はじめに 保存条件 必要なもの ( キット以外 ) キット内容 操作 B603 : Biofilm Viability Assay Kit Issued on November 27, 2019 Technical Manual バイオフィルム薬剤感受性試験 Biofilm Viability Assay Kit 0–5 o C で保存してください。 -プレートリーダー (450 nm の吸光フィルター ) -コニカルチューブ -インキュベーター ( 37 o C) -生理食塩水 - 20–200 µl のマルチチャンネルピペット -安全キャビネット - 100–1000 µl、20–200 µl マイクロピペット バイオフィルムは、微生物とその代謝物である細胞外多糖から構成される集合体で、あらゆる環境に存在しています。 医療器具内の細菌汚染やう蝕・歯周病の感染症はバイオフィルムが要因とされており、様々な分野でバイオフィルムの 関与が指摘されています。バイオフィルムの中へは抗生物質等が浸透しにくく、バイオフィルムに生息する微生物に対 する薬剤効果が低減するため、バイオフィルムによる汚染は深刻な問題となっています。そのためバイオフィルム形成 阻害能を有する薬剤や食品成分の探索が注目を集めています。 Biofilm Viability Assay Kit はバイオフィルム内の生菌の代謝活性を測定することで、バイオフィルム内微生物に対す る薬剤効果を確認するキットです。エネルギー代謝活動に関与する補酵素である NADH(NADPH) は mediator を介して WST を有色の formazan へと還元します。この還元能を利用することで微生物の代謝活性を検出します。蓋に固定さ れたペグにバイオフィルムを形成させるため、洗浄・発色操作によりバイオフィルムが剥がれることがなく、多検体を 簡便に測定することが可能です。 図 1 Biofilm Viability Assay Kit の測定原理 使用上のご注意 ・キットの中の試薬は、室温に戻してからご使用ください。 ・キットには滅菌済みの 96-well Plate が 10 枚添付されています。開封後は使用時まで滅菌状態を保ち、各工程 で新しい 96-well Plate をご使用ください。 ・還元剤が存在すると WST が還元されて発色し、バックグラウンドが上昇することがあります。 ・還元能のある薬剤を用いる場合は、薬剤自身による発色の有無を確認してください。 ・気泡は測定値のバラツキの原因となりますので、ご注意ください。 ・バイオフィルム形成のための培地や培養時間および発色に要する時間は微生物種や代謝活性により異なります (表 1 参照)。 ・菌種によっては安全キャビネット内でご使用ください。 96-peg Lid (1) 96-well Plate ①の各ウェルに菌懸濁液 180 μl を入れ、 96-peg Lid を被せてインキュベーター内で 37 o C で培養 する(ペグ上にバイオフィルムが形成される)。 ※バイオフィルム形成用培地、インキュベート時間は微 生物種に依存します。バイオフィルム形成条件は B601 Biofilm Formation Assay Kit にてご確認ください。 (2) 96-well Plate ②、 96-well Plate ③の各ウェル に滅菌生理 食塩水 200 μl を、 96-well Plate ④の各ウェル に被検 物質 を 含む培地 200 μl を入れる。 ※ 被検物質調製用培地は微生物種に依存します。 (3) 96-well Plate ②、 96-well Plate ③に手順 ( 1) の 96-peg Lid を順次浸して洗浄する ※ 。続けて 96-well Plate ④に 96-peg Lid を被せてインキュベーター内で 37 o C で培養 する。 ※洗浄の際は、 96-peg Lid を緩やかに生理食塩水に浸し、 激しい振とうは避けてください。 (4) 滅菌 コニカルチューブ内で WST solution 990 μl と Electron mediator reagent 110 μl を混合し、 Mueller- Hinton broth(MHB) 培地を 20.9 ml 加えて、発色試薬とする。 (5) 96-well Plate ⑤、 96-well Plate ⑥の各ウェル に滅菌生 理食塩水 200 μ l を、 96-well Plate ⑦の各ウェル に手順 (4) で調製した発色試薬 200 μl を入れる。 (6) 96-well Plate ⑤、 96-well Plate ⑥に手順 ( 3) の 96- peg Lid を順次浸して洗浄する ※ 1 。続けて 96-well Plate ⑦に 96-peg Lid を被せてインキュベーター内で 37 o C で培養 する ※ 2 。 ※ 1 洗浄の際は、 96-peg Lid を緩やかに生理食塩水に浸し、激しい 振とうは避けてください。 96-well Plate ① 菌懸濁液 96-well Plate ② 96-well Plate ③ 96-well Plate ④ 96-well Plate ⑤ 96-well Plate ⑥ 被検物質溶液 滅菌生理食塩水 滅菌生理食塩水 発色試薬 滅菌生理食塩水 滅菌生理食塩水 (1) (2) , (3) (5) , (6) 使用上のご注意 使用上のご注意 96-well Plate ⑦ 100 tests WST Solution 1 ml×1 Electron Mediator Reagent 0.12 ml×1 96-peg Lid ×1 96-well Plate ×10 ※ 2 発色に要する時間は、微生物種や被検物質により異なります。 ※発色試薬の菌汚染にご注意ください。 (7) 96-peg Lid を取り外し、 マイクロプレートリーダーで 450 nm の吸光度を測定する。 (7) 吸光度測定 (450 nm )