BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS POR ÓLEO DIESEL COM O USO DA MICROBIOTA NATIVA Bruno Gabriel Nascimento Andrade Rio de Janeiro 2009 BRUNO GABRIEL NASCIMENTO ANDRADE Aluno do Curso de Biotecnologia Matrícula 0613800351
BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS POR ÓLEO DIESEL COM O USO DA MICROBIOTA NATIVA
Bruno Gabriel Nascimento Andrade
Rio de Janeiro 2009
BRUNO GABRIEL NASCIMENTO ANDRADE Aluno do Curso de Biotecnologia
Matrícula 0613800351
BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS POR ÓLEO DIESEL COM O USO DA MICROBIOTA NATIVA
Trabalho de Conclusão de Curso, TCC, apresentado ao curso de Graduação em Biotecnologia, da UEZO como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Tecnólogo em Biotecnologia, sob a orientação da Profa Dra Judith Liliana Solórzano Lemos
Rio de Janeiro Julho de 2009
BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS POR ÓLEO DIESEL COM O USO DA MICROBIOTA NATIVA
Elaborado por Bruno Gabriel Nascimento Andrade Aluno do curso de Tecnologia em Biotecnologia da Uezo
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com Grau:_____
Rio de Janeiro,____ de _____________ de 2009
_________________________________________________ Profa. Dra. Marise costa de Mello
_________________________________________________
Profa. Dra Maria de Fátima Sarro
_________________________________________________ Profa. Dra Judith Liliana Solórzano Lemos
RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL JULHO DE 2009
A minha família – que me incentivou mesmo quando estava na iminência de desistir; a minha orientadora, Profa. Judith Liliana Solórzano Lemos, que sempre quando necessário me dava um puxão de orelha, e a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para que eu terminasse de trilhar este caminho.
“É melhor tentar e falhar do que preocupar-se e ver a vida passar. É melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final”. Martin Luther King Jr (1929 – 1968)
Resumo
As contaminações ambientais, tanto aquáticas quanto terrestres,
provocadas por produtos químicos e derivados de petróleo são um grande
problema nos dias de hoje. Além do problema ambiental gera-se o problema
social e econômico, pois, a limpeza desses ambientes por métodos tradicionais
é demasiadamente cara e, em alguns casos, prejudicial, apenas transferindo a
poluição de um local para outro. Este trabalho apresenta um processo que já
vem sendo empregada há um certo tempo, porém só nos ultimos anos ganhou
destaque como uma maneira ecologicamente correta de limpar ambientes
contaminados . O trabalho teve como objeto de estudo uma amostra de solo
comum da Zona Oeste, na qual foi testado o crescimento da microbiota nativa
sob condições normais em diferentes concentrações de fase lama (10, 20 e
30%), sendo a de 30% a mais favorável para a remediação de óleo diesel,
adicionado em concentração de 5% v/v sendo utilizada como fonte de carbono.
Palavras-Chave: Biorremediação, Microflora, Bioaumento.
Abstract
The environmental contamination, both aquatic and terrestrial, caused by
chemicals and oil products are a major problem nowadays. Besides the fact that
environmental problems also generates social and economic problems,
cleaning such environments is very expensive and, in some cases, prejudicial,
just transferring the pollution from one place to another. This work presents a
process that is already being used for a long time; however, only in recent years
this process has gained prominence as an ecologically correct way to clean
contaminated environments. This work had as object of study, a common
sample of soil of the western zone, which was tested the growth of native
microflora, under normal conditions, in different concentration of mud phase
(10, 20 and 30%), being the 30% better for remediation of diesel oil, on
concentration of 5% v/v, and used as carbon source.
Keywords: Biorremediation, Microflora, Bioaugmentation
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema para diluição seriada 12
Figura 2. Placas contendo colônias bacterianas de diluição 10-4 15
Figura 3. Placa contendo colônia fúngica de diluição 10-4 16
Figura 7. Consumo de O2 16
SUMÁRIO
Resumo v
Abstract vi
Listas de Figuras viii
1. Introdução 1
2. Revisão Bibliográfica 2
2.1. Exploração do Petróleo 2
2.2. Transporte e Refino 2
2.3. História do Petróleo no Brasil 3
2.4. Óleo Diesel 5
2.5 Técnicas Remediadoras 6
2.5.1. Incineração 7
2.5.2. Lavagem Química 7
2.5.3. Biorremediação 7
2.5.3.1. Microorganismos degradadores de petróleo 9
3. Materiais e Métodos 11
3.1. Amostra 11
3.2. Vidrarias 11
3.3. Reagentes 11
3.4. Equipamentos 11
3.5. Preparação e esterilização dos materiais 12
3.6. Análise das populações microbianas do solo 13
3.6.1. Bactérias 13
3.6.2. Fungos 13
3.7. Análise da capacidade biorremediadora da microbiota 14
4. Resultados e discussão 15
4.1. Análise quantitativa da microbiota do solo 15
4.1.1. Bactérias 15
4.1.2. Fungos 15
4.2. Análise da capacidade biorremediadora da microbiota 16
5. Conclusão 17
6. Referências bibliográficas 18
1. INTRODUÇÃO
A exploração do petróleo não tem sido uma atividade totalmente segura
ao longo da história, pois inúmeros acidentes têm ocorrido. Durante a extração,
transporte ou refino podem ocorrer vazamentos de petróleo bruto ou de
combustíveis já refinados, causando graves danos ao meio ambiente, como
graves poluições de ambientes terrestres ou aquáticos.
Na última década a preocupação com o meio ambiente teve um
crescimento assombroso, por isso processos ecologicamente corretos para a
limpezas de ambientes estão sendo desenvolvidos e utilizados, entre eles está
a biorremediação.
A Biorremediação é uma técnica que consiste na utilização de
microorganismos para a degradação de poluentes, transformando-os em CO2,
água e energia, quando há uma mineralização completa, ou então em
compostos menos complexos, podendo ser menos poluentes do que aqueles
que lhes deram origem. A microbiota nativa do ambiente contaminado utilizada
para este fim ou, uma população microbiana exógena capaz de degradar
aquele.
A caracterização de microorganismos com uma maior capacidade
natural de degradar hidrocarbonetos complexos como o petróleo e o
desenvolvimento de novas e mais efetivas técnicas de biorremediação são de
extrema importância, pois, além de terem o custo mais baixo quando
comparado a outras técnicas remediadoras, tendem a produzir compostos
biodegradáveis como resultado da ação microbiana que não afetam
negativamente o meio a ser tratado e evitam a transferência do poluente de um
meio para o outro.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. EXPLORAÇÃO DO PETRÓLEO A exploração de depósitos de petróleo com interesse comercial depende
da existência de rochas sedimentares no subsolo ou rochas impermeáveis com
espaços vazios.
A exploração pressupõe uma investigação de regiões com tais
características, o que é feito a partir do estudo do relevo da região, de estudos
geológicos da superfície e de processos geofísicos.
A perfuração, em função do tipo de solo, é programada para
profundidades que variam de 800 a 5000 m e é feita com o auxílio de brocas de
tungstênio ou diamante para rochas muito duras, ou brocas de dentes ou
lâminas para rochas menos resistentes.
Quando a perfuração é feita no mar, na chamada plataforma continental,
utilizam-se plataformas de aço ou navios-sonda. Essas plataformas atingem
150 m ou mais de comprimento e sua altura podem ser regulados por
complexos sistemas elétricos e hidráulicos, podendo ser rebocadas e
colocadas na posição adequada, existe outro tipo de plataforma, chamada
semi-submersível, que ocupa uma posição abaixo do movimento das ondas,
dando grande estabilidade ao equipamento, e que é sustentada na superfície
do mar por uma espécie de pequenos submarinos.
Embora as perfurações no mar apresentem um custo quatro vezes maior
que as feitas em terra, no Brasil, elas tornam-se interessantes economicamente
porque os poços marítimos produzem muito mais que os terrestres
(http://www.quimicaweb.com/quimica/exploracaodopetroleo.htm).
2.2. TRANSPORTE E REFINO DO PETRÓLEO Após a extração do petróleo, o transporte se dá por oleodutos até os
portos de embarque. Grandes petroleiros dão seqüência ao transporte até os
terminais marítimos a que se destinam, onde, novamente, através de
oleodutos, o petróleo é bombeado até as refinarias.
Como o petróleo é uma mistura de milhares de hidrocarbonetos cujos
pontos de ebulição estão muito próximos, seria impossível separá-los um a um;
então, a separação é feita em grupos de hidrocarbonetos, chamados frações
do petróleo. Cada fração do petróleo é ainda uma mistura de hidrocarbonetos
formada por um número menor de substâncias, e sua separação só é possível
porque as frações apresentam diferentes pontos de ebulição.
Inicialmente o petróleo é aquecido em um forno, sendo praticamente
vaporizado, e direcionado para uma coluna de fracionamento provida de várias
bandejas. A temperatura da coluna varia em função da altura, sendo que no
topo encontra-se a menor temperatura.
Os hidrocarbonetos de massas molares maiores, ainda líquidos,
permanecem no fundo e são separados para sofrerem, posteriormente, uma
destilação a pressão reduzida. Os mais leves, no estado gasoso, tendem a
subir na coluna, resfriando-se. Quando esses vapores atingem uma bandeja
com temperatura inferior ao ponto de ebulição de uma das frações, eles se
condensam e são retirados da coluna. Os vapores restantes borbulham através
dessa fração já líquida e passam para a bandeja superior, onde o mesmo
processo se repete e outra fração é liquefeita e retirada; isso ocorre
sucessivamente ao longo de toda uma coluna, que pode estar equipada até
com 50 bandejas.
Na verdade, é impossível separar de uma maneira eficiente as frações
na primeira vez em que este processo é efetuado, por isso ele deve ser
repetido. Uma parte dos vapores que deveriam se liquefazer na primeira
bandeja sobe para a segunda e só então se liquefaz. Existem comunicações
externas à coluna, entre as bandejas, que permitem que o líquido obtido na
segunda bandeja retorne à primeira. Nessa primeira bandeja ocorre a
vaporização dos componentes que vieram da segunda bandeja, mas os
componentes da primeira bandeja permanecem líquidos e são retirados. Este
processo se repete várias vezes em cada bandeja.
(http://www.quimicaweb.com/quimica/exploracaodopetroleo.htm)
2.3. HISTÓRIA DO PETRÓLEO NO BRASIL A história da indústria petrolífera do Brasil se confunde com a criação da
Petrobras, em 1953, empresa que alavancou a exploração deste recurso
natural que se tornaria um dos termômetros da política internacional. No
cenário mundial, hoje, o Brasil ocupa o 16º lugar no ranking dos maiores
produtores de petróleo do mundo. Até isso ocorrer foi preciso que houvesse um
aumento da capacitação de recursos humanos, injeção de capital, crises
internacionais e a criação de políticas que organizaram e priorizaram o petróleo
para o desenvolvimento do país.
Mas este foi o resultado de uma caminhada que começou quando
observadores e curiosos foram gradativamente desvendando os primeiros
vestígios de petróleo em solo brasileiro a partir do final do século XIX. Nos
EUA, em 1859, perfurava-se o primeiro poço de petróleo na Pensilvânia,
descoberto pelo coronel Edwin L. Drake.
No Brasil, as primeiras tentativas de encontrar petróleo datam de 1864,
Mas apenas em 1897, o fazendeiro Eugênio Ferreira de Camargo perfurou, na
região de Bofete (SP), o que foi considerado o primeiro poço petrolífero do
país, muito embora apenas dois barris tenham dele sido extraídos. Nesta
época o mundo conheceu os primeiros motores à explosão que expandiriam as
aplicações do petróleo, antes restritas ao uso em indústrias e iluminação de
residências ou locais públicos. No final do século XIX, dez países já extraíam
petróleo de seus subsolos.
Durante a década de 30, já se instalava no Brasil uma campanha para a
nacionalização dos bens do subsolo, em função da presença de trustes
(reunião de empresas para controlar o mercado) que se apossavam de
grandes áreas de petróleo e de minérios, como o ferro. Um das pessoas que
desempenhou papel chave nesta campanha foi Monteiro Lobato, que sonhava
com um Brasil próspero que pudesse oferecer progresso e desenvolvimento
para sua população. Depois de uma viagem aos Estados Unidos, em 1931,
Lobato retorna entusiasmado com o modelo de país próspero que conhecera e
passa a defender as riquezas naturais do Brasil e sua capacidade de produzir
petróleo, através de contribuições de artigos para jornais e palestras para
promover a conscientização popular.
Nesse meio tempo, no interior da Bahia, Manoel Ignácio Bastos, um
engenheiro que trabalhava para a delegacia de Terras e Minas encontra
amostras de uma substância negra que, após ser analisada pelos engenheiros
Antonio Joaquim de Souza Carneiro, da Escola Politécnica de São Paulo e
Oscar Cordeiro, da Bolsa de Mercadorias, é confirmada como sendo petróleo.
Depois de muitas tentativas frustradas de atrair a atenção das autoridades,
finalmente, em 1939, a sonda enviada pelo DNPM jorraria petróleo
abundantemente, sendo considerado o primeiro poço comerciável do país, dois
anos depois.
Apenas como curiosidade, quem recebeu os créditos pela descoberta foi
Oscar Cordeiro, fato que só seria corrigido pela Petrobras em 1965, quinze
anos após a morte de Ignácio Bastos, após extensa análise documental
apresentada pela viúva de Bastos.
O êxito obtido reforçou a necessidade de o país minimizar sua
dependência em relação às importações de petróleo. Conseqüentemente, em
1939 o governo de Getúlio Vargas instala o Conselho Nacional do Petróleo
(CNP), com a primeira Lei do Petróleo do país, para estruturar e regularizar as
atividades envolvidas, desde o processo de exploração de jazidas até a
importação, exportação, transporte, distribuição e comércio de petróleo e
derivados. Este decreto tornou o recurso patrimônio da União. Daí em diante
muitas perfurações foram feitas nas bacias do Paraná de Sergipe-Alagoas e do
Recôncavo, sendo que as principais descobertas foram feitas nesta. Nos anos
50, a pressão da sociedade e a demanda por petróleo se intensificavam, com o
movimento de partidos políticos de esquerda que lançam a campanha "O
petróleo é nosso". O governo Getúlio Vargas responde com a assinatura, em
outubro de 1953, da Lei 2004 que instituiu a Petróleo Brasileiro S.A (Petrobras)
como monopólio estatal de pesquisa e lavra, refino e transporte do petróleo e
seus derivados (http://www.comciencia.br/reportagens/petroleo/pet06.shtml).
2.4. ÓLEO DIESEL
O Óleo é um combustível derivado do petróleo sendo constituído
basicamente por hidrocarbonetos (compostos orgânicos que contém átomos de
carbono e hidrogênio). Alguns compostos presentes no diesel, além de
apresentar carbono e hidrogênio apresentam também enxofre e nitrogênio.
Normalmente, o diesel é um combustível mais “pesado” do que a gasolina e
sendo formado por cadeias carbônicas de 6 a 30 átomos, essa característica
também confere menor volatilidade e menor solubilidade em água. Participam da
composição do óleo diesel participam hidrocarbonetos parafínicos, oleofínicos
e aromáticos.
Produzido a partir da refinação do petróleo, o óleo diesel é formulado
através da mistura de diversas correntes como gasóleos, nafta pesada, diesel
leve e diesel pesado, provenientes das diversas etapas de processamento do
petróleo bruto. Recebeu este nome em homenagem ao engenheiro alemão
Rudolf Diesel que inventou um meio mecânico para explorar a reação química
originada da mistura de óleo e do oxigênio presente no ar
(www.motorvac.com.br/portugues/literatura/lite_oleodiesel.pdf).
O Diesel é constituído de muitos compostos recalcitrantes para o ataque
microbiano, possuindo em sua composição alcanos e compostos aromáticos de
alto peso molecular, dificultando muito sua degradação por microorganismos
(VIEIRA, 2007).
2.5. TÉCNICAS REMEDIADORAS
Para a descontaminação de ambientes poluídos por hidrocarbonetos
complexos, como o petróleo e seus derivados, ou mesmo por outros agentes
químicos são empregadas técnicas cuja ação vai depender do tipo do
contaminante, da concentração do mesmo e da extensão da área afetada.
Por esse motivo, diversas tecnologias de remediação têm sido
desenvolvidas e consolidadas principalmente pelos países desenvolvidos. O
Brasil, hoje mais preocupado com seus locais contaminados, começa a
desenvolver suas próprias tecnologias e também a adaptar as tecnologias já
estabelecidas às nossas condições ambientais. O Estado de São Paulo, em
função de sua intensa industrialização, apresenta uma situação mais crítica em
relação a esta questão. Desta forma, a CETESB tem desenvolvido manuais e
adaptado legislações, principalmente normas Holandesas (CETESB, 1996),
com vistas ao controle das áreas suspeitas de contaminação e
comprovadamente contaminadas. Neste sentido, destaca-se o Manual de
Gerenciamento de Áreas Contaminadas 1, que tem por função fornecer
informações e metodologias a serem utilizadas na solução dos problemas
gerados por áreas contaminadas, desde a investigação preliminar até a
proposição de técnicas de remediação (CETESB, 1996).
Muitas opções ou combinações de opções estão disponíveis para
restaurar a qualidade do solo e da água subterrânea. A seleção de tecnologias
a serem utilizadas baseia-se fundamentalmente no conhecimento das
características físico-químicas do contaminante, volume vazado, tempo de
vazamento, caracterização geológica e hidrogeológica do local, análise do meio
físico superficial e subterrâneo e extensão da pluma contaminante
(SPILBORGHS, 1997).
2.5.1. Incineração
A incineração é um processo tecnológico que emprega a decomposição
térmica, via oxidação em alta temperatura (usualmente 900ºC ou superior),
para destruir a fração orgânica de um resíduo ou reduzir o seu volume.
Qualquer resíduo contendo uma fração orgânica perigosa, não importa
se pequeno, é um candidato à incineração. Até mesmo águas contaminadas
podem ser incineradas. A incineração de solos contaminados por vazamentos
de produtos perigosos ou combustíveis é bastante praticada. (RODRIGUES,
2002)
Embora a incineração seja considerada o meio mais eficiente para
destruir resíduos perigosos, ele possui a desvantagem de destruir
completamente o solo contaminado e possuir um custo extremamente elevado
(NEHEMIAS et al, 2001).
2.5.2. Lavagem química A lavagem química é um processo tecnológico que desagrega
hidrocarbonetos do solo através do uso de solventes leves. Os solos
contaminados por produtos petrolíferos são encaminhados para a unidade
móvel de lavagem de sólidos, reciclador / lavador. Procede-se a lavagem a
quente, com forte agitação hidromecânica, que provoca um forte movimento
com desagregação eficiente dos produtos petrolíferos.
Utiliza-se nesta fase um surfactante biodegradável para transferência
dos compostos orgânicos da matriz sólida para a fase líquida.
O processo de lavagem é realizado em ciclos, por cargas, até a
obtenção de um baixo nível de hidrocarbonetos. O ciclo continua até não haver
libertação de produtos petrolíferos, esta técnica tem a vantagem de não
destruir o solo, sendo o mesmo devolvido após o processo
(http://www.hidroquimica.pt).
2.5.3. Biorremediação A Biorremediação é uma técnica alternativa e ecologicamente correta do
ponto de vista da destinação final dos resíduos. Desde meados da década de
90 a técnica de biorremediação tem sido adotada como uma maneira
extremamente eficaz e de baixo custo para a remediação de compostos
orgânicos em solos. Estas técnicas são baseadas em processos
microbiológicos que convertem os contaminantes em dióxido de carbono e
água, pela minerização completa, ou pela redução da toxicidade dos
compostos através de sua degradação parcial. Entretanto, a eficácia da
biorremediação sofre um impacto direto do processo de intemperização que o
solo contaminado passou desde a data do derramamento do contaminante
(TRINDADE, 2002).
A intemperização é a conseqüência da ação de fenômenos químicos,
físicos e biológicos. As ações destes fenômenos resultam na redução do
composto contaminante, seja por volatilização de compostos mais leves, ou
pela lixiviação dos compostos, afetando o tipo de contaminante presente no
solo e a disponibilidade deste para o ataque microbiano.
A natureza do contaminante presente no solo vai interferir na extensão
da degradação microbiana, por estar intrinsecamente relacionada ao peso
molecular do composto orgânico e da razão de hidrocarbonetos saturados e
aromáticos.
Outra importante conseqüência do processo de intemperização é a
redução da disponibilidade dos contaminantes aos microorganismos
(biodisponibilidade), devido à maior sorção destes pela matriz do solo, tirando-
os da fase dissolvida. Este fator será mais pronunciado em solos argilosos, já
que é grande a fração de partículas finas deste que intensificam a interação
entre a matriz e o contaminante (TRINDADE, 2002).
Estudos recentes apontaram que várias bactérias e fungos filamentosos
possuem a capacidade de mineralizar ou degradar hidrocarbonetos, no entanto
esta técnica é mais apropriada para um tratamento de refino e não quando se
tem altas concentrações do poluente. Então, a biorremediação poderia ser
empregada em associação a outras técnicas que façam um abatimento
ambiental considerável, deixando o contaminante remanescente para os
microrganismos (MANCERA et al, 2006)
Várias técnicas de biorremediação foram desenvolvidas, mas a
bioestimulação é a mais usada (HEAD, 1998). Esta técnica consiste na
ativação dos microorganismos nativos do solo através da adição de nutrientes
(PROVIDENTI et al, 1993). No entanto, em alguns casos a população
microbiana do solo afetado pode não ser o suficientemente grande, ou então
carecer da habilidade de degradar compostos com alto peso molecular; nesses
casos a técnica do bioaumento poderia ser usada. Essa técnica consiste na
adição de culturas microbianas com capacidade de remediação específicas e
conhecidas (D’ANNIBALE et al., 2006). Essas culturas devem,
conseqüentemente, possuir a habilidade de crescer em solos diferentes e
sobreviver à presença de outros microorganismos (RISER-ROBERTS, 1998).
2.5.3.4 Microrganismos degradadores de petróleo e/o u seus derivados
Bactérias e fungos são os principais microrganismos degradadores de
hidrocarbonetos. As bactérias constituem os microrganismos mais estudados,
dentre os quais as Pseudomonas foram as primeiras a serem postas em
evidência em função da sua capacidade de degradar hidrocarbonetos
aromáticos policíclicos (HAP). Mais tarde, outros gêneros (Alcaligenes,
Mycobacterium, Rhodococcus) foram também aplicados na degradação destes
compostos (BOUCHEZ et al., 1996). Leahy e Colwell (1990) citam os seguintes
gêneros de bactérias como os mais importantes: Achromobacter,
Acinetobacter, Alcaligenes, Arthobacter, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia e
Pseudomonas.
Além das bactérias, os fungos representam importante papel na
degradação dos hidrocarbonetos no solo, suas enzimas extracelulares podem
proporcionar substratos para o crescimento de bactérias através da hidrólise de
polímeros e também importantes metabólitos secundários. O mecanismo da
degradação de hidrocarbonetos por fungos têm sido menos estudado, mas
provavelmente envolvem oxigenases induzíveis similares as apresentadas por
algumas bactérias
Dentre os fungos que degradam hidrocarbonetos de petróleo é
importante distinguir os filamentosos, degradadores de lignina, tais como
Phanaerochaete chrysosporium, e os não degradadores de lignina como
Cunninghamella elegans (BOUCHEZ et al., 1996)
Os atributos que distinguem os fungos filamentosos das outras formas
microbianas determinam porque estes microrganismos são bons
biodegradadores. Primeiro, o crescimento micelial confere uma vantagem
sobre os microorganismos unicelulares, bactérias e leveduras, especialmente
no que concerne à colonização de substratos insolúveis. Os fungos ramificam-
se rapidamente no substrato, digerindo-o através da secreção de enzimas
extracelulares, disponibilizando, desta forma, o acesso para o ataque
bacteriano. Em segundo lugar, os fungos, aparentemente, toleram maiores
concentrações de produtos tóxicos no microambiente externo do que no seu
interior. São capazes de crescer sob condições ambientais de estresse, como
em meios com baixos valores de pH, por exemplo, e ainda suportar meios
pobres em nutrientes. Por outro lado, apresentam uma capacidade de
sobrevivência em meios com baixa atividade de água maior do que as
bactérias e leveduras, propriedade esta que os apontam como os mais
apropriados para trabalhar em condições de baixa umidade relativa. (DYMINSKI,
2006).
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Amostra
70g de solo
3.2. Vidrarias
10 pipetas de 10 ml
10 pipetas de 5 ml
10 pipetas de 1 ml
12 placas de petri
2 Erlen Mayer de 250 ml
10 tubos de ensaio de 15 ml
2 provetas de 250ml
2 Beckers
3.3. Reagentes
720 ml de água destilada
210 ml de meio Ágar-Nutriente de marca DIFCO
210 ml de meio Ágar-Sabouraud de marca HIMEDIA
200ml de meio mineral Bushnell Hass
150 ml de solução salina
Óleo Diesel
3.4 Equipamentos
Manta aquecedora
Capela de fluxo laminar
Balança de precisão
Autoclave
Geladeira
Vortex
Estufa para crescimento microbiano
Respirômetro eletrolítico
Pipetador automático
3.5. PREPARAÇÃO E ESTERILIZAÇÃO DO MATERIAL
O solo a ser testado foi colhido na zona oeste, transportado e armazenado na
geladeira do laboratório de tecnologia de cultura de células da Universidade
estadual da zona oeste por aproximadamente 144 horas
Inicialmente foram dissolvidos 10g de solo em 90ml de solução salina,
previamente esterilizada, para que fosse feita a diluição seriada do solo 1ml da
suspensão inicial (solo + solução salina) foi pipetado em um tubo de ensaio
contendo 9ml de solução salina fazendo a diluição (10-2), 1ml da solução deste
tubo foi adicionado em outro contendo 9ml de solução salina (10-3), repetindo a
operação até que a diluição atingisse um fator de 10-6, como a figura abaixo
exemplifica.
Fig1. Esquema de uma diluição seriada
3.5.1. Preparo do meio de cultivo para bactérias
Foram preparados 210ml de meio Ágar-nutriente em um erlenmeyer de 250ml, e após o mesmo ser submetido a esterilização recomendada pelo fabricante, 15lb de pressão a 121C° por 15 minutos em um autoclave, aproximadamente 30ml de meio foi vertido em cada placa de petri.
3.5.2. Preparo de meio de cultivo para fungos
Seguindo o mesmo procedimento do meio Ágar-nutriente, foram preparados 210ml do meio Ágar-Saboraud e, após sua esterilização recomendada pelo fabricante, aproximadamente 15lb de pressão a 121C° por 15 minutos, então vertidos em placas de petri.
3.6. ANÁLISE DA MICROBIOTA DO SOLO
3.6.1. Bactérias
As diluições 10-4, 10-5 e 10-6 foram plaqueadas em duplicata, transferindo
para cada placa 0,8 mL. As placas foram levadas para a estufa a 36.7º C, e mantidas
até o aparecimento de colônias, após 2 dias as colônias foram contadas, para que as
unidades formadoras de colônias pudessem ser calculadas, isto é, para que as
células viáveis, assumindo-se que cada colônia originou-se de uma célula viável,
contidas nas suspensões fossem contadas.
3.6.2. Fungos
Para os fungos foi repetida a diluição seriada, as suspensões também foram
plaqueadas em duplicata em meio Sabouraud, e inoculados 0,4 mL da respectiva
suspensão em cada placa de Petri. As placas foram levadas para a estufa a 30ºC, e
mantidas até o aparecimento das colônias características. Para a contagem das
colônias escolheu-se a diluição que continha entre 30 e 300 colônias e fez-se uma
média entre as duplicatas. Para o cálculo das unidades formadoras de colônias
(UFC/g de solo), foram utilizadas as seguintes equações, propostas por Carter
(1993): FD = Di x Ds x Q (FD: fator de diluição; Di: diluição inicial; Ds: diluições
subseqüentes; Q: volume de solução plaqueada) e UFC = 1/FD x n (UFC: número de
unidades formadoras de colônias; FD: fator de diluição; n: número de colônias
encontradas na placa).
3.7. CAPACIDADE BIORREMEDIADORA DA MICROBIOTA
A amostra de solo foi inicialmente adicionada em 200 ml de meio mineral
Bushnell Hass contendo diesel (5% v/v) como fonte de carbono. As amostras foram
submetidas à agitação de 200 RPM e temperatura de 20oC durante 9 dias.
A quantidade de solo adicionada foi de 10, 20 e 30g de solo por 100 ml de
meio mineral. O aparelho utilizado para esta fase do experimento se chama
respirômetro, e é automaticamente aerado com a quantidade de oxigênio que é re-
circulada por causa da célula eletrolítica, registrando então o consumo de O2 das
amostras.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. ANÁLISE QUANTITATIVA DA MICROBIOTA DO SOLO
4.1.1. Bactérias
Dois dias após a inoculação dos microorganismos, as placas foram
retiradas da estufa, suas colônias contadas e registradas visualmente (Figuras
2A, e 2B). As unidades formadoras de colônias, ou seja, o número de células
viáveis presentes em 1g de solo foi calculada segundo a equação proposta por
Carter, cujo valor foi de 8,68x107 u.f.c/g.
Figura 2. placas contendo as diluições de 10-4(duplicatas), nas quais houve uma contagem de 44 colônias( na figura 2A) e 51 colônias (na figura 2B).
4.1.2. Fungos
Sete dias após a inoculação dos microorganismos, as placas foram
retiradas, suas colônias contadas e registradas visualmente (figura 3).
Utilizando o mesmo método para a contagem de unidades formadoras de
colônia, foi encontrado o valor de 5,5x105 u.f.c/g. Não houve crescimento nas
placas que receberam alíquotas provenientes da diluição 10-6
Figura 3. placas contendo colônias de fungos provenientes da diluição seriada 10-4 (duplicatas), onde houve uma contagem de 22 colônias. 4.2. ANÁLISE DA CAPACIDADE BIORREMEDIADORA DA MICRO BIOTA
Após 9 dias, este gráfico foi apresentado pelo respirômetro, que mostra
que dentre as concentrações de solo testadas, aquela com 30% seria a mais
recomendável para o processo de biorremediação. Pois as curvas 5 e 6
(duplicatas) foram as que mostraram maior captação de O2, o que já era
esperado.
Figura 4. Acúmulo de oxigênio durante a degradação de óleo diesel por microbiota nativa de solo da zona oeste. (1=10%; 3 e 4=20% e 5 e 6=30%) por 210 horas de monitoramento
5 - CONCLUSÃO
A Microbiota nativa do solo retirado da zona Oeste obteve um
crescimento satisfatório em um ambiente sem restrições, e obteve êxito ao
degradar óleo diesel, sendo esta degradação maior em uma concentração de
lama de 30%.
Apesar de ser uma técnica ecologicamente correta, ela é indicada para
ambientes que não estejam saturados de contaminantes, de até 10% no
máximo em relação ao ambiente, uma vez que o petróleo e seus derivados são
muito tóxicos quando extrapolam essas concentrações, e sem uma
concentração mínima de nutrientes e de água, o crescimento celular é inviável,
sendo utilizada então como uma técnica “polidora” usada para retirar os
residuos que ainda ficaram após a utilização de outras técnicas remediadoras.
Estudos posteriores para o desenvolvimento de técnicas
biorremediadoras mais eficazes poderão, e deverão ser feitos, tanto na
utilização de microorganismos em ambientes mais saturados quanto na
produção de linhagens de microorganismos mais eficazes, genéticamente
alterados ou não.
Apesar de no momento as técnicas biorremediadoras não serem a
resposta definitiva na limpeza de ambientes contaminados por acidentes com
petróleo, ou contaminantes de outras origens, com o tempo, após muitos
estudos, poderão vir a ser.
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