Transcripciones de Cátedras Química Fisiológica y Patológica Macarena Las Heras – Hugo Díaz – Fabián Pinto – Marjorie Reyes – Carlos Rivera – Rocío Romero Universidad de Chile | Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas 1 26-04-2011 Biología Molecular II Mario Chiong Procedimientos para inhibir la expresión génica Estos procedimientos tienen que ver con el uso de dos estrategias, una de ellas es el DNA Anti Sentido (DNA AS) y el segundo, con RNA interferente (iRNA) Corresponden a pequeños oligonucleótidos (20-30 bases de DNA), desde el punto de vista farmacéutico, lo que se usa son trozos pequeños de DNA monohebra que son antisentido, es decir, que se aparean con el RNA mensajero y por lo tanto tienen el sentido opuesto a la lectura, de ahí su nombre. Lo que se utiliza en la práctica son derivados de estos ácidos nucleicos, que corresponden a nucleótidos fosforotioatos (S-ODN, El fosfato en vez de tener O tiene S) que aumentan la estabilidad del oligonucleótido, de manera de ser utilizados DNA AS
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Transcripciones de Cátedras Química Fisiológica y Patológica
Macarena Las Heras – Hugo Díaz – Fabián Pinto – Marjorie Reyes – Carlos Rivera – Rocío Romero
Universidad de Chile | Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
1
26-04-2011 Biología Molecular II
Mario Chiong
Procedimientos para inhibir la expresión génica
Estos procedimientos tienen que ver con el uso de dos estrategias, una de ellas es el DNA Anti Sentido (DNA AS) y el segundo, con RNA interferente (iRNA)
Corresponden a pequeños oligonucleótidos (20-30 bases de DNA), desde el punto de vista farmacéutico, lo que se usa son trozos pequeños de DNA monohebra que son antisentido, es decir, que se aparean con el RNA mensajero y por lo tanto tienen el sentido opuesto a la lectura, de ahí su nombre. Lo que se utiliza en la práctica son derivados de estos ácidos nucleicos, que corresponden a nucleótidos fosforotioatos (S-ODN, El fosfato en vez de tener O tiene S) que aumentan la estabilidad del oligonucleótido, de manera de ser utilizados
DNA AS
Transcripciones de Cátedras Química Fisiológica y Patológica
Macarena Las Heras – Hugo Díaz – Fabián Pinto – Marjorie Reyes – Carlos Rivera – Rocío Romero
Universidad de Chile | Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
2
mediante diversas aplicaciones (Inyectable, Digestión Oral, Inhalación y Aplicación Tópica), además son resistentes a hidrolisis por medios enzimáticos, particularmente a endonucleasas y exonucleasas.
Como vemos en la imagen de arriba, la situación normal es que el DNA se transcriba, por medio de la RNApol, formando un transcrito primario el cual se traduce a una proteína mediante ribosomas. Uno de los mecanismos por el cual funciona el DNA AS es que este oligonucleótido se aparea con el mRNA y, una vez apareado, impide la traducción porque a éste no se pueden unir los ribosomas, por lo tanto la cantidad de proteínas que se produce es bastante menor. El segundo método es que el mRNA al aparearse con el oligonucleótido, ahora, es reconocido por RNAasa tipo H y posteriormente el RNA es degradado.
Con el uso de oligonucleótidos complementarios al RNA es posible disminuir la cantidad de proteínas producidas dentro del organismo. Estos oligonucleótidos pueden ser dirigidos de manera altamente específica contra un RNA particular, pues es secuencia especifica. Dentro de medicamentos que utilizan esta tecnología encontramos:
• Vitravene: Es un oligonucleotido AS. Se administra en forma intravitreal (En forma ocular) en apcientes que tienen SIDA y que sufren infecciones de la retina producidas por citomegalovirus. Actualmente se comercializa de forma oficial.
• Antisentidofosforotioato:(administrado i.v. y proximamente rectal) para tratar la enfermedad de Crohn’s (los neutrófilos atacan células intestinales y las destruyen). Administración del antisentido por 26 días produjo una protección total en 75% de los pacientes por 6 meses (www.isispharm.com).
Existe una serie de oligos AS que se encuentran terminando su fase III de ensayo clínico, son producidos por genzyme y se espera que salga al mercado el próximo año. Su nombre es mipomersen y son dirigidas contra la proteína apoB·100, esta proteína tiene que ver con el anclaje de la lipoproteína LDL oxidada hacia el endotelio, provocando la formación de la placa de ateroma y su uso va a ser para combatir el riesgo de arteriosclerosis en pacientes con colesterol elevado.
Hace algunos años se dio el premio nobel por el descubrimiento de esta tecnología. En forma natural hay dos tipos de iRNA, los miRNA (micro RNA) y los siRNA (o shRNA), el iRNA propiamente tal existe sólo en forma sintetica. Ambos RNA (miRNA y siRNA)ocurren naturalmente y su función es regular la expresión génica, la diferencia entre ellos es donde se originan. Los siRNA se fabrican en respuesta a un RNA foráneo, habitualmente un RNA viral.
Transcripciones de Cátedras Química Fisiológica y Patológica
Macarena Las Heras – Hugo Díaz – Fabián Pinto – Marjorie Reyes – Carlos Rivera – Rocío Romero
Universidad de Chile | Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
3
Una célula se ve infectada por un RNA viral, por ejemplo a un retrovirus, y esa célula responde fabricando RNA de doble hebra (dsRNA) que da origen al siRNA. En cambio el miRNA, es un RNA que se produce en forma natural en todas las células desde levaduras, hasta mamíferos y se forma a través de un RNA mensajero de hebra simple (ssRNA), que se forma una horquilla y regula post-traduccionalmente la expresión de muchos genes, prácticamente todos los genes dentro de una célula humana están regulados por estos miRNA y es a menudo no 100% complementario al blanco.
Sintesis de miRNA
La síntesis del miRNA ocurre a partir de un mRNA maduro, que tiene el extremo 5’ modificado por el CAP y el extremo 3’ con poli A y forma una horquilla (ver la imagen superior) denominada miRNA primario (pri-miRNA),
la formación de ésta estructura ocurre en el nucleo. Existe un par de proteínas (Drosha y Pasha) que forman el complejo microprocesador el cual se une a la zona de horquilla indicada con cabezas de flechas; la enzima Pasha reconoce la horquilla y la enzima Drosha, que tiene una actividad RNAsa (III)endonucleasa, corta separando la horquilla formando el pre-miRNA. Esta horquilla posteriormente es transportada al citoplasma por una proteína de transporte (Exportina 5), que es una carioferina1;y es en el citoplasma donde es reconocida por otra proteína que se conocen con el nombre de Dicer (una Argonauta2
) la cual también es una endonucleasa, ésta que remueve la parte superior de la horquilla formando un RNA de doble hebra, el cual tiene una longitud exacta de 21-22pb (de no ser así no es posible formar el miRNA). Posteriormente el dupletemiRNA es reconocido por el complejo RISC, separando las dos hebras (mediante una helicasa) y generando el miRNA maduro, el cual tiene dos caminos, ser degradado (mecanismo similar al que ocurre con DNA AS) o pueden bloquear la traducción de proteínas.
1 Factor de transporte nucleocitoplasmatico que requiere Ran y GTP 2 Enzima RNAsa
Transcripciones de Cátedras Química Fisiológica y Patológica
Macarena Las Heras – Hugo Díaz – Fabián Pinto – Marjorie Reyes – Carlos Rivera – Rocío Romero
Universidad de Chile | Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
4
Estos miRNA en forma natural, están regulados en la expresión post-transcripcional de prácticamente todos los genes del organismo. Son muy importante en el desarrollo (en mamíferos se descubrieron en la embriogénesis), además tienen regulación metabolica (controlan la sisntesis, secreción y exportación de insulina) y generalmente un miRNA es codificado por muchísimos genes3
Existen tres mecanismos de acción:
.
1. Unión del complejo RISC al miRNA y degradación. 2. Unión del complejo RISC al miRNA y bloqueo de la traducción. 3. Se ha descrito recientemente, que le complejo RISC es capaz de viajar al nucleo,
unirse al DNA y producir hipermetilación del DNA, silenciando la expresión génica. Este mecanismo permite controlar, sin modificar el patrón de expresión génica, la expresión de un gen a nivel de la cantidad de mRNA. Este método bloquea la traducción o la estabilidad del mRNA.
Los RNA interferente, son muy parecidos al miRNA, pero se producen en respuesta a un RNA foráneo, también producen metilación tanto de histonas como de DNA. Se utiliza como herramienta de investigación, pues pueden ser fabricados para producir Knockdown
siRNA
4
de la expresión génica.
3 Expresión multiloci, varios locus expresan el mismo miRNA 4 Disminución de la expresión de un gen existente. Knockout: eliminación del gen.
Transcripciones de Cátedras Química Fisiológica y Patológica
Macarena Las Heras – Hugo Díaz – Fabián Pinto – Marjorie Reyes – Carlos Rivera – Rocío Romero
Universidad de Chile | Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
5
ExpresióndesiRNA
• Para expresión transiente: Se puedeentregara lacélulaelRNAdúplex (RNA doble hebra)
• Paraexpresiónestable: Se pueden entregar mediante un vector que contiene un DNA para producir un RNAhorquilla. Elvector puedeserplasmidio, retrovirus, adenovirus.