Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale
Biotechnologie végétale
Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale
Exemples d’utilisation en recherche fondamentale
Cultures de plantules in vitro Approches pharmacologiques et toxicologiques
Suspensions cellulaires et protoplastes Échanges membranaires, mécanismes
signalétiques Adressage protéique Dédifférenciation, Différenciation Contrôle du métabolisme
Approches pharmacologiques sur plantules
Déterminisme hormonal de la formation de racines secondaires
Zhu et al.
Utilisation des suspensions cellulaires dans un contexte de signalisation cellulaire
Hypersensitive Response (HR)
Interactions plantes / pathogènes
HR
Mort cellulaire
Circonscription du pathogène
SAR
Systemic Acquired Resistance :
« Immunisation des plantes »
Réaction rapide
À plus long terme …
Exemple typique : infection par le virus de la mosaïque du Tabac
3 jours d’infection
Nécroses = mort cellulaire
Restriction de la propagation du virus
Lam et al. (2001) Nature
Ehrenfeld et al. 2005 Mol. Cells
Composés phénoliques(autofluorescence)
Mort cellulaire(Bleu Evans)
Callose
H2O2
Caractéristiques histologiques de la réaction hypersensible
Inconvénients du modèle plante entière
Culture des plantes : En serre : dépendance des saisons Chambres de culture : coûteux Variabilité importante
Dosages enzymatiques difficiles Problèmes de pigments
Mesures de flux difficiles Utilisation difficile d’inhibiteurs
Utilisation de suspensions cellulaires
Quantification de la mort cellulaire
Utilisation d’inhibiteurs Petites quantités Rapidité d’absorption
Facilités d’extraction et dosages Métabolites (SA, phénylpropanoides ROS,
NO…) Activités enzymatiques Extractions d’ARN
Estimation de la mort cellulaire
Colorants des cellules vivantes :
Fluoresceine diacétate Rouge neutre
des cellules mortes Bleu Evans, Bleu Trypan, Iodure de
propidium
Comptages sous microsope Comptages par fluorimétrie
Mort cellulaire : Nicotiana tabacum/ Phytophtora cryptogea
H2O Cryptogéine
Prélèvements et comptage de la mort
cellulaire au cours du traitement
Cryptogéine
heures
% mortalité
Témoin
Recherche d’évènements précoces
Cryptogéine
heures
% mortalité
Témoin
Que se passe-t-il pendant ces premières heures?
Synthèse des composés phénoliques
H2O
Cry 50 µM
Transcription du gène codant la PAL
Zhang et al. 1998 Plant Cell
Suivi des concentrations ioniques intracellulaires
Exemple du calcium
Sondes calciques
Pénétration des sondes
Problème : sondes chargées négativement, imperméantes
Solution : dérivation avec un groupement acétométhylester (AM)
Les molécules pénètrent les cellules Action d’esterases endogènes Libération des formes actives dans le
cytoplasme
Inconvénients
Sensibilité au pH : Compartimentation ? Changements de pH cytoplasmique
plus qualitatif que réellement quantitatif
Suivi du calcium intracellulaire
Système Nicotiana plumbaginifolia / apoaequorine
Ca2+
Ca2+
Ca2+
coelentérazine
apoaequorine
++ O2
Ca2+
Ca2+
Ca2+
+ CO2
+λ=469nm
calcium
Mode d’action de la coelentérazine
Fluctuations de la concentration cytosolique de calcium
Temps (min)
Cry (0.5 mM Ca2+)
Cry (0.4 mM Ca2+)
Cry (0.3 mM Ca2+)
Cry (0.2 mM Ca2+)
Cry (0.1 mM Ca2+)Cry (0.1 mM Ca2+)
0 10 20 30 40
2,4
[Ca
2+]
cyt
(µM
)
Lecourieux et al. 2002 Plant Cell
Elaboration d’un modèle de signalisation cellulaire
Modèle très simplifié d’une voie de transduction du signal entre la perception de la cryptogéine et la mort cellulaire (Nicotiana)
Cry Ca2+
Phosphorylations (kinases)
NO3-
NADPH NADP
H2O2
Mort cellulaire
Utilisation de protoplastes en recherche
Transport membranaire Adressage protéique Protoplastes tissu-spécifiques
Étude de transports membranaires
Minéraux, H2O
Absorption racinaire
Trafic vasculaire
Relations Source / Puit
Photoassimilats
Étude de transports membranaires
Problème des suspensions cellulaires: Agrégats Paroi végétale
Les protoplastes : un modèle simple et pertinent
Étude de transports membranaires
Traceurs isotopiques
Sondes fluorescentes
Electrophysiologie
Traceurs isotopiques
Ni
Ni
Ni
Ni
Incubation protoplastes +
63Ni 10 µM
5 mn
CaCa
Ca
Ca
Filtration et rinçage CaCl2 2 mM s
Filtre 0.45µM
Comptage 63Ni dans le filtre = Ni intracellulaire
Ni
Ni
NiNi
Sondes fluorescentes
Protoplastes de blé chargés avec du BTC-5N (spécifique du Cd)
Lindberg et al. (2004) Planta
Utilisation des protoplastes en électrophysiologie
Caractérisation de canaux voltage- dépendants
Voltage Clamp
Patch Clamp
Les solutés diffusent selon le gradient électrochimique. Comment caractériser la régulation électrique de canaux ?
Voltage Clamp
Une électrode enregistre les modifications de tensions
La seconde impose une tension et corrige les variations
Protoplaste
Enregistrement des courants ioniques
Patch Clamp
Mesure des courants sur une surface membranaire très réduite
•forte résistance : mesure de courants faibles
•étude d’un petit nombre de canaux
Patch Clamp : principes
•Imposition d’un potentiel membranaire
•Mesure d’un courant100 pA
75 ms
Assmann (2001) Plant Physiol.
mV
pA
Adressage des protéines
Expression transitoire en protoplastes de protéines fusionnées avec une GFP
Canaux et transporteurs membranaires
Souvent : faible niveau d’expression
Fonction définie essentiellement par : Spécificité de substrat Expression tissulaire Adressage membranaire
Exemple d’une P-ATPase
ATP
ADPP
N
CPC
N
CPC
GFP Greffage d’une GFP sur une partie soluble
Green Fluorescent Protein
Aequorea victoria
Stucture « cannette de feuillets β »
Spécificité de la GFP:
pas de groupement prosthétique synthétisé séparément
modification d’acides aminés de la chaîne polypeptidique
Hexapeptide :FSYGVQ
Expression transitoire : principe
Insérer un fragment d’ADN codant un protéine dans un protoplaste Plasmide DNA double brin ou simple brin
Observation directe de l’expression
Pas forcément d’intégration chromosomique
Construction HMA4::GFP
HMA4GFP2x35S
Ori coliAmpi
Réplication et sélection dans E. coli
Protéine de fusionPromoteur
Transformation de protoplaste
Préparer de grandes quantités de plasmide
Transformation MaMg :
Mannitol (0.5 M) MES-KOH (5 mM) pH 5,6 MgCl2 (15 mM)
Polyethylène Glycol déstabilisation de la membrane
Transformation de protoplastes
Dans 300 µl de tampon
106 protoplastes
10 µg de plasmide
100 µg de « DNA carrier »
0-2 °C
300 µl PEG 40%
30 min sur glace
Rinçage par dilution /
sédimentation :
NaCl, CaCl2,
Glucose
Expression
Étaler les protoplastes rincés sur boite de Pétri
Incuber 4-48 heures à l’obscurité
Observations (Ex 495 nm / Em 515 nm)
Un transporteur du plasmalemme : AtHMA4
Témoin : GFP soluble
AtHMA4::GFP
Verret et al. (2004) FEBS Lett.
Thomine et al. (2003) Plant J.
Un transporteur de la membrane tonoplastique: AtNRAMP3
Isolation de protoplastes spécifiques d’une assise tissulaire
Gène rapporteur GFP sous le contrôle d’un promoteur spécifique d’une assise tissulaire
Prom GFP
Tri des protoplastes
exprimant la GFP par cytométrie en
flux
Isolement de protoplastes de racines
Birnbaum et Bernfey 2004 Curr. Opin. Plant Biol.
Les protoplastes tissu-spécifiques: un outil de recherche polyvalent
Electrophysiologie
Transcriptomique
Protéomique
Exemple : transcriptome des cellules du centre quiescent
Tri par cytométrie en flux
Fluorescence GFP
Contre marquage IP
Nawy et al. 2005 Plant Cell
Hybridation sur puces à ADN
Nawy et al. 2005 Plant Cell