Biologie für Mediziner WS `17/`18 - Ruhr-Universität Bochum Gene und... · Achondroplasie 10 Zwergwuchs Aniridie 2,6 Iris-Fehlen, -Defekt M. Huntington < 1 Bewegungsstörung, Psychosen

Biologie für MedizinerWS `17/`18

ad Gentherapie

ad Gentherapie

1. At this time, given the nature and number of unanswered scientific, ethical, and policy questions, it is inappropriate to perform

germline gene editing that culminates in human pregnancy.

2. Currently, there is no reason to prohibit in vitro germline genome editing on human embryos and gametes, with appropriate

oversight and consent from donors, to facilitate research on the possible future clinical applications of gene editing. There should

be no prohibition on making public funds available to support this research.

3. Future clinical application of human germline genome editing should not proceed unless, at a minimum, there is (a) a

compelling medical rationale, (b) an evidence base that supports its clinical use, (c) an ethical justification, and (d) a transparent

public process to solicit and incorporate stakeholder input.

Genom-Sequenzanalysen

• Mendelnde Erkrankungen

• Exom: nur Protein-kodierende Sequenzen

• Exom- vs. Genom-Sequenzanalyse

- höhere Wahrscheinlichkeit, pathogene Mutationen zu identifizieren

- effizientere Auswertung, da <3% des Gesamtgenoms

- weniger Variationen, kostengünstiger

bigdata

Online Mendelian Inheritance in Man

OMIM-Statistik 2. 1. 2018

autosom. X Y mito.

Gene mit bekannter Sequenz 14987 727 49 35 15798

Gene mit bekannter Sequenz

und Phänotyp 75 0 0 2 77

Phänotyp-Beschreibungen,

molekul. Basis bekannt 4803 324 4 31 5162

mendelnde Phänotypen / Loci,

molekul. Basis unbekannt 1462 124 5 0 1591

Phänotypen mit vermuteter

mendelnder Basis 1665 106 2 0 1773

22992 1281 60 68 24401

Definition

Mutation: Vorgang, der eine vererbbare Veränderung der

Nukleotidsequenz bewirkt ( Abweichung von “Wildtyp”-Sequenz)

Nukleotidabweichungen mit oder ohne phänotypische Auswirkung

Polymorphismus / Variante / VUS variant of uncertain significance

Mutationen / Gene

Mutationen

Soma Keimbahn

Definition

Mutation: Vorgang, der eine vererbbare Veränderung der

Nukleotidsequenz bewirkt ( Abweichung von “Wildtyp”-Sequenz)

Nukleotidabweichungen mit oder ohne phänotypische Auswirkung

Polymorphismus / Variante / VUS variant of uncertain significance

Gen: Nukleotid-Abfolge, die in RNA-Information übersetzt wird

(Transkription), gemäß der Protein gebildet werden kann (Translation)

Transkription + Translation Expression (zeit- und gewebespezifisch)

Mutationen / Gene

Gen-Definition

• lokalisierbare Region genomischer Sequenz, die

einer Erb-Einheit entspricht, welche assoziiert

ist mit regulatorischen und transkribierten

Abschnitten sowie anderen funktionellen

Sequenzregionen

Genstruktur

• Exons + IntronsmRNA-Spleißen

• regulatorische ElementePromoterenhancer, silencer

• mRNAoffener Leserahmen5‘ UTR, 3‘ UTR

Standard genetischer Code

T C A G

T

TTT Phe, FTTC " TTA Leu, LTTG "

TCT Ser, STCC " TCA " TCG "

TAT Tyr, YTAC TAA Ter TAG Ter

TGT Cys, CTGC TGA Ter TGG Trp, W

C

CTT Leu, LCTC " CTA " CTG "

CCT Pro, PCCC " CCA " CCG "

CAT His, HCAC " CAA Gln, QCAG "

CGT Arg, RCGC " CGA " CGG "

A

ATT Ile, IATC " ATA "

ATG Met M

ACT Thr, TACC " ACA " ACG "

AAT Asn, NAAC " AAA Lys, KAAG "

AGT Ser, SAGC " AGA Arg, RAGG "

G

GTT Val, VGTC " GTA " GTG "

GCT Ala, AGCC " GCA " GCG "

GAT Asp, DGAC " GAA Glu, EGAG "

GGT Gly, GGGC " GGA " GGG "

AUG … … … …

ATG … … … …

MetStart…………Stop

offener Leserahmen (mRNA/cDNA-Sequenz)

TGATAATAG

UGAUAAUAG

alternatives Spleißen

>94% humaner Gene alternativ gespleißt

50% pathogener Mutationen beeinflussen Spleißen

Spleißen

Alternatives Spleißen

Protein-Isoformen A1 A2 A3

Spleißosomen: Spleiß-Code

Verzweigungs-stelle

3‘ Spleiß-stelle

5‘ Spleiß-stelle

ISEISSESE ESSISE

ESE/ESS Mutationen ISS/ISE Mutationen

Spleißstellen-MutationenSpleiß-Mutationen

Konsensussequenzen von 3‘ Spleißstellen verschiedener Intron/Exon-Grenzen

Buchstabenhöhe proportional zur Basenfrequenz in der jeweiligen Position

3‘ Spleißstelle5‘ Spleißstelle Verzweigungsstelle

3‘ Spleißstelle5‘ Spleißstelle

Verzweigungsstelle

Spleißosomen

Spleiß-Therapiemethoden

ASOs

SMaRT (Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing)

spinale Muskelatrophie

Trans-splicing

endogene mRNA

exogene RNA

Neumutationen + Elternalter

väterliches Alter in Jahren

An

zah

l Neu

mu

tati

on

en

Goldmann et al., Nature Genet 2016

An

zah

l Neu

mu

tati

on

en

mütterliches Alter in Jahren

homologe Fehl-Rekombination

Duplikation Deletion

Chromatinoffen

kontrahiert

Transkription

RNA-Polymerase

mRNA

CpG-Dinukleotide

Mechanismen bei Neumutationen

junge Eltern alte Eltern

22 Mitosen23 Mitosen/Jahr

>600 Mitosenbei 40-jährig. ♂

23 Mitosen/Jahr

100-150 Mitosenbei 20-jährig. ♂

Neumutationen

Neumutationen40-80 SNV, 1-2 kodierend

3-9 indels; 0,015 CNV

22 Mitosen

parentalpostzygot.4%

Keimbahn89%

postzygot.7%

2 Neumutationen/zusätzl. Jahr bei Zeugung ♂0,2 Neumutationen/zusätzl. Jahr bei Zeugung ♀

↑ indels + CNVs

SchlußfolgerungenAutismus- + Schizophrenie-Erkrankungen

→ Spermien einfrieren in jungen Jahren ?

→ “Selektionsdruck erhöhen” ?

Spontan-Mutation

• Neu-Mutation (de novo)

• nicht Mutagen-induziert

• Fehler DNA-Replikation

unverändert mutiert

DNA-Replikation

Basenmismatch

elterl. DNA

neue DNA

Spontan-Mutationsrate• Rate variiert für verschiedene Gene, abhängig von

– Größe des Gens

– Sequenz

– Mutationen in hot spots

– Pseudogene

• Mutationsraten: 10-5-10-6 pro Locus und Generation

– 10-8 pro Nukleotid und Generation

– Neumutationsrate Duchenne Muskeldystrophie: 3x10-5

• jeder Mensch wird mit 60 Neumutationen geboren(und erwirbt somatisch zusätzliche Mutationen) -meist in nicht-kodierenden Genom-Abschnitten aber -

• durchschnittlich 1 Aminosäuresequenz-Änderung

Mutationsraten in Krankheitsgenen

Erkrankung

Mutationen / 106

Gameten Phänotyp

Duchenne Muskeldystrophie 40-105 chron. progr. Muskelerkrankung

Hämophilie A 30-60 Blutgerinnungsstörung

Hämophilie B 0,5-10 Blutgerinnungsstörung

Achondroplasie 10 Zwergwuchs

Aniridie 2,6 Iris-Fehlen, -Defekt

M. Huntington < 1 Bewegungsstörung, Psychosen etc.

Marfan-Syndrom 4-6 Hochwuchs, Aortenruptur etc.

Neurofibromatose Typ I 40-100 Gutartige ZNS-Tumoren/Haut

Osteogenesis imperfecta 10 Glasknochenkrankheit

Polyzyst. Nierenerkrankung 60-120 Zystennieren, Nierenversagen

Retinoblastom 5-12 Netzhauttumore

Mutationen: hot spots

• spezifische Basensequenzen– (z.B. GC-reiche Abschnitte, CpG-Nukleotide 5-Methylcytosin)

• kurze repetitive Sequenzen– Replikations- und/oder Reparaturenzyme verursachen Fehler

• palindromische Sequenzen– oft assoziiert mit Insertionen oder Deletionen

• Duplikationen größerer Regionen – Fehlpaarung in Meiose durch Pseudogene/ repetitive Sequenzen

Punktmutationen

Transitionen (Pu Pu; Py Py)

Transversionen (Pu ↔ Py)

spontane Depurinierung, Depyrimidierung, Desaminierung

stumme (kein AS-Austausch) DNA-Polymorphie

neutrale (keine Aktivitätsänderung des Proteins)

missense (geänderter AS-Rest/Leserahmen erhalten)

nonsense (vorzeitiger Translationsstop)

[Insertion/Deletion]

Punktmutation

C T T A G T G A C T A C G G T A A ADNA

G A A T C A C T G A T G C C A T T T

C U U A G U G A C U A C G G U A A A RNA

Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Protein

C T T A G C G A C T A C G G T A A ADNA

G A A T C G C T G A T G C C A T T T

C U U A G C G A C U A C G G U A A A RNA

Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Proteinstumm/still

Punktmutation

C T T A G T G A C T A C G G T A A ADNA

G A A T C A C T G A T G C C A T T T

C U U A G U G A C U A C G G U A A A RNA

Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Protein

C C T A G T G A C T A C G G T A A ADNA

G G A T C A C T G A T G C C A T T T

C C U A G U G A C U A C G G U A A A RNA

Pro Ser Asp Tyr Gly Lys Proteinmissense

Punktmutation

C T T A G T G A C T A C G G T A A ADNA

G A A T C A C T G A T G C C A T T T

C U U A G U G A C U A C G G U A A A RNA

Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Protein

C T T A G T G A C T A G G G T A A ADNA

G A A T C A C T G A T C C C A T T T

C U U A G U G A C U A G G G U A A A RNA

Leu Ser Asp Stop Proteinnonsense

Punktmutation: Insertion

C T T A G T G A C T A C G G T A A ADNA

G A A T C A C T G A T G C C A T T T

C U U A G U G A C U A C G G U A A A RNA

Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Protein

C T T A G T T G A C T A C G G T A A ADNA

G A A T C A A C T G A T G C C A T T T

C U U A G U U G A C U A C G G U A A A RNA

Leu Ser Stop Protein

Punktmutation: Deletion

C T T A G T G A C T A C G G T A A ADNA

G A A T C A C T G A T G C C A T T T

C U U A G U G A C U A C G G U A A A RNA

Leu Ser Asp Tyr Gly Lys Protein

C T T A G G A C T A C G G T A A A...DNA

G A A T C C T G A T G C C A T T T...

C U U A G G A C U A C G G U A A A... RNA

Leu Arg Thr Thr Val Lys ProteinLeseraster-Verschiebung

Cystische Fibrose ∑>2000 Mutationen

häufigste Mutationen in D

Induzierte Mutationen

• Chemikalien + Strahlung Mutationen

• Mutagene (mutagen wirkende Substanzen)

• Karzinogene (karzinogen wirkende Sustanzen)

• Alkylantien (entfernen Base)

• Akridine (Entfernung / Einfügung von Basen)

• Röntgenstrahlen (Chromosomenbrüche, Deletionen)

• UV-Strahlung (Thymidin-Dimere)

DNA-Reparatur

• Fehler in DNA-Replikation / -Schädigung

Mutationen

• allermeiste Fehler in Zellen repariert

• verschiedene Reparaturmechanismen

• Mutationen in DNA-Replikation 1 : 108 Basen

Mismatch Reparatur

• mismatch repair-Enzyme erkennen in ReplikationBasenfehlpaarungen im neusynthetisierten DNA-Strang

• fehlerhafte Base korrigiert

• mismatch proof reading

AC

P.Modrich

Excisions-Reparatur

• schadhafter DNA-Abschnitt/Base excidiert, mittels DNA-Polymerase ersetzt: Nukleotid-Excision

• Austausch <20 Nukleot./1 Base

• UVB-Schäden, Karzinogene

Einzelbasen-Excision

• 1-5 Basen ersetzt

• repariert oxidative Schäden

C=C

UV

C=C

C=C

T. LindahlA. Sancar

DNA-Reparatur

• Versagen DNA-Reparaturmechanismen Mutationen

• somatische Gewebe “altern”

• umfangreiche Schäden programmierter Zelltod (Apoptose) betroffener Zellen (p53-induziert)

• Mutationen in Genen für DNA-Reparatur-Enzyme Mutationen, vorzeitiges Altern

Erbl. Störungen der DNA-Replikation und -Reparatur

Erkrankung Frequenz Defekt

Ataxia telangiectasia 1/40,000 Kinase-Defekt in Zellzyklus-

Kontrolle

Bloom-Syndrom 100 Fälle

seit 1950

DNA-Ligase-Defekt

Fanconi-Anämie 1/22,000 best.

Populationen

defekte Excissionsreparatur

Hereditary nonpolyposis

colon cancer (HNPCC)

1/200 Mismatch Repair-Defekt

Werner-Syndrom 3/1,000,000 Helicase-Defekt

Xeroderma pigmentosum 1/250,000 defekte Excissionsreparatur

Trichothiodystrophie <100 Fälle defekte Excissionsreparatur

Hämoglobin

• 4 Globin-Proteineumgeben 4 Häm-Gruppen (Fe-Atom): je 2 - + -Ketten

• O2-TransportLunge PeripherieCO2 Lunge

β-Kette

α-KetteHäm

Basenaustausch im HBB-Gen Sichelzell-Anämie

Wildtyp mutiert. Allel

(HbS Glu6Val)

Normale Erythrozyten

Sichelzell-Form

…ACT CCT GAG GAG AAG…

…Thr Pro Glu Glu Lys…6

…ACT CCT GTG GAG AAG…

…Thr Pro Val Glu Lys…6

HBB-Genotyp Sichelzellanämie-Phänotyp

• Sichelzell-Anämie war 1. Erkrankung mit definiertermolekularer Ursache

• Phänotyp bei homozygoten Mutationsträgern:

– verändertes Hb präzipitiert im desoxygenierten Zustand Erythrozyten sicheln

– hämolytische Anämie, Infarkte, Skelettstörungen

• heterozygote Anlageträger häufiger in Malaria-Endemiegebieten: Resistenz

evolutionärer Selektionsvorteil