1 Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik Prof. Jörg Kudla (Freisemester) Dr. Oliver Batistic Institut für Biologie & Biotechnologie der Pflanzen Schlossplatz 7 Schwerpunkte: Vorlesung 1: Einführung & Enzyme der Gentechnik Vorlesung 2: Methoden der Gentechnik Vorlesung 3: Vektoren & Klonierung Vorlesung 4: Reportergene und Hefe-Zwei-Hybrid System Vorlesung 5: Transgene Organismen Vorlesung 6: Genomik und moderne Methoden Vorlesung 7: Proteine Reportergene und Markergene Reporter- und Markergene Genprodukte der Reportergene erlauben den Nachweis (und eventuell die Quantifizierung) und/oder die Selektion von zu untersuchenden Ereignissen oder Eigenschaften von biologischen Substanzen bzw. Organismen. Markergene: Erlauben die Selektion von gesuchten Ereignissen (z. B. Transformation). Sind in der Regel dominant. Zur Selektion sind unterschiedliche Systeme verfügbar: - die Komplementation defizienter Rezipienten mit dem intakten Wildtypgen -die Verwendung dominant selektierbarer Marker (z.B. Antibiotika- oder Toxin- Resistenzen. Reportergene: Als Reportergene werden solche Makergene bezeichnet, die zwar nicht dominant selektiv sind, deren Genprodukte aber leicht durch einfache biochemische, histochemische oder photometrische Methoden nachweisbar sind.
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Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik · 1 Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik Prof.JörgKudla(Freisemester) Dr.OliverBatistic InstitutfürBiologie& BiotechnologiederPflanzen
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Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik
Prof. Jörg Kudla (Freisemester) Dr. Oliver BatisticInstitut für Biologie &Biotechnologie der PflanzenSchlossplatz 7
Schwerpunkte:
Vorlesung 1: Einführung & Enzyme der GentechnikVorlesung 2: Methoden der GentechnikVorlesung 3: Vektoren & KlonierungVorlesung 4: Reportergene und Hefe-Zwei-Hybrid SystemVorlesung 5: Transgene OrganismenVorlesung 6: Genomik und moderne MethodenVorlesung 7: Proteine
Reportergene und Markergene
Reporter- und Markergene
Genprodukte der Reportergene erlauben den Nachweis (und eventuell die Quantifizierung) und/oder die Selektion von zu untersuchenden Ereignissen oder Eigenschaften von biologischen Substanzen bzw. Organismen.
Markergene: Erlauben die Selektion von gesuchten Ereignissen (z. B. Transformation). Sind in der Regel dominant.Zur Selektion sind unterschiedliche Systeme verfügbar:- die Komplementation defizienter Rezipienten mit dem intakten Wildtypgen-die Verwendung dominant selektierbarer Marker (z.B. Antibiotika- oder Toxin-Resistenzen.
Reportergene: Als Reportergene werden solche Makergene bezeichnet, die zwar nicht dominant selektiv sind, deren Genprodukte aber leicht durch einfache biochemische, histochemische oder photometrische Methoden nachweisbar sind.
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Reporter- und Markergene
Anforderungen/Merkmale
- Selektierbarkeit von Organismen oder Ereignissen(Wachstumsselektion, optischer Nachweis, radioaktiver Nachweis)?
- Quantifizierbarkeit von Aktivitäten?
- möglichst einfacher (und preiswerter) Nachweis?
- Nachweis in lebenden Organismen?
- hohe Sensitivität bzw. optische Auflösung?
Reporter- und Markergene - Anwendungen
- Selektionsmarker
a) transformierte Zellen, Gewebe bzw. Organismen(Antibiotikaresistenz, auxotrophe Marker, Herbizidresistenz, Farbreaktion)
b) Klonierungsereignisse (ß-Galactosidase)
- Bestimmung von Enzymaktivitäten (Luciferase, Alkalische Phosphatase)
- Expressionsmuster und –stärke von Genen (Promoterfusionen mit GUS, GFPoder Luciferase)
- Lokalisation von Proteinen in Zellen und Geweben (Fusionsproteine)
• GFPs mit subcellulären targeting Sequenzen (ER-GFP)
• enGFP (enhanced fluorescence)
• YFP, CFP, RFP (veränderdete Absorbtions- und Emissionspeaks):
erlauben Co-Lokalisationsuntersuchungen von zwei Proteinen
• FRET (fluorescence resonance energie transfer):
in vivo Protein-Protein- Interaktionsstudien
• Cameleon (Calcium imaging)
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Cameleon: A FRET based calcium indicator
Allen et al. (1999) Plant J 19, 735
Miyawaki et al.(1997) Nature 388,882
+Ca2+ -Ca2+
CFP
YFP
YFP
CFP
440nm 480nm
509nm
440nm
FRET
CaM M13
Z MBP
480nm
Measuring Calcium with the Cameleon Protein
YFP
CFP
Ratio
P2P1
Kamera
Filterrad
Excitation
PC
Pumpe
Mikroskop -
Kammer
EmissionP2P1
Kamera
Filterrad
Excitation
PC
Pumpe
Mikroskop -
Kammer
Emission
YFP CFP Ratio
21
Z MBP
1.50
1.75
2.00
2.25
0.8
0.85
0.9
0.95
1
Cold shock + 0.5µM Baf
Hyp Hyp
[Ca2+]cyt oscillations in protoplasts
Hyperpolarization
Calcium-Oszillationen in Blattepidermiszellen
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Yeast two-hybrid system
1. 1,2,3-Hybrid-Systeme
- Two-Hybrid-System
- Grundprinzip, Vektoren, technische Durchführung
- Anwendungen
- Vorteile und Nachteile
- One-Hybrid-System
- Three-Hybrid-System
Two-Hybrid-System
1. System zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Hefezellen. Nachweis geschieht durch die Aktivierung der Transkription von Reportergenen.
2. Ein bekanntes protein X ("bait" – Köder) wird mit der DNA-Bindungsdomäne (BD) eines Trans-kriptionsfaktors (GAL4) fusioniert (Fusionsprotein)
3. Ein (oder mehrere) zu untersuchende Proteine(e) Y ("prey" – Beute) werden mit der Aktivierungs-domäne (AD) dieses Transkriptionsfaktors fusioniert.
4. Interagieren die Proteine X und Y, so bringen sie AD und BD in räumliche Nähe zueinander und der Transkriptionskomplex (RNA Polymerase II) der Hefe wird gebildet.
5. Die BD vermittelt hierbei die spezifische Bindung an die entsprechenden Zielpromotoren. Die AD bindet an die in trans wirkenden Komponenten des Transkriptionskomplexes.
6. Die Transkription der Reportergene (auxotropher Marker HIS3 und ß-Galactosidase) wird hierdurch aktiviert und erlaubt die Selektion positiver Kolonien.
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Funktionsprinzip I
A) GAL4-Transkriptionsfaktor (BD & AD in einem Protein)
B) Nur Bindungsdomäne
Transkription
BD AD
HIS 3Gal 4 binding site
RNA-Pol.II
BD
HIS 3
Keine TranskriptionGal 4 binding site
C) Nur Aktivierungsdomäne
HIS 3
Keine TranskriptionGal 4 binding site
ADRNA-Pol.II
Funktionsprinzip II
BD
HIS 3
Transkription
AD RNA-Pol.II
Gal 4 binding site
YX
Transkription
BD AD
HIS 3Gal 4 binding site
RNA-Pol.II
BD
HIS 3
AD
Gal 4 binding site
Y
XHybridprotein 1
Hybridprotein 2RNA-Pol.II
Keine Transkription
Interaktion
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Funktionsprinzip III
Gal4
TRP1LEU2HIS 3
HIS 3LacZ
Hefegenom
ADH-Prom
AD Protein YBD Protein X
LEU2TRP1
GAL4-BD cDNA „Y“cDNA „X“
„prey“„bait“
GAL4-AD
ADH-Prom
2µ 2µ
Auxotrophie
BD TranskriptionAD RNA-Pol.II
Gal 4 binding site
YX
Plasmide
Ablauf eines Two-Hybrid-Screenings
Klonierung der „bait“cDNA in das BD-Plasmid
Transformation in die Hefe
(Selektion auf -Trp-Platten)
Kultivierung der „bait“-Hefe in Flüssigmedium
Selektion auf -Leu, -Trp, -His-Platten
Klonierung der „prey“cDNA in das AD-Plasmid
bzw. Herstellung einer cDNA-Bank
Transformation in die Hefe (nur sinnvoll bei einzelnen
„prey“-cDNA-Klonen (Selektion auf -Leu-Platten)Kontrolle auf ß-GAL-Aktivität
und -His-Medium (negativ!)
Transformation der „prey“-cDNA-Klone bzw. Bank
Erneute Selektion der Kolonien:
auf LTH-Platten, Duplikate
auf ß-GAL-Aktivität untersuchen (Filter-Lift-Assay)
Transformation in E. coli und Plasmidisolation
Erneute Transformation in Hefe:
Kontrollen:
+ „leere Hefe“: His+ß-GAL: -
+ „bait Hefe“: His+ß-GAL: +
Sequenzanalyse der „prey-cDNA“
Isolation der Plasmide aus der Hefe
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Anwendungen
ADH-Prom
AD Protein YBD Protein X
TRP1LEU2
GAL4-BD cDNA „Y“cDNA „X“
„prey“„bait“
GAL4-AD
ADH-Prom
2µ 2µ
ADH-Prom
AD ProteineBD Protein X
TRP1LEU2
GAL4-BD cDNA-BankcDNA „X“
„prey“„bait“
GAL4-AD
ADH-Prom
2µ
1. Untersuchung zweier bekannter Proteine auf Interaktion