Top Banner
Reprint
10

Biomimetic Hydroxyapatite–Drug Nanocrystals as Potential Bone Substitutes with Antitumor Drug Delivery Properties

May 10, 2023

Download

Documents

Richard Liu
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: Biomimetic Hydroxyapatite–Drug Nanocrystals as Potential Bone Substitutes with Antitumor Drug Delivery Properties

�������

Page 2: Biomimetic Hydroxyapatite–Drug Nanocrystals as Potential Bone Substitutes with Antitumor Drug Delivery Properties

���� ��������� ����������

��� � ���� ����������������� ������ �! "������! ����#�$ ������ %��& '����� �� ���� ��!�(��� "�������� ))

�� ������� ���������� � ������������� �������� ����� �������� ������ ���� ������� �� ����������� ������ �� � � ���� ��� ���� ��� !�� ��

�� ������������

���� ���������� ��� ���������� ����������� �� �������� ��� ���� �� ������ ��� ������� ��� ���� ���������� ��������� �������� ��� ����������� ���� ���� �� ������� ��

��� ����������� ����� �������� �!� ��� ���������� ����� ������������ �� �������� ��� ���������� ���� �� ������� ������� ����������� ���� ������ ��� ��� ��� ������ ��� ����� ����� ����� "�� �� �� ��� ������� ���������� �� ��� �������� ������ ��#�� �� ����� ������� �� �������� ���� ��$����� ��������� �������� %�������� �� ��� ����� ����� ������ �� ���������� �� ��������� �����&�������� '�() ���������� � ����� �� ����� �** � � ����� �� *+!* � � ��� ���#����� �� !+, � � ��� � ��� ��� ���������� ���� �� ����������-�� ���� �� ��� ������� �� �������� �� �� �� �������������� ��� �� �� ����������� ���������� ���� � ���������� �������� ��������� ��� ��� ������� �� �������� ���� ����� ����� ������ .������ ��� �&���� ������� ���������� ���(� ��� �� �����&����� �# �� ���� ����� ��� � ����������������� ��� ���� ���������������� �� �� ����������� ��������� �� ������� ��� ���������� �� �������� �(��/�

0������ ���� ��� ������ ���������-����� �� �( �������������� �������� ����� �#�� ��� ��� �� �������� ����� ������ �� ��� �� �������� �� ��� ������� ������� ���� ������� ���������� � ��� ������ ��� ���������� ���� ���������� �������� .� ���� ����&�� ��� ��������� �� ������� ��������������� ���� ������ �� ����� ���� �� �� ������� �� � �������� #����� ������ ���������� �� ��������� ���� 0�� �&� ���� ��� ��������� �� ��� � ������ �� ��� �� ���������������� ���� �� ��������� � ��� ����� �� �� �� ���������� ��� ������ �� �� ���� �� ����� � ��&������1+2�

���� � ���� ������ ������ ��� � ��� ����� �������� ���� ����� �� � ����� ��� �� �!��

+"#$ %��&� '� (�)���� *�� +� %���,,�� *�� -� ��&�./�

*�0��1���1 �& �����.1�2 �� �����/������� -�1�� 3145���4� 6��)��.�17 5� +��������� 3���� �� 8���9 +������ :�1��2;�����< ������1����)���=4������1*�� -� ��&������ *�� '� -�����11�� %��&� �� '�1���*�0��1���1 >����/������/�� 6��)��.�17 5� +������ ?������ 8� ����@� +��� :�1��2;%��&� �� �� +���/��*�0��1���1 �& %�2.�/�� �����.1�2 ��5 ���/1��/����.1�26��)��.�17 5� -�������� ����� �A� ���BB -����� :�1��2;*�� *� ���.�� %��&� 3� -������1�� &�� ?�����,�5 -�11�� �����.1�2� 3/���� �& �����.1�26��)��.�12 �& +��.1��+��.1�� +3 �C3 :6�;

"##$ -6( :��&�� ���8�B��� ;� 6��)��.�12 �& +������ :>4�5. &�� 3���/1�5(�.���/� C�0�/.;� 6��)��.�12 �& +���� 1�� �� :�?3C �����.1�20��D�/1. *BAE���8E�9; ��5 �%3(� 6� :%��1&��� ����1; ��� �/F��G��5��5 &�� .400��1�

"��� 0� 3���� ������������ ��� ���������� ��� ���������� �� ��� �������� ����� ��"��� ��������������� '..) '�443��������) ��� ��� ��� ������ '..) � ��& ��'���������� ��������� ) �������� '43%)� �� �� �� ��� ����� ��������������������� ����������� ������� ��� ��� � ��� �������� �( ������������ ������� ���� ������ ����������� '�(��)�� ������������ '�(��) ���������� ��� ��������� �� ��������� ����������� "�� ���������� ��� ���������� #������ ������������ �� ��� ������ ���������� �� ��� ����� ��� ��� �������� �� ��� �( ������������ (��������� �� ��� ������ � ��&�� ���� ���� ��������� �� ��� �������� ������ ��� ��� ������ ������ �� ������� ��� �������� 4������ ����� ��������� ������� ��� ��������� ������ ���������� �������������� ��� ��� ��������� ������ �$����� ������� ��� ������� ���������� ���� ��� ������ 43% � ��& ����� ���� �������� ������� ��� ��������� ������ ������� ������� "�� ���� ����������� ���������� �� ��� ��� ������ � ��&�� �� ������ �� ���������� ����������� ���� ���������� ������� ��� ������������� ��� �( ������ ��#�� ��� �� ����� �&����� �� ���� ��� ��� ����������� ������ �� ��� ���� ���� ����� ��� ������� ��������� ������� 5����������� ���������� �� ��������� ������ ��������� ������ �� ������� �� ��� ������� �� ���������������� �(�� ������ ���� ���������� �� ��������� ������ ���������� �� ��� ������� �� ��� ��� ���� �(��������� "�� ����� ���� �� ����������� ���������� ����������� ��� ������ �� �� ����� ��� ���������� #������6 ����$���������� ������ �� ������� ��� ������ 43% ���� ��� ������ ���������� ��� �$����� �������� %�������� ���� ��� ������ ������� ���� �� ������ ������ �� ��� �� � ��� ��� ��� ����� �� �(�� ��� ������ �� 43% �� ������ ��� �(��� ���� �� ���� �� ������� ��� � ���� ��� �(��� 7����� ���� ���# �� ��������� ���� ��� ���������� �� �( ���������� �� �� ������� �� ���� ��� �� ������ �(8��� ���� ��9������ ������� ��� ������ ���������� �����������

����

�����

Page 3: Biomimetic Hydroxyapatite–Drug Nanocrystals as Potential Bone Substitutes with Antitumor Drug Delivery Properties

0�� ��� ������ ������ ����������������� '..) '��������6 �443) ��� ���� ����� ����-�� �� �� �������� ���� �������� ��� ��������&���� ��� ����� ���� ������ �������� ������������ ����� ���6 ������� �� �� ��� �� ��� ��� ����� ������� �� ������ �� ��� ����� ��� �� ��������� ���:+�!� "�� ����������� ��� ������ �� ������� �� ������� �� �������� �( �������� �$����� ���� ��� ���� ������������ �� � ������� �� ����� �������� ��� ��� ���� �������� ���� ������ ���� ���������� ��������� ��� ���� ��� ����������� �� ��� �$����� ������������ ������� �� ��� ������������/� %�������� ��������������� ������ ��� ����� ������ ����� �� �� ������-�� ���������� �( ���� ����� ���� ������� ���������� �������� ������������� �( ���������� ��� ���� ��� ��� �������� ��� �������� ��� ����� ��� ���� ���������1� "��� ����� �� �������������������� ������ ��� ����� �������� ������� �&� ���� �&������� � ������ ����� ��������� �������� ��-� ��� ��83 ���� ����� ��� �� ����� �������� ��� ���� ������� ����������� �������� �������� ���� ��� ���� ������������ ��

������ � ��� ��� ������ ������� �� ���� �� �� ��� ���������������� '�3�)� ���� ��� � ��� �� ����� �������� ��� ����� ������� �������� �� ����� ������ ��� ��� �������� ���,��;� �3� ��� ��������-�� �� ��� ����������� ������ �������� �� � ����� ����� ��� ��� ���� ������ �������� ����� < ���� �� ���� �������� "��� �������� �� ��� ����� ��� �������� �� ���������� �� ����� ��������� ��� �� ���� �����������.� ������� ��� �������� �� ������ �� �3� ����� ��������� ������ �� ��� ��������� ��� ���������� �� ����� ������������������� ��� ����������� 5� � �3�� ��� �� ��������������� ������ ���� �������� ��� ���� ��� �� 3����=� ��������������� �� �� �������� ��� ���������������2+ *� 5������������ ��� ���� 3+�+3 �������� �� �3� �� �� ����� �������� �� ������� ��� ������������ �� ��� ����� ����� ��� �"���� ������ ��� �#�� �� ������� ��� �������� �� �3� ����� ����� �� ��������� �������� ������� �� ��� ����8�$������������ ���������� �� �(8�3� ��9������ ���� ����� �������������� � ��� ��� ��������������� �� ��� ������������ ������ � ��� ������� ��� ���������� ����� ������ �������������� "��� ���������� � ��� ������ ������������������� �� ��� ��������� ��� �������� �������� �� ����� ������������ ��� -��������� � ����� ���� ��� ��� ��������������� ������ �� ���������� ��� ������������ �� �� �&������� �� ���� �� ����� ������ �� ������ ���� ���� �������� ��

(������ ��� ������ � ��� ������� �� ������� ��� ����������� ���� ��������� �( ������� ��� ���� ��������� ����������������/��1� �� � � �������� ����� �� ����� ���������� ���� �������� ���������� ����������� ���� ������� ������ ����� �������� �� ������� ������ ��� ����� �� ��� � ��� ���� ��������� ��� ���� �������#�� ���� ������ � ������� ����8��������������-����� �� ����� ����� � ���� ������� � �������#������� ��� ��������� ��� ��� ��� �������� ����� ��� ������ ��%�������� ������ '..) � ������ ���� � ���������������� ���� ��� ���� �������� �� � ���� ��� ��������� � �����&� ����� �� ��� ���� �������� � !� "���� � ������ �&����� ����� �������� ������� ��� ����� ���� �� �� ��� �� ��� ��� �����������&� ���� ��������� /+ ,� "� ��� #�������� �&���� ������������������ �������� 3�..�� ������������ ��� ����������������(���������� ���� ��� ��� ���� �������#���

"�� �� �� ��� ������� ����� �� �� ������ ��� ��� � ���������� ���������� ��� �������� ��� �� ���� � �������������� �� �������� ������� �� � �� �������� ������� ����� ��� �������� ��� ���� �������� ����� ���� ������� ����������������� (� ������ ������� ����� ;+ :� ��� ���������� ��� ������� �� �������� ����� ��� ������� ������� ��� ��� ����� �� �� ���������� �� ��� ���� ���� ��� ��� �� ����� �� ��� �������� ������������ �� ��� �( �����������"���� �� ���� ����� �� ���� ������������ ��� ���������� ��� ������� �� ������� '0��� ��)� ���������� '0��� ��)� ��� ��'����������� ��������� ) �������� '43%) '0��� �) ����� ��� ���� � ��� �������� �����&�������� ��������� ������� ���������� ����������� '�(��) �� ������������ '�(��) ���������� ��� ���� ��������� �������� �� ������ ������������ �������� ��� 43% ��� � ������ �� ����� ��������'�+ � >+� ��� *�: � >+� �� ��� �� ��������� �����������)� ���� ���������� �� �� ��� ����� '�* � >+� ����� �� ��������)� "�� �#� ����� ��� ��� ���������� ���������� ������ ���? �#�� @ ��!16 �#� @ �2;6 �#�! @ ;�*!6�#�/ @ ���!� ������� �� �#� ����� ��� �������� ��� ��� ������� � ��&�� ������ ��� ��� ����������� ������ �� ����� ����������� ���������!*� "���� �������� ����� ��������� �� ����� �� � ���� ��� �������� �� ��� ����� �����'�443 ��� 43%) ���� ���� �� � ����� ������ ���� '�����������)� ��� ������� ��� ����� �� ��� ����� ����� �� ������� ���� �� ��������� ��� ���� �������� ��� ������� ����������� ���� ������� �������� ��� �� �� �����������

�� *� �!�

���� #���&� � �� +&������,���� �� �&� �' ������ �! - �� ���� +�����

�( ���������� ���� ����� ������� ���� ��# ��83 �����'��,;� ��������� ����� ��� � '.�3) �������) ���� ���������-�� ������� �� ��� ��������� ��������� �� ������ ������� ������������ �����#� ������� ������ ���� ��������� ������� ���������� '"��� �)� "�� ������ ��83 ������ ����� ���� ��A���� ������ ������ ���������� 'A35) ������� ���� ������������ ����� ��������� ��� �������� �� � ����� �� ��������������� .� ��������� ������� ��� ��# ��83 ������ ���� �� ����� ��� ������ ��83 ����� ��� ���� ��� ��� �(�� ����������

���� ����� �� � ����� ��� �� �!�� � ���� ������ ������ ��� � ��� ����� �������� ������� �������� ����

Pt

Cl

H3N Cl

H3N

O−

PCP

−O

O

−O O−

O

(CH2)3

NH3+

OHNH2

Pt

H2N

O P

PO

O

O

O

Pt

NH2

H2N

O(a) (b)

(c)

������ �� -���/4��� .1�4/14�� �& �; ���5�������5�/�����5�0��1��4�:��; :/�.0��1��� �**%;� �; ����5����1� :1�� �)����� ����1�)� /����� �. ��41����,�5 �25�&&����1 /�1���.;� ��5 /; 5�:�1�2����5������0��1��4�;��5����1� :*%-;�

����

�����

�� ������� � ���E-�5�/�� �00��/�1���. �& 25��H2�0�1�1�!*�4� '���/�2.1��.

Page 4: Biomimetic Hydroxyapatite–Drug Nanocrystals as Potential Bone Substitutes with Antitumor Drug Delivery Properties

� ����� ���� ��� �(�� �������� ���������� ���� ��� ��� ������ ��� ������ �������� �� ��� �����"���� ������ ������ ������� '"B%) ������� ��� �����

��� �� ������ �� �����#� '����� 1� 1 � ) �� ������#�'����� �** � * � ) ����������� ��� ��� �(�� ��� �(���� ���� ���������� '0��� � ��� �)� "�� ������ ������ ������ ��� �(�� ���������� ��� ������ ����� ���� ���� ������ ���� ��� ��� �(�� ������� '"��� �)�3����� A���� ���������� 'AC4) �������� �� �(�� ���

�(�� '0��� !� ��� �� ����������) ������ ����������� ����

������� �&� � �� � ��������-�� �����&�������� ����� �����'D�345 :�/! )� "�� ���������� �� ��� ���������� �&� � ��������� � �������� �� ������ �� ����������� ���� ��� $���������� ������� �� �������� ������ '"��� �)��!�� "�� ������� ��� ��-�� ���� ��� � �������� ���� ������ �� 5�������=� ��� �� '��� B&���� ���� ������) ����� ��� �@ ,E'** ) ���������� ���#� ��� ���� !1* ��� !* F ��� �(�� �������� ����������� "�� �(�� ���������� ������� ��� ���� �� ���� �� ���� ������� ��� ������������� ���� ������� '0��� !)���� ���� ��� $������������ ����� �� �� ��� �� ������ �� ������ ����� �� ��� ��-�� ' !* ��� �! F� ����������)�

���� '� ������� �� ���� .�!���!� $� �' ������ �!

"�� ����� ���������� �� ��������� ��� ������ ����������� �� ��� �(�� ��� �(�� ���������� ���� ������������ ���������� �� ��� ���������� ��� ������ �� ������� ���� ������� "�� ���������� ������� �� ������� '�443)� ������������ ��� ��'���������� ��������� ) �������� '43%)����� �$����� �������� ��������� �� ������ ���� ������������ �� �� �*+! % �� ��� ������� �� �(�� �� �(�� ����������� ��� ����� �� 0����� /� "�� ���� ���� ���� ��� �&� � ����#� �� ������� �� 43% ��� ������ ����� ����� �:* � ������� ����� �� �( ����������� ����� ��� ����#� �� ����������� ��� ����������� ������ ������� � �&� � ���� ���������� / �� .� ��� ���� ������ ������ ���� ���������� ���� ��������� �� ��� ������� �� �(�� ���������� � ����� �����(�� �������� "������ ��� ��������� �� ���� ������������ ��� �(�� ����������� ���� ������ �� ��� ���������� ����������� ��� �**� 2:� ��� ,2G ��� ����������� ��������� ��� 43%� ����������� ���� ����������� �� � �(������ ��� �� 1�,� 1�2� ��� ;�, ��G �� �������� ����'�**@H���������� �()�.� �������� ��� ���� ��������� �������� ���� �(�� ���

: G� 2 G� ��� 1 G� ��� ����������� �������� ��� 43%� ����������� '������������ �� �( ������ ���� �� 1� G� 1�/G���� ,�!G)� "�� ������ ��� �� ���������� �������� ��� �(�������� ���� �(�� ����������� ��� ��� ��������� �� ����������� ���������� �������� '/�, I �*+! %)� ����� ��� ���������� �� ���� �������� ���� �(�� ��� �(�� ��� ,/G ���!:G '������������ �� � �,G ��� ;�:G ������ ����)� ������������(������ ��� ���� �(�� ��� �(�� ����������� ��� ��#

��83 ������ ���� ���� �� ��� ��� ���� ��� ���������� ��� ���������� ������� '.�3 �������)� ��� ������ ��83 ������ ������ ���� �� A35 ������� ���� �������� ��� ��� �(+������9������ � ����� �� ��� ������� �( ����������� ���������� ���� ���������� �� ��� ���� ����� �������� ���� ������������ �������� "�� ������� �� ��83 ����� ������� �1�,G ���������������� �(�� ��9����� ��� �� ��������(�� �� �� ��� *�!/G '���� ��� ��/1� ����������)� �������� ������� ���� ��� ������������ ���� �� *��:G ����������� 1� G ���������������� �(�� ��� ������� �(�� '������� ��!*� ����������)� ( �� ��� ����� ��� �������� ��� ���43%������ �( �� ���� ���� ������ ��83 ������ �� ���1��� ��/1 ��� 43%������ �(�� ';�,G) ��� ������� �(���� ����� ���� ������������ ������ �� �� , ��� ��!* ���

���� ������� �������� � ���� ������ ������ ��� � ��� ����� �������� ���� ����� �� � ����� ��� �� �!��

����� �� %�2.�/�/����/�� /����/1���.1�/. �& 1�� 1G� 5�&&����1 120�. �& �����/�2.1��. 4.�5 �. 5�4� /������.� ���4�. ��� �����3*�

��. �0.

*����� �& /�2.1������12 "I$ @� � B� � 8

*����� .�,� ����� 1�� / 5���/1��� "J$ B@� � �@ �B� � ��

+4�F ��E% ����� ��1�� ��9@ � ��� ��9� � ���

34�&�/� ��E% �1���/ ��1�� ��B� � ���@ ��8@ � ���@

30�/�&�/ .4�&�/� ���� "�� �!�$ ��� � @ ��� � 9

(a)

(b)

������ �� C�- �����. �& .2�1��1�/ � ����/�2.1��. G�1� �; 0��1�.��0�5���0�����2 : �0.; :./��� ��� K ��� ��;� ��5 �; ���5��.��0�5 ���0�����2 : ��.; :./��� ��� K ��� ��;�

����

�����

�� ������� � ���E-�5�/�� �00��/�1���. �& 25��H2�0�1�1�!*�4� '���/�2.1��.

Page 5: Biomimetic Hydroxyapatite–Drug Nanocrystals as Potential Bone Substitutes with Antitumor Drug Delivery Properties

43%������ ',�!G) �(�� ��� ������� �(��� 5������������� ��������� ������ �� ��������� ��� ��� �( ���������������� ��� �������� ������ ������� �� 43% ����������� .��������� � *�1 ��������� ��� ���� ������� ��� ����� ��

�� ���������� �������� ���� ��� �( ������������ �������������� ���� ������ ������ �� ����� �&����� �� ��� ��������������� ������ ���� ��� ����������� ������ �� ��� ��������� ���� �����

���� ����� �� � ����� ��� �� �!�� � ���� ������ ������ ��� � ��� ����� �������� ������� �������� ����

900

625

400

225

100

25

15 20 25 30 35 40 45 500

2θ (degrees)

co

un

ts/s

������ �� L(* 0�11���. �& �; ���� �� �; �0.� ��5 /; ��.�

0 5 0 100 150 200

0

20

40

60

80

100

HAps + CDDP (10-3

M)

HAps + DPM (10-3

M)

HAns + CDDP (10-3

M)

HAns + DPM (10-3

M)

HAps + Alendronate (5*10-3

M)

HAns + Alendronate (5*10-3

M)

HAps + Alendronate (10-3

M)

HAns + Alendronate (10-3

M)

M/M

tot[%

]

Time [h]

������ �� �5.����5 ��.. 0��/��1���. &��� ��!B - .��41���. �& /�.0��1�� :�**%� /��/��.;� *%- :.M4���.;� �� ����5����1� :1�������.;� ��5 &��� �8�9 N ��!B - .��41��� �& ����5����1� :1��/F ����.; �. � &4�/1��� �& 1��� &�� 0��1�.��0�5 :&4�� .2����.; ��5 ���5��.��0�5 :��012 .2����.; � ����/�2.1��.� ��.0��1�� ��5 *%- /��/��1��1���. G��� 5�1������5 �2 ��%?�3 ����2.�.� ����5����1� /��/��1��1���. �2 6�)�. .0�/1��./�02� *�1� ��0��.��1 ����)��4�. ��5 ����� ���. ��5�/�1� 1�� �..�/��1�5 .1��5��5 5�)��1���.�

����

�����

�� ������� � ���E-�5�/�� �00��/�1���. �& 25��H2�0�1�1�!*�4� '���/�2.1��.

Page 6: Biomimetic Hydroxyapatite–Drug Nanocrystals as Potential Bone Substitutes with Antitumor Drug Delivery Properties

������� �� ��� ����������� ������ �� ���������� ���� ����( ����������� ��� ������������ �� ������� �� ��� �������������� �� ��� 7 �� ��� 3 � A35 ���#� '0��� 1)� (� ����������� �� 1!*�,2 �J ��� �������� ��� ��� �����������������(�� ��9����� '0��� 1)� ���� ��� ��������� �� � ���������� �� ��� ���������� ���� �� 1!*�!; �J '0��� 1�)� ��� �(������ �� 1!��!, �J '0��� 1�)� ��� ������������ � ���� ��1!��,2 �J ����������� ��� ���������� ����� ������������ ��� �( ������� "�� 3 ������ �� ��� �����������������( A35 ������ '���� ��� �����) �������� ���� ��� ������������� �������� �� �!!�* �J ��� ��� �� ��� ������� �� ������� �(�� ��������� '�!!�1 �J) ��� ���������� �����������'�! �! �J)�A35 ������� ���� ��� �������#�� �� ������������� �(

�� ���� "�� 3�8K ������ ���� *�1* � *�*1 ��� *�,* � *�*1 ��� �������������� �(�� ��� �(��� ����������� "���� ���� ������� �� ��� ������� ���� ����� ��� �������� �������� ������� ������ � ��& ���� ��� ������� 3�+K ���� ������������ ������ ���������� ���� ��� �( ����������� 7� ��� �����

����� �� ������ ��� ������� �� A35 �������� ���� ���������� ���� ������� ��������� ��������� ������ �������������� ��� �( ���������/��1� "�� �&���� ������ �� ��� ������ ������ ����� ���#� �� 1!��*� 1!!�� ��� 1!/�� �J� ��� �� �������� ���� ��� �� �&���� ��������� '������ ��� �����)� ���������� �� ��� ����� �&��������# ������� ������ ��� � ������ 1!��!, �J �� ��� �� ������� �(��� ��� ���������� �� ����������������� ������� ������� ��� ��� �( ������� "�� �� ��������� ��� �������� ��� ��� 3 ���# �� �!!�* �J� ���� ���*�1 �J ���� ���� ���� �������� ��� ���� �(�5� ��� A35 ������ ���� �������� ��� 43%������ �( ���

9������� "�� 3�8K ������ ���� *�/* � *�*1* ��� *�,* � *�*1 ���43%������ �(�� ��� �(�� �������� ����������� "��������� ���� ��� �� ����� ��� ���� 43% ��������� ����� �#��������� �� 3�+K ���� ����������� ������ ������ ����������������� �������� ��� 3 � ������� ������ ��� ��� 43%������ �( ���������� ��� �! �2 �J� ���� ��� ���� ��������� �������� ��� ���� �( ��� ������������� �(� ���������� ���� ��� ���������� ������� �( ��� 43% ��� ������������ ���� �������� ��� ��������

���� ���� *�!� � "����!�

"�� ������ #������ �� ����������� �������� ��� 43% ��� �(�� ��� �(�� �� � ������� �� ����� �� � �� �$����� �������� ��� ������ �� 0����� ,� LJ���� ���������� ������� ��������� ���� ��� �$����� ������ ������� ��� �������� ��43%������ �( ����������� ��� �� ���������� ���# �&�� � �� , � � ���� ��� ��� ������� �� ��� ���# �������'�B3B5 ������)� "��� ���� �������� ��� ��� ���������� ���������������� �� ��� ��� ������ � ��&��� ��� �������������� ������� �� ��� ������ �� ��� �� � ������ � ��& ������� �� �� .�3������ � ������ ���������� '7B5) ������

���� ������� �������� � ���� ������ ������ ��� � ��� ����� �������� ���� ����� �� � ����� ��� �� �!��

(a)

(b)

(c)

Binding Energy, eV

537 535 533 531 529 527 525

co

un

ts/s

������ �� ?H2��� �. .0�/1��� ������ ��1����5 &�� �; ��.� �; 4���4�5����5����1� ��5 /; ����5����1����5�5 ��.� *�11�5 ����. G��� 4.�5 &��/4�)� &�11��� ��5 &4�� ����. &�� �H0������1�� 0��F.�

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

M/M

tot [

%]

Time (days)

HAps+DPM

HAns+DPM

HAps+CDDP

HAns+CDDP

HAps+alendronate

HAns+alendronate

������ �� (����.�5 ��.. 0��/��1���. �& /�.0��1�� :�**%� /��/��.;� *%-:.M4���.;� ��5 ����5����1� :1�������.; �. � &4�/1��� �& 1��� &�� 0��1�.��0�5 :&4�� .2����.; ��5 ���5��.��0�5 :��012 .2����.; � ����0��1�/��.� *�1� ��0��.��1 ���� )��4�. ��5 ����� ���. ��5�/�1� 1�� �..�/��1�5.1��5��5 5�)��1���.�

����

�����

�� ������� � ���E-�5�/�� �00��/�1���. �& 25��H2�0�1�1�!*�4� '���/�2.1��.

Page 7: Biomimetic Hydroxyapatite–Drug Nanocrystals as Potential Bone Substitutes with Antitumor Drug Delivery Properties

�������� '��� ������� ��� ������)� "�� � ���� �� ���� �������� ��� �������� �� ���������������� �(�� ���� /1 ��� �G �� ��� � ���� ��������� ����������� ���� ���� ���������� ���� ��� ������������ ����� ����� ���� ��� ����������� ���������������� �(�� �� ��� '11 ��� !!G� �����������)� .� ��� ��� �� 43%������ �( ������������ ��� ������� ��� ������ ��� ����� $������������ ������� �$������� ������������ �� 21 ��� �**G ��� �(�� ��� �(��� ����������� '0��� ,)�

�� �� �� ���

(��������� ��� ���������� ����� ��� ������ �� ��� ��������� �� ���������� �� ��� ����� ��� �� ��� �( ������������ ����� (��������� �� ������� ��� ���������� ��� ����������� ��� �� ��� 43% '0��� /)� 0�� �������� A35 ������� ������� ��� ������ �� ������� ��������� ���������� ������� ��� ��������� ������ �$�� ������ ����� �� ������ ������������� ����� ��� ���� �������� ����������/� 43% �� ��� ������������� ��������� �� ������� ��� ���� ��#�� ��� ������� � ����� ������ ��� �� ��� �������� ������ �� ���� ����� ��� ���� �� ���� ������� "��� ��������� �� ����� �� ��� �������-�� ������� ��� 43% � ��&�� ��� ����� ��� ����������� ���������� ������ ��������� �� ��� �( ������ ���� ������������ ������ "�� ���� ���������� �� ������������������� ������� ��� �������� ������ �������� � ��������� ����������� ������ � ��� �� ��� ��� �� ��������� ��� �������� ��� �� �� �������� ����������� ��� ������ ����������� ���������� �� ��� �������������� ������� ��� ����� �&�

������ .������ �� ��� � ������� ���� ��� ����� �&����� ������ �� ���������� ���������� ���� ��� �� ����������� ���������� ����������� ������� ��� ������ � ������������ ���� ��� ��������� ������ �( ������� ���� �� ���������� ���� ����� ������� �� K����� �� ��� ��

0�� ��� ����� �������� ����� ������������� ��� ����������� ����� ��� ��� ��� �&����� �� �� ������� �� ��� ��������� �� ���������� ��� ��������� ������������ �� ������ ����� �� �������� �( ���������� ���� �� ��������� ������������ 7�� ��� ���� ���� �������� ��� ���� ������� �� �(������ ����� ��� �� ����� �� ��� ��������� �� ��� ������� �������� �� �( ���������� ��� ������ � ��������� ��� ��-������ �� ��� ���������� ������� ���� ������ �� ������ ���� ������� �� 0����� ;� "�� ��� ��-�� ���������� ����� ��� �(����� �(�� ��� � ��� �������� ��� 43% ���������� '� ��������� � �������� ������� �� :*G)� ��������� ���� ����� ��� ��� ������ ����� ����� �������� �� ���������� �� ��� ���������� �(� �� ��� ������� ����� ��� ���������� �� ���� ������ �� ������������� .� �������� ��� ��-�� ������� ������������ ���������� ����� ��� ��� ��� ��� �������� ������ ��� �(�� ������� � ������ ������� � ���� �� ������������ �� ��� ��� �� �(�� �� � ����� �� �(��� (� �(�� ���� ���� ������ ��83 ����� ���� �(��� ��� ������ ����� �� ��� ��������� ��� ���� �� ����� ���������� �� ��������������� ��������� ������� �� ������� ��� ������ �&����� ����������� ������ ���� ���������� ��������� ������� "�� ���������� �� ������ ��83 ������ ��� ������� �� ������� ��� ����������� �� ���������� ��� ��� ���������� ��������'/�, I �*+! %) �� ��� ��� ��-�� ������ ��� �(�� ��� �������� ��� �(�� ����� ����� ���������� "��� ��� �� �� � �����

���� ����� �� � ����� ��� �� �!�� � ���� ������ ������ ��� � ��� ����� �������� ������� �������� ����

0 50 100 150 200

0

20

40

60

80

100

HAps + CDDP (10-3

M)

HAps + DPM (10-3

M)

HAns + CDDP (10-3

M)

HAns + DPM (10-3

M)

HAps + Alendronate (5*10-3

M)

HAns + Alendronate (5*10-3

M)

HAps + Alendronate (10-3

M)

HAns + Alendronate (10-3

M)

M/M

tot[%

]

Time [h]

������ �� �5.����5 ��.. 0��/��1���. �������,�5 G�1� ��.0�/1 1� � .4�&�/� ����. &�� ��!B - .��41���. �& /�.0��1�� :�**-� /��/��.;� *%- :.M4���.;� ��5����5����1� :1�������.;� ��5 &�� 8�9 N ��!B - .��41���. �& ����5����1� :���F�5 1�������.; �. � &4�/1��� �& 1��� &�� 0��1�.��0�5 :&4�� .2����.; ��5���5��.��0�5 :��012 .2����.; � ����0��1�/��.� *�1� ��0��.��1 ���� )��4�. 5�)�5�5 �2 � �������,�1��� /��.1��1O ����� ���. ��5�/�1� 1�� �..�/��1�5.1��5��5 5�)��1���.�

����

�����

�� ������� � ���E-�5�/�� �00��/�1���. �& 25��H2�0�1�1�!*�4� '���/�2.1��.

Page 8: Biomimetic Hydroxyapatite–Drug Nanocrystals as Potential Bone Substitutes with Antitumor Drug Delivery Properties

�� ��� ������ ������ ��83 ����� �� ��� ����� ���� ������ ����������� �� ����������� ���� ��� ���� �������� ��� ��� � "������ ��� ���������� ��������� ����� �( ������� ����� ���������� ���������� ���������� ���������� ������� �� �� ������� �� ��� ������ ��83 ������� ���� �������� ����������� �� ��� ���� �������� .� �������� ��������� ������������� ���������� �� ������� �� ��������������� ������� ������������� �� ������ 43% ����� �� ��� ��������� �������� �� ���������� �� ��83 ������ �� ��� �( ��������"�� ������ ������� �� ��� ���� ����� ��� ��� �( �����

������� ������� ���� � ��������� ����� '43%M������� M �����������) ���� � ����� ���� ��� ���������� ������� LJ������� ����� ���� ��� ������� ������ �� ��� �� � ��� ���������� ��� 43%������ �(�� ��������� ���� ������ �� ������ ��� ��� ����� ������� ���� ������� � ���� ����#��� ����� ������ + �������� ����� "��������� ��� ���������� ������� �� �� �&����� �� �� $���� ���� ��� 43%6 ����� ��� ��������� �� ��� ��������� ������ ������-�� ������� �� ��#�� $����������� �� ���������� ����������� �� ��� ��������� �������( ������6 ��� ���� ��� ��� ���������� ������ �� ���������������� ����������� ������� ��� �������������� ��������� ������ �� < ����� H� ������ ��� ��������������� ��� ��������� �� �������! � �� ��� ������ ������� '���� ��� �����)��� ���� ����� �� ��� ��� �&���� ���� ����� ���������� � ������������� ������ ��� ��� ����� � ����� �������������� K��� ��-�� ���� �� ��� ������ ������� ��� � ��� �������� ���������� ��� ���������� '0��� 2)� ��������� ���� ���������� ������� ������ ����� �� ��� ������� �� ��� ��������� ������� �������� '��83 �����) ��� ��� �� ������ �����

.� �������� ���������� ��-�� 43%����������� �����'0��� 2) ����� �� ������� �� ��� � ���� �� �������� ���� ����� ��� �� �(�� �� � ����� �� �(�� ������������ .� �� ����� � ���� ��� ������ �� ���� ���� ���� ������� � ���������� �� ��� 3������������� ����� �� �&��� ���� ���� ������� �� ������ �� � �������� �� �������� ��� �� ����������� �� ��� ������ ������� ���� '��83 �����) �� ��� �(����������� ��������

/� +���!� ���

"�� �� ����� ���������� ��� ���������� �� �������� 43%���� ���������� ������� ������������ �� ����������� �(���������� ���� ���� ������������� "�� �( ������ ���� ��������� ����� '��83 �����)� �� �� �� ��� ����� �� ��� ��������� ����� ��� ����� ��� �� ���������� ���� ��� �(������� ������� ��� ���������� ��� ������ #������ �� �������� ����� ������������� B��������� ������� �� � ������������ �� ������-�� ������� ������ �� ��� ��������������� �( ������ �� ������ ������� ���� ��� ���������� ���������� 43%� 7� ��� ����� ����� ������� �� ��������������� ���������� �� ��� �( ����������� ������ �� ���������� ������ ����� �&����� ������� ��� ������������������� ��� ��� ������ ��������� ������ ��� ���� ������ ������������ "�� ����� �������� ��� ������� �� �� � �&������ ��� ������ � ��������6 ��� �&� ��� �(�� ����������������� � ������ ��83 ����� ����� ���������� �� ��������������� ���������� � ����� ���� ��� �(�� �����������

���� ������� �������� � ���� ������ ������ ��� � ��� ����� �������� ���� ����� �� � ����� ��� �� �!��

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

M/M

tot[%

]

Time (days)

HAps+DPM

HAns+DPM

HAps+CDDP

HAns+CDDP

HAps+alendronate

HAns+alendronate

������ �� (����.�5 ��.. 0��/��1���. �������,�5 G�1� ��.0�/1 1� 1�� � .4�&�/� ����. �& /�.0��1�� :�**%� /��/��.;� *%- :.M4���.;� ��5 ����5����1� :1�������.; �. � &4�/1��� �& 1��� &�� 0��1�.��0�5 :&4�� .2����.; ��5 ���5��.��0�5 :��012 .2����.; � ����0��1�/��.� *�1� ��0��.��1 ���� )��4�. 5�)�5�5�2 � �������,�1��� /��.1��1O ����� ���. ��5�/�1� 1�� �..�/��1�5 .1��5��5 5�)��1���.�

����

�����

�� ������� � ���E-�5�/�� �00��/�1���. �& 25��H2�0�1�1�!*�4� '���/�2.1��.

Page 9: Biomimetic Hydroxyapatite–Drug Nanocrystals as Potential Bone Substitutes with Antitumor Drug Delivery Properties

"��� ������ �������� �� ������� ��� �� ���� ������������������ ��� �( ������� ����� ��� ������� ���������� 7� �������� ����� �(�� ����������� ������ � ���� ��83 ����������� ����� ���������� �� ��������� ������ ������ �� �������-�� �������� H��� ������ �� ��� ������ #������� ������43% �� ������� �� ��������� �� ��������� ������ �$������������ ��� ��������� ������ ����������� .� �� ������� ��������� ����� ���������� ����������� ������� �$����� ���������� ������ ����������� ��� � ��&����� ������� ���������������� ��� ������ �� < ����� �������� ������ �� ����������� %�������� �� ������� ���� ������ �� 43% ��#�� ���������� � ���� ������ �� ��� ������ + �������� �����0����� ����� ���������� �� ������ ������ '�$����� ��������� ������ ����������) �� ��� ��������� �� ��� ���� �� �(���������� ����� ��� ������ �� ������ 43% ����� ��������� ���� �������� �� �(�� ������ ���� ��� �(�� ������������ "�� ����� ������ �� ��������� ���� �( ������������� ������ �� ����� �� �� ������ �� ��� � ��� ���� ������������� �� ��� ����+�( ��9����� ��� �� ������� ��� ������� ���������� �����������

0� 1����� ���!

���4�� ����������������� '..) '�������) ��� �������� ��� 5�� �+(���� 5���� ��� ����� ���������� ��� � #��� ���� ��� %��# 5���� N 4�� �� .���� �3�'��)'� 7)'57/)� '��@ ����������� ���) ��� �������� ������� �� �������� ��������� �!!���$ ��%� � ���� ������&� ������ $��&? �3�'��)'� 7)'57/)�

'1** �� ��!1 �) ������� ������� ' * >)��� ����������� � ����������� �� ����� �������� '��� %43� / � �� ��!1 �) �� * > �������� (� � ������ ����� �������� �������� ��� ������������� ���� ����� �� ����� ������� (���� �� !* �� �� ��������� ��� ���������� ���������� �� �� ��� ��57/� ��� ��� ������� ���������� �� ��� �� ��� �������� ��� � ��� ��� ����� �� 1 E� ��� / �� "�� ���������� ������������������ ��� ��������� �� ��������� �� ��� ������� ��� ������ (���� ��� �3� '��) '%43)� O� 7� �1� *K/7;3 3� '0H@;**��,)? ��2�1;6 �� �226 K� 2�**� 0����? �� 2�,/6 �� �,26 K� ;�2�� �� K%C '4 7)? �*1 �� ' �� �� '��3( �: �-� ������� �������� �� ��� ������ ���������������) ��� �, �� '2�� � ������� ������ �������� �� ����������� ��)� !�3 K%C '4 7)? /*� ! �� � K%C ������ ���� ����������� � ���#��(����43A!** %�- ������ ��� ��������� �� !**��! '��)��� � ��1� '!�3) %�-� �� �� �� ������ ���� ��������� �� �������!�'��� �������)��������� ��� '"53)� !�3 �� �� ������ ���� ���������� �� �&������!37/ '21G)��%��� �� �� )* ������%�����? K����������� �( ����������

'�(��) ���� ��������-�� ������� �� � �������� ����� ���� �� � ����������� �!/�!1�� K��������� ���� ����������� ��� �� �$��������������� �� ��'7�) '�� *��; � � +!) �� ��� �������� �� �!37/

'*��1% �� �����)� "�� ������� �&���� ��� ������� �� !; E� ��� / ������ �������� ��� ��������� ��� ��� �&���� ��� ��� �������� ��� � ����� ���������� �� ��� �������� ������ "��� ��� ������� �� ����������� ��� ����� �$���� ��������� ������ ���� ����� ��� ����-��������"�� ������� �� ������������ ���������� ������ � ������� �� ������� ������� ������� �**+�1* � ��� ������ ��� ��� ��������������3���������� �( ���������� '�(��) ���� ��������-�� ������� �� ��������� ����� ���� �� � ����������� �!,�� "�� ���������� ��������������� ��� �� �$����� ������� �� 'K�/)!37/ �� ��� ���������� �� �$����� ������� �� ��'��!�77) '2�1 %) #������ ��� �� �� �������� ���� �� �* �� �������� �� � 'K�/)7� �������� "�� ������� �&���� ��� ������� �� !; E� ��� ; � ��� ���� ��� ��������� ������������� ��� ������� �� ��������� �� ��� �������� ��������� ������ ���������� ��� ����-�������� "�� ������� �� ����������� ������ ������������� �� ������� ������� ��� �** �� �1* � ��� ������ ��� ���������

������� ������? "���� ������ ������ ������� '"B%) ��������������� ���� ������ ��� ����� � 3����� �% �** ������ ���� "�� ��������� �� ��� ���� ���������� ��������� �� �������� ����� ������� � ��� ������� �� ��� ����� ��������� �� ���������� ���� ���������� �� ���������� ����� ��������� 3����� A���� ����������'AC4) �������� ���� ����� ����� � 3����� 3H �;�* ������ ��������� ���� �$������ ���� � �������� �������� ������ ���� �������P� ��������� ��������� �� /* #J ��� /* (� "�� ������ ��� ������������ ���� � �E ��������� ��� *� �������� ����� "�� �� ���� ���� �������� ����� ��� ����� ������ �� �������� �� ��� �� ��� ������ ���� ���� � ����� * ����� ��� �1 ����� "�� � ����� ��� ��� 1E �� ,*E ���� � ���� ��-� 'E �) �� *�*1 ��� � ��������� � �� ! �� ������ �� ��� ��-� ���� ��� � �������� ��� ������ �������� 5������=� ��� ��?

��*�*� � �*�:/�

�� ����������������������� � �

*

��

� � '�)

����� � �� ��� ���������� ���� ��� ���� '** )� �� ��� �* ��� ������ ��������� �� �������� '** ) �� ��� ������ ��� ��� ��������-�� ��� ��� ��������� �( �������� ����������� ��� �@��1/*1 F� "�� ������ �� �(���������� ��� �������� ������� �� ��� ��� ��

���������� @ '+8,) �** ' )

����� +@��� ���� �� ��������� ���#�� ��� ,@��� ���� �� ������������#� < ��#������ ���� �!���

5����� ������ ���� ������ ���� ���� �������#�� ����� � ����B��� 5����� �;1* ������ ��� �� �������� K ���������� �� ;; P ����������� ��� ���#���� ��������+B ���+"��� '�B") ���������!;�� ���� � ������ ��� ����������� ������� ���� ������������ ��������� ����� ��� � '.�3) ����� � ������ ������ ����'7B5) ����� � 3��#���B �� 7��� � / ** 4J� "�� �� ��� ���� �������� �������� �� �������� ����� ��� �G �� ������ �� ���� ������������� �� ������� � ��� 2 �� � 5������ ������������ �� ���������� 43% ���� ����� ���� �� LJ���� ����������� ���� ��������"�� LJ���� ������ ���� ������� ������� �:* ��� !** � ����� �J����� ���� 1 LJ���������.C ����������� ����� ��� ��� ������������ ������� �� *1 ��� !* � ������� ������� ���#� ��� ���������� 43%� ����������� (��������� ������������ ���� ������� ��� ���� ���� ����� ����� �� ��� ������� �� ��� ��� ��� � �������� ���� ��������� �� ������� ���� �� ��� ������� ��*�*1 �>+� ����� ����������� "�� ����� ������ ��� ������� ��1,2 � ������� ��� ������� ���# �!2�� 3���������� ������� ���� ������ ���� ����������� ������ �� �������������������� �������� � $����- � �!:��

A���� ������ ������ ���������� 'A35) ������� ���� ������ ���� �� %�3���� .����� ��� '55.) �$������ ���� � ������ ���(P� ����� '�/2,�, �J) ���� � ���� ��-� �� **I ;1* � ��� ���� ������� �� 1 �J� ��������� � ��������� ��� *�;/ �J� H��� � ������� ��� ������ �� ������ ���� ��� ��� ���� �� � ������� ��� ������ �� �������� ����� �� ��� �������� �� ��� ������ ��� ���������* �J ������� ���� ������ �� ������ ������ ���� �� ����� �� ����� "�� ����� �� ��� �������� ������� �������� '�B) ��� ���� ������ �� � *� �J� "�� $����������� ���� ���� ��� ������� ��#�� ������������ ������ �� �� '�� ���� ��� �� �� ��� ��� �� ��) ��� ������������ ����� ��� ���� ���� �� �� � �G�

5�������� ������� ��� �� �����? 4���� ������� �� �( ���������� ��� ��-� ���� ��� � ��������� ��# ��� ������ ��83 ������ ��� ������� ������ ���� ���� ������ ��� ���� �� �� �� ��� �� � ���������������� 4��� ��� ��������� �� ��� ���� � 54� (��������� ��� ������� �&���� ���� ���� ������ �� �� ��������� ��� ������ ��� �������� ��� ����� �54� 4��� �������� ��� ���� �( ��������-�������� ���������� ��� ������ �&���� ���� ���� � ����� �� � ��� ������������ 4��������� ���� ��������� ���������� ���������� �� � ����������� ��� �� :*G�*���� ��� �� ���� �� ��� � ���� )* ������%�����? (� ��$���

'��1 >) �� �������� 43% �� ���������� �������� �� �������� �����

���� ����� �� � ����� ��� �� �!�� � ���� ������ ������ ��� � ��� ����� �������� ������� �������� ����

����

�����

�� ������� � ���E-�5�/�� �00��/�1���. �& 25��H2�0�1�1�!*�4� '���/�2.1��.

Page 10: Biomimetic Hydroxyapatite–Drug Nanocrystals as Potential Bone Substitutes with Antitumor Drug Delivery Properties

'�*+! %� *�/ � >+� �������� *�2 � >+� 43%� *�/ � >+� �����������6 ������� ��� 43% �������� ��$����� ��������� ��� �1 ���!* ��� ����������) ��� ����� �� �* � �� �( ���������� �� � ����� ���������� B�������� ���� ������ � ������ �� >� (���� �1 ��� ����� ��� �� � �����& ���������� ��� �( ���������� ��� ����������� � ����� ���� �� !; E�� (��������� ������� ��� ��� ������ � ���&�� ��� ���������� ���� ����� ���� �� �������� ��� ������������ �� ���� �� ������ �� ��� ����������� ������� ���� �� �� (� �������� �� ��� ��$���� '�** �>) �� ��� ����������� ���� ��� ����������� ��� ��� ���� ����� �� ! �� ������������� �� �� *** �� �� � %��� ������������� / �/ ���� �� ���� ��� ���� $��������������� ������ ���� ����� ������ "�� ������������ �� ������� ���43% ���� ����� ���� �� ����������� ���� ��� ������ .�3�7B5�������6 ���������� ������������ ���� ����� ���� �� ���� ���� ����� �������� ���������� ! � �� ���� )* ������%�����? "�� ���� �������+���� ��9��

����� ���� ������ ���� ���� �������� ����� ��� ����-������� ���/2 �� ( $������� '1 �) �� ��� �����9����� ��� �&�� �� � ����������� ���� ���� �* > �� �* % �B3B5 ������ ����� '��������� ������� ��� ����������� �� ��� ����� *��2+*� *%)� (���� �1 � �� ������ ��� �� � �����& ���������� ��� �( ���������� ��� ��������� �� ������ ���� �� !; E� ��� ��� � ���� �� ���� ������� ��� ��� �(���������� ��� ����� ���� �� �������� ��� ������ �� ���������������������� �� ��� ����������� ������� ���� �� � �� ��������������

C������? (��� *� **,C������? 5���� ��� /� **,

3������� �����? D�� /� **;

+��� �� Q���� P� 4� R����� �� � ����� -��� ����� . )�/ 0� � ���

� / �� ������� ����� ����� K("7 5���� 5������ P����� 4��������� "�� K��������� ���/� ��� �

� � �� (�#�� P� P���� %� 7����� "� "������ ����� ��1 �� � �� �1 *����2����� �232� 3� :��

�!� >� %� C�������-�>����-�� %� J����C���� D� %� 0� 0�������� ����� "���� ����� 44� �2/;�

�/� %� 3� 0����-� 0� D� %�������� �� %� %����� '� * �� ����� �� ��"� ��� ���/� 4� ;/�

�1� (� >������ (� C��������� 3� ���������� D� D� J����� 3� ����� 0� C��������-� ����� ���� ����� 45� !1�;�

�,� 5� %����� Q�%��� Q� %������� �� 7������� "� %��������� P� �����#��%� (�#�� 5� "� ��� Q� P������� ' �� '� ���� 2����� �220� 46� ,��

�;� Q� "������ Q� .����� '� 2���� � ��� ����� 7� 11,��2� (� L����� Q� 5������ K� (��#�� P� 7��� '� 2���� � ! �� �22�� 89� //*��:� �� C��������� ���� � 0� ��� ! � �232� 75� �/!!�

��*� >� (� S������ P� H� P���� ���� � 0� ��� ! � �232� 75� �/!:����� (� 4� P� ��� �� D� 3������� ���� � 0� ��� ! � �232� 75� �//1��� � B� 5���� D� �� >� 3�$� ���� � ! �� �240� :6� /: �

��!� H� (� D� 4� H�� 0� D� %� D� %������� D� �� P���#� '� ������ ��� �*���� �22�� 8� ��

��/� (� �������� %� D� R� ���� '� 2���� � ! �� ����� 49� ;/���1� (� �������� >� "� P���� >� �� R���������� %� D� R� ���� '� 2���� �

! �� ���/� 44� ;*!���,� 5� D����� �� 0�����&� (� 5�������� R� R�� ����� 4� %������� �� (���

��� 3� D������� 5� >���� 3� 3���� 7� R�������� R� 4����� D� R�����&��� ��9��� D� %� ������ ����� ���� ���/� 47� *;!�

��;� �� C��������� R� %�������� 5� >���� 3� D������� �� (����� 0� 0�����%� 3����� 4� %������� D� %� ������ �� ��9��� '� �� �� �� �� ���0� 86�!2,:�

��2� C� R� R� C����� %� D� C������ ��� �222� 46� :;���:� (� B-��� R� R�� �� *��� ���� � �� �% ! �� ����� :4� �;1�� *� D� >��� ��� �22�� 8;� ;1�� �� R� �� K������ C� "���� C� D� 3������ S� ����� ��� 5� R����

H� H�� (� %������� C� R� R� C����� 0� �� B������� ��� ����� 5;�,�;�

� � 0� H������ 4� 5� ��� ���� ! �� �240� 56� �1,1�� !� %� D� ��� ��#� �� P� P������ �� S���� D� 3� 4�������� C� D� �������

��9� D� C����9#� ������ �� �� �22/� 55� �� ;�� /� "� P������ 3� J���-����3�-� �� P� P������ R� (������ �� C� 5�����

0� H������ 0� ( ����� 4� 5� ��� ���� � 0� ��� �� ! �� �22�� 83� 1!�

� 1� "� P������ 0� H������ �� P� P������ �� P�� ����� 4� 5� ��� '����� � ! �� ���� 2��� �22�� 887� !/��

� ,� "� P������ 3� J���-����3�-� 0� ( ����� �� %����� �� S������ P� P������ �� �� � �� ��� � < � ���� � �� ���� �� �22�� :1�

� ;� (� �������� B� >������� D� >� ������ 3� R� C��&���� '� ������� ��� ������ �224� 49;� �/;�

� 2� D� R�����&� R� R�� ����� %� "������ (� 0������ 5� "�#������� R� 4������ '� ��� �� �� �� ! �� �223� 5:� �,1�

� :� �� 3��--�� K� C������ %� �� 5������ (� "� ������ %� 5������ >� �������--�� 0� R�������� R� 4������ 3� J���� C� ������� �� �� ��� =��� ����0� 46� *;�

�!*� "� Q����������� %� L�� �� Q� K���� %� K������ ���� '� ������ �����4:7� :1�

�!�� S� B� B�# ��� '� ��� �� �� �� ! �� �222� :;� 2,���! � "� �������� '� ������ ��� �2��� 64� ��/1��!!� (� 3������ �� �������� 5� 5������ %� J������ �%���� �� �� ������

�� �22�� 45� �* ���!/� 5� 3� (� R������ R� R�--������ K� C������ >� C� ������� �� 3��--��

%� .������ 3� R������� => ��� �� 996 8:7� ������!1� B� >����� (� "� ������ R� ������� 5� 5����� '� =��� � ���� ���� �����

49� !;;��!,� >� 5-������� �� 5���Q���� >� ����Q�� �� D����5����� ����� ����

���/� 46� �2:��!;� 5� ��������� 3� �� B ��� B� "���� '� *�� �� �� ���� �2�4� 79� !*:��!2� B� (� "���� K� 0� Q������� �� �� ������ ����� ����� 68� �///��!:� P� 3� T������ %� (� 4� 5���� *���� �� �� �200� 43� ,��

UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU

���� ������� �������� � ���� ������ ������ ��� � ��� ����� �������� ���� ����� �� � ����� ��� �� �!��

����

�����

�� ������� � ���E-�5�/�� �00��/�1���. �& 25��H2�0�1�1�!*�4� '���/�2.1��.