BIOREATTORI - diccism.unipi.it · IMMOBILIZZAZIONE DEGLI ENZIMI Quando l’enzima viene alimentato al reattore in soluzione, esso lascia il reattore insieme al prodotto; si ha quindi

BIOREATTORI

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Reazioni senza variazione di volume e a temperatura costante

(reattori con controllo della temperatura)

REAZIONI CATALIZZATE DA ENZIMI

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p1-p0=a(s0-s1)

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Ritenzione dell’enzima nel reattore

mediante una membrana porosa sullo

scarico (enzima relativamente grande).

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CONVERSIONE NEL REATTORE AGITATO CONTINUO

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Effetto inibente del substrato

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Per ottenere la stessa conversione in un solo reattore agitato, è

necessario un volume di reattore V>(V1+V2+V3):

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IMMOBILIZZAZIONE DEGLI ENZIMI

Quando l’enzima viene alimentato al reattore in soluzione, esso

lascia il reattore insieme al prodotto; si ha quindi perdita di

enzima.

L’enzima può anche rappresentare una impurezza indesiderabile,

che deve essere rimossa.

Per evitare tali inconvenienti, l’enzima può essere immobilizzato,

in modo da essere trattenuto dentro il reattore.

Vi sono vari metodi possibili di immobilizzazione.

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Metodi chimici

1 - Ancoraggio covalente su un supporto solido insolubile in

acqua.

I supporti solidi possono essere di diversa natura: vetri e

ceramiche porose, acciaio inossidabile, sabbia, carbone, ossidi

metallici e vari composti polimerici.

Gli enzimi vengono immobilizzati di solito attraverso i loro gruppi

amminici o carbossilici che, ovviamente non devono essere né

quelli essenziali per l’attività catalitica, né vicini ad essi.

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quelli essenziali per l’attività catalitica, né vicini ad essi.

Il processo consiste in 2 fasi:

1. Attivazione del supporto

2. Attacco dell’enzima

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2 - Reticolazione con reagenti polifunzionali (glutaraldeide)

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Le particelle di enzima reticolato sono gelatinose e non hanno le

proprietà meccaniche richieste per molte applicazioni.

Migliori proprietà meccaniche sono ottenute adsorbendo l’enzima

su un supporto e quindi reticolando l’enzima adsorbito:

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Metodi fisici

1 - Inclusione in fibre spugnose o in fibre cave

2 - Inclusione in un gel polimerico

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2 - Inclusione in un gel polimerico

Con questa tecnica un enzima è addizionato ad una soluzione di

monomero, quindi si innesca la polimerizzazione.

3 - Incapsulazione

Gli enzimi sono intrappolati in piccole capsule, di diametro fino a

300 µm (microincapsulazione), circondate da una membrana

porosa che consente il passaggio di substrato e prodotto, ma non

dell’enzima (l’enzima, internamente, si trova in soluzione).

L’immobilizzazione dell’enzima comporta in genere una sua maggiore

stabilità nei riguardi di quegli agenti che provocano la perdita della

conformazione nativa dell’enzima attraverso un suo “srotolamento”

(pH, T, agitazione, ecc.).20

Diffusione e reazione nella particella

Nel caso di enzima immobilizzato in un supporto, il substrato deve

diffondere attraverso il supporto per raggiungere il sito catalitico. Ciò

comporta un gradiente di concentrazione del substrato entro la

particella.

Quando v è funzione crescente di S (cinetica di Michaelis-Menten), la

velocità di reazione all’interno della particella sarà inferiore a quella

corrispondente a S=S0 (esterno particella).

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corrispondente a S=S0 (esterno particella).

Pertanto la quantità di substrato convertito per unità di tempo e di

volume entro la particella sarà inferiore a quella che si avrebbe senza

gradiente di concentrazione.

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•Ureasi (da bacillus) usi analitici, trattamenti di acque, rene artificiale.

Di gran lunga più utilizzati sono gli enzimi idrolitici (idrolisi

dell’amido, della cellulosa, dei grassi, delle proteine). Sono coinvolti

nei settori più diversi:

Produzione di detersivi

•la proteasi degrada le proteine insolubili in frammenti che possono

essere rimossi o disciolti dal detergente;

• l’α-amilasi attacca l’amido rompendo i legami 1,4 dando destrine

solubili:

• la lipasi idrolizza i trigliceridi dando acidi grassi, digliceridi,

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• la lipasi idrolizza i trigliceridi dando acidi grassi, digliceridi,

monogliceridi e glicerolo (più degradato è il grasso, più facile è la sua

rimozione dal tessuto per l’aumentata idrofilicità).

Degradazione degli alimenti;

Trattamento delle acque di scarico;

Lavorazione dell’amido;

Maturazione della frutta colta acerba;

Lisi delle cellule morte;

Maturazione della carne e dei formaggi,….

Settore medico

•Glucosidasi – analisi del glucosio nel sangue e nelle urine;

•Lisozima – trattamento di ulcerazioni, morbillo, sclerosi multipla,

alcune malattie della pelle, infezioni post-intervento;

•Ialuronidasi – facilita la diffusione di composti che vengono iniettati

insieme ad essa (antibiotici, adrenalina, eparina, anestetici locali).

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insieme ad essa (antibiotici, adrenalina, eparina, anestetici locali).

L’amido, materiale di riserva delle piante, è costituito da una

frazione di amilosio (circa 20%), che è un polimero dell’α-

glucosio con legami glicosidici 1-4, e da una frazione di

amilopectina (circa 80%), di composizione simile all’amilosio,

ma con ramificazioni α-1-6 mediamente ogni 25 unità di

PROCESSI DI PRODUZIONE

CONVERSIONE DELL’AMIDO

ma con ramificazioni α-1-6 mediamente ogni 25 unità di

glucosio.

Il processo di conversione consiste nella idrolisi

(depolimerizzazione) dei legami glicosidici, per la produzione

di zuccheri semplici.

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Diversi enzimi, prodotti da batteri e muffe sono in grado di

idrolizzare (depolimerizzare) l’amido; i più noti sono:

• αααα-amilasi - agisce idrolizzando casualmente i legami α-1-4.

Quando ottenuto dal Bacillus licheniformis, in presenza di ioni

Ca2+ è stabile anche a temperature piuttosto elevate (90-110°C).

•ββββ-amilasi – Attacca i legami α-1-4 delle catene amilosiche con

formazione di unità maltosiche a partire dalle estremità (la

rottura si ferma a 2 o 3 unità glicosidiche dai punti di rottura si ferma a 2 o 3 unità glicosidiche dai punti di

reticolazione 1-6).

•Glucoamilasi (o amiloglucosidasi) - è un enzima in grado di

idrolizzare sia il legame 1-4, sia quello 1-6, anche se

quest’ultimo molto lentamente.

•Pullulanasi – mostra attività specifica solo per i legami 1-6 (a

pH 4.5 e T= 60°C).

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Il processo può suddividersi in 3 stadi:

1. Liquefazione

2. Saccarificazione

3. Isomerizzazione

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L’amido, sospeso in acqua al 30-40%, viene dapprima gelatinizzato e

quindi predepolimerizzato (destrinizzazione) mediante αααα-amilasi

(man mano che si idrolizzano i legami α1-4 si riduce la viscosità del

gel, operazione che viene detta appunto “liquefazione”).

1 - LIQUEFAZIONE DELL’AMIDO

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Quando l’amido liquefatto viene ulteriormente demolito per

idrolisi, si ottiene una notevole varietà di prodotti dolcificanti

(saccarificazione).

Così, impiegando una serie di enzimi comprendenti ββββ-amilasi e

pullulanasi per la dereticolazione, è possibile produrre sciroppi

con tenori di maltosio vicini all’80%.

2 - SACCARIFICAZIONE

con tenori di maltosio vicini all’80%.

Uno sciroppo con un tenore di glucosio del 95-97% può essere

ottenuto per trattamento successivo con αααα-amilasi e

glucoamilasi.

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Il maltosio, o zucchero di malto, è un disaccaride composto

da due unità di glucosio con una connessione α(1-4).

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Il prodotto che si ottiene isomerizzando il glucosio a fruttosio ad

opera della glucosio-isomerasi ha un potere dolcificante simile

allo sciroppo di saccarosio ed ha trovato largo impiego nella

fabbricazione di bevande analcoliche.

La costante di equilibrio della reazione di isomerizzazione

Glucosio ↔↔↔↔ Fruttosio alla temperatura di processo è all’incirca

3 – ISOMERIZZAZIONE DEL GLUCOSIO

Glucosio ↔↔↔↔ Fruttosio alla temperatura di processo è all’incirca

unitaria, pertanto il prodotto contiene glucosio e fruttosio

approssimativamente nel rapporto 1:1.

fruttosioglucosio

↔

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Nelle condizioni operative ottimali per assicurare elevata attività e

stabilità dell’enzima (pH≅7.5, T=55-60 °C) il glucosio ed il fruttosio

sono piuttosto instabili e si decompongono facilmente ad acidi

organici e sottoprodotti di colore scuro.

Per superare questo problema, il tempo di reazione viene tenuto

breve facendo passare il glucosio in modo continuo attraverso una

colonna contenente l’enzima immobilizzato (enzima in particelle

da 0.3-1 mm).da 0.3-1 mm).

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