu pH, izoelektrik noktadır.
Peptidlerin Titrasyon Eğrisi ve İzoelektrik Nokta
Bir tetrapeptid;Glu-Gly-Ala-LysN-terminal: Glu, C-terminal: Lys aminoasitleri3 peptid bağıGlutamilGlisilAlanilLizin
Bir tetrapeptidin poliamfolitik davranışı
PEPTİD YAPI ANALİZİ
♣Aminoasit bileşenlerinin tayini
♣ Aminoasit dizi analizi
♣ Polipeptid zincirinin yapısı
♣ R-gruplarının pozisyonları
♣ Çoklu peptid zincirlerin varlığı
♣ Protein olmayan bileşenlerin belirlenmesi
Genelde asit hidrolizi; 6 N HCl ile 110oC de azot altında 24 saatte aminoasitlerine hidrolizlenirler.
Aminoasit karışımı; a) Klasik aminoasit analizörü
b) HPLC yada
c) Gaz-sıvı kromatografisi ile analizi yapılır.
Aminoasit Bileşenlerinin Tayini
a) Non-kovalent bağların parçalanması (pH, sıcaklık, kimyasal modifikasyon, denaturantlar (üre, GdnHCl, SDS)
b) Kovalent bağların parçalanması; disülfitbağların parçalanması (zincir içi veya zincirlerarası) (performik asit oksidasyonuveya merkaptoetanol ile indirgeme)
Doğal Yapının Bozundurulması
Peptidlerin hidrolizi çeşitli yollarla olur: 1) Asit veya baz hidrolizi:
Tüm peptid bağlarının hidrolizi, örn:6 N HCl, 110 oCveya kısmi hidroliz
2) Enzimatik; proteolitik enzimler(proteazlar)
3) Kimyasal; Spesifik peptid bağlarının CNBr ile parçalanması örn: Met’nin C-ucundan hidrolizi
Peptid Hidrolizi ve Fragmantasyon
Bazı proteolitik enzimlerin dizi spesifikliği
CNBrReaksiyonu
N-terminal belirlenmesi1) Sanger metodu(2,4-DNFB)
2) Edman degradasyonu(PITC)
3) Dansil metodu(Dansyl-Cl)
4) EnzimatikYönt.(aminopeptidaz)
1)Hidrazinoliz (Hidrazin ile parç.)
2) LiBH4 ile indirgeme
3) Enzimatik(Karboksipeptidaz)
C-terminal belirlenmesi
• Frederick Sanger tarafından geliştirilmiştir.• İnsulin dizisinin belirlenmesi için
kullanılmıştır.– (6 kDa protein)
• 12 yıl bu metod ile uğraşmış• 1958 yılında Nobel ödülü
N-terminal belirlenmesi Sanger Metodu
Sanger metodundaki anahtar reaktif;1-fluro-2,4-dinitrobenzen
“Sanger Reaktifi”“nukleofilik aromatik substitüsyon”
FFOO22NN
NONO22
N-terminal belirlenmesi Sanger Metodu
1-Floro-2,4-dinitrobenzen N-terminal amino asidin amino azotu ile reaksiyona girer.
Sanger Metodu(devam)
FFOO22NN
NONO22
NNHCHHCH22CC NNHCHCOHCHCO
CHCH33
NNHCHCHCHC
CHCH22CC66HH55
HH22NNCHCCHC
OO OOOOOO
CH(CHCH(CH33))22
––++
OO22NN
NONO22
NNHCHHCH22CC NNHCHCOHCHCO
CHCH33
NNHCHCHCHC
CHCH22CC66HH55
NNHCHCHCHC
OO OOOOOO
CH(CHCH(CH33))22
––
- HF
Kuvvetli Asit(HF) hidrolizi ile tüm peptid bağlarıparçalanarak amino asit karışımı oluşur. Bu karışımda sadece N-terminalde yer alan amino asit 2,4-DNP amino asit türevidir.
OO22NN
NONO22
NNHCHHCH22CC NNHCHCOHCHCO
CHCH33
NNHCHCHCHC
CHCH22CC66HH55
NNHCHCHCHC
OO OOOOOO
CH(CHCH(CH33))22
––
HH33OO++
OO
OO22NN
NONO22
NNHCHCOHHCHCOH
CH(CHCH(CH33))22
HH33NNCHCOCHCO––
CHCH33
++HH33NNCHCH22COCO––
OO OO
++
OO
HH33NNCHCOCHCO––
CHCH22CC66HH55
++++ ++
++
Sanger Metodu(devam)
2,4-DNP Valin
Edman Degradasyonuve Peptidlerin Otomatik
Dizi Analizleri
N-terminal belirlenmesi Edman Metodu
Edman Metodu(Degradasyonu)
peptidpeptid
İşaretleme (PITC)
İşaretleme (PITC)
ParçalamaParçalama
Diğer döngüDiğer döngü
BaBağğlanma adlanma adıımmıı
DDüüzenlenme adzenlenme adıımmıı
1. N-terminal amino asit tayin yöntemi2. Sıralı olarak yapılabildiği için, aynı örnek
üzerinde dizi analizlenebilir. Genelde N-terminalden başlıyarak 20 AA(20 döngü) bu metod ile belirlenebilir.
3. 10-10 g örnek yeterlidir.4. Otomatize edilebilir.
Edman Degradasyonu (devam)
Edman degradasyonundaki anahtar reaktif;“fenil izotiyosiyanat”
(PITC)
NN CC SS
Edman Degradasyonu (devam)
Fenil izotiyosiyanat N-terminal amino asidin amino azotu ile reaksiyona girer.
peptidpeptidHH33NNCHCCHC
OO
RR
++NNHHCC66HH55NN CC SS ++
Edman Degradasyonu (devam)
peptidpeptidCC66HH55NNHCHCNNHHCHCCHC
OO
RR
NNHH
SS
feniltiyokarbamoilfeniltiyokarbamoil ttüürevirevi (PTC)(PTC)
PTC türevleri daha sonra TFA(susuz ortam) ile muammele edilerek N-terminal AA peptidden ayrılır.
Edman Degradasyonu (devam)
peptidpeptidCC66HH55NNHCHCNNHHCHCCHC
OO
RR
NNHH
SS
TFATFA
peptidpeptidHH33NN++
++CC66HH55NNHH CC
SSCC
NN CHCH
RR
OO
tiyazolontiyazolon
TiyazolonTiyazolon oluoluşşum um kokoşşullarullarıında, nda, tiyazolontiyazolon
tekrar dtekrar düüzenlenerek zenlenerek NN--terminal amino terminal amino asitinasitinfeniltiyohidantoinfeniltiyohidantoin (PTH)(PTH)
ttüürevi olurevi oluşşur.ur.
Edman Degradasyonu (devam)
CC66HH55NNHH CCSS
CC
NN CHCH
RR
OO
CCCCNN
HNHN CHCH
RR
OOSS
CC66HH55
peptidpeptidHH33NN++
++
PTH AA türevi izole edilir ve tanımlanır.
Zarar görmeden kalan peptid(1 AA eksik), tekrar Edman degradasyonunatabi tutulur.(2.,3.,döngüvb.)
CCCCNN
HNHN CHCH
RR
OOSS
CC66HH55
Edman Degradasyonu (devam)
PTH- Amino asit türevi
Dansil Metodu ile N-terminal Analizi
Bir çok peptidde N-terminal, N-formil veya N-asetilgrupları ile bloke edilmiş formda bulunurken C-terminal ise amidlere modifiye olmuştur.
N-Formil grubu
N-Asetil grubu
C terminal amidi
Amino asitler arasında peptid bağı oluşturmak zor değildir.Esas önemli olan amino asitleri doğru dizide birleştirmekÖrn: fenilalanin ve glisin karışımında gelişigüzel peptid bağı oluşumu 4 tane dipeptidoluşumu ile sonlanır.Phe—Phe, Gly—Gly, Phe—Gly, Gly—Phe
Peptid Sentezi
1. Olasılık sayısını sınırlamak için bir amino asitinamino azotu ile diğer amino asitin karboksil grubunu “koruma” altına almak gerekir.
NN--KorunmuKorunmuşşfenilalaninfenilalanin
CC--KorunmuKorunmuşşglisinglisin
NNHCHCOHHCHCOH
CHCH22CC66HH55
OO
XX HH22NNCHCH22CC
OO
YY
Peptid Sentezi
2. İki korunmuş amino asidin bağlanması
Peptid Sentezi
NNHCHHCH22CC
OO
YYNNHCHCHCHC
CHCH22CC66HH55
OO
XX
NNHCHCOHHCHCOH
CHCH22CC66HH55
OO
XX HH22NNCHCH22CC
OO
YY
3. N-terminaldeki amino grubu ve C-terminaldeki karboksil grubu korumasının kaldırılması
NNHCHHCH22COCO
OO
HH33NNCHCCHC
CHCH22CC66HH55
OO++ ––
PhePhe--GlyGly
NNHCHHCH22CC
OO
YYNNHCHCHCHC
CHCH22CC66HH55
OO
XX
Peptid Sentezi
Peptid Sentezi: Amino Grubunun KorunmasıAmino Gruplarının Amid Formunda Korunması* Amino grupları amidlere dönüştürülerek korunabilirler. * Benziloksikarbonil (C6H5CH2OCO—) yaygın olarak kullanılan koruyucu gruptur ve Zkısaltması ile ifade edilir.* Z-koruması amino asidin benziloksikarbonilklorür ile muammele edilmesi ile gerçekleştirilir.
CHCH22OCClOCCl
OO
++ HH33NNCHCOCHCO
CHCH22CC66HH55
OO––++
1. 1. NaOHNaOH, H, H22OO
2. H2. H++
NNHHCHCOHCHCOH
CHCH22CC66HH55
OO
CHCH22OCOC
OO
(82(82--87%)87%)
Amino Gruplarının Amid Formunda Korunması
benziloksikarbonil klorür(Z)
Phe
NNHHCHCOHCHCOH
CHCH22CC66HH55
OO
CHCH22OCOC
OO
KKıısaltma:saltma:
ZZNNHHCHCOHCHCOH
CHCH22CC66HH55
OO
veya veya ZZ--PhePhe
Amino Gruplarının Amid Formunda Korunması
Benziloksikarbonil koruyucu grubunun en büyük avantajı kolayca uzaklaştırılabilmesidir.
a) hidrojenolizb) HBr(asetik asitte) ile parçalama
Z- Korumasının kaldırılması
Z-Koruyucu Grubunun Uzaklaştırılması: Hidrojenoliz
NNHHCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33
CHCH22CC66HH55
OO
CHCH22OCOC
OO
HH22, Pd, Pd
HH22NNCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33
CHCH22CC66HH55
OO
CHCH33 COCO22
(100%)(100%)
NNHHCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33
CHCH22CC66HH55
OO
CHCH22OCOC
OO
HBrHBr
HH33NNCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33
CHCH22CC66HH55
OO
CHCH22BrBr COCO22
(82%)(82%)
++
BrBr ––
Z-Koruyucu Grubunun Uzaklaştırılması: HBr ile Parçalama
NNHHCHCOHCHCOH
CHCH22CC66HH55
OO
(CH(CH33))33COCCOC
OO
KKıısaltma:saltma:
BocBocNNHHCHCOHCHCOH
CHCH22CC66HH55
OO
veyaveya BocBoc--PhePhe
Peptid Sentezi: Amino Grubunun Korunmasıtert-Butoksikarbonil Koruyucu Grup
NNHHCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33
CHCH22CC66HH55
OO
(CH(CH33))33CCOCOC
OO
HBrHBr
HH33NNCHCCHCNNHCHHCH22COCO22CHCH22CHCH33
CHCH22CC66HH55
OO
COCO22
(86%)(86%)
++
BrBr ––CHCH22CC
HH33CC
HH33CC
Boc-Koruyucu Grubunun Uzaklaştırılması: HBr ile Parçalama
Karboksil grupları genelde ester formunda korunur. Metil ve etil esterlerinden korumanın kaldırılması bazik ortamda hidroliz ile gerçekleştirilir. Benzil esterler hidrojenoliz ile parçalanırlar.
Peptid Sentezi: Karboksil Grubunun Korunması
Karboksil Gruplarının Ester Formunda Korunması
Benzil EsterlerininHidrojenolizi
NNHHCHCCHCNNHCHHCH22COCOCHCH22CC66HH55
CHCH22CC66HH55
OO
CC66HH55CHCH22OCOC
OO OO
HH22, Pd, Pd
HH33NNCHCCHCNNHCHHCH22COCO
CHCH22CC66HH55
OO
CC66HH55CHCH33 COCO22
(87%)(87%)
++ –– CHCH33CC66HH55
Katı(solid) faz sentezinde başlangıç materyali inert katı bir destek materyaline bağlanır. Reaktantlar çözeltiye eklenir. Reaksiyon; katı ve solüsyon arasındaki arayüzede gerçekleşir. Başlangıç materyali katıdestek üzerine bağlı olduğundan oluşan her ürün de katı destek materyaline bağlı olarak kalır.Saflaştırma; katı destek materyalinden basit bir yıkama ile yan ürünlerin uzaklaştırılması ile gerçekleşir.
Katı-Faz Peptid Sentezi: Merrifield Metodu
Katı Destek Materyali
Stiren ve divinilbenzen kopolimeriYukarıda polstiren gösterilmiştir, divinilbenzenile çapraz bağlama ile daha rijit bir polimer elde edilmektedir.Polimerik desteğin klorometilmetil eter ve SnCl4ile muammele edilmesi ile benzen halkalarında ClCH2 yan zincirlerinin oluşmasını sağlar.
CHCH22 CHCH22 CHCH22 CHCH22CHCH CHCH CHCH CHCH
CHCH22 CHCH22 CHCH22 CHCH22CHCH CHCH CHCH CHCH
CHCH22ClCl
Klorometil grubu bir benzil halojenürdür ve nukleofiliksübstitüsyona reaktiftir(SN2).
Katı Destek Materyali
Klorometillenmiş destek materyaline Boc-korumalıC-terminal amino asit ilave edilir, nükleofiliksübtitüsyon oluşur ve Boc-korumalı amino asit reçineye ester olarak bağlanır.
Merrifield Yöntemi
BocBocNNHHCHCOCHCO
RR
OO––+
Daha sonra Boc koruyucu grup HCl ile uzaklaştırılır.
Amino grubunun aktivasyonu (DCC) sonrası ikinci amino asidin bağlanması
BocBocNNHHCHCOCHCO
Merrifield Yöntemi
RR22
OO––
Boc koruyucu grubun uzaklaştırılması
Bir sonraki amino asidin eklenmesi ve döngünün
tekrarlanması
Merrifield Yöntemi
Sentezlenen peptidin katı destek materyalinden ayrılması
(CF3CO2H de hazırlanmış HBr)
Merrifield yöntemi otomasyona uygun
Bir nanopeptid (bradykinin),1962 yılında, 8 günde 68% verim ile sentezlenmiştir.
Ribonukleaz (124 amino asit), 1969369 reaksiyon; 11,391 adım
Kimyada Nobel Ödülü: 1984
Merrifield Yöntemi
Fizyolojik Öneme Sahip Küçük Peptidler