Bioinform_1NY_03

MTA SZBK DNS-Chip Laboratóriumwww.szbk.hu/chiplab~

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

A DNS CHIPEKA DNS CHIPEK ÉS ALKALMAZÁSUKÉS ALKALMAZÁSUKSZE Bioinformatika

2003.10.09.

Kromoszómákgenetikai állomány

hordozói

DNS

mRNS

Fehérjéksejtfunkciók

ellátása

Génekinformáció hordozók

sejt

AAAAAAAAAAAA

AAAAAA

„Genom, avagy a DNS birodalma”: egy szervezet

teljes DNS készlete.

„Transzkriptom, avagy a hírvivő RNS-ek birodalma”:

egy sejten belüli, egy időpontban jelenlévő mRNS készlet.

„Proteom, avagy a fehérje birodalom”: egy sejten belüli, egy időpontban jelenlévő fehérje készlet.

Néhány definíció


cDNS=copy DNS, az érett mRNS DNS-sé átírt változataOligonukleotid=néhány tíz nukleotidból álló DNS darab

A genomprogram

•Humán Genom Projekt és a Celera Genomics nevű biotechnológiai óriás 2000-ben együttesen jelentették be

az emberi genetikai állomány kódjának közel teljes megfejtését.

•2001 februárjának közepén hozta nyilvánosságra eddigi eredményeit a világ két legrangosabb tudományos folyóiratában, a Nature, illetve a Science lapjain.

„„Az emberiség 100,000 éves történelmének egyik Az emberiség 100,000 éves történelmének egyik legfontosabb napja, hiszen az emberek először legfontosabb napja, hiszen az emberek először

olvashatják el saját könyvük betűit” olvashatják el saját könyvük betűit” Craig VenterCraig Venter, a , a CeleraCelera igazgatójaigazgatója


•Trillió sejt/szervezet•3 milliárd betű/sejt•2 méternyi DNS/sejt•1betű/mp, 24 óra/nap 100év. •1betű-mp, 16,5perc egy különbség. •12 000 nukleotidot határoztak meg minden mp-ben Human Genome Project keretén belül •3 mm-es távolságban összerakva 9000 km lenne, több mint 2x hosszabb mint a Mississippi •a korábbi feltételezésekkel (80-100ezer gén) ellentétben csak kb. 35ezer gén•a genomnak csak 1-1,5%-a kódoló, azaz exon szekvencia•egyenlőtlen géneloszlás-genetikai sivatagok•egyenlőtlen a kromoszómális eloszlás is (az XY kromoszómák sokkal kevesebb gén tartalmaznak mint pl. a 17 vagy 22-es kromoszóma•kb. 3millio SNP minden 1000 „beteg”•a rasszok jobban hasonlítanak egymásra a két nem

Néhány érdekes adat az emberi genomról


Körn

yeze

ti h

atá

sok,

gyóg

ysze

rek,

fert

őzé

sek

daganat képződés, gyulladás, különböző betegségek

sejtosztódás, diffrenciáció, sejthalál

A funkcionális molekuláris biológia lényege 1.

funkciók

felderítése

GT

P

G TP

Minőségi és

mennyiségi

változások

szövet, szerv szint

sejt szint


DNS

RNS

fehérje

metabolitok

vizsgálata

Összehasonlítás

egészséges szövettel

Segítség:Segítség:

adatbankok,adatbankok,

szekvenálásiszekvenálásiprojektekprojektek

A funkcionális molekuláris biológia és diagnosztika lényege (2)

Eltérő állapotok molekuláris hátterének felderítése

Trombosis, sclerosis

Körn

yeze

ti h

atá

sok,

gyóg

ysze

rek,

fert

őzé

sek

A funkcionális molekuláris biológia lényege 3.

G

T

P

G

P

Min

őség

i és m

en

nyis

ég

i vált

ozá

sok

követé

se

aktív gének vizsgálata

AAAAA

AAAAAAAAAA

AAAAA

T

P

P

P

P

P

A biochipek nagyszámú gén vagy fehérje együttes

funkció analízisére alkalmasak

A biochipek nagyszámú (több ezer)

cDNS, oligonukleotid vagy fehérjemolekula

részletet tartalmazó kémiailag aktivált

tárgylemezek

Az 1990-es években egy forradalmian új technika,

fejlődött ki a gén és fehérje funkciók

analízisére.


Chip-technológia

A DNS-chip technolólgia komplementer nukleinsav-láncok hibridizációján alapul

Comparative molecular expression analysis

A. Examination of “transcriptome” B. Examination of “proteome”(generation of mRNA maps) (generation of protein maps)

- 2D gelelectrophoresis- MALDI-TOF mass spectrometry- combined electrophoretic and microsequencing techniques- “protein-chip” techniques

3. Sequence-based techniques

- ESTs (expressed sequence tags)- SAGE (serial analysis of gene expression)- DNA sequencing chip- Mass spectrometry sequencing

- Differential display- RDA (representational difference analysis)

2. PCR-based techniques

- Northern blotting- RNase protection/S1-mapping- Subtraction cloning- DNA arrays

1. Hybridization-based techniques

DNA-chip Laboratory, BRC. Szeged

Dot-blot technikaRadioaktív génspecifikus próba

Különböző sejtekből preparált teljes RNS-ek szilárd hordozóra

kötve

Hibridizáció A pozitív RNS minták

jelölődnek

Reverz dot-blot technika

Génspecifikus mintákrögzítése szilárd hordozóhoz

Teljes RNS jelölése

Hibridizáció Pozitív génspecifikus minták jelölődnek

DNS-chip technika100-20,000

Génspecifikusminta

Hibridizálás


macroarray

•nylon membránon néhány 100 génspecifikus minta (DNS darab)

•radioaktív jelölés•kis minta sűrűség (100-1000 pont/cm2)

microarray

•üveglemezen több 1.000-10.000 génspecifikus minta

(DNS darab)•fluoreszcens jelölés

•közepes mintasűrűség(5000 pont/cm2)

chip

•üveglemezen több 10.000-100.000 génspecifikus

minta (DNS darab) •fluoreszcens jelölés •nagy minta sűrűség

(10.000pont/cm2)

A chipek hordozó szerinti osztályozása

cDNS klón és/vagy DNS szekvencia biológiai minta

szövetből, sejtkultúrából

MakroarrayMikroarray Chip

nyomtatás

mRNS, DNS, fehérje

adatfeldolgozás, bioinformatika, génműködésre vonatkozó

információk értékelése

Egy chipkísérlet lépései

Hibridizálás, fehérje-ellenanyag kölcsönhatás

néhány 100, vagy több 1.000,

10.000 gén, fehérjejelölt minta

X

cDNS cDNS alapú chip készítésalapú chip készítésee

Egyedi bEgyedi baktaktérium klónokérium klónok izolálása izolálása

kékék/k/fehér szelekciófehér szelekció

PCR amplifikációPCR amplifikáció96 mintahelyes lemezeken96 mintahelyes lemezeken

cDNS könyvtár bcDNS könyvtár baktaktériumbanériumban

PCR reakció ellenőrzésePCR reakció ellenőrzéseTisztításTisztítás

felcsepegtetés üveglemezekrefelcsepegtetés üveglemezekre

Minden lemezenMinden lemezentöbb 1000 ismert több 1000 ismert

és ismeretlen és ismeretlen szekvenciájú cDNS szekvenciájú cDNS

darab szerepel duplikátumbandarab szerepel duplikátumban

Ismert és ismeretlen Ismert és ismeretlen szekvenciájú cDNS szekvenciájú cDNS

darabokat tartalmazó klónokdarabokat tartalmazó klónok

CH

IPK

ÉS

ZÍT

ÉS

CH

IPK

ÉS

ZÍT

ÉS

DNA-chip Lab.BRC, SzegedDNA-chip Lab.BRC, Szeged

Microgrid ArrayerBioRobotics, UK


Microgrid ArrayerBioRobotics, UK

• 4, 16 4, 16 tűtű

• 84 84 lemezlemez

• 24 mi24 mikrotiter lemezkrotiter lemez (384) (384)

• SebességSebesség: 6400 : 6400 pontpont < 4h. < 4h.

• Sűrűség: Sűrűség: 20.000 20.000 pontpont//lemezlemez


Nyomtatótű a MicroArrayer robothoz


Touch surface Move pins Wash, repeat

Making microarrays by mechanical microspotting and ink jetting

1. Mechanical microspotting

Sample is loaded into a spotting

pin by capillary action

Small volume is transferredto a solid surface by physicalcontact between the pin and

the solid surface

Same sample can betransferred with thesame pin to the next

solid surface generatingmultiple arrays

Microarray

After the first spottingcycle, the pin is washedand the next sample isloaded and deposited

Microarray

Wash, repeatDeliver drop Move jets

Sample is loaded into aminiature nozzle equippedwith a piezoelectric fitting

An electrical current isused to expel a precise

amount of liquid from thejet onto the surface

Second sample is loadedand deposited to an adjacent

address

2. Ink jetting


OligonukleotidOligonukleotid alapú chip készítésalapú chip készítésee 1. 1.szintetikus oligonukleotidokszintetikus oligonukleotidok

kémiai kikötésekémiai kikötése

OligonukleotidOligonukleotid alapú chip készítésalapú chip készítésee 2. 2.in situ szintézisin situ szintézis

CH

IPK

ÉS

ZÍT

ÉS

CH

IPK

ÉS

ZÍT

ÉS

DNA-chip Lab.BRC, SzegedDNA-chip Lab.BRC, Szeged

Affymetrix

Semi conductor MicroarraysSemi conductor Microarrays

• Multiplex in situ custom DNA synthesis

• 1k and 10k features available

1. Semiconductor Base

2. Scalable Density

3. Active Device - Computer Controlled Electro-Chemistry

In situIn situ MicroArray DNA Synthesis MicroArray DNA Synthesis

11

22 33

4455

60 Cycles60 Cycles

In situIn situ MicroArray DNA Synthesis MicroArray DNA Synthesis

11

22 33

4455

60 Cycles60 Cycles

Scalable Technology PlatformScalable Technology Platform

1K

1024 Features

10K

13,416 Features

Nagyobb DNS molekulákpl. PCR- felskszorozott cDNS klónok

kovalens kikötése aktivált tárgylemezre


Fehérje-chipek

DNS-chipekMutációk,

Egy nukleotid eltérések (SNP), deléció, inszerció

Genom

G

FehérjékFehérjék

Kifejeződés,módosítások,

kölcsönhatások

Proteom

P

Gén kifejeződésmegváltozása

Transzkriptom

T

mRNSmRNS

AAAAA

AAAAAAAAAA

AAAAA

Mire alkalmasak a chipek?


Pontmutációk (SNP) detektálása •Oligonukleotid

alapú chipek•egy nukleotid

eltérésazonosítása

DNS

JelöltDNS

hibridizáció

mosás

detektálás

Adat analízis1. SNP: 3. pozíció A-C2. SNP: 2. pozíció C-T


1. S

NP

3

po

zíci

ó

AGTC

2. S

NP

2

po

zíci

ó

AGTC

Génkifejeződés tanulmányozása

mRNS

JelöltcDNS

hibridizáció

mosás

detektálás

Adat analízis:•relatív aktivitás mérése

•a színessel jelöltgének aktívak

•a feketék nemDNA-chip Lab.BRC, Szeged

aktív gének vizsgálataAAAAA

AAAAAAAAAA

AAAAA

– cDNS vagy oligonukleotid chip– transzkriptom analízise– aktív-inaktív gének detektálása– bonyolult adat és statisztikai analízis

biológiai anyag

jelölt cDNS jelölt cDNS

Cy5 dCTPCy5 dCTP Cy3 dCTPCy3 dCTP

Hibridizáció, mosásSzkennelés


Jelölt próba készítése: két különböző minta együttes analízise

beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti

hatásoknak kitett sejt vagy szövet

kontroll minta (egészséges, kezeletlen)

sejt vagy szövet

RNS tisztítás

cDNS írás RNS-ből

(reverz transzkripció)

cDNS-chipek alkalmazásai: cDNS-chipek alkalmazásai: (1) szövetspecifikus génexpresszió különbségek vizsgálata

RNS

cDNS

cDNS-chip 4000 különbözőArabidopsis génmintát tartalmaz


Gyógyszer-indukált génexpresszióváltozás vizsgálataMycobacterium tuberculosis-ban cDNS-chip technikával

3,834 ORF (össz. becsült ORF 97%-a)PCR génspecifikus primerekkel,

tisztítás és felvitel poli-L-lizinnel bevontmikroszkóplemezekre robot segítségével

1. cDNS-chip készítése

PNAS (1999) 96, 12833-12838

4. Adatfeldolgozás

3. HibridizációEREDMÉNYEK:EREDMÉNYEK:

- Isoniazid több olyan gént indukált, melyek a gyógyszerhatás mechanizmusával kapcsolatos fehérjéket kódolnak: II-es típusú zsírsavszintetázt, trehalóz dimikolil transzferázt.

- további indukált gének: valószínűleg a gyógyszer toxikus hatásával magyarázható általános hatás miatt

- egy új efflux proteint kódoló gén indukcióját is megfigyelték

Az eredmények olyan információkat szolgáltathatnak, melyekgyógyszer hatásmechanizmusokat, új targeteket tárhatnak fel.

2. RNS izolálás, és próbakészítés M. tuberculosis-ból

RNS izoláció, jelölt cDNS készítéseCy3-dUTP és Cy5-dUTP felhasználásával

Reverz transzkripció reakcióban.

Kezeletlen, kontrollbaktériumok

Isoniaziddal kezelt

baktériumok

Új gének azonosításaGénfunkciók jellemzése

Génkölcsönhatások megértése

Differenciáció tanulmányozásaTumorképződés

vizsgálataGyógyszerek felfedezése

RNS

cDNS

cDNS-chip 6000 különbözőegyedi egér génmintát tartalmaz


cDNS-chipek alkalmazásai: cDNS-chipek alkalmazásai: (2) eltérő állapotokért felelős

génexpresszió különbségek vizsgálata

Egészséges és dagantos (HBL100 vs. breast carcinoma BT474) szövetek génkifejeződéseinek

összehasonlítása


Genomszintű változások,kromoszóma rendellenességek,

amplifikációk, deléciók detektálása

DNS

PCRPCR

Paraffinba ágyazott mintáknormálnormál daganat daganat

Génátrendeződési arányok

-16

-11

-6

-1

4

9

01 p

12-1

3.3

01 p

13-p

21

01 p

33-3

4.2

01 p

34.2

01 p

36.3

1

01 q

21

01 q

21.1

01 q

21.2

-22

01 q

21.3

01 q

24-q

25

01 q

31-q

32

02 p

13-p

12

02 q

13

02 q

34-q

35

03 p

21.1

-9

03 p

21.3

03 q

03 q

21.1

-q21

.2

04 p

16.3

06 p

21.3

06 p

21.3

1

06 q

27

07 p

15.3

-7p

14

07 p

21.3

08 p

23

08 q

21.2

-q21

.3

09 p

12-1

3.3

09 p

13

09 q

21.2

09 q

32-q

33.3

10 p

11.2

11q

23

12 p

13

12 q

13 q

32.2

14 q

24-q

31

16 q

23.1

17 p

13

17 p

13

18 p

11.1

-q11

.2

18 q

21.3

19 p

13.2

19 p

13.2

19 q

13.1

2

19 q

13.4

19 q

13.4

19 q

13.4

3

20 q

11.2

2

20 q

13.3

3

21 q

22.1

22 q

13.1

Xp

11.3

-p11

.23

Tüdő génarány agy génarány

Metasztázisok, tumorok, multiplex tumorok jellemzése, igazolása

Lézer szkennerCy5

Lézer szkennerCy3

kontroll minta (egészséges, kezeletlen)

sejt vagy szövet

Cy5 dCTPCy5 dCTP

beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti

hatásoknak kitett sejt vagy szövet

jelölt cDNSjelölt cDNS

Cy3 dCTPCy3 dCTP

Képanalízis

ADATFELDOLGOZÁS

?

Nem szignifikánsadatok

„Árnyékzóna”

DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

Cy-3, Cy-5 jelek kvantitatív összehasonlításaQuantarray szoftverrel (GSI Lumonics)

Arány és intenzitásmegszorítások nélkül

Arány és intenzitásmegszorításokkal

DNS-chipek képanalízise

R1=(CH1I-CH1Bk)/(CH2I-CH2Bk)R1M=IF(CHB1<0.55,"",IF(CHB2<0.55,"",IF(FLAG=1,"",R1)))R1MN=IF(R1M="","",R1M/NoF)R1MNA=IF(R1MN="","",IF(R1MNx="","",IF(RMN1Rep>=RMN1x, IF(RMN1Rep/RMN1x<2,(RMN1x+RMN1x)/2,""),IF(RMN1x/RMN1Rep<2, (RMN1Rep+RMN1x)/2,""))))

R1 R1M R1MN R1MNA MRATM MRATMNMRATMNA Plate codeClone name Accesion No.0.9296 0.9296 0.6942 1.038 0.7769 0.75441617 MO7/2 W36984

1.035 MO7/3 W365201.574 1.574 1.1755 1.2588 1.357 1.0157 1.12949102 MO7/5 Mouse s-adenosylmethionine synthetase mRNAW29782

1.21 1.21 0.9037 0.927 1.227 0.9184 0.93787425 MO7/6 W149600.5451 0.5451 0.4071 0.4337 0.5814 0.4352 0.47144461 MO7/7 W17570

1.049 1.049 0.7834 0.7928 1.107 0.8286 0.82148204 MO7/8 W143320.9534 0.9534 0.712 0.866 0.9839 0.7365 0.86148952 MO7/11 W078741.1457 1.1457 0.8557 0.8842 1.163 0.8705 0.87050898 MO7/13 W087200.9712 0.9712 0.7253 0.7543 0.969 0.7253 0.75449102 MO7/14 EST W183661.3814 1.3814 1.0317 0.921 1.409 1.0546 0.95247006 MO7/15 W079971.1676 MO7/16 W185211.1205 1.1205 0.8369 0.8544 1.098 0.8219 0.84618263 MO7/17 ESTs, Highly similar to GLYCOGEN PHOSPHORYLASE, MUSCLE FORM [Oryctolagus cuniculus]W184571.1963 1.1963 0.8935 0.8628 1.199 0.8975 0.88398204 MO7/18 W155660.8856 0.8856 0.6614 0.7541 0.8721 0.6528 0.73731287 MO7/19 W338091.1279 1.1279 0.8423 0.7949 1.163 0.8705 0.83083832 MO7/20 W16187

1.352 1.352 1.0097 0.9327 1.329 0.9948 0.93263473 MO7/21 AA0523950.953 0.953 0.7117 0.7797 1.004 0.7515 0.79491018 MO7/22 TALIN W17813

1.2679 1.2679 0.9469 0.9844 1.246 0.9326 0.95583832 MO7/23 Pale ear W298551.1082 1.1082 0.8276 0.806 1.163 0.8705 0.80827096 MO7/24 W17959

Adatfeldolgozás, statisztikai analízis

Slide 42

Spot label

Rat

io C

y5/C

y3Ábrázolási módszerek 1. normál arány

Ábrázolási módszerek 2. log2 arány

LeuLeukémiákkémiák molekuláris molekuláris osztályozásaosztályozása

génexpresszió génexpresszió monitorozássalmonitorozással DNS-chipek DNS-chipek alkalmazásávalalkalmazásával

- Új alosztályok felfedezése - Új esetek osztályozása

- Jóslat kemoterápiás kezelés hatékonyságára

- Atipikus esetek tisztázása

Jövő:Jövő:

- Tumorminták gyűjtése - Kemoterápia jellemzése

- Expressziós analízis - Adatbank létrehozása

- Alosztályok meghatározása - Kemoterápiára adott válaszok

jellemzése DNS-chipekkel - hatásmechanizmus feltárása - rezisztenciáért felelős gének

azonosítása

Science 1999, 286, 531.

B-sejt limfómák

osztályozása

Alizadeh et al.,Nature, 2000, 403,

503-511.

Mintaelőkészítés, csoportosítások tervekrónikus mieloid leukémiák osztályozásához

Teszt és általánosgének azonosítása: CMLCML

1. beteg1. beteg2. beteg2. betegx. betegx. beteg

RNSRNSRNS

cDNScDNScDNS

hibridizálás

Későbbi kimenetel

1. típus

2. típus

3. típus

diagnózis kezelés korai reakció RNS

kontrol

RNS

kontrol

RNS

kontrol

relapszusrelapszus

tünetmentességtünetmentesség

RNS

kontrol

RNS

kontrol

RNS

kontrol

RNS

kontrol

RNS

kontrol

RNS

kontrol

RNS

kontrol

Génexpressziós klaszterek patkány fejlődése során

a. Normalized gene-expression trajectories are shown grouped by waves that are determined by clustering. The graphs below show the average normalized expression pattern or wave over the nine time points for all of the genes in each cluster.

b. Tree of all gene-expression pattern. c. Plots of all normalized time series, highlighted wave 3.

The time of birth is marked by a vertical line

DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

Dataprocessing and visualization

Repression of cell division

Imaging: „tree” & „galaxis”clastering methods

Sejtosztódást gátló, apoptózist serkentő vegyülethatásának vizsgálata 3 sejttenyészeten 2 különböző

koncentrációban humán cDNS-chippel

Bioinform_1NY_03

Documents