Biotecnologia Animal
Luiz Lehmann Coutinho
Laboratório de Biotecnologia
ESALQ - USP
Introdução
• Qual é o objetivo da produção animal?
• Melhorar a eficiência e a qualidade dos produtos.
O que precisa ser melhorado?
• Conversão alimentar
• Eficiência do crescimento
• Eficiência reprodutiva
• Sanidade
• Qualidade da carne
O que poderia ser feito ?
• Seleção
• Seleção assistida por marcadores
• Animais transgênicos
• Novas vacinas
• Novos promotores de crescimento
Seleção assistida por marcadores
• Princípios
– Variação genética
– Identificação de alelos favoráveis
• Exemplos
– Gene do halotano
– Musculatura dupla
Princípios
Expressão Gênica
Variação genética
Polimorfismo:
Cromossomo 5
ATAACGCGCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA
TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT
Cromossomo 5’
ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA
TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT
PCR
Polimorfismo:Cromossomo 5
ATAACGCGCAATCTGACTGATATGTA
TATTGCGCGTTAGACTGACTATACAT
Cromossomo 5’
ATAACGTGCAATCTGACTGATATGTA
TATTGCACGTTAGACTGACTATACAT
Marcadores Moleculares
• Determinação direta do genótipo
• Características de baixa herdabilidade
• Características não determináveis nos dois
sexos
• Características difíceis ou caras para serem
determinadas
Identificar genes responsáveis pela
prolificidade em suínos.
• Estratégia: Genes Candidatos
– Análise de genes conhecidos com base em
informações de fisiologia (hormônio ou
receptores ligados a reprodução).
– Mutações observadas em outras espécies.
– Resultados observados em animais
transgênicos.
Prolificidade em suínos
• Animais da raça Meishan chinesa tem um
maior número de leitões por leitegada.
• Investigação de genes ligados ao sistema
reprodutivo, por exemplo: ESR1
• Detecção do polimorfismo por PCR e digestão
com enzima de restrição.
1) Identificação da sequencia do gene.
2) Desenho de primers e amplificação do gene.
3) Sequenciamento em diversos indivíduos para detecção de
polimorfimsos.
4. Detecção de SNP
5. Estudo do efeito do polimorfismo na prolificidade.
Marcadores Genéticos em Uso
MARCADOR / TESTE OBSERVAÇÃO
Paternidade Uso não exclusivo
HAL Qualidade da carne – uso não exclusivo
ESR Tamanho de leitegada – uso exclusivo (PIC)
PRLR Tamanho de leitegada – uso exclusivo (PIC)
KIT Cor branca – uso exclusivo (PIC)
MC1R Cor vermelha / preta – uso exclusivo (PIC)
Fonte: PLASTOW (2000), citado por Freitas
Marcadores Genéticos em Uso
MARCADOR / TESTE OBSERVAÇÃO
MC4R Crescimento e deposição de gordura – uso
exclusivo (PIC)
FUT1 Resistência à E. Coli F18 – uso exclusivo
(PIC / ITH suiça)
RN Qualidade da carne – teste exclusivo e não
exclusivo (breve)
AFABP, HFABP Gordura intramuscular – uso não exclusivo
IGF2 Composição da carcaça – uso exclusivo
(Seghers)
"Trade secret tests" Várias características
Fonte: PLASTOW (2000), citado por Freitas
Bovinos
Bovino com fenótipo de musculatura dupla
Castelhano, E. C., 2000
McPherron et al., Nature e PNAS 1997
Musculatura dupla em bovinos
Testes de DNA para bovinos
•Tenderness
•Marbling
•Quality grade
•Yield grade
•Fat thickness
•Ribeye area
•Heifer pregnancy rate
•Stayability (longevity)
•Calving ease
•Docility
•Myostatin
•Arthrogryposis
Multiplex
•Coat color
•Breed-specific
horned/polled
•Multisire parentage
•BVD-PI diagnostic test
Clop, A., Marcq, F., Takeda, H., Pirottin, D., Tordoir, X., Bibe, B., Bouix, J., Caiment, F., Elsen,
JM., Eychenne, F., Larzul, C., Laville, E., Meish, F., Milenkovic, D., Tobin, J., Charlier, C.,
Georges, M.: A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the
myostatin gene affects muscularity in sheep., Nat Genet 38:813-818, 2006.
Pubmed reference: 16751773.
1) Identificação de um QTL no cromossomo 2
Georges, 2007
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
4/20/2010 Zootecnia I 57
Efeito de GH no crescimento
• Falta de HC
– Redução no crescimento
– Redução no crescimento do osso
– Redução na massa muscular
– Aumento na deposição de gordura
• Terapia com HC
– Aumento no crescimento de osso, músculo
– Aumento na síntese de RNA, proteína e entrada de a.a. nas células
– Diminuição de gordura
4/20/2010 Zootecnia I 59
Resultados de HC em bovinos
Observação Controle 33 ug rbST/kg PV/dia
GPD 1.14 1.23
Cons. 6.9 6.5
C/G 6.05 5.32
Rend. carcaça 62.7% 61.3%
Área long. 52.7cm2
56.6 cm2
Espes. gord 1.94cm 1.76cm
% gord. 41.9 36.3
% prot. 13.2 14.6
Moseley et al., 1992
Microinjeção em Pronúcleo
Microinjeção em Pronúcleo
Microinjeção em Pronúcleos
Vantagemlinhas transgênicas com
expressão correta.
Desvantagens
limitado à embriões
de 1 célula,
difícil visualização do
pronúcleo,
introdução de várias
cópias do transgene.
Microinjeção de ovos (Auburn Univ.)
Bagre do canal transgênico
Salmonídeo transgênico
Instalação para peixes transgênicos
Genes sendo transferidos
• Hormônio de Crescimento
• Proteína Anti-congelante
• Hormônio Liberador do Hormônio de
crescimento
• IGF-I
Salmonideo transgênico
Promotor AFP + gene HC
Salmonideo Transgênico
Progresso do melhoramento
Marcadores Moleculares
• Determinação direta do genótipo
• Características de baixa herdabilidade
• Características não determináveis nos dois
sexos
• Características difíceis ou caras para serem
determinadas
Fator limitante
• Quais são os genes que controlam
as características de interesse?
Princípios
Polimorfismo:
Cromossomo 5
ATAACGCGCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA
TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT
Cromossomo 5’
ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA
TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT
Sequência do gene MyoD
MyoD : 881 cccatactgcctccagctgaagctgtagctgaagggagtccctgttccccccaggaagga 940
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
pMyoD: 241 cccatactgcctccagctgaagctgtagctgaagggagtccctgttccccccaggaagga 300
MyoD : 941 ggaaacctgagtgacagtggagcccagattccttcccccaccaactgcacccctcttccc 1000
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||
pMyoD: 301 gcaaacctgagtgacagtggagcccagattccttcccccaccaactgcacccctcttncc 360
Como encontrar os polimorfismos
associados com a característica de
interesse ?
Estratégias:
• Procura em todo o genoma
• Genes candidatos
Bases Genéticas de Mapeamento:
• Segregação
• Recombinação
• Polimorfismo
Crossing-over e recombinação durante a meiose
Gametas
Bases Genéticas do Mapeamento
Mapeamento:
A
M
B
A
M
B
a
m
b
A
M
B
A
M
B
A
M
B
a
m
b
A
M
B
a
m
b
A
M
b
A
M
B
A
M
B
a
m
B
a
m
b
Polimorfismo:
Cromossomo 5
ATAACGCGCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA
TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT
Cromossomo 5’
ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA
TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT
Microssatélites
• Sequência de bases (2-6 nucleotídeos)
repetidas várias vezes
• Alto grau de polimorfismo
• Distribuído ao acaso no genoma
Microssatélite
Profiles of a run by automatic DNA- Sequencer (ALF-
Pharmacia ) for two microsatelites - BM1224 e TEXAN15
BM1224
TEXAN 15
Sample sizer
150pb
50-500bp
sizer 150pb 200pb
Amplificação por PCR:
Cromossomo 5
ATAAC GCGCAATCACACACACTGACTGATATGTATATTGCGCGTTAGTGTGTGTGACTGACTATACATCromossomo 5’ATAAC GTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTATATTGCGCGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT
Exemplo de mapeamento em
aves
Identificação de regiões do
genoma: Mapeamento de QTLs
• Não necessita de informação prévia da localização do loco ou gene de interesse.
• A busca é feita em todo o genoma com marcadores microssatélite.
• Necessita de uma estrutura de família
– Cruzamento entre linhagens ou raças contrastantes
– Dentro de uma raça (desenho de netas)
• Bastante trabalhosa
• Pode resultar na localização do loco de interesse, mas podem existir muitos genes na região.
Projetos de mapeamento no
Brasil• Mapeamento de genes de resistência a ecto e
endoparasitas em bovinos (Embrapa)
• Mapeamento de genes de crescimento e qualidade
de carne em suínos (UFV)
• Mapeamento de genes de crescimento e qualidade
de carne em aves (Embrapa –ESALQ)
Mapeamento de genes de crescimento e
qualidade de carne em aves
(Embrapa –ESALQ)
• Cruzamento entre uma linhagen de corte (TT) e uma de postura (CC).
• Características fenotípicas (F2).
– Ganho de peso, consumo, conversão alimentar.
– Composição de carcaça
– Rendimento de partes
• Genotipagem (F2):
– Microssatélite
– SNP
Linhagem de corte (TT)
Linhagem de Postura (CC)
Caracterização dos Parentais e F1
Grupos
Genét.Peso
41d
Carc. Peito Gord. Pulmão Coração Hemat.
CC 514a 330a 73a 0,8a 4,4a 4,7a 32,2a
TT 2395b 1776d 486d 57,2b 17,1d 13,3d 34,6c
LLc 1689c 1185b 284b 37,8c 11,9b 9,8b 30,4b
CT 1573d 1129b 292b 30,8d 11,4b 8,9b 31,7ab
TC 1193e 832c 206c 18,1e 9,9c 7,0c 32,6a
Família de referência
• Seis machos TT X seis fêmeas CC para gerar a
população F1. Cruzamentos recíprocos.
• Seis famílias de F1 foram selecionados. Cada uma
com um macho e 3 fêmeas.
• Cada macho foi cruzado com 3 fêmeas para gerar
a população F2
• Cada família de F2 tem 100 indivíduos
• Total de 3600 indivíduos F2
Indivíduos F2
Mapeamento de QTL com
Microssatélites
Posição no cromossomo (cM) Marcador Nº do Kit
Resultado do 2
12 Mcw 248 3 Não associado
24 Mcw 168 7 Não associado
52 Lei 209 4 Não Otimizado
66 Gct 06 7 Não associado
71 Mcw 101 7 Não Otimizado
94 Mcw 106 7 Não associado
122 Adl 19 7 Não associado
151 Adl 234 7 Não Otimizado
162 Mcw 297 3 Associado (P<0,05)
169 Lei 146 3 Associado (P<0,01)
175 Lei 174 3 Associado (P<0,10)
211 Lei 71 3 Associado (P<0,01)
235 cM QTL identificado por van Kaam, et al. (1999)
259 Lei 101 3 Não associado
267 Adl 251 7 Não Otimizado
288 Mcw 218 3 Não associado
300 Lei 108 3 Não associado
309 Lei 160 3 Não associado
316 Lei 88 3 Não associado
330 Mcw 200 3 Não associado
366 Lei 91 3 Não associado
381 Lei 139 3 Não associado
400 Lei 169 3 Associado (P<0,10)
414 Mcw 283 3 Não associado
417 Lei 106 3 Associado (P<0,01)
424 Lei 107 3 Não associado
434 Lei 79 3 Associado (P<0,01)
455 Mcw 145 7 Associado (P<0,01)
466 cM QTL encontrado por van Kaam, et al. (1999)
475 Abr 328 7 Não associado
500 Adl 101 7 Não associado
520 Adl 238 7 Não associado
527 Lei 134 3 Não associado
565 Mcw 107 7 Não associado
Genotipagem Seletiva
Mapeamento de QTL no Cromossomo 1
0
2
4
6
8
10
12
14
0 100 200 300 400 500
Distâcia em cM
F
PN P42
P35 P41
Ligação significativa a 5%
Estratégia:
• Identificação de Genes Candidatos:
– Análise de genes conhecidos (hormônio de
crescimento, miostatina, fatores miogênicos,
...)
– Análise de sequencias expressas, EST
– Estudo de expressão gênica.
Exemplos
• Musculatura dupla
• Gene do halotano
• Receptor de estrogênio
Gene Halotano: receptor de
ryanodina.
• Mutação associada com aumento na % de
músculo na carcaça.
• Maior susceptibilidade ao estresse.
• Associado com pior qualidade de carne.
Polimorfismo:
Cromossomo 5
ATAACGCGCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA
TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT
Cromossomo 5’
ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA
TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT
RFLP
Digestão com enzima que reconhece a seqüência GCGC:
Cromossomo 5
GCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA
CGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT
ATAACGC
TATTGCG
Cromossomo 5’
ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA
TATTGCGCGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT
Cromossomo 5
ATAACGCGCAATCACACACA........CTGACTGATATGTA
TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT
Cromossomo 5’
ATAACGTGCAATCACACACACACACTGACTGATATGTA
TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT
Receptor de estrogênio
• Animais da raça meishan chinesa tem um
maior número de leitões por leitegada.
• Associação entre polimorfismo do gene do
receptor de estrogênio e tamanho da leitegada.
• Detecção do polimorfismo por PCR e digestão
com enzima de restrição.
Deficiência na adesão de
leucócitos em bovinos (BLAD)
• Mutação na proteína CD18.
• Animais homozigotos para a doença
raramente sobrevivem.
• Freqüência gênica de 15% nos touros e 6%
nas fêmeas.
Bovino de musculatura dupla
Efeito da ausência de expressão do gene da miostatina em camundongos (McPherron et al.,
1997)
Castelhano, E. C., 2000
McPherron et al., Nature e PNAS 1997
Musculatura dupla em bovinos
Bovino com fenótipo de musculatura dupla
Castelhano, E. C., 2000
Exon 1 Exon 2 Exon 3Intron 1 Intron 2 DNA extra gênico
Síntese de RNA
RNA primário
RNAm
Processamento
Transcriptoma: Estudo de
seqüências expressas (EST)
Construção da biblioteca de cDNA
RNA total mRNA
AAAA
AAAA
AAAA
AAAA
Síntese do cDNA
RNA m
AAAAAA
TTTTTTNot I
Síntese da Primeira fita
AAAAAA
TTTTTTNot I
Síntese da Segunda fita
AAAAAA
TTTTTTNot I
Adição do Adaptador SalI
AAAAAA
TTTTTTNot I
AAAAAA
TTTTTTNot I
Digestão com NotI
AAAAAA
TTTTTTNot I
Ligação no Plasmídio
Sal I Sal I
Sal I
Sal I
Sequenciamento das EST
cDNA
ACGTACGTACGTAC
TGCATGCATGCATGPrimer
3’ 5’
5’
Plasmídio
Cromatograma
Análise de polimorfismo
SOMITOS
CÉLULAS
PLURIPOTENTES
FIBRA
MUSCULAR
MIOBLASTOS
PROLIFERAÇÃO
DETERMINAÇÃO
DIFERENCIAÇÃO
MATURAÇÃO
FGF / HGF / Prohibitin / Laminin B / Ciclinas / EBP1 / CDC45 /
BRCA1 / MCT1 / p10 binding ptn / peroxiredoxin 1 / RAB1 /
BTG1 / MN1 / Translationally controlled Tumor ptn / cell division
control ptn 4
Paired mesoderm homeobox ptn 1 / homeobox ptn
Hox-d12/ BMP1 / Transcriptor Factor 4 / Hoxa 7 /
Early development regulator 2 / Slug ptn /
Nucleoredoxin / RRM containg ptn SEB4 / COP9 /
TATA binding ptn associated factor / Mo25
Notch / ATF4 / PCAF associated factor / LIM /
Motch / retinoblastoma tumor supressor / SRF
/ Muscle specific gene M9 / Limb deformity ptn
/ pleiotrophin
Caldesmon / Transgelin / Destrin / Myosin
binding ptn / Collagen / Diaphanous ptn /
Catenin / Actina / Tubulinas / Calpactina /
Miosina / Dynactin / Dysbinding / SW1 / SNF
/ Keratin 17 / Troponina / Tropomiosinas
Macroarray
Microarray
Estudos de expressão gênica
Genes diferencialmente expressos entre linhagens de corte e postura
Metabolism
Cell growth and
maintenance
Unknown
Li...
Selected Gene Tree: Linhagens (Default Inter...
Selected Condition Tree: Linhagens (Default Inter...
Colored by: Linhagens (Default Interpretation)
Gene List: metabolism (155)
Linhagen... Li...
Selected Gene Tree: Linhagens (Default In...
Selected Condition Tree: Linhagens (Default In...
Colored by: Linhagens (Default Interpretation)
Gene List: cell growth and-or maintenance (2...
Linhagen... Li...
Selected Gene Tree: Linhagens (Def...
Selected Condition Tree: Linhagens (Def...
Colored by: Linhagens (Default Interpreta...
Gene List: molecular_function unknown...
Linhage...
Metabolism Cell growth and
maintenance
Unknown
•101 genes diferencialmente expressos entre as linhagens (P<0.05).
•Na linhagem de corte, 62 induzidos e na linhagem de postura 39 estavam induzidos.
•Entre os genes com maior expressão na linhagem de corte 1 esta envolvido com contração muscular, 3 com sinalização celular, 1 com proliferação celular, 2 com desenvolvimento de músculo e 2 com síntese de proteína.
• Entre os genes com maior expressão na linhagem de postura, 3 estavam envolvidos com sinalização celular e 2 com síntese de proteína.
Up-regulated Broiler
Up-regulated Layer
Mapeamento dos genes diferencialmente expressos em regiões de QTL
29,9 Mb
32,7 Mb
40,8 Mb
68,2 Mb
71 Mb
96,4 Mb
150,6 Mb
161,4Mb
21 Mb
41,9 Mb
QTL Carcass yield
59,6 Mb
71 MbQTL Breast weight**
147,5 Mb
154 Mb
176Mb
177,5 Mb
QTL Intestinal length * * and body weight
36,3 Mb
80,8 Mb
23 Mb
38,5 Mb
QTL Egg weight
73 Mb
90,5 Mb
QTL Carcass and breast weight and feed conversion **
GGA1: 11 transcripts DE
8 in QTLGGA2: 5 transcripts DE
2 in QTL
SOMITO MIOBLASTO MIOTUBO MIOFIBRA
MyoD ou Myf-5 Miogenina MRF4
Determinação Diferenciação Maturação
bFGF, TGF-, miostatina
oncogenes
Similaridade entre os perfis de expressão de MyoD/miogenina
Similaridade entre os perfis de expressão de MRF4/Myf5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728
Estádios de desenvolvimento
mR
NA
mio
sta
tin
a (
10
-3 f
mo
l/fm
ol b
-actin
a)
Valores observados
Valores estimados
MIOSTATINA
MIOSTATINA
Precursoras
Myo D
Myf 5
Mioblastos
Proliferação
Miogenina
Mioblastos
determinados
Miotubos
Diferenciação
Rb
Cdk2p21MIOSTATINA
Thomas et al. 2000, JBC, v.275, n.51, p.40235-43
McPherron et al, 1997
RESULTADOS DA
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
Embrião HH20 Embrião HH24 Embrião HH24
RESULTADOS DOS CORTES
HISTOLÓGICOS
TN
NC
STST
NC
TN
Grupos
Genét.Peso
41d
Carc. Peito Gord. Pulmão Coração Hemat.
CC 514a 330a 73a 0,8a 4,4a 4,7a 32,2a
TT 2395b 1776d 486d 57,2b 17,1d 13,3d 34,6c
LLc 1689c 1185b 284b 37,8c 11,9b 9,8b 30,4b
CT 1573 1129 292 30,8 11,4 8,9 31,7
Expressão MyoD
0
10
20
30
40
50
60
70
E12 E15 E18 E24 E26
10
-4 fm
ole
s/f
mol b
actin
a
CC
LLC
TT
Atraso transiente na determinação - Expressão de MyoD
Expressão miogenina
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
E12 E15 E18 E24 E26
10
-4 f
mole
s/f
mol b
actin
a
CC
LLC
TT
Atraso transiente da diferenciação – Expressão de Miogenina
Expressão miostatina
0
5
10
15
20
25
E12 E15 E18 E24 E26
Estádios desenvolvimento
10
-4 f
mole
s/f
mol b
actin
a
CC
LLC
TT
Menor expressão do inibidor da proliferação de mioblastos –
Expressão de Miostatina
Strategy:
Gene candidato
Expressão diferencial de genes
MyoD : 881 cccatactgcctccagctgaagctgtagctgaagggagtccctgttccccccaggaagga 940
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
pMyoD: 241 cccatactgcctccagctgaagctgtagctgaagggagtccctgttccccccaggaagga 300
MyoD : 941 ggaaacctgagtgacagtggagcccagattccttcccccaccaactgcacccctcttccc 1000
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||
pMyoD: 301 gcaaacctgagtgacagtggagcccagattccttcccccaccaactgcacccctcttncc 360
Polimorfismo
12
6
Mapa comparativo
(Humano)
EST