Biochimija Sryer v3

Л.Страйер

Second Edition

BIOCHEMISTRY

Lubert StryerStanford University

W.H.Freeman and CompanySan Francisco

Л.Страйер В 3-х томах

Перевод с английского канд. биол. наук М.Д.Гроздовойи канд. биол. наук А.М.Колчинского

Под редакцией академика С.Е.Северина

том

Москва «Мир»1985

ББК 28.072С 83УДК 577.1

Страйер Л.

С 83 Биохимия: В 3-х т. Т.3 Пер. с англ.- М.: Мир, 1985,-400 с., ил.

В книге ученого из США на самом современном научном уровне рассмотрены ос-новные проблемы биохимии и молекулярной биологии.

Третий том посвящен хранению, передаче и реализации генетической информации,а также молекулярным основам ряда физиологических процессов (иммунной защите, дей-ствию гормонов, транспорту веществ в клетке, работе биологических мембран).

Предназначена для биохимиков, молекулярных биологов, физиологов, химиков, меди-ков, для студентов, аспирантов и преподавателей биологических, химических и медицин-ских специальностей.

С2001040000-372

041(01)-85св. пл. подп. изд., 1985

ББК 28.07257.04

Редакция литературы по биологии

1975, 1981 by Lubert Stryer

перевод на русский язык, «Мир»,1985

Часть

ИнформацияХранение, передача и экспрессиягенетической информации

Модель пары дезоксирибону-клеотидных мономеров двой-ной спирали ДНК. В этой пареаденин связан водороднойсвязью с тимином.

ГЛАВА 24ДНК: генетическая роль,структура и репликация

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) -молекула наследственности. ДНК - очень

Аденин(А)

Гуанин(G)

Тимин(Т)

Цитозин(С)

длинная нитевидная молекула, состоящаяиз большого числа рибонуклеотидов. Пу-риновые и пиримидиновые основания ДНКнесут генетическую информацию, тогдакак сахарные и фосфатные группы вы-полняют структурную роль. В настоящейглаве обсуждаются структура, генетическаяроль и репликация ДНК, причем основ-ное внимание уделяется ДНК прокариот,так как эти организмы устроены про-ще и подчиняются общим для всех ор-ганизмов законам. Хромосомы эукариоти-ческих клеток рассматриваются в гл. 29.

24.1. Ковалентная структураи номенклатура ДНКОстов ДНК имеет одинаковое строение навсем протяжении молекулы. Он состоит изостатков дезоксирибозы, связанных фосфо-диэфирными мостиками. 3'-гидроксильнаягруппа остатка сахара одного дезоксирибо-нуклеотида соединена с 5'-гидроксильной

6Часть IV.Информация

группой соседнего сахара фосфодиэфирнойсвязью. Вариабельной в ДНК является по-следовательность оснований. ДНК содер-жит четыре типа оснований: два пури-новых основания - аденин (А) и гуанин (G);два пиримидиновых основания - тимин (Т)и цитозин (С). Строение цепи ДНК показа-но на рис. 24.2.

Строение ДНК можно изобразить и бо-лее кратким путем. В этом случае для обо-значения четырех основных нуклеотидовиспользуются следующие символы:

Вертикальные линии в приведенных сим-волах соответствуют остаткам сахара,буквы A, G, С и Т - основаниям. Диаго-нальная линия с символом (на схеме,приведенной ниже), обозначает фосфоди-эфирную связь. Эта диагональная линиясоединяет конец одной вертикальной ли-нии с серединой другой. Точки соедине-ния соответственно означают 5'-ОН- и3'-ОН-группы. В приведенном ниже приме-ре символ указывает, что дезоксиаде-нилат связан с дезоксицитидином фосфо-диэфирным мостиком. 3'-ОН-группа дезок-сиаденилата присоединена к 5'-ОН-группедезоксицитидина через фосфорильную груп-пу:

Предположим теперь, что с дезоксицити-дином этого динуклеотида связан дезокси-гуанилат. Соответствующий тринуклеотидможно представить следующим образом:

Сокращенное обозначение этого трину-клеотида - pApCpG или ACG.

Глюкуронат Глюкоза Глюкуронат Глюкоза

Цепь ДНК характеризуется поляр-ностью. Один конец цепи несет 5'-ОН-группу, а другой - 3'-ОН-группу, которая несвязана с другим нуклеотидом. Согласнопринятым сокращениям, символ ACG оз-начает, что свободная 5'-ОН-группа при-надлежит дезоксиаденозину, а свободная3'-ОН-группа - дезоксигуанозину. Итак, по-следовательность оснований пишется в на-правлении 5'—>3'. Напомним, что амино-кислотная последовательность белка пи-шется в направлении от N-концевой ами-нокислоты к С-концевой аминокислоте.Следует отметить, что ACG и GCA - раз-ные соединения, точно так же, как Glu-Phe-Ala отличается от Ala-Phe-Glu.

24.2. Трансформация пневмококковс помощью ДНК показала, что генысостоят из ДНКБактерии пневмококки сыграли важнуюроль в открытии генетической функцииДНК.

Пневмококки обычно окружены слизи-стой блестящей полисахаридной капсулой.Этот наружный слой имеет существенноезначение для проявления патогенности

бактерий. Они вызывают пневмонию у че-ловека и других чувствительных млекопи-тающих. Мутанты, лишенные полисаха-ридной оболочки, не патогенны. Бактериидикого типа обозначают буквой S (от англ.smooth - гладкий), так как они образуютгладкие колонии, а мутантные бактерии, неимеющие капсулы,- буквой R (от англ.rough - шероховатый), так как они обра-зуют шероховатые колонии. У однойгруппы R-мутантов отсутствует ферментдегидрогеназа, превращающий UDP-глю-козу в UDP-глюкуронат. Фермент необхо-дим для синтеза капсульного полисахари-да, который у этих пневмококков состоитиз чередующейся последовательностиостатков глюкозы и глюкуроната:

В 1928 г. Фред Гриффит (Fred Griffith)обнаружил, что непатогенный R-мутантможно трансформировать в патогеннуюS-форму следующим путем. Он инъециро-вал мышам смесь живых бактерий R-формы и убитых нагреванием пневмокок-ков S. Поразительное открытие Гриффитасостояло в том, что эта смесь вызывалагибель мышей, хотя ни живые R-пневмо-кокки, ни убитые нагреванием S-пневмо-кокки мышей не убивали. Кровь погибшихмышей содержала живые S-пневмококки.Следовательно, убитые нагреванием S-пневмококки каким-то образом трансфор-мировали живые R-пневмококки в живыеS-пневмококки. Это изменение было ста-бильным: трансформированные пневмо-кокки давали патогенное потомствоS-формы. Затем было установлено, что та-кая трансформация R—>S может происхо-дить in vitro. Некоторые клетки в растущейкультуре R-формы трансформировалисьв S-форму при добавлении бесклеточногоэкстракта убитых нагреванием пневмокок-ков S. Это открытие заложило основу для

24. ДНК: генетическая роль,структура и репликация 7

Рис. 24.1. Схема структуры ДНК. Саха-рофосфатный остов показанчерным цветом, а пуриновыеи пиримидиновые основанияразноцветные. (Kornberg A.,The synthesis of DNA; ScientificAmerican, Inc., 1968.)

изучения химической природы трансфор-мирующего начала.

Исследователи стали фракционироватьбесклеточный экстракт убитых нагрева-нием пневмококков S и определять транс-формирующую активность его компонен-тов (рис. 24.3). В 1944 г. Освальд Эйвери,Колин Мак-Леод и Маклин Мак-Карти(Oswald Avery, Colin MacLeod, MaclynMcCarty) опубликовали результаты своейработы. Оказалось, что «нуклеиновая кис-лота дезоксирибозного типа - основное дей-ствующее начало трансформирующего эк-стракта пневмококка типа III.» Экспери-ментальные доказательства этого заключе-ния состояли в следующем: 1) при эле-ментном химическом анализе очищенного,высокоактивного трансформирующего на-


чала результат был близок к расчетномудля ДНК; 2) оптические, электрофоретиче-ские свойства, поведение при ультрацен-трифугировании и диффузия очищенногоматериала соответствовали свойствамДНК; 3) при экстрагировании белков илилипидов не происходило потери трансфор-мирующей активности; 4) трипсин и химо-трипсин не влияли на трансформирующуюактивность; 5) рибонуклеаза (которая, какизвестно, гидролизует рибонуклеиновуюкислоту) не влияла на трансформирующееначало; 6) при добавлении дезоксирибону-клеазы трансформирующая активность, на-оборот, терялась.

Эта работа - памятная веха в историибиохимии. До 1944 г. считалось, что гене-тическую информацию несут хромосомныебелки, а ДНК играет вторичную роль. Та-кая преобладающая точка зрения была ре-шительно опровергнута открытием строгодоказанного факта, что очищенная ДНКобладает генетической специфичностью.В 1943 г. Эйвери (Avery) живым языкомописал это исследование и его последствия

Рис. 24.2. Строение одной цепи ДНК.Показана часть цепи.

Рис. 24.3. Трансформация непатогенногопневмококка R (мелкие коло-нии) и возникновение патоген-ного пневмококка S (крупныеблестящие колонии) под дей-ствием ДНК из убитых нагре-ванием пневмококков S.[Avery О. Т., MacLeod С. М.,McCarty M., J. Exp. Med., 79,158 (1944).]

в письме, направленном брату в другойуниверситет (рис. 24.4).

Новое подтверждение генетической ро-ли ДНК было получено при изучении од-ного вируса (бактериофага), заражающегоЕ. coli. Бактериофаг Т2 состоит из сердце-вины (ДНК), заключенной в белковую обо-лочку. В 1951 г. Роджер Херриот (RogerHerriott) предположил, что «вирус, очевид-но, действует, как крошечный шприц дляподкожных инъекций, наполненный транс-формирующим началом; вирус как тако-вой никогда не проникает в клетку; толькоотросток вступает в контакт с клеткой-хо-

зяином и, возможно, ферментативно про-делывает небольшое отверстие в наружноймембране (рис. 24.5). Затем нуклеиноваякислота из головки вируса перетекаетвнутрь клетки». Чтобы проверить этопредположение Альфред Херши и МартаЧейз (Alfred Hershey, Martha Chase) поста-вили следующий опыт. Фаговую ДНК по-метили радиоактивным изотопом 32Р,а белковую оболочку - изотопом 35S. Этиметки весьма специфичны, так как ДНК несодержит серы, а в белковой оболочке нетфосфора. Культуру Е. coli заразили поме-ченным фагом, который за непродолжи-тельное время инкубации прикреплялсяк бактерии. Суспензию обрабатывали в те-чение нескольких минут в гомогенизатореУоринга при 10000 об/мин. В этих усло-виях зараженные фагом клетки подверга-лись воздействию значительных сил сдви-га, которые разрушали связи между виру-сами и бактериями. Затем суспензию цен-трифугировали, чтобы осадить бактерии надно пробирки. Полученный осадок содер-жал зараженные бактерии, а надосадочнаяфракция - более мелкие частицы. Исследуясодержание 32Р и 35S в осадке и надоса-дочной фракции, определяли локализациюфаговой ДНК и белка оболочки. В ре-зультате были получены следующиеданные.

1. Большая часть фаговой ДНК обнару-живалась в бактериях.

2. Большая часть фагового белка обна-руживалась в надосадочной фракции.

3. Обработка в гомогенизаторе почти невлияет на способность зараженных бакте-рий продуцировать вирусное потомство.

Дополнительные эксперименты показа-ли, что менее 1% 35S было перенесено изродительских фаговых частиц фаговомупотомству; 30% родительской 32Р-метки,наоборот, обнаруживалось в потомстве.Эти простые, убедительные экспериментыпоказали, что фаг Т2 можно физическиразделить на генетическую и негенетиче-скую части... Серусодержащий белок по-коящихся фаговых частиц содержитсятолько в защитной оболочке, котораяобеспечивает прикрепление фаговой ча-стицы к бактериальной клетке и функцио-нирует в качестве приспособления для вве-дения фаговой ДНК в клетку. Этот белок,возможно, не несет никакой функции, необ-


В течение последних двух лет, вначале с Мак-Леодом, а в настоящее время с д-ром Мак-Кар-ти, я пытаюсь выяснить, какова химическая природа того вещества в бактериальных экстрак-тах, которое вызывает это специфическое изменение. В неочищенном экстракте бактерий типаIII полно капсульных полисахаридов, углевода С (соматического), нуклеопротеинов, свободных ну-клеиновых кислот дрожжевого и тимусного типа, липидов и других клеточных компонентов. По-пробуй найти в таких сложных смесях активное начало! Попробуй выделить и химически иден-тифицировать именно то вещество, которое само, придя в соприкосновение с R-клетками типа II,заставляет их вырабатывать капсульный полисахарид типа III и приобрести все аристократиче-ские особенности того самого типа клеток, из которых был приготовлен экстракт! Вот это ра-бота, полная проблем и неожиданных затруднений. Но, ВОЗМОЖНО, мы наконец достиглисвоего.

...Если окажется, что мы правы - а это, разумеется, очень весомое «если»,- тогда можно счи-тать, что нам известна и химическая природа индуцирующего начала, и химическая структуравещества, которое в результате образуется. Первое - это тимусная нуклеиновая кислота, вто-рое - полисахарид типа III. Оба они впоследствии воспроизводятся в дочерних клетках, и через бес-численное множество переносов без повторного добавления индуцирующего агента можно выде-лить то же самое активное и специфичное трансформирующее начало в количестве, значительнопревышающем то, которое было использовано в самом начале для индуцирования реакции. Этонапоминает вирус. Возможно, это - ген. Но механизм явления меня сейчас не интересует. Всемусвое время, и первым шагом должно быть выяснение химической природы трансформирующегоначала. Остальные вопросы пусть решает кто-нибудь еще. Конечно, с каждым шагом работаобрастает трудностями. Она затрагивает биохимию нуклеиновых кислот тимусного типа, ко-торые, как известно, составляют основную часть хромосом, но которые до сих пор считалисходными независимо от их происхождения. Она затрагивает генетику, энзимологию, клеточныйметаболизм и синтез углеводов. Но сегодня, только располагая множеством надежно обосно-ванных данных, можно убедить кого бы то ни было в том, что натриевая соль дезоксирибознойнуклеиновой кислоты, свободная от белка, могла бы обладать специфической биологической ак-тивностью. Именно такие данные мы и пытаемся теперь получить. Тут хватает всяких весе-леньких неожиданностей, чтобы пойти на дно, но разумнее справиться с ними самому, преждечем кто-нибудь другой попытается это сделать.

Рис. 24.4. Из письма Освальда Эйверибрату Рою, написанного в мае1943 г. (Из статьи HotchkissR. D. In: Phage and the Origin ofMolecular Biology, J. Cairns,S. Stent, eds., Cold SpringHarbor Laboratory, 1966, pp.185-186.)

ходимой для роста фаговых частиц внутриклетки. ДНК же выполняет какую-то функ-цию в размножении фага. Представленныеэксперименты не позволяют сделать болеедалеко идущие выводы относительно хи-мической природы наблюдаемых явлений».

Осторожный тон этого вывода не дол-жен умалять его значения. Вскоре генети-ческая роль ДНК стала общепризнанной.Эксперименты Херши и Чейз убедительноподтвердили факты, открытые восемью го-дами раньше Эйвери, Мак-Леодом и Мак-Карти на другой системе. Дополнительныедоказательства были получены при иссле-довании содержания ДНК в отдельныхклетках. Они показали, что для данноговида содержание ДНК одинаково во всех


клетках с диплоидным набором хромосом.Гаплоидные клетки имеют вполовину мень-ше ДНК.

24.3. Гены некоторых вирусов состоятиз РНКГены всех прокариотических и эукариоти-ческих организмов построены из ДНК,гены вирусов - из ДНК или из РНК. Вирустабачной мозаики, заражающий листья

Рис. 24.5. Схема бактериофага Т2, вводя-щего свою ДНК в бактериаль-ную клетку. (Wood W.B.,Edgar R.S., Building a BacterialVirus, Scientific American. Inc.,1967.)

растений табака,- один из наиболее изу-ченных РНК-содержащих вирусов. Онобразован одной молекулой РНК, окру-женной белковой оболочкой из 2130 одина-ковых субъединиц (обсуждение структурыи сборки вирусов см. в гл. 30). Обработаввирус фенолом, можно отделить белок отРНК. Изолированная вирусная РНК инфек-ционна, тогда как изолированный белок ли-шен инфекционности. Использование син-тетических гибридных вирусных частицеще раз показало, что генетическая специ-фичность вируса заключается только в егоРНК. Существует множество штаммов ви-руса табачной мозаики. Был получен син-тетический гибридный вирус из РНКштамма 1 и белка штамма 2. Другой такойвирус был приготовлен из РНК штамма2 и белка штамма 1. После зараженияклетки гибридным вирусом вирусное по-томство всегда состояло из РНК и белка,соответствующих специфичности РНК ги-бридного вируса, использованного для зара-жения.

24.4. Двойная спираль ДНК Уотсона-Крика

В 1953 г. Джеймс Уотсон и Френсис Крик(James Watson, Francis Crick) установилитрехмерную структуру ДНК и сразу жепредложили возможный механизм ее ре-пликации. Это блестящее достижениестоит в ряду важнейших событий в исто-рии биологии, так как оно открыло путьк пониманию функции гена на молекуляр-ном уровне. Уотсон и Крик проанализиро-вали картины дифракции рентгеновскихлучей на нити ДНК (рис. 24.6), полученныеРозалиндой Франклин и Морисом Уилкин-сом (Rosalind Franklin, Maurice Wilkins),и предложили структурную модель, кото-рая в основных своих чертах оказаласьверной. Характерные особенности этой мо-дели сводятся к следующему.

1. Две спиральные полинуклеотидныецепи закручены вокруг общей оси. Цепинаправлены в противоположные стороны(рис. 24.7).

2. Пуриновые и пиримидиновые основа-ния расположены внутри спирали, а остат-ки фосфата и дезоксирибозы - снаружи(рис. 24.8). Плоскости оснований перпенди-кулярны оси спирали. Плоскости остатковсахара расположены почти под прямымуглом к основаниям.

3. Диаметр спирали 20 А. Расстояние

Межплоскостное расстояние 3,4 А

Рис. 24.6. Фотография дифракции рент-геновских лучей на влажной ни-ти ДНК (В-форма). Крест в се-редине картины характерен дляспиральной структуры. Интен-сивные меридианальные ре-флексы возникают в результа-те дифракции на стопке пароснований, расположенных нарасстоянии 3,4 А друг от друга.(Печатается с любезного разре-шения д-ра Maurice Wilkins.)

между соседними основаниями вдоль осиспирали 3,4 А, они повернуты относитель-но друг друга на 36°. Таким образом, наодин виток спирали каждой из цепей при-ходится 10 нуклеотидов, что соответствует34 А.

4. Две цепи удерживаются вместе водо-родными связями между парами основа-ний. Аденин всегда спаривается с тимином,гуанин - с цитозином (рис. 24.9 и 24.10).

5. На последовательность основанийв полинуклеотидной цепи не накладывает-ся никаких ограничений. Определенная по-следовательность оснований несет кон-кретную генетическую информацию.

Важнейшее свойство двойной спирали -специфичность спаривания оснований. Ис-ходя из стерических ограничений и способ-ности к образованию водородных связей,Уотсон и Крик постулировали, что аденин


Формы ДНК -А-форма ДНК: двухспиральная ДНК, содержащая примерно 11 остатков наодин оборот спирали. В этой правозакрученной спирали плоскости пар осно-ваний повернуты примерно на 20° относительно перпендикуляра к оси спира-ли. Образуется при дегидратации В-формы ДНК.В-форма ДНК: классическая уотсон-криковская двойная спираль, содержащаяпримерно 10 остатков на один оборот спирали. В этой правозакрученной спи-рали плоскости пар оснований перпендикулярны оси спирали.Z-форма ДНК: левозакрученная двухспиральная форма ДНК, содержащаяоколо 12 остатков на один оборот. Эта структура предложена АлександромРичем (Alexander Rich) и его сотрудниками на основе изучения кристалличе-ской структуры d(CG)3.

должен спариваться с тимином, а гуа-нин - с цитозином. Стерические ограниче-ния на расположение основания обуслов-

Рис. 24.7. Схема модели двухспиральнойДНК. Вся структура повто-ряется через 34 А, что соответ-ствует 10 остаткам в каждойцепи.


лены периодическим строением спираль-ной структуры сахарофосфатного остоваобеих полинуклеотидных цепей. Глико-зидные связи, которыми присоединяетсяк остову пара оснований, отстоят друг отдруга на расстояние 10,85 А (рис. 24.11).Пара пиримидин—пурин прекрасноукладывается в это пространство. В то жевремя для двух пуринов этого расстояниянедостаточно. Для двух пиримидинов мес-та более чем достаточно, но они оказалисьбы слишком далеко друг от друга, чтобыобразовать водородные связи. Следова-

Рис. 24.8. Схема одной из цепей двойнойспирали ДНК (вид по оси спи-рали). Основания - в данномслучае только пиримидины -расположены внутри, а сахаро-фосфатный остов - снаружи.Отчетливо видно, что структу-ра имеет ось симметрии деся-того порядка. Основания обо-значены зеленым цветом, саха-ра - красным.

Рис. 24.9. Модель пары оснований аде-нин—тимин.

Рис. 24.10. Модель пары основании гуа-нин—цитозин.

Рис. 24.11. Наложение АТ-пары основа-ний (обозначена желтым цве-том) на GС-пару (обозначенасиним цветом). Обратите вни-мание, что положения глико-зидных связей и С'-1 атома де-зоксирибозы (обозначен зе-леным) в двух типах пароснований почти одинаковы.


Рис. 24.12. Модель двухспиральной моле-кулы ДНК. Показаны три парыоснований. Обратите внима-ние, что две цепи ориентиро-ваны в противоположном на-правлении.

тельно, одно из оснований в паре в двой-ной спирали ДНК всегда должно быть пу-рином, а другое - пиримидином. Крометого, на спаривание оснований наклады-вают ограничения правила образованияводородных связей. Атомы водорода в пу-риновых и пиримидиновых основаниях за-нимают вполне определенные положения.Аденин не может спариваться с цитозином,так как тогда на месте одной связи оказа-лось бы два атома водорода, а на местедругой - ни одного. Точно так же гуанин неможет связываться с тимином. Аденин, на-оборот, образует с тимином две водо-родные связи, а гуанин - три водородныесвязи с цитозином (рис. 24.9 и 24.10).Ориентация этих водородных связей и рас-стояние между ними оптимальны длясильного взаимодействия между основа-ниями.

Эта схема спаривания оснований получи-ла убедительное подтверждение в резуль-


тате проведенных ранее исследований ну-клеотидного состава ДНК разных видов.В 1950 гг. Эрвин Чаргафф (Erwin Chargaff)обнаружил, что соотношение аденина с ти-мином и гуанина с цитозином у всех иссле-дованных видов было близко к 1. Значениеэтого факта оставалось неясным, пока небыла предложена модель Уотсона-Крика(рис. 24.12 и 24.13). Только тогда стало по-нятным, что эта закономерность отражаетважнейшее свойство структуры и функцииДНК - специфичность спаривания основа-ний.

24.5. Комплементарные цепи служатматрицами друг для д р у г апри репликации ДНКМодель двухспиральной молекулы ДНКпозволила сразу же предложить механизмрепликации ДНК. Уотсон и Крик опубли-ковали свою гипотезу через месяц послетого, как представили модель структурыДНК в виде прекрасной статьи, отличав-шейся простотой и ясностью.

«Если задан определенный порядок ос-нований в одной из цепей, можно напи-сать точную последовательность основа-ний в другой цепи, поскольку спариваниеспецифично. Таким образом, каждая изцепей комплементарна другой цепи,и именно это свойство подсказывает, ка-ким образом может удваиваться молеку-ла дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Прежние дискуссии о самоудвоениивсегда опирались на представление о не-кой матрице или каком-то шаблоне.Предполагалось, что матрица копируетнепосредственно самое себя, или должнаобразовывать «негатив», который в своюочередь действует в качестве матрицыи образует исходный «позитив». Нив одном случае не было предложено де-тального объяснения, как это могло быпроисходить на уровне атомов и моле-кул.

В нашей модели дезоксирибонуклеино-вой кислоты имеется, по существу, параматриц, причем каждая из них компле-ментарна другой. Мы полагаем, чтоперед удвоением водородные связи раз-рываются и две цепи раскручиваютсяи расходятся. Затем каждая цепь исполь-зуется в качестве матрицы для образова-ния на ней новой комплементарной цепи,так что в конце концов у нас будет двепары цепей, тогда как раньше былатолько одна. Более того, при таком спо-собе репликация последовательность пароснований будет в точности удвоена».

24.6. Репликация ДНК полуконсервативнаУотсон и Крик предположили, что одна изцепей каждой дочерней молекулы ДНКсинтезируется заново, а другая происходитот родительской молекулы ДНК. Такоераспределение атомов родительской моле-кулы называют полуконсервативным.Метью Меселсон и Франклин Сталь(Matthew Meselson, Franklin Stahl) постави-ли принципиально важный экспериментдля проверки этой гипотезы. Родитель-скую ДНК пометили тяжелым изотопомазота 15N, чтобы сделать ее более тяже-лой, чем обычная ДНК. Для этого выра-щивали Е. coli в течение многих поколенийв среде, содержавшей в качестве единствен-ного источника азота 15NH4Cl. Затем бак-терии быстро переносили в среду, содер-жавшую 14N-стабильный изотоп азота.Этот эксперимент должен был показать,как распределяются изотопы 14N и I 5Nв молекулах ДНК в ходе последующихциклов репликации.

Распределение 14N и 15N в потомствеизучали с помощью только что разрабо-танного метода равновесной седиментациив градиенте плотности. Небольшое коли-чество ДНК растворяют в концентриро-ванном растворе хлористого цезия с плот-

Рис. 24.13. Пространственная модельдвойной спирали ДНК. Отчет-ливо видны большая бороздка(показана красным цветом)и малая бороздка (показана си-ним цветом). Обратите внима-ние, что часть каждого основа-ния доступна для взаимодей-ствия с другими молекулами.(Печатается с любезного разре-шения д-ра Sung-Hou Kim.)

ностью, близкой к плотности ДНК( ~ 1 , 7 г/см3). Этот раствор центрифуги-руют почти до равновесного состояния.Под действием противодействующих про-цессов седиментации и диффузии в центри-фужной ячейке возникает градиент концен-трации хлористого цезия. В результатесоздается устойчивый градиент плотностиот 1,66 до 1,76 г/см3. Под действием цен-тробежной силы молекулы ДНК переходятв ту область градиента, в которой плот-ность раствора равна их собственной пла-вучей плотности. Высокомолекулярная


Рис. 24.14. Разделение 14N- и 15N-ДНКпри центрифугировании в гра-диенте плотности. А - фото-графия центрифужной ячейкив ультрафиолетовом свете;Б - денситометрическая криваяпоглощения, полученная присканировании фотографии,приведенной на рис. А.[Meselson M., Stahl F. W., Proc.Nat. Acad. Sci., 44, 671 (1958).]

ДНК образует четко выраженную полосу,обнаруживаемую по поглощению ультра-фиолетового света. Молекулы 14N-ДНК и15N-ДНК хорошо разделяются в такомградиенте, поскольку их плотность разли-чается примерно на 1% (рис. 24.14).

ДНК выделяли из бактерий через раз-личные промежутки времени после перено-са со среды, содержащей 15N, на 14N. Ана-лиз этих образцов центрифугированиемв градиенте плотности показал, что послеодного цикла репликации ДНК дает однуполосу (рис. 24.15). Плотность этой полосыбыла равна в точности среднеарифметиче-скому значению между плотностью 14N- и15N-ДНК. Отсутствие 15N-ДНК свиде-тельствовало о том, что целостность ро-дительской ДНК в ходе репликации нару-шается. Отсутствие 14N-ДНК показывало,что часть атомов всех дочерних молекулДНК происходила от родительской ДНК.Соотношение 14N и 15N в дочерних моле-кулах должно составлять 1:1, так как плот-ность гибридных молекул ДНК была сред-ней между 14N- и 15N-ДНК.

После двух циклов репликации ДНКраспределялась поровну в двух полосах.Одна из них - гибридная ДНК,другая - 14N-ДНК. Меселсон и Стальсделали из этих убедительных эксперимен-


тов вывод, «что азот молекул ДНК рас-пределяется поровну между двумя физиче-ски раздельными структурами, что послеудвоения каждая дочерняя молекула полу-чает одну из этих структур и что этиструктуры сохраняются интактнымив течение многих удвоений». Полученныерезультаты прекрасно согласовывалисьс моделью репликации ДНК Уотсона—Крика (рис. 24.16).

24.7. Некоторые вирусы содержатна определенных стадиях жизненного циклаодноцепочечную ДНКДНК не всегда двухцепочечная молекула.Роберт Синсхеймер (Robert Sinsheimer) об-наружил, что ДНК фага φ Х 1 7 4 , небольшо-го вируса, заражающего Е. coli,- одноцепо-чечная молекула. Несколько эксперимен-тальных фактов привели его к этомунеожиданному выводу. Во-первых, соотно-шение оснований в ДНК фага φХ174 неудовлетворяет правилу [А] = [Т] и [G] == [С]. Во-вторых, вязкость раствора ДНК

фага φХ174 значительно меньше вязкостираствора ДНК Е. coli той же концентра-ции. Гидродинамические свойства ДНКфага φХ174 соответствуют полимерув конформации случайного клубка. В отли-чие от этого ДНК в форме двойной спира-ли ведет себя гидродинамически как оченьжесткая палочка. В-третьих, аминогруппыоснований ДНК фага φХ174 легко реаги-руют с формальдегидом, тогда как основа-ния в двойной спирали ДНК почти недо-ступны для этого реактива.Обнаружение этой одноцепочечной ДНКпородило сомнения в универсальностисхемы полуконсервативной репликации,предложенной Уотсоном и Криком. Одна-ко вскоре было показано, что ДНК фагаφХ174 находится в одноцепочечном со-стоянии только на протяжении части жиз-ненного цикла вируса. Синсхеймер обнару-жил, что зараженные клетки Е. coli содер-жат двухцепочечную форму ДНК фага

Рис. 24.15. Доказательство полуконсерва-тивной репликации в клетках Е.coli с помощью центрифугиро-вания в градиенте плотности.Положение полосы ДНК зави-сит от содержания 14N и 15N.После 1,0 генерации все моле-кулы ДНК представляют со-бой гибриды, содержащие рав-ное количество 14N и l 5N.Родительская ДНК (1 5N) после1,0 генерации не обнаруживает-ся. [Meselson M., Stahl F.W.,Proc. Nat. Acad. Sci., 44, 671(1958).]

φ Х 1 7 4 . Эта двухцепочечная ДНК назы-вается репликативной формой, так как онаслужит матрицей для синтеза ДНК вирус-ного потомства. Вирусы, содержащиеодноцепочечную РНК, также реплици-

Рис. 24.16. Схема полуконсервативной ре-пликации. Родительская ДНКизображена зеленым, а ново-синтезированная - красным.[Meselson M., Stahl F.W., Proc.Nat. Acad. Sci, 44, 671 (1958).]


Рис. 24.17. Электронная микрофотогра-фия частиц вируса φХ174. (Пе-чатается с любезного разреше-ния д-ра Robley Williams.)

руются через промежуточную двухцепочеч-ную репликативную форму. Механизмыэтих процессов подробнее рассматривают-ся в гл. 30. Здесь же важно лишь подчерк-нуть, что эти исследования подтвердиливсеобщность схемы репликации Уотсона—Крика. Двухцепочечная ДНК (илиРНК) - репликативная форма всех из-вестных генов.

24.8. Молекулы ДНК очень длинныеПрежде чем перейти к механизму реплика-ции ДНК, представляющему собойсложный ферментативный процесс, рассмо-трим некоторые свойства ДНК. Порази-тельная особенность молекул ДНК, встре-чающихся в природе,- их необычайная дли-на. Хромосома Е. coli представляет собойединую молекулу двухспиральной ДНК, со-держащей 4 млн. пар оснований. Массаэтой молекулы ДНК 2,6•106 кДа. Онаимеет крайне асимметричную форму: ееконтурная длина 14•106 А, а диаметр 20 А.Контурная длина (1,4 мм) этой молекулыДНК соответствует размерам макроскопи-


ческих структур, а диаметр 20 А находитсяна уровне атомных размеров. Бруно Зимм(Bruno Zimm) показал, что самая большаяхромосома у Drosophila melanogaster содер-жит единую молекулу ДНК, состоящую из6,2•107 пар оснований. Контурная длинаэтой молекулы 2,1 см. Столь асимме-тричные молекулы ДНК весьма чувстви-тельны к разрыву под действием сил сдви-га. Они легко разрываются на фрагменты,масса которых в 1000 раз меньше, чем мас-са исходной молекулы, если при манипуля-циях с ней не принимаются особые мерыпредосторожности.

Изображения молекул ДНК многих бак-терий и вирусов были непосредственно по-лучены с помощью электронного микро-скопа (рис. 24.18). Размеры некоторых та-ких молекул ДНК приведены в табл. 24.1

Следует отметить, что даже самые ма-ленькие молекулы ДНК имеют весьма вы-тянутую форму. Например, ДНК вирусаполиомы содержит 5100 пар основанийи имеет контурную длину 1,7 мкм (17000А). Напомним, что диаметр молекулы ге-моглобина составляет 65 А, а длина колла-гена, одного из самых длинных бел-ков,- 3000 А. Это сравнение подчеркиваетогромную длину и выраженную асимме-трию молекул ДНК.

Рис. 24.18. Электронная микрофотогра-фия молекулы ДНК бактерио-фага λ (форма RFII). (Печатает-ся с любезного разрешенияд-ра Thomas Broker.)

Для измерения длин молекул нуклеиновых кислот применяется единицадлины, равная 1000 пар нуклеотидов в случае двухцепочечных молекул ну-клеиновых кислот (т.п.н., или kb - от англ. kilobase) или 1000 нуклеотидовв случае одноцепочечных молекул (т.н., или kb). 1 kb двухцепочечной ДНКимеет контурную длину 0,34 мкм и массу примерно 660 кДа.

24.9. Двойная спираль может быть обратиморасплавлена

Две цепи ДНК-спирали могут легко ра-зойтись, если разрушить водородные свя-зи, соединяющие спаренные основания.Этого можно достичь, либо нагревая рас-твор ДНК, либо добавляя в раствор кисло-ту или щелочь для ионизации оснований.Раскручивание двойной спирали называет-ся плавлением, так как происходит мгно-венно при строго определенной температу-ре. Температура плавления (Тпл) - это татемпература, при которой разрушается по-ловина спиральной структуры. Резкостьэтого перехода показывает, что двойнаяспираль ДНК - структура высококоопера-тивная. Плавление ДНК легко регистриро-вать, измеряя ее поглощение при 260 нм.Нарушение межплоскостных взаимодей-ствий пар оснований приводит к увеличе-нию поглощения - эффект, называемый ги-перхромизмом (рис. 24.19).

Температура плавления молекулы ДНКсущественно зависит от ее нуклеотидногосостава. Молекулы ДНК, богатые GС-па-рами оснований, имеют более высокие зна-чения Тпл, чем молекулы, богатые АТ-па-рами оснований (рис. 24.20). В общем Тпл

Таблица 24.1. Размеры некоторых молекул ДНК(Kornberg A., DNA replication, W. H. Freeman and Co.,1980, p. 20)

Организм

Вирусы

Полиома или SV-40Фаг λФаг Т2Вирус коровьей оспы

Бактерии

МикоплазмаE.coli

Эукариоты

ДрожжиДрозофилаЧеловек

Число пароснований,kb

5,148,6

166190

7604000

13500165000

2900000

Контурнаядлина, мкм

1,7175665

2601 360

460056000

990000

Рис. 24.19. При плавлении двойной спира-ли, когда она переходит в одно-цепочечную форму, поглоще-ние раствора ДНК при 260 нмвозрастает.

Рис. 24.20. Кривые плавления различныхДНК. На графике отложено от-носительное поглощение при260 нм в зависимости от темпе-ратуры (поглощение при 25°Спринято за 1). Тпл равна 69°Сдля ДНК Е. coli (50% GС-пар)и 76°С для ДНК. P. aeruginosa(68% GС-пар).


Рис. 24.21. Электронная микрофотогра-фия молекулы ДНК, частичнорасплетенной под действи-ем щелочи. Одноцепочечныеучастки имеют вид петель, ко-торые окрашены менее интен-сивно, чем двухцепочечныеучастки. Эти расплетенныеучастки ДНК богаты АТ-пара-ми оснований. Один из них по-мечен стрелкой. [Inman R. В.,Schnos M., J. Mol. Biol., 49, 93(1970).]

ДНК многих видов повышается линейноот 77 до 100°С с увеличением содержанияGС-пар от 20 до 78%. GC-пары стабильнееАТ-пар, так как в них основания удержи-ваются вместе тремя водородными связя-ми, а не двумя. Следовательно, АТ-богатыеобласти ДНК должны плавиться первыми(рис. 24.21). Как мы увидим ниже, in vivoдвойная спираль расплетается под дей-ствием специальных белков. Некоторые изних вызывают раскручивание ДНК, гидро-лизуя АТР (разд. 24.21).

Разделенные комплементарные цепиДНК спонтанно реассоциируют с образо-ванием двойной спирали, если температурастановится ниже Тпл. Этот процесс ренату-рации иногда называют отжигом. Ско-рость реассоциации зависит от концентра-ции комплементарных последовательно-стей (разд. 29.10). Легкость, с которойплавятся и реассоциируют двойные спира-ли, имеет критическое значение для выпол-нения ДНК ее биологических функций.


24.10. Некоторые молекулы ДНК имеюткольцевую формуМетодом электронной микроскопии былопоказано, что интактные молекулы ДНКиз многих источников замкнуты в кольцо(рис. 24.18). Открытие того факта, что Е.coli имеет кольцевую хромосому, не былонеожиданностью. Оно было предсказанона основе генетических исследований, пока-завших, что карта генетического сцепленияэтой бактерии является кольцевой. Термин«кольцевая» означает лишь, что цепь ДНКнепрерывна, и отнюдь не относится к еегеометрической форме. In vivo молекулыДНК всегда имеют весьма компактнуюформу. В связи с этим следует отметить,что хромосома Е. coli примерно в 1000 раздлиннее, чем клетка бактерии.

Не все молекулы ДНК имеют кольце-вую форму. Например, ДНК бактериофагаТ7 является линейной. Молекулы ДНК не-которых вирусов, таких, как бактериофаг λ,претерпевают взаимопревращения линейнойи кольцевой форм. В вирусной частице при-сутствует линейная форма, а в клетке-хо-зяине - кольцевая (разд. 30.16).

24.11. Кольцевые двухспиральныемолекулы ДНК могут находитьсяв суперспирализованномсостоянииПри превращении линейной двухцепочеч-ной ДНК в замкнутую кольцевую молеку-лу она приобретает новое свойство. Дже-ром Виноград (Jerome Vinograd) установил,что ось двойной спирали ДНК может самабыть закручена в суперспираль. Эта супер-спираль может быть закручена в правуюили в левую сторону (рис. 24.22). Термины«суперспирализованная», «сверхскручен-

Рис. 24.22. Схематическое изображениерелаксированной (А) и супер-спирализованной (Б) ДНК.

ная», «суперспиральная», «суперскручен-ная» и «сверхспиральная» - синонимы.Кольцевую ДНК, совершенно лишеннуюсуперспиральных витков, называют релак-сированной. Для того чтобы превратить ре-лаксированную ДНК в суперспирализован-ную, необходимо затратить определеннуюэнергию. Например, энергия, затрачивае-мая на образование 15 суперспиральныхвитков в одной молекуле ДНК вирусаSV-40 (ее контурная длина 1,7 мкм), соста-вляет около 100 ккал/моль. Энергия напря-жения суперспирализованной ДНК (энер-гия суперспирализации) примерно пропор-циональна квадрату числа суперспи-ральных витков.

Суперспирализация, по-видимому, вы-полняет две биологические функции. Во-первых, суперспирализованная ДНК имеетболее компактную форму, чем релаксиро-ванная ДНК такой же длины (рис. 24.23).Суперспирализация может играть опреде-ленную роль в упаковке ДНК. Во-вторых,Суперспирализация может влиять на сте-пень расплетания двойной спирали и, сле-довательно, на ее взаимодействия с други-ми молекулами. Точнее, отрицательнаясуперспирализация может приводить к рас-кручиванию двойной спирали. Интересно от-метить, что почти все кольцевые молекулыДНК, встречающиеся в природе, отрица-тельно суперспирализованы.

Важная характеристика замкнутой коль-цевой ДНК - ее порядок зацепления L (отангл. linking). Число L указывает, сколькораз одна цепь пересекает другую цепь, еслиих спроецировать на плоскость. ЧислоL должно быть целым. Кручение Т (отангл. twisting) и величина суперспирализа-ции W (от англ. writhe) связаны между со-бой уравнением

L = W + Т,

т.е. находятся в обратной зависимости.Порядок зацепления - топологическая ха-

рактеристика; она может изменяться, лишькогда в одну или в обе цепи кольцевойДНК вносятся разрывы. Действительно,были выделены ферменты, которые ката-литически изменяют величину L. Катали-тическую активность таких топоизомеразлегко выявить с помощью гель-электрофо-реза, так как суперспирализованная ДНКболее компактна и поэтому имеет боль-шую подвижность, чем релаксированнаяДНК (рис. 24.24).

Рис. 24.23. Электронные микрофотогра-фии митохондриальной ДНК:А - релаксированная кольцеваяформа; Б - суперспирализован-ная кольцевая форма. (Печа-тается с любезного разрешенияд-ра David Clayton.)

24.12. Открытие ДНК-полимеразыПерейдем теперь к молекулярному меха-низму репликации ДНК. Артур Корнберг(Arthur Kornberg) и его коллеги в 1955 г.начали поиск фермента, синтезирующегоДНК. Вскоре этот поиск увенчался успе-хом, главным образом потому, что припланировании экспериментов были при-няты три правильных решения, т.е. былсделан правильный выбор между несколь-кими возможностями.

1. Что представляют собой активиро-ванные предшественники ДНК? Корнберги его коллеги сделали правильное предпо-ложение, что активированные промежу-точные продукты синтеза ДНК - дезоксири-бонуклеозид-5'-трифосфаты. В основе это-


Рис. 24.24. Фотографии гелей, на которыхвидна релаксация суперспира-лизованной ДНК вируса SV-40.Дорожка А - суперспирализо-ванная ДНК с большим чис-лом отрицательных витков.При инкубации ДНК с топои-зомеразой в течение 5 мин (Б)и 30 мин (В) образуется ряд по-лос с более низкой степенью су-перспирализации. [Keller W.,Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 2553(1975).]

го предположения лежали два соображе-ния. Во-первых, пути биосинтеза пуринови пиримидинов приводят к образованиюнуклеозид-5'-фосфатов (а не нуклеозид-3'-фосфатов). Во-вторых, активированнымпромежуточным продуктом синтеза пиро-фосфатной связи в таких коферментах, какNAD+, FAD и СоА, является АТР.

2. Что может служить критерием синте-за Д Н К ? Предполагалось, что абсолютноеколичество ДНК, синтезированной в пер-воначальных экспериментах, должно бытьвесьма невелико, главным образом из-заобилия нуклеаз. Поэтому нужен был ка-кой-то чувствительный тест. Был разрабо-тан такой тест с использованием радиоак-тивных нуклеотидов-предшественников.Включение этих предшественников в ДНКобнаруживали путем измерения радиоак-


тивности в осадке, полученном после обра-ботки инкубационной смеси кислотой. В ос-нове этого метода лежит тот факт, чтоДНК осаждается кислотами, напримертрихлоруксусной кислотой, а нуклеотиды-предшественники остаются в растворе.

3. Какие клетки следует выбрать для ис-следования? После того как первона-чальные эксперименты с экстрактами жи-вотных клеток дали отрицательные резуль-таты, выбор пал на бактерии Е. coli,поскольку деление этих клеток происходитвсего лишь за 20 мин (время генерации), и,следовательно, их можно выращиватьв больших количествах. Как и предполага-лось, эта бактерия исключительно богатаферментами, участвующими в синтезеДНК.

Экстракт Е. coli инкубировали с радиоак-тивным дезокситимидин-5'-трифосфатом.Радиоактивность этого 14С-меченногопредшественника составляла 1•106 имп./мин. Радиоактивность осадка, полученногодобавлением к инкубационной смеси кис-лоты, составляла всего 50 имп./мин. Былосинтезировано лишь несколько пикомолейДНК, но этим было положено начало.Корнберг писал: «Хотя количество нуклео-тида, включившегося в состав нуклеиновойкислоты, было ничтожным, оно было су-щественно выше уровня фона. Мы попро-бовали забить клин в эту узенькую щелку.

Рис. 24.25. Электронная микрофотогра-фия молекул ДНК-полиме-разы (сферические структуры),связанных с молекулой ДНК(тонкая нить). (Печатаетсяс любезного разрешения д-раJack Griffith.)

Рис. 24.26. Реакция элонгации цепи, ката-лизируемая ДНК-полимера-зой.

Молотком нам служила очистка фермен-та - метод, отработанный при изученииспиртового брожения».

Этот новый фермент был назван ДНК-полимеразой (рис. 24.25). Теперь его назы-вают ДНК-полимеразои I, так как с техпор были выделены другие ДНК-полиме-разы. После десяти лет напряженной ра-боты в лаборатории Корнберга ДНК-по-лимераза I была очищена до гомогенногосостояния и детально охарактеризована.Насколько велики были масштабы проде-ланной работы, говорит тот факт, что дляполучения 500 мг чистого фермента необ-ходимо было взять 100 кг клеток E.coli.

ДНК-полимераза I - это единая полипеп-тидная цепь с массой 109 кДа. Она катали-зирует последовательное присоединение де-зоксирибонуклеиновых звеньев к цепи ДНК:

(ДНК)n остатков +

+ dNTP (ДНК)n+1 + РРi

Для синтеза цепи ДНК ДНК-полимеразеI необходимы следующие компоненты:

1. В среде должны присутствовать всечетыре дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфа-та: dATP, dGTP, dTTP и dCTP. В дальней-шем мы будем обозначать эти дезоксири-бонуклеозидтрифосфаты общим символомdNTP. Кроме того, необходимы ионыМg2+.

2. ДНК-полимераза I присоединяет де-

зоксирибонуклеотиды к 3'-гидроксильномуконцу предсуществующей цепи ДНК (илиРНК). Другими словами, необходима за-травочная цепь, или затравка, со свобод-ной 3'-гидроксильной группой.

3. Необходима матричная ДНК. Матри-цей может служить как одно- так и двухце-почечная ДНК. Двухцепочечная ДНК слу-жит эффективной матрицей лишь в томслучае, если ее сахарофосфатный остовразорван в одном или нескольких местах.

Реакция элонгации (удлинения) цепи, ка-тализируемая ДНК-полимеразой, происхо-дит путем нуклеофильной атаки 3'-ОН-кон-цом матрицы ближайшего к рибозе атомафосфора очередного дезоксирибонуклеозид-трифосфата. В результате образуется фос-фодиэфирный мостик и одновременно выс-вобождается пирофосфат (рис. 24.26). По-следующий гидролиз пирофосфата обеспе-чивает дальнейшую полимеризацию. Такоесмещение общего состояния равновесиябыло бы невозможно, если бы активиро-ванными промежуточными продуктамислужили нуклеозиддифосфаты. Именнов этом мы усматриваем убедительнуюпричину преобладания нуклеозидтрифос-фатов по сравнению с дифосфатами в каче-стве активированных предшественниковв биосинтетических реакциях. Элонгацияцепи ДНК происходит в направлении 5'—>—>3' (рис. 24.27). За секунду одна молекулаДНК-полимеразы I присоединяет пример-но 10 нуклеотидов. Полимеризация процес-


Рис. 24.27. ДНК-полимеразы катализи-руют рост цепей ДНК в напра-влении 5'—>3'.

сивна, т. е. фермент присоединяет много ну-клеотидов, оставаясь связанным с однойматрицей.

24.13. ДНК-полимераза получаетинструкции от матрицыДНК-лолимераза катализирует образова-ние фосфодиэфирной связи только в томслучае, если основание очередного нуклео-тида комплементарно соответствующемуоснованию матричной цепи. Если же осно-вание очередного нуклеотида не образуетуотсон-криковской пары с соответствую-щим основанием матричной цепи, вероят-ность образования ковалентной связиочень низка. Следовательно, ДНК-полиме-раза - фермент, направляемый матрицей.Она была открыта первой из ферментовтакого типа.Ряд экспериментов доказывает, что ДНК-полимераза получает инструкции от ма-трицы.1. Первым доводом в пользу этого утвер-ждения послужил тот факт, что значи-тельный синтез ДНК идет только в при-сутствии всех четырех дезоксирибонуклео-зидтрифосфатов и матричной Д Н К ,2. ДНК-полимераза может включатьв ДНК некоторые аналоги оснований. На-пример, урацил или 5-бромурацил можетзамещать тимин. Гипоксантин может заме-щать гуанин. Способность аналогов заме-щать основания высоко специфична. Со-гласно правилу замещения, тот или инойаналог может включаться лишь при усло-вии, что он способен образовать уотсон-криковскую пару с основанием, комплемен-тарным замещаемому основанию. Так, ги-поксантин может замещать G (но не А, Т


и С), поскольку он образует подходящуюпару оснований с цитозином.

3. Нуклеотидный состав новосинтезиро-ванной ДНК зависит от характера ма-трицы, а не от относительного количествачетырех нуклеотидов-предшественников.Образующаяся ДНК имеет тот же нуклео-тидный состав, что и двухспиральная ма-тричная ДНК. Из этого следует, что поддействием ДНК-полимеразы реплицируют-ся обе цепи матричной ДНК.

4. Наиболее убедительным доводом слу-жат данные о том, что ДНК фага φХ174,реплицированная in vitro ДНК-полимера-зой I, полностью инфекционна. Следова-тельно, частота, с которой этот ферментделает ошибки, очень низка.

24.14. ДНК-полимераза I исправляетошибки в ДНКДНК-полимераза обладает еще одним ви-дом ферментативной активности: в опреде-ленных условиях она способна расщеплятьцепи ДНК. ДНК-полимераза постепенногидролизует цепь ДНК с 3'-гидроксильно-го конца. При этом отщепляются монону-клеотиды. Таким образом, ДНК-полимера-за I является также 3'—>5'-экзонуклеазой(рис. 24.28). Удаляемый нуклеотид должениметь свободный 3'-ОН-конец и не долженнаходиться в составе двойной спирали.Является ли такая экзонуклеазная актив-ность фермента нежелательным побочнымэффектом, или она каким-то образом уча-ствует в биологическом действии ДНК-по-лимеразы? Эксперименты с использова-нием химически синтезированных полину-клеотидов с некомплементарным остаткомна конце затравки показали, что 3'—>—>5'-экзонуклеазная активность выпол-няет в процессе полимеризации функцию ре-дактирования. Рассмотрим полимер, пока-занный на рис. 24.28, в котором последова-тельность остатков dT образует двойнуюспираль с более длинным полимером dA.На 3'-конце этой poly(dT)-последователь-ности имеется один остаток dC, который

не образует водородных связей, так как онне комплементарен dA. При добавленииДНК-полимеразы и dTTP этот некомпле-ментарный остаток dC отщепляется рань-ше, чем начинается присоединение остат-ков dT. Эксперименты с использованиеммножества различных синтетических поли-меров показали, что ДНК-полимеразаI всегда удаляет некомплементарныеостатки на конце затравки, прежде чемпродолжать полимеризацию. Если на конценаходится комплементарное основание ив среде присутствуют активированныепредшественники, гидролиза практическине происходит. Полимеризация предотвра-щает гидролиз с 3'-конца.

По всей вероятности, репликация ДНКидет с высокой точностью, так как спарива-ние оснований проверяется дважды. В техслучаях, когда пара оснований не вмещает-ся в двойной спирали, полимеризация обы-чно не идет. Однако, если на этом этапевсе-таки произойдет ошибка, она можетбыть исправлена раньше, чем будет при-соединен следующий нуклеотид. Такимобразом, ДНК-полимераза I проверяет ре-зультат каждого проведенного акта поли-меризации, прежде чем перейти к следую-щему.

Кроме того, ДНК-полимераза I можетгидролизовать ДНК, начиная с 5'-конца це-пи. Эта 5'—>3'-нуклеазная активность(рис. 24.29) существенно отличается от об-суждавшейся выше 3'—>5'-экзонуклеазнойактивности. Во-первых, расщепляемаясвязь должна находиться в двухспираль-ном участке. Во-вторых, может происхо-дить расщепление как концевой фосфодиэ-фирной связи, так и связи, расположеннойна расстоянии нескольких нуклеотидов от5'-конца (который может иметь свободнуюили фосфорилированную гидроксильнуюгруппу). В-третьих, 5'—>3'-нуклеазная ак-тивность увеличивается, если одновремен-но идет синтез ДНК. В-четвертых, ак-тивный участок 5'—>3'-нуклеазной актив-ности четко отделен от активных участковполимеризации и 3'—>5'-гидролиза. ДНК-полимеразу I можно расщепить протеоли-тическими ферментами на фрагмент с мас-сой 36 кДа, содержащий всю 5'—>—>3'-нуклеазную активность, и фрагментс массой 75 кДа, содержащий всю полиме-разную и всю 3'—>5'-экзонуклеазную ак-тивности. Таким образом, ДНК-полимера-за I содержит по меньшей мере два

Рис. 24.28. 3'—>5'-экзонуклеазная актив-ность ДНК-полимеразы I.

Рис. 24.29. 5'—>3'-нуклеазная активностьДНК-полимеразы I.

различных фермента в одной полипептид-ной цепи. 5'—>3'-нуклеаза дополняет 3'—>—>5'-экзонуклеазную активность, исправляяошибки другого рода. Например, 5'—>—>3'-нуклеаза участвует в вырезании пири-


Рис. 24.30. ДНК-лигаза катализирует со-единение двух цепей ДНК, вхо-дящих в состав одной двухспи-ральной молекулы.

Рис. 24.31. Ковалентный промежуточныйкомплекс фермент—AMP.

мидиновых димеров, образующихся приоблучении ДНК ультрафиолетом (разд.24.24). Более того, 5'—>3'-нуклеазная ак-тивность играет ключевую роль в самойрепликации ДНК (разд. 24.19).

24.15. ДНК-лигаза соединяетфрагменты ДНКДНК-полимераза I может присоединятьдезоксирибонуклеотиды к затравочной це-пи, но она не способна катализировать со-единение двух цепей ДНК или замыканиеодной цепи ДНК. Обнаружение кольцевойДНК указывало, что такой фермент дол-жен существовать. В 1967 г. в несколькихлабораториях одновременно была открытаДНК-лигаза - фермент, катализирующийобразование фосфодиэфирной связи междудвумя цепями ДНК (рис. 24.30). Ферментэтот активен при наличии свободнойОН-группы на 3'-конце одной цепи ДНК и


фосфатной группы на 5'-конце другой. Об-разование фосфодиэфирной связи междуэтими группами - эндергоническая реакция.Следовательно, для реакции соединения це-пей требуется источник энергии. У Е. coliи других бактерий эту роль выполняетN A D + , тогда как в клетках животных и за-раженных бактериофагом клетках даннаяреакция осуществляется за счет энергииАТР.

Заслуживает внимания и еще один ас-пект работы ДНК-лигазы: ДНК-лигаза неможет соединить две молекулы одноцепо-чечной ДНК. Цепи ДНК, соединяемыеДНК-лигазой, должны быть частью двух-цепочечной молекулы ДНК. Исследованиямодельных систем дают основание думать,что ДНК-лигаза образует фосфодиэфир-ную связь только в том случае, если вбли-зи от места разрыва имеется хотя бы не-сколько пар оснований. В действительно-сти ДНК-лигаза заделывает одноцепо-чечные разрывы в остове двухспиральнойДНК. Этот процесс необходим для нор-мального синтеза ДНК, для репарации по-врежденной ДНК и для сращивания(сплайсинга) цепей ДНК при генетическойрекомбинации.

Рассмотрим механизм этой реакции,установленный Робертом Леманом (RobertLehman). ATP или NAD+ вступают в реак-цию с ДНК-лигазой и образуют ковалент-ный комплекс фермент-AMP, в которомAMP связан с ε-аминогруппой лизиновогоостатка фермента фосфоамидной связью(рис. 24.31). Остаток AMP активирует фос-фатную группу на 5'-конце ДНК. Послед-няя стадия - нуклеофильная атака активи-рованного атома фосфора 3'-ОН-группой.В результате образуется фосфодиэфирнаясвязь и освобождается AMP. Движущаясила этой последовательности реакций - ги-дролиз пирофосфата, отщепляющегося приобразовании комплекса фермент—адени-лат. Таким образом, на образование фосфо-диэфирной связи в остове ДНК расходуют-

Рис. 24.32. Механизм реакции, катализи-руемой ДНК-лигазой.

ся две богатые энергией фосфатные связи.если источником энергии служит АТР.

24.16. Открытие ДНК-полимераз II и IIIМы видели, что ДНК-полимераза I можетсинтезировать и репарировать ДНК in vitro.Выполняет ли она эти функции in vivo? Во-прос вполне правомерный, так как ферментне всегда способен осуществлять in vivo туреакцию, которую он катализирует in vitro.Условия, существующие в клетке, могут от-личаться от условий, используемых при по-становке опытов in vitro, и, кроме того,в клетке могут присутствовать другие фер-менты. Действительно, в клетке E.coliимеются по меньшей мере две другие ДНК-полимеразы, названные полимеразами IIи III, которые были обнаружены примерночерез 15 лет после открытия ДНК-полиме-разы I. Чем же объясняется такое запазды-вание? Дело в том, что активность ДНК-по-лимераз II и III маскировалась высокойактивностью полимеразы I.

Ситуация изменилась в 1969 г., когда Пау-ла Де Лусия и Джон Кэрнс (Paula DeLucia,John Cairns) выделили мутантную формуE.coli, в экстракте которого обнаруживалосьот 0,5 до 1% нормальной полимеразной ак-тивности ДНК-полимеразы I по сравнениюс обычными клетками. Этот мутант (обо-значенный polA 1) размножался с такой жескоростью, как и родительский штамм.Кроме того, многие фаги размножалисьв клетках polA 1 так же хорошо, как и в ро-дительских клетках. Однако этот мутант го-раздо быстрее погибал под действием уль-трафиолетового облучения. К тому жемутант polA 1 был более чувствителен к ле-тальному действию химического мутагенаметилметансульфоната. Де Лусия и Кэрнссделали вывод, что репликация ДНК в клет-ках полученного ими мутанта polA 1 идетнормально, но репарация ДНК существеннонарушена. Они предположили, что для син-

теза ДНК нужна какая-то другая полимера-за, отличная от ДНК-полимеразы I.

Низкий фон активности полимеразы Iу мутанта polA 1 облегчил поиск новыхДНК-полимераз. Вскоре в нескольких лабо-раториях были выделены и охарактеризо-ваны два таких фермента. ДНК-полимеразыII и III подобны полимеразе I в следующихотношениях:

1. Они катализируют направляемый ма-трицей синтез ДНК из предшественниковдезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

2. Для проявления их активности необхо-дима затравка со свободной 3'-ОН-группой,

3. Синтез идет в направлении 5'—>3'.4. Они обладают 3'—>5'-экзонуклеазной

активностью. ДНК-полимераза III (но не II)является также 5'—>3'-нуклеазой.

Эти полимеразы различаются по характе-ру предпочитаемых ими матриц. Для поли-мераз II и III оптимальными матрицамислужат двухцепочечные ДНК, имеющие ко-роткие одноцепочечные пробелы. Полиме-раза I, наоборот, предпочитает протя-женные одноцепочечные участки, сосед-ствующие с двухспиральными участками.Максимальные скорости катализа in vitroдля этих ферментов также различаются: по-лимераза I присоединяет 10 нуклеотидовв секунду, а полимераза II - 0,5 и полимеразаIII - 150 нуклеотидов в секунду. В физиоло-гически активном состоянии ДНК-полиме-раза III ассоциирована с некоторыми други-ми белками. Этот мультисубъединичныйкомплекс называют голоферментом ДНК-полимеразы III.

Какова роль этих полимераз in vivo?Вскоре мы расскажем о том, что мультифер-ментный комплекс, содержащий ДНК-поли-меразу III, синтезирует большую часть но-вообразующейся ДНК, а ДНК-полимеразаI удаляет затравку и заполняет пробелы.Роль ДНК-полимеразы II пока не устано-влена. Проведенные в последнее время био-


Рис. 24.33. Положение структурных геновтрех ДНК-полимераз Е. coli.Ген ДНК-полимеразы I распо-ложен в локусе polA, ген ДНК-полимеразы II - в локусе polBи ген ДНК-полимеразы III - влокусе dnaE.

химические и генетические исследования по-казали, что, кроме ДНК-полимераз I и IIи ДНК-лигазы, для репликации ДНК в клет-ке E.coli необходимо более 10 белков. Пре-жде чем рассмотреть взаимодействие этихбелков с ДНК, познакомимся в общих чер-тах с репликацией на уровне целой хромо-сомы.

24.17. Расплетание родительской ДНКи синтез новой ДНК происходятв репликационной вилкеИзображения ДНК во время репликациибыли получены с помощью радиоавтогра-фии и электронной микроскопии. При ра-диоавтографии изображение образуетсяв результате распада подходящего изотопа,например трития. Испускаемые электронывзаимодействуют с гранулами серебра фо-тографической эмульсии. После проявленияпленки возникают черные точки. Метод ра-диоавтографии имеет довольно низкую раз-решающую способность - порядка несколь-ких сотен ангстрем. Однако у этого методаесть определенное преимущество: он позво-ляет видеть лишь те молекулы, которые со-держат метку. Для того чтобы сделать ДНКвидимой при радиоавтографии, в нее вклю-чают тимин или тимидин, меченный три-тием.


Рис. 24.34. Радиоавтограф реплицирую-щейся ДНК Е. coli. (Печатаетсяс любезного разрешения д-раJohn Gairns.)

На радиоавтографах и электронных ми-крофотографиях видно, что реплицирую-щаяся ДНК E.coli имеет форму замкнутогокольца с внутренней петлей (рис. 24.34). Мо-лекулы такой формы называют тета-струк-турами, так как они напоминают греческую

букву θ (рис. 24.35). Тета-структуры показы-вают, что молекулы ДНК сохраняют во вре-мя репликации кольцевую форму. Разреше-ние этого метода недостаточно велико,чтобы различить свободные концы. Однакоочевидно, что длинных нитей одноцепочеч-ной ДНК в молекуле нет. Таким образом,эти изображения позволяют отвергнуть ме-ханизм репликации, согласно которому це-пи родительской ДНК сначала полностьюраскручиваются, и только затем исполь-зуются в качестве матриц при синтезе новойДНК. Напротив, синтез новой ДНК сопря-жен с одновременным раскручиванием роди-тельской ДНК. Участок, где происходитодновременное расплетание и синтез, назы-вается репликационной вилкой.

24.18. Репликация ДНК начинается в строгоопределенном месте и продолжаетсяпоследовательно в обоих направленияхНачинается ли репликация ДНК E.coliв произвольном месте хромосомы, или жев хромосоме имеется определенный участокинициации? Репликация ДНК - строго регу-лируемый процесс, поэтому a priori кажет-ся гораздо более вероятным, что она на-чинается в определенном месте. Действи-тельно, как показали работы по определе-нию относительного числа различных геновв условиях быстрого синтеза ДНК, реплика-ция в клетках E.coli начинается в одномопределенном месте хромосомы. Рассмо-трим два гена - а и b. Предположим, что гена расположен вблизи от точки начала репли-кации, а ген b - вблизи от конца. Тогда гена будет реплицироваться намного раньше,чем ген b. В быстро растущей культуре наодин ген b будет приходиться примерно двагена а. Если же, наоборот, репликация ДНКначинается в случайной точке, количествогенов а и b будет одинаковым. Относитель-ное число генов было определено с по-мощью метода гибридизации, который рас-сматривается ниже (разд. 25.5). Результатыэтих экспериментов ясно показали, что от-носительное число генов действительно за-висит от их положения на карте (рис. 24.36).Эти данные позволили сделать следующиевыводы.

1. Репликация начинается в строго опре-деленном уникальном участке - вблизи генаilv, локализованного на 74' на стандартнойгенетической карте E.coli.

2. Репликация идет одновременно в обо-их направлениях с примерно одинаковой

Рис. 24.35. Схематическое изображениекольцевой хромосомы Е. coli вовремя репликации. Синимилиниями в этой тета-структурепоказана родительская ДНК,красными - новообразованнаяДНК.

Рис. 24.36. Относительные количестваразличных генов в условияхбыстрого синтеза ДНК у Е. coliв зависимости от их положенияна генетической карте.


скоростью. Другими словами, существуютдве репликационные вилки: одна движется почасовой стрелке, другая - против часовойстрелки.

3. Две репликационные вилки встречают-ся вблизи маркера trp (25' на генетическойкарте) - в точке, почти диаметрально проти-воположной началу репликации.

Еще одно доказательство двунаправлен-ности репликации ДНК у E.coli было полу-чено методом радиоавтографии. Для этоговначале репликацию проводили в среде, со-державшей тимин, меченный тритием доумеренной удельной радиоактивности. Че-рез несколько минут инкубации бактерииперенесли в среду, содержавшую высокоме-ченный тритием радиоактивный тимин.Пробы с двумя различными уровнями ра-диоактивности использовались для того,чтобы получить на радиоавтографах два ти-па цепочек зерен серебра: цепочки с низкойплотностью зерен, соответствующие ДНК,синтезированной вначале, и цепочки с высо-кой плотностью, соответствующие ДНК,синтезированной позже. Если бы реплика-ция шла в одном направлении, были бывидны цепочки с высокой плотностью зеренна одном конце и низкой плотностью надругом. Если же репликация идет в двух на-правлениях, середина каждого отпечаткаДНК должна была бы иметь низкую плот-ность зерна, а концы - высокую (рис. 24.37).Радиоавтографы дали наглядный ответ(рис. 24.38). Цепочки зерен серебра (отпечат-ки ДНК) во всех случаях имели более высо-кую плотность зерен на обоих концах, чемпосередине, указывая тем самым, что репли-кация хромосомы E.coli идет в двух напра-влениях.

24.19. Одна цепь ДНК синтезируетсяпрерывистоВернемся к взаимодействию молекул прирепликации. В области репликационнойвилки обе цепи родительской ДНК служатматрицами для синтеза новой ДНК. Напом-ним, что цепи родительской ДНК антипа-раллельны. Следовательно, общее направле-ние синтеза ДНК должно быть 5'—>3' дляодной из дочерних цепей и 3'—>5' для другой(рис. 24.39). Однако все известные ДНК-по-лимеразы синтезируют ДНК в направлении5'—>3', а не 3'—>5'. Как же тогда происходит


Рис. 24.37. Предполагаемые результатырадиоавтографии в случаеодно- и двунаправленной ре-пликации, если бактерий пере-носят со среды, содержащей ти-мин с умеренной радиоактив-ностью, на среду с высокора-диоактивным тимином.

Рис. 24.38. Радиоавтограф ДНК Е. coli вовремя репликации (условияопыта указаны в подписик рис. 24.37). Наблюдаемоераспределение зерен серебрапоказывает, что репликацияидет в двух направлениях.[Prescott D. M., Kuempel P.L.,Proc. Nat. Acad. Sci, 69, 2842(1972).]

Рис. 24.39. При низком разрешении кажу-щееся направление репликацииДНК будет 5'—>3' для однойдочерней цепи и 3'—>5' длядругой. На самом деле обе цеписинтезируются в направлении5'—>3', как показано нарис. 24.40.

кажущийся (при низкой разрешающей спо-собности метода) рост одной из дочернихцепей в направлении 3'—>5'?

Проблема была решена Рейдзи Оказаки(Reiji Okazaki), который обнаружил, что зна-чительная часть новосинтезированнойДНК существует в виде коротких фрагмен-тов. Такие фрагменты длиной около 1000нуклеотидов (они называются фрагментамиОказаки) существуют в течение непродол-жительного времени в непосредственнойблизости от репликационной вилки. По ме-ре прохождения репликации эти фрагментысоединяются друг с другом ковалентно поддействием ДНК-лигазы и образуют одну издочерних цепей (рис. 24.40). Другая новаяцепь синтезируется непрерывно или почтинепрерывно. Та цепь, которая образуется изфрагментов Оказаки, называется отстаю-щей цепью, а та, что синтезируется без раз-рывов или почти без разрывов,- ведущейцепью. И фрагменты Оказаки, и ведущаяцепь синтезируются в направлении 5'—>3'.Прерывистая сборка отстающей цепи позво-ляет путем полимеризации в направлении5'—>3' на атомном уровне получать общийрост цепи в направлении 3'—>5'.

24.20. Затравкой синтеза ДНК служитРНК

Как начинается синтез ДНК? Напомним,что всем ДНК-полимеразам для иницииро-вания синтеза ДНК необходима затравка сосвободной 3'-ОН-группой. Что служит за-травкой при синтезе ведущей цепи и фраг-ментов Оказаки? Важным толчком к реше-нию этого вопроса послужило наблюдение,что для инициации синтеза ДНК необходимсинтез РНК. На основе этого открытия бы-ло высказано предположение, что РНК, оче-видно, служит затравкой в синтезе ДНК, таккак уже было известно, что РНК-полиме-разы способны начинать синтез цепей denovo. Затем было показано, что новообра-зующаяся ДНК ковалентно связана с ко-ротким фрагментом РНК, который и слу-жит затравкой. Итак, РНК-затравкав синтезе ДНК.

По всей вероятности, репликация ДНКв клетке E.coli происходит, как показано нарис. 24.41.

1. Особая РНК-полимераза (ее называютпраймаза) синтезирует короткую цепь РНК(примерно 10 нуклеотидов), комплементар-ную одной из цепей ДНК-матрицы. В отли-чие от ДНК-полимеразы праймаза не ну-

Рис. 24.40. Схематическое изображениерепликационной вилки. Обе це-пи ДНК синтезируются в на-правлении 5'—>3'. Ведущаяцепь синтезируется непрерыв-но, а отстающая - в виде корот-ких фрагментов (фрагментыОказаки).

Рис. 24.41. Инициация синтеза ДНК.А - праймаза синтезирует ко-роткую комплементарнуюцепь РНК; Б - эта РНК служитзатравкой для синтеза новойДНК; В - РНК, входящая в со-став новообразованной цепи,гидролизуется, при этом обра-зуется брешь, которая впослед-ствии заполняется.


Рис. 24.42. Электронная микрофотогра-фия хромосомы Е. coli, прикре-пленной к двум фрагментамклеточной мембраны. На ри-сунке изображена одна интакт-ная суперспирализованная мо-лекула ДНК. [Delius H.,Worcel A., J. Mol. Biol., 82, 108(1974).]

ждается в затравке для синтеза полинуклео-тида.

2. 3'-гидроксильная группа концевого ри-бонуклеотида этой цепи РНК служит за-травкой для синтеза ДНК под действием го-лофермента ДНК-полимеразы III. Большаячасть новообразованной ДНК синтезирует-ся этим мультисубъединичным комплексом.

3. РНК-компонент этого РНК-ДНК-ги-брида гидролизуется под действием ДНК-полимеразы I.

4. После удаления РНК из новообразо-ванных цепей между фрагментами ДНКостаются довольно обширные бреши. ДНК-полимераза I, которая хорошо приспособле-


на для синтеза ДНК на одноцепочечной ма-трице, заполняет эти бреши.

Последние исследования показали, чтодействию праймазы предшествует образо-вание предзатравочного промежуточногокомплекса, состоящего как минимум из пятибелков. Один из них - белок dnaB - можетпередвигаться вдоль ДНК, используя энер-гию гидролиза АТР. Белок dnaB может слу-жить сигналом для активации праймазы.Специфичность инициации очередного ци-кла репликации может обеспечиваться бел-ками, доставляющими белок dnaB точнов область гена ilv, где находится точка нача-ла репликации хромосомы E.coli. Время на-чала репликации ДНК имеет критическоезначение, поскольку оно должно бытьскоординировано с делением клетки. И дей-ствительно, бактериальная хромосома ассо-циирована с впячиванием клеточной мем-браны (рис. 24.42).

24.21. Энергия гидролиза АТР используетсядля расплетания родительской ДНКв области репликационной вилкипод действием белка repВ 1953 г. Уотсон и Крик отмечали, что «рас-крутить спираль - задача труднопреодоли-мая». Исследования, проведенные в послед-нее время, показали, что в клетке E.coli

Рис. 24.43. Каталитические активностиДНК-гиразы.

в области репликационной вилки происхо-дит активное расплетание родительскойдвойной спирали под действием фермента —белка rep. Поскольку энергия для расплета-ния родительской ДНК высвобождаетсяпри гидролизе АТР, белок гер называют хе-ликазой. На разделение каждой пары осно-ваний затрачиваются примерно две моле-кулы АТР. Затем каждая из разделенныхцепей родительской ДНК взаимодействуетс несколькими молекулами белка, связываю-щегося с одноцепочечной ДНК (ОЦ-связы-вающий белок). Роль ОЦ-связывающегобелка - стабилизировать одноцепочечныеучастки ДНК, образовавшиеся под дей-ствием хеликазы, чтобы расплетеннаяобласть могла функционировать в качествематрицы. ОЦ-связывающие белки назы-

вают также белками, дестабилизирующимиспираль (белки ДС), или плавящими белка-ми.

24.22. ДНК-гираза вводит отрицательныесупервитки в родительскую ДНК, чтобыоблегчить ее расплетаниеПри расплетании ковалентно замкнутойкольцевой молекулы ДНК возникают топо-логические проблемы, так как расплетаниедвойной спирали вызывает образование по-ложительных супервитков в замкнутой мо-лекуле. В области репликационной вилкиродительская ДНК вращается со скоростью100 об/с - более чем в 100 раз быстрее, чемобычная долгоиграющая пластинка. Чтобыпроцесс расплетания продолжался, необхо-димо снять эти положительные супервитки,образовавшиеся в результате вращения.Другими словами, необходимо наличие ка-кого-то молекулярного шарнира. НедавноМартин Геллерт (Martin Gellert) установил,что эту функцию выполняет ДНК-гираза.Эта топоизомераза удаляет положи-тельные супервитки, внося одноцепочечныеразрывы и затем заделывая фосфодиэфирныесвязи в остове ДНК. АТР не требуется длятакой термодинамически выгодной релакса-ции третичной структуры ДНК. Более того,ДНК-гираза может активно вводить отри-цательные супервитки в ковалентно замкну-тую кольцевую ДНК за счет энергии гидро-лиза АТР (рис. 24.43). Эти отрицательныесупервитки способствуют расхождению це-пей родительской ДНК в области реплика-ционной вилки 1.

24.23. Сложность аппарата репликации,по-видимому, необходима для обеспеченияочень высокой надежностиСуществующие представления о молекуляр-ном механизме репликации ДНК у E.coli

1 В этой главе автор называет ДНК-гиразойдва совершенно различных фермента. Один изних - ДНК-гираза, способная вводить в ДНКтермодинамически невыгодные отрицательныесупервитки за счет энергии гидролиза АТР; дру-гой - независимая от АТР ДНК-топоизомераза,приводящая кольцевую молекулу ДНК в тер-модинамически равновесное (релаксированное)состояние. Это два совершенно различных бел-ка: у них различные ингибиторы, потребностив ионных условиях среды, механизм действия.В репликации в качестве молекулярного шарни-ра участвует ДНК-гираза.- Прим. перев.

24. ДНК: генетическая роль,структура к репликация 33

Рис. 24.44. Схематическое изображениеферментативных процессовв области репликационной вил-ки Е. coli. Фрагменты, отме-ченные синим цветом, катали-зируют инициацию, элонгациюи сшивание (с помощью ДНК-лигазы) цепей ДНК. (Коrn-berg A., DNA replication,W.H. Freeman and Co., 1980.)

представлены на рис. 24.44 и в табл. 24.2.Поражает сложность взаимодействий мно-жества белков, участвующих в этом процес-се. Генетический анализ показывает, чтов репликации ДНК непосредственно уча-ствует не менее 15 белков. Почему механизмрепликации ДНК столь сложен? В частно-сти, почему синтез ДНК начинается с РНК-затравки, которая затем удаляется? Если быДНК-полимеразы могли начинать синтезцепей de novo, в РНК-затравке не было бынадобности. Однако такая способность бы-ла бы несовместима с чрезвычайно высокойточностью ДНК-полимераз. Напомним, чтоДНК-полимеразы, прежде чем образоватьновую фосфодиэфирную связь, проверяютправильность предшествующей пары осно-ваний. Эта функция редактирования суще-ственно снижает частоту ошибок. РНК-по-лимеразы, напротив, могут начинать синтезцепей de novo, так как они не проверяют


предыдущую пару оснований. Частота оши-бок для них на несколько порядков вели-чины выше, чем для ДНК-полимераз. Былонайдено остроумное решение этой про-блемы: начинать синтез ДНК с полинуклео-тида, синтезируемого с низкой надеж-ностью, но отмечать его «временный»характер, включив в его состав рибонуклео-

Таблица 24.2. Белки репликации Е. coli

Белок

dna В

Праймаза

rер

ДНК-связы-вающий

ДНК-гираза

ГолоферментДНК-полиме-разы III

ДНК-полиме-раза I

ДНК-лигаза

Функция

Дает возможностьпраймазе иницииро-вать синтез РНК

Синтезирует РНК-за-травкиРасплетает двойнуюспираль

Стабилизирует одно-цепочечные участки

Вводит суперспираль-ные витки

Синтезирует ДНК

Удаляет затравку изаполняет бреши

Соединяет концыДНК

Масса,кДа

~250

60

65

74

400

>300

109

74

Числомоле-кул вклетке

20

100

50

300

20

300

300

тиды. Затем ДНК-полимераза I вырезаетэти короткие последовательности РНК-за-травок и замещает их последовательностьюДНК, синтезированной с высокой надеж-ностью. Создается впечатление, что многиедетали, усложняющие механизм реплика-ции ДНК, предназначены для обеспечениячрезвычайно высокой точности. Генетиче-ский анализ показывает, что частота оши-бок составляет одну на 109-1010 считанныхпар оснований.

24.24. Повреждения ДНК постояннорепарируютсяПоскольку множество химических и физиче-ских агентов вызывает в ДНК повреждения,во всех клетках имеются специальные меха-низмы для исправления этих повреждений.Основания в ДНК могут изменяться и те-ряться, фосфодиэфирные связи остова мо-гут разрываться, а две цепи могут попереч-но сшиваться друг с другом. Эти поврежде-ния образуются под действием ионизирую-щей радиации, ультрафиолетового облуче-ния и различных химических веществ.Многие повреждения в ДНК поддаются ис-правлению, так как генетическая информа-ция записана в обеих цепях двойной спира-ли. Благодаря этому информацию, утрачен-ную одной из цепей, можно извлечь издругой цепи.

Один из наиболее хорошо изученных ме-ханизмов репарации - вырезание пиримиди-нового димера (рис. 24.45), который обра-зуется при действии на ДНК ультрафиоле-тового света. Соседние пиримидиновыеостатки в одной цепи ДНК могут в этих ус-ловиях образовать ковалентную сшивку.Такой пиримидиновый димер не уклады-вается в двойную спираль, так что реплика-ция и экспрессия генов оказываются блоки-рованными до тех пор, пока повреждение небудет удалено.

В осуществлении этого процесса важнуюроль играют четыре ферментативные актив-ности (рис. 24.46). Первая из них - УФ-специ-фичная эндонуклеаза - находит место повре-

Рис. 24.45. Модель димера урацила, обра-зованного под действием уль-трафиолетового облучения.Тиминовый димер имеет при-мерно такую же структуру.

ждения и вносит одноцепочечный разрыввблизи от димера, обычно с 5'-стороны.Участок, содержащий димер, выпячиваетсяиз двойной спирали, что позволяет ДНК-по-лимеразе I (или другой подобной полимера-зе) провести репарационный синтез в напра-влении 5'—>3'. Затравкой при этом служит3'-конец разорванной цепи, а матрицей - ин-тактная комплементарная цепь. Затемобласть, где расположен пиримидиновыйдимер, вырезается под действием 5'—>—>3'-нуклеазной активности ДНК-полиме-разы. Наконец, новосинтезированная цепьи остаток той же цепи ДНК соединяютсяДНК-лигазой. Другой путь репарации-фо-тохимическое расщепление пиримидиново-го димера. Почти все клетки содержат фо-тореактивирующий фермент, который уз-нает димер и расщепляет его на исходныеоснования, используя энергию поглощенно-го синего света.

24.25. Рак кожи при золотистой ксеродермеобусловлен нарушением нормальнойрепарации ДНКЗолотистая ксеродерма (Xerodermapigmentosum) - редкое заболевание кожиу людей. Оно наследуется как аутосомныйрецессивный признак. У гомозиготныхбольных кожа крайне чувствительна к сол-нечному и ультрафиолетовому свету. Серь-езные поражения кожи наблюдаются ужев детстве, а с возрастом они принимают всеболее тяжелый характер. Кожа становитсясухой, и дерма в значительной степени атро-


Ксеродерма -от греч. слов, означающих «сухая кожа». Этот термин был впервые использованF. Hebra и М. Kaposi в 1874 г. для описания «пергаментной кожи» и аномаль-ной пигментации, наблюдавшихся у одного из больных.

фируется. Появляются кератозы, веки по-крываются рубцами, поражается роговица.Обычно во многих местах возникает рак ко-жи. Многие больные погибают, не достиг-нув 30 лет, от метастазов этих злокаче-ственных опухолей кожи.

В ДНК человека, как и у E.coli, под дей-ствием ультрафиолетового света образуют-ся пиримидиновые димеры. Более того, ме-ханизмы репарации у человека и у E.coli,по-видимому, сходны. Изучение фибробла-стов кожи больных золотистой ксеродер-мой показало, что одна из форм этой болез-ни сопровождается биохимическим наруше-нием. В нормальных фибробластах поло-вина пиримидиновых димеров, образовав-шихся под действием ультрафиолетовогооблучения, вырезается менее чем за сутки.В фибробластах же, полученных от больныхзолотистой ксеродермой, за тот же проме-жуток времени вырезания димеров почти ненаблюдается. Какой этап репарации нару-шен? Ответ был получен путем определениямолекулярной массы цепей ДНК из фибро-бластов, облученных ультрафиолетовымсветом. В нормальных клетках в течение не-скольких часов после облучения происходитзаметное снижение молекулярной массыодноцепочечной ДНК. Это снижение моле-кулярной массы обусловлено первой реак-цией процесса репарации, а именно расще-плением цепи ДНК рядом с пиримиди-новым димером. После УФ-облучения кле-ток золотистой ксеродермы, наоборот, сни-жения молекулярной массы не происходит.Следовательно, это кожное заболевание,возможно, вызвано инактивацией эндону-клеазы, которая гидролизует остов ДНК ря-дом с пиримидиновым димером. Тяжелыеклинические последствия этого фермента-тивного нарушения свидетельствуют об ис-ключительной важности процессов репара-ции ДНК.

24.26. ДНК содержит тимин вместо урацила,что делает возможной репарациюдезаминированного цитозинаЦитозин в ДНК спонтанно дезаминируетсяс измеримой скоростью, образуя урацил.


Дезаминирование цитозина является потен-циально мутагенным, так как образующий-ся урацил спаривается с аденином, и, следо-вательно, одна из дочерних цепей будетсодержать AU-пару оснований вместо ис-ходной GC-пары:

Эта мутация исправляется под действиемрепарационной системы, узнающей чуже-родный урацил в молекуле ДНК(рис. 24.47). Прежде всего урацил-ДНК—гликозидаза гидролизует гликозид-ную связь остатка урацила с дезоксирибо-зой. На этом этапе остов ДНК остаетсяинтактным, но одно основание отсутствует.Затем специфическая эндонуклеаза узнаетэтот дефект и расщепляет остов рядом с от-сутствующим основанием. ДНК-полимера-за I вырезает оставшийся дезоксирибозо-фосфат и вставляет цитозин, комплемен-тарный гуанину в неповрежденной цепи.Наконец, репарированная цепь заделывает-ся ДНК-лигазой.

В течение многих лет оставалось загад-кой, почему в ДНК присутствует тимин, а неурацил, ведь оба основания спариваютсяс аденином. Единственное различие междуними - метильная группа тимина на местеатома водорода при С-5 в урациле. Почемуэто метилированное основание использует-ся в ДНК, но не в РНК? Напомним, что наметилирование дезоксиуридилата с образо-ванием дезокситимидилата расходуетсямного энергии (разд. 22.16). Открытие срав-нительно недавно активной системы, репа-рируюшей дезаминирование цитозина, слу-жит убедительным ответом на эту загадку.Урацил-ДНК—гликозидаза не удаляеттимина из ДНК. Таким образом, метильнаягруппа тимина служит меткой, позволяю-щей отличать его от дезаминированного ци-тозина. Если бы этой метки не было, ура-цил, стоящий на правильном месте, было быневозможно отличить от урацила, образо-

Рис. 24.46. Репарация участка ДНК, со-держащего тиминовый димер,в результате последовательно-го действия специфической эн-донуклеазы, ДНК-полимеразыи ДНК-лигазы. Тиминовый ди-мер показан синим цветом,а новосинтезированный уча-сток ДНК - красным. [На-nawalt P.C, Endeavor, 31, 83(1972).]

вавшегося в результате дезаминирования.Дефект остался бы незамеченным, и в однойиз дочерних молекул ДНК неизбежно про-изошло бы мутационное замещение однойGC-пары на AU-пapy. Система репарации,которая выискивает урацилы и оставляеттимины, подавляет такие мутации. По всейвероятности, тимин используется в ДНКвместо урацила для увеличения надежностигенетической информации. В противопо-ложность этому РНК не репарируется, ив ней используется урацил, так как он пред-ставляет собой менее дорогой строи-тельный блок.

24.27. Рестриктирующие эндонуклеазысовершили переворот в анализе ДНКФерменты рестрикции - эндонуклеазы, спо-собные узнавать определенные последова-тельности оснований в двухспиральнойДНК и расщеплять обе цепи. Эти исключи-тельно тонкие скальпели - великолепныйподарок природы биохимикам. Существо-вание ферментов рестрикции позволилопроводить эксперименты, о которых нельзябыло даже и мечтать всего лишь нескольколет назад. Они представляют собой незаме-нимые инструменты для исследования

Рис. 24.47. Остатки уранила в ДНК выре-заются и замещаются цитози-ном - исходным основанием.


Палиндром (перевертыш) -слово, предложение или стих, которые читаются одинаково слева направои справа налево.

Примеры:РадарТо не ясли ломал, а молился енот.А роза упала на лапу Азора.Нажал кабан на баклажан.Roma tibi subito motibus ibit amor.

Происходит от греческого слова palindromos - бегу назад.

структуры хромосомы, определения после-довательности нуклеотидов в оченьдлинных молекулах ДНК, выделения генови получения новых молекул ДНК для кло-нирования. Разработку всех этих методовначали Вернер Арбер, Гамилтон Смит и Дэ-ниел Натанс (Werner Arber, Hamilton Smith,Daniel Nathans).

Рестриктирующие эндонуклеазы обнару-живаются у самых различных прокариот.Биологическая роль этих ферментов со-стоит в том, чтобы расщеплять чужеродныемолекулы ДНК. Собственная клеточнаяДНК при этом не расщепляется, так какучастки, узнаваемые своими ферментамирестрикции, у нее метилированы. Взаимос-вязь между ресткрикцией и модификациейрассматривается в гл. 30 (разд. 30.9). Важ-ное значение имеет тот факт, что многиеферменты рестрикции узнают специфиче-ские последовательности ДНК длиной отчетырех до шести пар оснований и гидроли-зуют фосфодиэфирные связи в обеих цепяхв этой области. Удивительная особенностьтаких участков расщепления - их симметрияотносительно оси вращения второго поряд-ка. Другими словами, узнаваемая последо-вательность пар оснований представляет со-бой палиндром.

Расщепляемые участки расположены сим-метрично относительно оси второго поряд-ка. Например, фермент рестрикции изStreptomyces achromogenes узнает последова-тельность


В каждой цепи эта эндонуклеаза рвет фос-фодиэфирную связь между G и С, дисталь-ную по отношению к оси симметрии. К на-стоящему времени очищено и охарактеризо-вано более 80 ферментов рестрикции. Ихназвания состоят из сокращенного до трехбукв названия микроорганизма (например,Есо от E.coli, Hin от Haemophilus influenzae,Нае от H.aeguptins), обозначения штаммаи римской цифры. Специфичность неко-торых ферментов показана на рис. 24.48.Обратите внимание, что производимые вдвух цепях разрывы могут быть распо-ложены либо со сдвигом относительнодруг друга, либо строго против другдруга.

Ферменты рестрикции используются длярасщепления молекул ДНК на опреде-ленные фрагменты, которые более удобныдля анализа и манипулирования, чем ис-ходная молекула. Например, EcoRI расще-пляет кольцевую двухцепочечную ДНК ви-руса SV-40 длиной 5,1 kb только в одномместе, Нра - в четырех местах и Hind - в 11местах. Кусок ДНК, образованный однимферментом рестрикции, можно специфиче-ски расщепить на более мелкие фрагментыс помощью другого фермента. Используянесколько ферментов рестрикции, можнокартировать хромосомы (разд. 31.8). Болеетого, набор фрагментов, полученных с по-мощью ферментов рестрикции, может слу-жить своего рода «отпечатком пальца»для соответствующей молекулы ДНК. Не-большие различия между сходными моле-кулами ДНК можно легко выявить с по-мощью электрофоретического разделенияих рестрикционных фрагментов. Для каж-дого данного геля электрофоретическаяподвижность фрагмента ДНК обратнопропорциональна логарифму числа пар ос-нований (до определенного предела длиныфрагментов). Для разделения фрагментовДНК длиной до 1000 пар оснований ис-пользуют полиакриламидный гель, а для

Рис. 24.48. Специфичность некоторых эн-донуклеаз рестрикции. После-довательности пар оснований,узнаваемые этими фермента-ми, имеют ось симметрии вто-рого порядка. Две цепи ДНКв этой области симметричныотносительно оси, обозначен-ной зеленым овалом. (Однацепь сдвинута относительнодругой на 180°.) Места расще-пления показаны краснымистрелками. Сокращенные на-звания каждого фермента ре-стрикции приведены справа отпоследовательности, которуюон узнает.

разделения более длинных молекул болеепористый агарозный гель. Если ДНК со-держит радиоактивную метку, полосыможно выявить методом радиоавтографии.В другом случае гель можно покраситьбромистым этидием, который при связыва-нии с двухспиральной ДНК флуоресцируетярким оранжевым светом. При использо-вании этого способа можно легко увидетьполосу, содержащую 50 нг ДНК(рис. 24.49). Помимо чувствительности,важное достоинство таких гелей - их высо-кая разрешающая способность.

24.28. Последовательность нуклеотидовв ДНК можно быстро определитьс помощью специфического химическогорасщепленияПоявление надежных методов определенияпоследовательности нуклеотидов в моле-кулы ДНК облегчило также изучениеструктуры ДНК и ее связи с экспрессиейгена. Метод химического расщепления, раз-работанный Алланом Максамом и Уолте-ром Гилбертом (Allan Maxam, WalterGilbert), основан на использовании ДНК,меченной 32Р по одному из концов однойиз цепей. Для введения 32Р в 5'-гидро-ксильный конец обычно используют поли-нуклеотидкиназу. Меченую ДНК расщеп-ляют предпочтительно по одному из четы-рех нуклеотидов. Условия реакции подби-рают таким образом, чтобы на каждуюцепь приходился в среднем один разрыв.

Рис. 24.49. Электрофоретическое разделе-ние фрагментов, образующих-ся при расщеплении ДНКSV-40 тремя различными фер-ментами рестрикции. Этифрагменты флуоресцируютблагодаря тому, что гель окра-шен бромистым этидием. (Пе-чатается с любезного разреше-ния д-ра Jeffrey Sklar.)


Частичное расщепление по каждому осно-ванию дает набор радиоактивных фраг-ментов, начинающихся 32Р-меткой и кон-чающихся одним из положений этогооснования. Например, если исследуемаяДНК имеет последовательность

5'-32P-GCTACGTA-3'

то в результате специфического расщепле-ния с 5'-стороны каждого из четырех осно-ваний получатся следующие радиоак-тивные фрагменты:

Затем эти фрагменты разделяют методомэлектрофореза в полиакриламидном геле,который дает возможность разделять мо-лекулы ДНК, различающиеся по длиневсего лишь на один нуклеотид. Следую-щий этап - радиоавтография этого геля.Как показано на рис. 24.50, самая нижняяполоса расположена на дорожке, соответ-ствующей расщеплению по С, следую-щая - на дорожке Т, затем еще одна - надорожке А. Следовательно, последователь-ность первых трех нуклеотидов имеет вид5'-СТА-3'. Если прочитать все семь полосснизу вверх, получится последовательность5'-CTACGTA-3'. Итак, радиоавтограф геля,полученного после четырех различных реак-ций химического расщепления, дает наборполос, по которым можно непосредственнопрочитать нужную последовательность.

Как достигается специфическое расще-пление ДНК? Для этого используют со-единения, которые способны модифициро-вать основание и затем отщеплять его отостатка сахара (рис. 24.51). Пурины моди-фицируют диметилсульфатом, метилирую-щим гуанин по N-7 и аденин по N-3. Рас-щепление гликозидной связи метилирован-ного пурина легко достигается нагрева-нием при нейтральном значении рН.


В результате основание отделяется от со-ответствующего остатка сахара. Затемсмесь нагревают в щелочи, что вызываетрасщепление сахарофосфатного остоваДНК и удаление остатка сахара. В резуль-тате образуются фрагменты, несущие наконце метку. Эти фрагменты разделяютв полиакриламидном геле и на радиоавто-графе получают картину полосы различ-ной интенсивности. Темные полосы со-ответствуют фрагментам, образовавшимсяпри расщеплении по гуанину, так как гуа-нин метилируется гораздо быстрее, чемаденин. В то же время гликозидная связьв метилированном аденозине менее ста-бильна, чем в метилированном гуанозине.Поэтому при обработке разбавленной кис-лотой после метилирования происходитпредпочтительное выщепление аденина(получается дорожка А + G). Сравнение до-рожки А + G с параллельной дорожкойG на том же геле показывает, происходитли расщепление по А или по G (рис. 24.52).Расщепление по цитозину и тимину прово-дят гидразином. Остов затем расщепляют

Рис. 24.50. Схематическое изображениегеля, на котором показаны ра-диоактивные фрагменты, обра-зовавшиеся при специфиче-ском расщеплении последова-тельности 5'-32P-GCTACGTA-3' по каждому из четырех осно-ваний (дорожки A, G, С и Т).Слева указано число нуклеоти-дов (n) в каждом фрагменте.Последовательность основа-ний читается непосредственнос геля снизу вверх.

Рис. 24.51. Стратегия метода определенияпоследовательности нуклеоти-дов в ДНК с помощью химиче-ского расщепления.

пиперидином, который вытесняет продуктыреакции с гидразином и катализируетэлиминацию фосфатов. В результате рас-щепления по цитозинам и тиминам полу-чают серию полос примерно равной интен-сивности (дорожка С + Т). Эти пирими-дины различают, проводя гидразинолизв присутствии 2 М NaCl, подавляющимреакцию с тимином (дорожка С). Теперь по-следовательность ДНК можно прочитатьпо радиоавтографу геля, сопоставляя до-рожки G, A + G, С + Т и С (рис. 24.52).Самый короткий фрагмент имеет самуювысокую электрофоретическую подвиж-ность, так что 5'-концу соответствует низгеля. Если использовать несколько различ-ных гелей для разделений всех меченыхфрагментов, можно легко определить та-ким образом последовательности длинойболее 150 пар оснований.

24.29. Полная последовательностьоснований ДНК фага φХ174 былаопределена с помощью методаферментативной репликацииДругой метод определения последователь-ности оснований в ДНК основан на обра-зовании меченых фрагментов с помощьюконтролируемого прерывания фермента-тивной репликации in vitro. Этот методразработали Фред Сэнгер (Fred Sanger)и его сотрудники. Для считывания опреде-ленной последовательности с одноцепочеч-ной ДНК используют ДНК-полимеразу

Рис. 24.52. На радиоавтографе геля виднымеченые фрагменты, образо-вавшиеся при химическом рас-щеплении. 5'-конец этой ДНКбыл помечен 32Р. Самый ко-роткий нуклеотид расположену основания геля. С геля можнопрочитать последовательность5'-CTTTTTTGGGCTTAGC-3'.


I 1 ) . В качестве затравки для синтеза ис-пользуется комплементарный фрагмент,который можно получить из набора про-дуктов рестрикции, соответствующей двух-цепочечной ДНК. Кроме четырех радиоак-тивных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов,инкубационная смесь содержит 2',3'-диде-зоксианалог одного из них. Включение это-го аналога блокирует дальнейший рост це-пи, так как он не содержит концевой3'-гидроксильной группы, необходимой дляобразования следующей фосфодиэфирнойсвязи. Так образуются фрагменты, несу-щие на 3'-конце дидезоксианалог (рис. 24.53).Затем четыре набора фрагментов, образо-ванных терминированием цепей, разделяютгель-электрофорезом и прочитывают по-следовательность оснований синтезирован-ной ДНК по радиоавтографу геля. Исполь-зуя менее 1 пмоль очищенной ДНК, мож-но определить последовательности 200 ну-клеотидов.

С помощью метода контролируемой ре-пликации in vitro Сэнгер определил пол-ную последовательность 5375 основанийв ДНК фага φХ174. Расшифровка последо-вательности ДНК целого генома - крупноедостижение молекулярной биологии. Онапозволила сделать ряд важных выводов,которые мы рассмотрим в гл. 26(разд. 26.11). Интересно отметить, что Сэн-гер определил полную последовательностьоснований целого генома через четвертьвека после того, как он расшифровал ами-нокислотную последовательность белка2.

1 Поэтому данный метод в отечественной ли-тературе называют методом полимеразного ко-пирования.- Прим. перев.2 Следует отметить, что в промежутке междуэтими открытиями Ф. Сэнгер разработал ориги-нальный метод определения последовательно-сти оснований в РНК, который имел огромныепреимущества перед другими известными в товремя методами.- Прим. перев.


ЗаключениеДНК - молекула наследственности у всехпрокариотических и эукариотических орга-низмов. У вирусов роль генетического ма-териала выполняет либо ДНК, либо РНК.Любая клеточная ДНК представляет собойдве очень длинные спиральные полину-клеотидные цепи, закрученные вокруг об-щей оси. Две цепи двойной спирали ориен-тированы в противоположном направле-нии (антипараллельны). Сахарофосфатныйостов каждой цепи лежит снаружи двойнойспирали, а пуриновые и пиримидиновыеоснования - внутри. Две цепи удерживают-ся вместе водородными связями между па-рами оснований. Аденин (А) всегда спари-вается с тимином (Т), а гуанин (G) - cцитозином (С). Таким образом, цепи двой-ной спирали взаимно комплементарны. Ге-нетическая информация закодирована в по-следовательности оснований вдоль цепи.Большинство молекул ДНК имеет кольце-

Рис. 24.53. Стратегия метода определенияпоследовательности нуклеоти-дов в ДНК путем терминиро-вания цепи. Фрагменты обра-зуются в результате добав-ления 2',3'-дидезоксианалогаодного из dNTP в каждую изчетырех пробирок, в которыхпроисходит полимеризация.Например, при добавлении ди-дезоксианалога dATP обра-зуются фрагменты, оканчи-вающиеся на А (показанокрасным цветом).

вую форму. Ось двойной спирали кольце-вой ДНК может сама закручиватьсяи образовывать суперспираль. Суперспира-лизованная ДНК имеет более компактнуюформу, чем релаксированная ДНК.

При репликации ДНК две цепи двойнойспирали расплетаются и расходятся по ме-ре того, как синтезируются новые цепи.Каждая родительская цепь служит матри-цей для образования новой комплементар-ной цепи. Таким образом, репликацияДНК полуконсервативна - каждая дочерняямолекула получает одну цепь родитель-ской молекулы ДНК. РепликацияДНК - сложный процесс, в осуществлениикоторого участвует много белков, в томчисле ДНК-полимеразы трех типови ДНК-лигаза. Активированные предше-ственники синтеза ДНК - четыре дезокси-рибонуклеозид-5'-трифосфаты. Новая цепьсинтезируется в направлении 5'—>3'. Этотсинтез осуществляется путем нуклеофиль-ной атаки внутреннего атома фосфора оче-редного дезоксинуклеозидтрифосфата3'-гидроксильным концом цепи затравки.Самое важное состоит в том, что ДНК-по-лимераза катализирует образование фос-фодиэфирной связи только в том случае,если основание очередного нуклеотидакомплементарно основанию матричной це-пи. Другими словами, ДНК-полимеразы —ферменты, направляемые матрицами.ДНК-полимеразы I, II и III обладают так-же 3'—>5'-экзонуклеазной активностью, ко-торая увеличивает надежность репликациипутем удаления некомплементарных остат-ков. ДНК-полимеразам I и III присуща,кроме того, 5'—>3'-нуклеазная активность,играющая важную роль в механизмах ре-пликации и репарации ДНК.

Репликация ДНК в клетках E.coli на-чинается в строго определенном месте (вточке начала репликации) и идет в обоихнаправлениях. В области репликационнойвилки (там, где из двух цепей ДНК полу-чаются четыре) обе цепи родительскойДНК используются в качестве матриц длясинтеза новой ДНК. Белок rep расплетаетродительскую ДНК за счет энергии гидро-

лиза АТР. Расплетанию способствует так-же ДНК-гираза, которая играет роль моле-кулярного шарнира и вводит отрица-тельные супервитки в родительскую ДНК.Одна цепь ДНК (ведущая) синтезируетсянепрерывно, тогда как другая (отстающая)синтезируется в виде фрагментов длиной1 kb. Поскольку образование отстающейцепи происходит путем сборки из от-дельных фрагментов, полимеризация в на-правлении 5'—>3' на атомном уровне при-водит к общему росту этой цепив направлении 3'—>5'. Синтезу новой ДНКпредшествует синтез РНК, которая исполь-зуется затем в качестве затравки. Впослед-ствии РНК, входящая в состав новообра-зованной РНК-ДНК-цепи, гидролизуетсяи замещается ДНК. Затем ДНК-лигаза со-единяет новообразованные фрагментыДНК, которые спарены с одной и той жематричной цепью. В этой реакции уча-ствует в качестве источника энергииNAD+.

Повреждения в ДНК, вызванные ионизи-рующей радиацией, ультрафиолетовымсветом и различными химическими соеди-нениями, постоянно репарируются. Напри-мер, пиримидиновые димеры, индуциро-ванные ультрафиолетовым светом, выре-заются специфической эндонуклеазой. Ура-цил, который образуется при спонтанномдезаминировании цитозина в ДНК, уда-ляется гликозидазой, которая дифференци-рует урацил и тимин.Ферменты рестрикции узнают специфиче-ские последовательности, обладающиесимметрией второго порядка, и гидроли-зуют одну фосфодиэфирную связь в каж-дой цепи ДНК в этой области. Эти эндону-клеазы можно использовать для расщепле-ния молекул ДНК на специфические фраг-менты, удобные для дальнейшего изучения.Разработка методов, позволяющих быстроопределять последовательность нуклеоти-дов в ДНК на основе специфического рас-щепления и электрофоретического разделе-ния продуктов, революционизировала изу-чение структуры ДНК.


РЕКОМЕНДУЕМАЯЛИТЕРАТУРА

С чего начатьKornberg A., 1979. Aspects of DNAreplication, Cold Spring Harbor Symp.,Quant Biol., 43, 1-9.Alberts В., Sternglanz R., 1977. Recentexcitement in the DNA replicationproblem, Nature, 269, 655-661.Fiddes J.G., 1977. The nucleotidesequence of a viral DNA, Sci. Amer.,237(6), 54-67.Hamilton H.О., 1979. Nucleotidesequense specificity of restriction endo-nucleases, Science, 205, 455-622.Nathans D., 1979. Restriction endo-nucleases, simian virus 40, and the newgenetics, Science, 206, 903-909.Bauer W.R., Crick F.H.C., White J.H.,1980. Supercoiled DNA, Sci. Amer.,243(1), 118-133. (Ясно и четкорассмотрена топология суперспи-ральных ДНК.)

КнигиKornberg A., 1980. DNA Replication,Freeman. (Выдающаяся монография,читается с большим интересом.)Cold Spring Harbor Laboratory, 1979.Replication and Recombination, ColdSpring Harbor Symposia ofQuantitative Biology, vol. 43. (Наибо-лее информативный сборник статейпо репликации, репарации и рекомби-нации ДНК.)Bloomfield V.A., Crothers D.M.,Тinосо I., Jr., 1974. Physical Chemistryof Nucleic Acids, Harper and Row.Davidson J.N., 1977. The Biochemistryof the Nucleic Acids, Academic Press.Ts'o P.O.P., 1974. Basic Principles inNucleic Acid Chemistry, vol. 1 and 2,Academic Press.

Возникновение основополагающихконцепцийAvery О.Т., MacLeod С.M.,McCarty M., 1944. Studies on thechemical nature of the substance induci-ng transformation of pneumococcaltypes. Induction of transformation bya deoxyribonucleic acid fraction isolatedfrom Pneumococcus Type III, J. Exp.Med., 79, 137-158.Hershey A.D., Chase M., 1952. Indepen-dent functions of viral protein andnucleic acid in growth of bacteriophage,J. Gen. Physiol., 36, 39-56.Watson J.D., Crick F.H.C., 1953.


Molecular structure of nucleic acid.A structure for deoxyribose nucleic acid,Nature, 171, 737-738.Watson J.D., Crick F.H.C., 1953.Genetic implications of the structure ofdeoxyribonucleic acid, Nature, 171,964-967.Kornberg A., 1960. Biological synthesisof deoxyribonucleic acid, Science, 131,1503-1508.Meselson M., Stahl F.W., 1958. Thereplication of DNA in Escherichia coli,Proc. Nat. Acad. Sci., 44, 671-682.Taylor J.H. (ed.), 1965. Selected Paperson Molecular Genetics, Academic Press.(В этой книге содержатся классичес-кие статьи, упоминавшиеся в даннойглаве.)

Определение последовательности ос-нований в ДНКSanger F., Nicklen S., Coulson A.R.,1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc. Nat. Acad.Sci., 74, 5463-5467.Maxam A.M., Gilbert W., 1977. A newmethod for sequencing DNA, Proc. Nat.Acad. Sci., 74, 560-564.

Белки, участвующие в репликацииДНКWickner S.H., 1978. DNA replicationproteins of Escherichia coli, Ann. Rev.Biochem., 47, 1163-1191.Lehman I . R . , 1974. DNA ligase: struc-ture, mechanism, and function, Science,186, 790-797.McHenry C., Kornberg A., 1977. DNApolymerase III holoenzyme ofEscherichia coli: purification andresolution into subunits, J. Biol. Chem.,252, 6478-6484.Rowen L., Kornberg A., 1978. Primase,the dna G protein of Escherichia coli: anenzyme which starts DNA chains, J. Biol.Chem., 253, 758-764.Kornberg A., Scott J.F., Bertsch L.L.,1978. ATP utilization by rep protein inthe catalytic separation of DNA strandsat a replicating fork, J. Biol. Chem., 253,3298-3304.Cozzarelli N.R., 1977. The mecha-nism of action of inhibitors ofDNA synthesis, Ann. Rev. Biochem., 46,641-668.

Место начала репликации ДНК и на-правление репликацииPrescott D.M., Kuempel P. L., 1972.Bidirectional replication of thechromosome in E. coli, Proc. Nat. Acad.Sci., 69, 2842-2845.

Bird R.E., Lourarn J., Martuscelli J.,Caro L., 1972. Origin and sequence ofchromosome replication in E. coli,J, Mol. Biol, 70, 549-566.Ogawa T., Okazaki Т., 1980. Discontinu-ous DNA replication, Ann. Rev. Bio-chem., 49, 421-458.

Структура ДНКCantor С.R., Schimmel P.R., 1980.Biophysical Chemistry, Freeman.[Имеется перевод: Кантор Ч., Шим-мел Р. Биофизическая химия. В 3-хт. - М.: Мир, 1984.] (Гл. 3 и 6 в томе1 и гл. 22-24 в томе 3 содержат пре-восходный обзор, посвященный кон-формации нуклеиновых кислот.)

Суперспиральная ДНКBauer W.R., 1978. Structure andreactions of closed duplex DNA, Ann.Rev. Biophys. Bioeng., 7, 287-313.Crick F.H.C., 1976. Linking numbersand nucleosomes, Proc. Nat. Acad. Sci.,73, 2639-2643. (Доступное введениев проблему порядка зацепления, на-пряжения и угла закручивания супер-спиральной ДНК.)Mizuuchi K., O'Dea M.H., Gellert M.,1978. DNA gyrase: subunit structureand ATPase activity of the purifiedenzyme, Proc. Nat. Acad. Sci., 75,5960-5963.Cozzarelli N.R., 1980. DNA gyrase andthe supercoiling of DNA, Science, 207,953-960.

Репарация ДНКHanawalt P.C., Cooper P.K.,Ganesan A.K., Smith C.A., 1979. DNArepair in bacteria and mammalian cells,Ann. Rev. Biochem., 48, 783-836.Lindahl Т., Ljungquist S., Siegert W.,Nyberg B., Sperens В., 1977. DNA N-glycosidases. Properties of uracil-DNAglycosidase from Escherichia coli, J. Biol.Chem., 252, 3286-3294.Cleaver J.E., 1978. Xerodermapigmentosum. In: Stanbury J.B.,Wyngaarden J. В., Fredrickson D. S.(eds.), The Metabolic Basis of InheritedDisease (4 th ed.), pp. 1072-1095,McGraw-Hill.

Воспоминания и исторические очеркиCairns J., Stent G.S., Watson J. D. (eds.),1966. Phage and the Origins ofMolecular Biology, Cold Spring HarborLaboratory. (Увлекательный сборниквоспоминаний некоторых основопо-ложников молекулярной биологии.)Watson J.D., 1968. The Double Helix,Atheneum. (Живой рассказ об откры-

тии структуры ДНК и ее биологичес-ких функциях, в котором проступаетяркая личность автора.) [Имеетсяперевод: Уотсон Д. Двойная спи-раль. - М.: Мир, 1969.]Olby R., 1974. The Path to the Double

Helix, University of Washington Press.Portugal F.H., Cohen J.S., 1977.A Century of DNA: A History of theDiscovery of the Structure and Function

of the Genetic Substance, MIT Press.Judson H., 1979. The Eighth Day ofCreation, Simon and Schuster.

Вопросы и задачи1. Напишите комплементарные

последовательности (в стан-дартной записи в направлении 5'—>3') дляследующих последовательностей:а) GATCAA,б) TCGAAC,в) ACGCGT,г) ТАССАТ.2. Одна из цепей двухспиральной

ДНК имеет следующий нуклео-тидный состав (относительное молярноесодержание): [А] = 0,30, [G] = 0,24.а) Что можно сказать о содержании [Т]и [С] в той же цепи?б) Что можно сказать о содержании [А],[G], [Т] и [С] в комплементарной цепи?

Рис. 24.54. Схематическое изображениерадиоавтографа геля. Виднырадиоактивные фрагменты,образующиеся при специфиче-ском расщеплении олигону-клеотидов.

3. ДНК одного делеционного му-танта бактериофага λ имеет

контурную длину 15 мкм вместо 17 мкм.Сколько пар оснований недостает у этогомутанта?4. Какой результат получили бы

Меселсон и Сталь, если бы ре-пликация ДНК была консервативной? Ука-жите предполагаемое распределение моле-кул ДНК после 1-й и 2-й генерацийв случае консервативной репликации (т.е.когда родительская двойная спираль нерасходится).5. Зависит ли от видовой принад-

лежности способность из-вестных ДНК-лигаз использовать для сое-динения ДНК-цепей NAD+ или АТР?Предположим, что обнаружена новаяДНК-лигаза, нуждающаяся в каком-тодругом источнике энергии. Предположитеприемлемую с энергетической точки зре-ния замену NAD+ или АТР в этой реак-ции.6. ДНК-лигаза из Е. coli релакси-

рует суперспирализованнуюкольцевую ДНК в присутствии AMP. В от-сутствие АТР эта активность не проявляет-ся. Каков механизм этой реакции и почемуон зависит от AMP?7. На рис. 24.54 приведена схема

радиоавтографа геля с четырь-мя дорожками фрагментов ДНК, образо-вавшихся при химическом расщеплении.ДНК содержала 32Р-метку на 5'-конце.Какова последовательность этой ДНК?

Дополнительные вопросы см.: Wood W. В.,Wilson J. H., Benbow R. M., Hood L. Е.Biochemistry: A Problems Aproach,Benjamin, 1974, chs. 16, 17.

ГЛАВА 25ИнформационнаяРНК и транскрипция

В этой главе мы рассмотрим выражениев фенотипе (экспрессию) генетической ин-формации, содержащейся в ДНК. Функциягенов - кодирование синтезируемых в клет-ке белков. Однако сама ДНК не исполь-зуется в качестве непосредственной ма-трицы для синтеза белка. Роль такихматриц выполняют молекулы РНК (рибо-нуклеиновой кислоты). В норме поток гене-тической информации в клетке идет в сле-дующем направлении:

В настоящей главе мы увидим, что неко-торые молекулы РНК играют роль проме-жуточных переносчиков информации в син-тезе белка, тогда как другие молекулыРНК являются частью аппарата белковогосинтеза. Затем мы рассмотрим синтезРНК, протекающий в соответствии с по-следовательностью ДНК-матрицы. Это -процесс транскрипции, за которым следуеттрансляция. При трансляции РНК-ма-трицы направляют синтез белков. Болееподробно этот вопрос рассматриваетсяв гл. 27.

Участие РНК в синтезе белка казалосьвероятным уже в 1940 г., за несколько летдо того, как было показано, что ДНК - ма-териал наследственности. Торбьёрн Кас-персон (Torbjorn Caspersson) изучал рас-пределение РНК и ДНК в отдельныхэукариотических клетках с помощью свето-вой микроскопии. Он исходил из того фак-та, что и РНК, и ДНК сильно поглощаютультрафиолетовый свет с длиной волны260 нм, но только ДНК интенсивно окра-


шивается реактивом Фёльгена. Касперсонобнаружил, что почти вся ДНК содержит-ся в ядре, тогда как РНК находится боль-шей частью в цитоплазме. К такому жевыводу пришел Жан Браше (Jean Brachet),который разделял клетки на ядерную и ци-топлазматическую фракции и определялв них содержание ДНК и РНК. Более того,он обнаружил, что РНК в цитоплазматиче-ской фракции находится в составе малень-ких частиц и ассоциирована с белком. Бы-ло показано, что эти частицы, состоящиеиз РНК и белка, служат местом синтезабелка. Теперь их называют рибосомы.

25.1. Структура РНКРНК, подобно ДНК, представляет собойдлинную неразветвленную молекулу, со-стоящую из нуклеотидов, соединенныхфосфодиэфирными связями 3'—>5'. Числонуклеотидов в молекуле РНК колеблетсяот всего лишь 75 до многих тысяч. Кова-лентная структура РНК отличается отДНК в двух отношениях. Как указываетсамо название, сахарный остатокв РНК - рибоза, а не дезоксирибоза. Рибозасодержит 2'-гидроксильную группу, кото-рой нет в дезоксирибозе. Другое различиесостоит в том, что одним из четырех осно-ваний в РНК является урацил (U) - вместотимина, содержащегося в ДНК. Как и ти-мин, урацил может образовывать пару ос-нований с аденином. Но в молекуле ураци-ла нет метильной группы, имеющейсяв молекуле тимина.

Таблица 25.1. Молекулы РНК у Е. coli

Тип РНК

Рибосомная(рРНК)

Транспортная(тРНК)

Информаци-онная (мРНК)

Отно-ситель-ное со-держа-ние, %

80

15

5

Коэф-фици-ентседи-мента-ции,S

23165

4

Масса, кДа

1,2•103

0,55•1 03

3,6•101

2,5•101

Гетерогенна

Числонукле-

отидов

37001700

120

75

Молекулы РНК имеют одноцепочечноестроение, за исключением РНК некоторыхвирусов. Поэтому нуклеотидный составРНК не подчиняется правилу комплемен-тарности. Действительно, в большинствемолекул РНК содержание аденина отли-чается от содержания урацила, а содержа-ние гуанина отличается от содержания ци-тозина. Но молекулы РНК все-таки содер-жат участки с двухцепочечной структурой,которые образуют петли в виде шпилек(рис. 25.2). В этих участках А спариваетсяс U, a G спаривается с С. Кроме того,G может образовывать пару основанийс U, но она менее прочна, чем GС-пара(разд. 27.6). Спаривание основанийв шпильках РНК часто несовершенно. Не-которые основания, расположенныев шпильке друг против друга, не компле-ментарны, и одно или несколько основа-ний в одной из цепей могут выпетливаться(выступать) из участка двойной спирали,чтобы облегчить спаривание других осно-ваний. Доля двухспиральных участковв различных РНК варьирует в широкихпределах - в наиболее типичном случае до50%

Рис. 25.2. РНК может складываться самана себя и образовывать двухс-пиральные структуры.

Рис. 25.1. Структура части цепи РНК.

25.2. Клетки содержат три типа РНК:рибосомную, транспортную и инфор-мационнуюКлетки содержат три типа РНК(табл. 25.1). Информационная РНК (ее на-зывают также матричная РНК, отсюдамРНК) служит матрицей для синтеза бел-ка. Каждому работающему гену (или груп-пе генов) соответствует своя молекуламРНК. Следовательно, мРНК - крайне ге-терогенный класс молекул, у Е. coli сред-няя длина молекулы мРНК составляетпримерно 1,2 kb. Транспортная РНК(тРНК) переносит аминокислоты в активи-рованной форме к рибосомам, где они сое-диняются пептидной связью в определен-

25. Информационная РНКи транскрипция 47

Единица Сведберга (S) -коэффициенты седиментации биологических макромолекул выражаютсяв единицах Сведберга (сокращенно S); 1S = 10- 1 3 с. (Сведберг - шведскийученый, изобретатель ультрацентрифуги.)

ной последовательности, которую задаетРНК-матрица. Для каждой из 20 амино-кислот имеется по крайней мере одна раз-новидность тРНК, Транспортная РНК со-стоит примерно из 75 нуклеотидов (масса25 кДа). Это самые маленькие молекулыРНК. Рибосомная РНК (рРНК) - основнойкомпонент рибосом, но пока ее роль в син-тезе белка точно не установлена. В клеткеЕ. coli имеется три разновидности рРНК,называемые 23S-, 16S- и 5S-PHK соответ-ственно их поведению при седиментации.В каждой рибосоме содержится по одноймолекуле каждой из этих трех разновидно-стей РНК. Из трех указанных типов РНК(мРНК, тРНК, рРНК) количественно пре-обладает рРНК. Затем идет тРНК, и мень-ше всего в клетке содержится информа-ционной РНК, на долю которой приходит-ся всего лишь 5% всей РНК.

25.3. Формулирование концепцииинформационной РНККонцепция мРНК была сформулированаФрансуа Жакобом и Жаком Моно(Francois Jacob, Jacues Monod) в классиче-ской статье, опубликованной в 1961 г. По-скольку в эукариотических клетках белкисинтезируются в цитоплазме, а не в ядре,было очевидно, что должен существоватькакой-то химический посредник, коди-руемый генами. Жакоб и Моно назвалиего структурным посредником. Каковаприрода этого промежуточного продукта?Важную роль в решении этого вопроса сы-грало проведенное ими исследование регу-ляции синтеза белка у Е. coli (гл. 28). Неко-торые ферменты Е. coli, например фер-менты, участвующие в поглощении и ис-пользовании лактозы, индуцибельны. Этоозначает, что количество этих ферментовувеличивается более чем в 1000 раз в при-сутствии индуктора (например, изопропил-тиогалактозида). Особенно показательнабыла кинетика индукции. Добавление ин-дуктора уже через несколько минут вызы-вало максимальный синтез ферментов, ка-тализирующих обмен лактозы. При удале-


нии индуктора синтез данных ферментовпрекращался также быстро. Эти экспери-ментальные данные были несовместимыс существованием стабильных матриц длясинтеза указанных ферментов. Отсюда Жа-коб и Моно сделали вывод, что времяжизни посредника должно быть очень ко-ротким. Затем они предположили, что ондолжен обладать следующими свойствами.

1. Посредник должен быть полинуклео-тидом.

2.. Нуклеотидный состав предшественни-ка должен соответствовать нуклеотидномусоставу ДНК, которая его кодирует.

3. Посредник должен быть весьма гете-рогенным по размеру, так как гены (илигруппы генов) различаются по длине. Жа-коб и Моно высказали правильное предпо-ложение, что три нуклеотида кодируютодну аминокислоту, и вычислили, чтомасса посредника должна быть не менее500 кДа.

4. Посредник должен быть временно ас-социирован с рибосомами - местом синтезабелка.

5. Посредник должен синтезироватьсяи распадаться очень быстро. Отсюда сле-дует, что аналоги оснований, например5-фторурацил, должны включаться в по-средник в течение нескольких минут.

Для Жакоба и Моно было очевидно, чтоизвестные в то время фракции РНК неудовлетворяют этим критериям. Рибосом-ная РНК, которую принято было считатьматрицей для синтеза белков, была слиш-ком гомогенна по размеру. Кроме того, еенуклеотидный состав был сходен у видов,сильно различавшихся по нуклеотидномусоставу ДНК. Более того, эта РНК быластабильной, и 5-фторурацил включалсяв нее очень медленно. Транспортная РНКтоже не подходила на роль посредника потем же причинам. К тому же она слишкоммала. Однако в литературе высказывалосьпредположение о существовании третьеготипа РНК, который, по-видимому, удовле-творял всем критериям посредника.В клетках Е. coli, зараженных бактериофа-гом Т2 (рис. 25.3), была обнаружена ранеенеизвестная фракция РНК подходящегоразмера с очень коротким временем жиз-

ни. Самое интересное, что нуклеотидныйсостав этой фракции РНК был близокк составу вирусной ДНК, а не ДНК Е. coli.

25.4. Экспериментальные данныео существовании информационнойРНК-посредника в синтезе белкаПравомочность гипотезы о короткоживу-щей РНК-посреднике, играющей рольпереносчика информации при синтезе бел-ка, была проверена вскоре после того, какгипотеза была сформулирована. СиднейБреннер, Франсуа Жакоб и Мэтью Месел-сон (Sydney Brenner, Francois Jacob,Matthew Meselson) провели экспериментына E. coli, зараженной бактериофагом Т2.Почти все белки, синтезирующиеся послезаражения, детерминируются генами фага.Синтез этих белков не сопровождается уве-личением общего количества РНК. Однаковскоре после заражения появляется минор-ная фракция РНК с коротким временемжизни. Как уже говорилось выше, нуклео-тидный состав минорной фракции РНКсходен с составом фаговой ДНК. Эта си-стема представлялась оптимальной дляпроверки гипотезы посредника, посколькув ней происходило быстрое переключениеприроды синтезируемого белка. Еще однопреимущество состояло в том, что в зара-женных клетках не происходило синтезарРНК и тРНК.

Рис. 25.3. Электронная микрофотогра-фия клетки E. coli, зараженнойвирусами Т2. (Печатается с лю-безного разрешения д-ра LeeSimon.)

Как же происходит при заражении пере-ключение синтеза с одних белков на дру-гие? Одна возможность состояла в том,что фаговая ДНК программирует образо-вание новых рибосом. Согласно этомупредположению, гены определяют синтезспециализированных рибосом, а каждаярибосома может синтезировать белоктолько одного вида. Альтернативное пред-положение, выдвинутое Жакобом и Моно,состояло в том, что рибосомы - неспециа-лизированные структуры, которые полу-чают генетическую информацию от генав виде нестабильной информационнойРНК (посредника). Эксперименты Бренне-ра, Жакоба и Меселсона были спланиро-ваны таким образом, чтобы можно быловыяснить, происходит ли после заражениясинтез новых рибосом или же новообразо-ванная РНК присоединяется к предсуще-ствовавшим рибосомам.

Бактерии выращивали в среде, содержав-шей тяжелые изотопы (15N и 13С), заража-ли фагом и немедленно переносили в сре-ду, содержащую легкие изотопы (14N и12С). Рибосомы, синтезированные дои после заражения, можно было разделитьцентрифугированием в градиенте плотно-сти, так как их плотности различались(«тяжелые» и «легкие» соответственно;рис. 25.4). Новая РНК была помечена ра-диоактивными изотопами с помощью 32Р-и 14С-урацила, а новый белок был помеченизотопом 35S. В результате этих экспери-ментов было установлено следующее.

1. Синтеза рибосом после заражения непроисходит, о чем свидетельствует отсут-ствие «легких» рибосом.

2. РНК синтезируется после заражения.Большая часть радиоактивно меченнойРНК обнаруживается в «тяжелом» рибо-сомном пике. Итак, большая часть ново-синтезированной РНК ассоциированас предсуществующими рибосомами. Допол-нительные эксперименты показали, что вовремя роста фага происходит быстрыйраспад и ресинтез этой новой РНК.

3. Радиоактивный изотоп 35S временнопоявлялся в «тяжелом» рибосомном пике,из чего следует, что синтез новых белковпроисходит на предсуществующих рибосо-мах.

Эти эксперименты позволили сделать


Рис. 25.4. Центрифугирование рибосоми РНК контрольных бактерийи бактерий, зараженных фагомТ2, в градиенте плотности. Ме-ченная 32Р РНК, синтезирован-ная после заражения, попадаетв полосу рибосом, образо-ванных до заражения («тя-желые» рибосомы). После за-ражения синтеза рибосом непроисходит.

следующий вывод: рибосомы - неспециали-зированные структуры, синтезирующиев каждый данный момент тот белок, ко-торый закодирован в информационной РНК,находящейся в данный момент в рибосо-мах. Исследования незараженных бакте-риальных клеток также показали, что ин-формационная РНК служит звеном, пере-носящим информацию от гена к белку.Вскоре представление об информационнойРНК стало одним из основополагающихв молекулярной биологии.

25.5. Опыты по гибридизации показали,что информационная РНК комплементарнакодирующей ее ДНК-матрицеВ 1961 г. Сол Спигелман (Sol Spigelman)разработал новый метод, названный гибри-дизацией. Он должен был дать ответ наследующий вопрос: комплементарна липоследовательность оснований РНК, син-тезированной после заражения фагом Т2,последовательности оснований ДНК фагаТ2? Из работы Джулиуса Мармура и ПолаДоти (Julius Marmur, Paul Doty) было из-вестно, что при нагревании двухспираль-


ной ДНК выше температуры плавленияона переходит в одноцепочечную форму.При медленном охлаждении раствора этицепи реассоциируют и образуют двухспи-ральную структуру, обладающую биологи-ческой активностью. Мармур и Доти обна-ружили также, что двухспиральные моле-кулы образуются только в том случае,если цепи ДНК происходят из организмоводного вида или близкородственных ви-дов. Это наблюдение подсказало Спигел-ману, что в смеси одноцепочечной ДНКи РНК должны образовываться гибридыДНК-РНК, если их последовательностиоснований комплементарны (рис. 25.5).Схема эксперимента была следующей:

1. РНК, синтезированную после зараже-ния Е. coli фагом Т2 (Т2-мРНК), метилиизотопом 32Р. В другом экспериментеДНК фага Т2 (Т2-ДНК) пометили изото-пом 3Н.

2. Смесь Т2-мРНК и Т2-ДНК нагревалидо 100°С. В результате двухспиральнаяДНК расплавлялась и переходила в одно-цепочечную форму. Этот раствор, содержа-щий одноцепочечные РНК и ДНК, медлен-но охлаждали до комнатной температуры.

3. Охлажденную смесь анализировалиметодом центрифугирования в градиентеплотности. Образцы центрифугировали не-сколько дней в бакет-роторе. Затем пласти-

Рис. 25.5. Если РНК и ДНК имеют ком-плементарные последователь-ности, может образоваться ги-брид РНК—ДНК.

ковые пробирки с образцами протыкалиснизу и собирали фракции по каплям длядальнейшего анализа.

В результате были обнаружены три по-лосы (рис. 25.6). Полоса с наибольшейплотностью соответствовала одноцепочеч-ной РНК. Вторая полоса соответствоваладвухспиральной ДНК. Третья располага-лась вблизи от полосы ДНК и состояла издвухцепочечных гибридных молекулДНК—РНК. Итак, Т2-мРНК образовыва-ла гибрид с Т2-ДНК. В отличие от этогоТ2-РНК не гибридизовалась с ДНК мно-гих бактерий и неродственных вирусов, да-же если их нуклеотидный состав был подо-бен Т2-ДНК. Последующие экспериментыпоказали, что фракция мРНК из незара-женных клеток гибридизуется с ДНКименно того организма, из которого онабыла выделена, но не с ДНК нерод-ственных организмов. Эти убедительныеэксперименты продемонстрировали, чтопоследовательность оснований мРНК ком-плементарна последовательности ДНК-ма-трицы. К тому же был разработанмощный метод, с помощью которого мож-но было исследовать поток генетическойинформации в клетках и выяснять, сходныли две молекулы нуклеиновой кислоты.

25.6. Рибосомные РНК и транспортныеРНК также синтезируются наДНК-матрицеМетод гибридизации был использован за-тем, чтобы выяснить, синтезируются лирРНК и тРНК также на ДНК-матрицах.Образование гибридов РНК—ДНК выяв-ляли с помощью фильтров, а не центрифу-гированием в градиенте плотности, так какэтот метод проще, чувствительнее и тре-бует меньше времени. ОдноцепочечныеРНК проходят через нитроцеллюлозныйфильтр, а двухспиральные ДНК и гибридыРНК—ДНК задерживаются на фильтре.РНК Е. coli пометили изотопом 32Р и сме-шали с немеченой ДНК Е. coli. Эту смесьнагревали, медленно охлаждали и затемотфильтровывали через нитроцеллюлозу.Радиоактивность, задержанную на филь-тре, просчитывали. Результаты экспери-ментов не вызывали сомнений: гибридыРНК—ДНК образовывались со всемирРНК (5S, 16S и 23S) и тРНК. Отсюда сле-довало, что в геноме Е. coli имеются после-довательности, комплементарные этим мо-лекулам РНК.

Рис. 25.6. РНК, образовавшаяся послезаражения E. coli фагом Т2,комплементарна вируснойДНК. В этих экспериментах погибридизации РНК метили32Р, а ДНК фага Т2 - 3Н. Рас-пределение радиоактивностив градиенте плотности хлори-стого цезия показывает, чтобольшая часть РНК, синтези-рованной после заражения, по-падает в одну полосу с ДНКфага Т2. (Spiegelman S., Hybridnucleic acids, Sci. Amer., 1964.)

Рис. 25.7. Электронная микрофотогра-фия РНК-полимеразы E. coli.(Печатается с любезного разре-шения д-ра Robley Williamsи д-ра Michael Chemberlin.)


Рис. 25.8. Механизм реакции элонгациицепи, катализируемой РНК-по-лимеразой.

25.7. Все клеточные РНК синтезируетРНК-полимеразaКонцепция мРНК стимулировала поискифермента, который синтезирует РНК в со-ответствии с последовательностью ДНК-матрицы. Стратегия эксперимента былатакой же, как и при поиске ДНК-полиме-разы I. В 1960г. Джерард Хёрвиц и Сэ-мюэл Вейсс (Jerard Hurwitz, Samuel Weiss)независимо открыли такой фермент. Ониназвали его РНК-полимеразой. Ферментуиз клеток Е. соli (рис. 25.7) нужны былидля синтеза РНК следующие компоненты.

1. Матрица. Предпочтительная матри-ца - двухцепочечная ДНК. ОдноцепочечнаяДНК также может служить матрицей. НиРНК (как одноцепочечная, так и двухцепо-чечная), ни гибриды РНК—ДНК не могутслужить эффективными матрицами.

2. Активированные предшественники. Не-обходимы все четыре рибонуклеозидтри-фосфата - ATР, GTP, UTP и СТР.

3. Двухвалентные ионы металлов. Фер-мент активен в присутствии Mg2+ илиMn2 +. In vivo эту потребность ферментаудовлетворяет Mg2+.

РНК-полимераза катализирует инициа-цию и элонгацию цепей РНК. Фермент ка-тализирует следующую реакцию:(РНК)n остатков + Рибонуклеозидтрифос-

фат (РНК)n + 1 остаток + PP i.


Синтез РНК во многих отношенияхподобен синтезу ДНК (рис. 25.8). Во-первых, как будет вскоре показано болееподробно, синтез идет в направлении 5'—>—>3'. Во-вторых, по-видимому, механизмэлонгации сходен. Происходит нуклео-фильная атака внутреннего фосфата оче-редного нуклеозидтрифосфата 3'-ОН-груп-пой на конце растущей цепи. В-третьих,движущая сила синтеза - гидролиз пиро-фосфата.

Однако по некоторым важным особен-ностям синтез РНК отличается от синтезаДНК. Во-первых, РНК-полимеразе не нуж-на затравка. Во-вторых, ДНК-матрица присинтезе РНК полностью сохраняется, тог-да как при синтезе ДНК она сохраняетсялишь наполовину. В-третьих, РНК-полиме-раза, насколько известно, не обладает ни-какими нуклеазными активностями.

Все три типа клеточной РНК Е.coli - мРНК, тРНК и рРНК - синтезируют-ся одной РНК-полимеразой в соответствиис инструкциями, заданными ДНК-матри-цей. В клетках млекопитающих имеет ме-сто разделение труда между несколькимивидами РНК-полимераз. Кроме того, необ-ходимо отметить, что некоторые вирусыкодируют РНК-синтезирующие ферменты,совершенно отличные от ферментов клет-ки-хозяина. Таковы, например, РНК-поли-мераза, кодируемая ДНК-содержащим фа-гом Т7, и РНК-репликаза, кодируемаяРНК-содержащим фагом Qβ. Репликазафага Qβ является РНК-зависимой РНК-полимеразой, так как она синтезируетРНК не по ДНК-матрице, а по РНК(гл. 30). Клеточные же ферменты, синтези-

5 ' - G C G G C G A C G C G C A G U U A A U C C C A C A G C C G C C A G U U C C G C U G G C G G C A U U U U - 3 ' мРНК

3 ' - C G C C G C T G C G C G T C A A T T A G G G T G T C G G C G G T C A A G G C G A C C G C C G T A A A A - 5 'ДНК

5 '-GCGGCGACGCGCAGTTAATCCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTT-3 '

Рис. 25.9. Последовательность основа-ний мРНК комплементарнапоследовательности матрич-ной ДНК. Показана часть по-следовательности триптофано-вого оперона.

рующие РНК, наоборот, представляют со-бой ДНК-зависимые РНК-полимеразы.

25.8. РНК-полимераза получает инструкцииот ДНК-матрицыПодобно ДНК-полимеразам, описаннымв предыдущей главе, РНК-полимераза ис-пользует информацию, содержащуюсяв ДНК-матрице. Первым доводом в поль-зу этого утверждения послужили данныео том, что нуклеотидный состав новосин-тезированной РНК комплементарен соста-ву матричной цепи ДНК. Если в качествематрицы использовать синтетический по-лидезоксирибонуклеотид poly(dT), содержа-щий только остатки тимидиловой кислоты,то в синтезируемую полирибонуклеотид-ную цепь включается только один рибону-клеозидтрифосфат - АТР. Продукт реак-ции - полирибоаденилат [сокращенное обо-значение poly(rA)]. Если в качестве ма-трицы для РНК-полимеразы используетсясополимер с чередующимися основаниямиpoly(dA-dT), то включаются UTP и АТР,а в качестве продукта реакции образуетсяpoly(rA-rU). Нуклеотидный состав РНК,синтезированной с использованием в каче-стве матрицы одноцепочечной ДНК фагаφХ174, также свидетельствует о наличиикомплементарности между РНК-продук-том и ДНК-матрицей (табл. 25.2). Экспери-менты по гибридизации показывают, чтоРНК, синтезированная РНК-полимеразой,

Таблица 25.2. Нуклеотидный состав РНК, синтезиро-ванной на вирусной ДНК в качестве матрицы

ДНК-матрица (плюс-цепь фагаφХ174)

АТGС

0.250,330,240,18

РНК-продукт

0,250,320,230,20

UАСG

комплементарна матричной ДНК. Наибо-лее убедительный довод в пользу надежно-сти копирования ДНК при транскрипцииполучен при изучении последовательностиоснований; оказалось, что последователь-ность мРНК в точности комплементарнапоследовательности матричной ДНК(рис. 25.9).

25.9. Обычно в данном участке геноматранскрибируется только одна цепь ДНКТранскрибируются ли обе цепи двухспи-ральной матричной ДНК, или только од-на? А priori кажется маловероятным, чтов одном и том же участке ДНК обе цепикодируют функциональные белки. Один изпервых ответов на этот вопрос был полу-чен при использовании метода гибридиза-ции в опытах с Е. coli, зараженной фагомφХ174. Частицы фага φХ174 содержатодноцепочечную ДНК, которую называют

Рис. 25.10. Как показывает этот гибриди-зационный эксперимент, толь-ко одна цепь РФ-ДНК фагаφХ174 используется в качествематрицы при транскрипции.


Рис. 25.11. Электронная микрофотогра-фия, на которой виден процесстранскрипции. [Miller О. L.,Hamkalo В. A., Visualization ofRNA synthesis on chromosomes,Int. Rev. Cytol., 33, 1 (1972).]

плюс-цепью. После того как плюс-цепьпроникает в бактерию, синтезируется ком-плементарная минус-цепь, и в результатеобразуется кольцевая двухцепочечная мо-лекула ДНК, называемая репликативнойформой (РФ). Эта РФ-ДНК направляетсинтез мРНК, которая в свою очередь де-терминирует фаговые белки. Вскоре послезаряжения E. coli фагом φХ174 в среду до-бавляли 32Р-фосфат; так получили ра-диоактивную фаговую РНК. Ее выделили.Кроме того, РФ-ДНК разделили на соста-вляющие плюс- и минус-цепи, что нетруд-но сделать, поскольку они различаются понуклеотидному составу и, следовательно,по плавучей плотности. Затем осуществилигибридизацию, с тем чтобы выяснить, ком-плементарна ли новосинтезированнаямРНК плюс-цепи, или минус-цепи, или жеобеим цепям. Был получен однозначныйрезультат: только минус-цепь РФ-ДНКобразовывала гибрид с меченой мРНК.Итак, только одна цепь РФ-ДНК фага


φХ174 служит in vivo матрицей для тран-скрипции.

Точно так же только одна цепь таких ви-русов, как Т7, SP8 и α, транскрибируется invivo. В случае таких вирусов, как фаги Т4или λ, ситуация сложнее. В одних участкахгенома матрицей служит одна цепь, в дру-гих - другая. Такая же транскрипция с пере-меной матрицы в различных группах геновпроисходит и в клетках Е. coli.

25.10. РНК-полимераза Е. coli состоит изсубъединицРНК-полимераза Е. coli - очень большойи сложный фермент. Масса целого фермен-та равна примерно 500 кДа. РНК-полиме-раза состоит из отдельных субъединиц(табл. 25.3); это можно доказать, вызвавдиссоциацию фермента в концентрирован-ном растворе мочевины. Субъединичныйсостав целого фермента, называемого го-

лоферментом,- α2ββ'σ. Как это видно из

Таблица 25.3. Субъединицы РНК-полимеразы E.coli

Обозначениесубъединицы

αβ

β'σ

Числосубъединиц

21

11

Масса, кДа .

4015516595

Рис. 25.12. Электронная микрофотогра-фия РНК-полимеразы-голо-фермента, связанного со мно-гими промоторными участка-ми фрагмента ДНК фага Т7.[Williams R.C., Ргос. Nat. Acad.Sci., 74, 2313 (1977).]

последующего текста, после того как ини-циация синтеза РНК произошла, σ-субъе-диница отделяется от фермента. РНК-по-лимераза без σ-субъединицы называетсяминимальным ферментом или кор-фермен-том (α2ββ'). Каталитический участок РНК-полимеразы находится в кор-ферменте.Установлено, что β'-субъединица участвуетв связывании с ДНК-матрицей, а β-субъе-диница - в связывании субстратов - рибону-клеозидтрифосфатов. σ-Субъединица голо-фермента участвует в выборе участкаинициации транскрипции.

Синтез РНК РНК-полимеразой Е. coliпроисходит в три этапа, называемых1) инициация, 2) элонгация и 3) термина-ция. С этими процессами мы познакомим-ся несколько ниже.

25.11. Транскрипция инициируется на промо-торных участках матричной ДНКТранскрипция начинается в определенныхучастках матричной ДНК, называемыхпромоторами. Как РНК-полимераза нахо-дит эти участки? Один из подходов к ре-шению этой проблемы состоит в том,чтобы выделить те фрагменты, которыеголофермент РНК-полимеразы защищаетот расщепления панкреатической дезокси-

рибонуклеазой, и определить в этих фраг-ментах последовательность нуклеотидов.Другой подход сводится к тому, чтобы ис-следовать ряд мутантов с повышенной илипониженной интенсивностью транскрипцииопределенных генов. В результате такихисследований было установлено, что про-моторные участки состоят примерно из со-рока пар оснований, что соответствуетфрагменту ДНК длиной примерно 140 А.Как показал анализ различных промото-ров Е. coli и фагов, функцию сигнала узна-вания в основном выполняет последова-тельность семи пар оснований, серединакоторой находится на расстоянии пример-но 10 нуклеотидов перед точкой, с которойначинается кодирование мРНК (рис. 25.13).Второй участок узнавания расположен нарасстоянии около 35 нуклеотидов передточкой начала мРНК; он также участвуетв первоначальном связывании РНК-поли-меразы.

25.12. σ-Субъединица обеспечиваетузнавание промоторных участков РНК-полимеразойКор-фермент (α2ββ') РНК-полимеразы неможет начинать транскрипцию в промо-торных участках. Для специфической ини-циации необходим голофермент α2ββ'σРоль сигма-субъединицы была открытаследующим образом. Если РНК-полимера-зу очищали хроматографией на колонкес фосфоцеллюлозой, то она была практи-

Рис. 25.13. Промоторные последователь-ности лактозного (А), галактоз-ного (Б) и триптофанового (В)оперонов E.coli, фагов λ (Г)и φХ174 (Д) и вируса SV-40 (Е).Предполагаемая область го-мологии, так называемая по-следовательность Прибнова(Pribnow), показана зеленым.


Рис. 25.14. Разделение РНК-полимеразына σ-субъединицу и кор-фер-мент (минимальный фермент;

α2ββ') на колонке с фосфоцел-люлозой.

чески лишена активности при использова-нии в качестве матрицы ДНК фага Т4, носохраняла активность в опытах с ДНК изтимуса теленка. Наряду с этим та же РНК-полимераза, очищенная центрифугирова-нием в градиенте концентрации глицерола,была, напротив, весьма активна на обеихматрицах. Из этого наблюдения можнобыло сделать вывод, что в препарате РНК-полимеразы, очищенной на фосфоцеллю-лозе, не хватает какого-то фактора. Так онои было (рис. 25.14). Активность фермента,очищенного на фосфоцеллюлозе, значи-тельно увеличивается при добавлении дру-гой фракции, элюирующейся с колонки.Этот стимулирующий фактор сам по себене обладает каталитической активностью.Он был назван сигма (σ)-фактором. После-дующие эксперименты показали, что фер-мент, очищенный на фосфоцеллюлозе,лишен σ-субъединицы, тогда как фермент,очищенный в глицероле, содержит ее. Та-ким образом, препарат, проявлявший мак-симальную активность при использованиив качестве матрицы ДНК фага Т4, предста-влял собой голофермент α2ββ'σ а кор-фер-мент α2ββ' был не в состоянии транскриби-ровать эту ДНК. Добавление σ-субъеди-ницы к кор-ферменту приводило к рекон-струкции вполне активного голофермента.Кор-фермент обладал способностью тран-скрибировать ДНК тимуса теленка, таккак эта матрица содержит много одноце-почечных разрывов. РНК, синтезированнаякор-полимеразой in vitro, не соответствуеттранскриптам, образующимся in vivo.В частности, кор-фермент транскрибирует


обе цепи фаговых ДНК-матриц, тогда какголофермент транскрибирует асимметрич-но одну цепь, как он это делает in vivo.

Сигма-субъединица обеспечивает специ-фическую инициацию, снижая в 104 разсродство РНК-полимеразы к ДНК, несодержащей промоторов. Кроме того, сиг-ма-субъединица активирует узнавание про-моторных последовательностей РНК-поли-меразой. Наконец, сигма-субъединица уча-ствует в раскрывании двойной спиралиДНК, так чтобы одна из цепей могла слу-жить матрицей. При связывании голофер-мента РНК-полимеразы расплетается при-мерно один виток спирали ДНК. Такпроисходит подготовка фермента к обра-зованию первой фосфодиэфирной связи но-вой цепи РНК.

После того как начинается синтез новойцепи РНК, сигма-субъединица отделяетсяот голофермента. Кор-фермент продол-жает транскрибировать матрицу ДНК. Та-ким образом, функция голофермента —поиск промотора и инициация, а функциякор-фермента - элонгация. Отделившаясясигма-субъединица присоединяется к дру-гой молекуле кор-полимеразы, чтобы уча-ствовать в инициации нового цикла тран-скрипции.

Инициация новых цепей РНК регули-руется многими способами. Некоторыепромоторные последовательности обеспе-чивают высокую эффективность инициа-ции, другие менее эффективны. Кроме то-го, эффективность инициации регулируетсябелками, которые связываются с самимпромоторным участком или рядом с ним.Репрессоры блокируют транскрипцию,препятствуя связыванию РНК-полимеразы,а факторы положительной регуляции спо-собствуют инициации, облегчая связываниеРНК-полимеразы. Эти важные регуля-торные механизмы мы рассмотрим под-робнее в гл. 28.

25.13. Цепи РНК начинаются с pppG илирррАБольшинство новосинтезированных цепейРНК содержат своего рода ярлычок, ко-торый показывает, с чего начался их син-тез. Новые цепи РНК имеют строго опре-деленную структуру 5'-конца: молекуланачинается либо с рррА, либо с pppG. В от-личие от синтеза ДНК затравка в этомслучае не нужна. Цепи РНК могут обра-зовываться de novo.

Этот ярлычок на 5'-конце был открытдвумя способами. Было обнаружено, чтоцепи РНК включают 32Р, если инкуба-ционная смесь содержит меченный поγ-атому 32Р-АТР. Очевидно, что включен-ная метка должна быть локализована наконце, так как только α-атом фосфора ну-клеозидтрифосфата может участвоватьв образовании внутренних фосфодиэ-фирных мостиков РНК. Кроме того, прищелочном гидролизе новосинтезированнойРНК образуются продукты трех типов: ну-клеозиды, нуклеозид-2'-монофосфаты (илинуклеозид-3'-монофосфаты) и нуклеозид-тетрафосфаты (рис. 25.15). Если в ка-честве субстрата использовали γ-32Р-АТР,образовывался аденозин-3'-фосфат-5'-три-фосфат. γ-Атом фосфора этого нуклео-зидтетрафосфата содержал метку. Анало-гичный результат был получен с γ-32P-GTP.Однако, если взять γ-меченный СТР илиUTP, радиоактивность не включается.Следовательно, новообразованная цепьРНК имеет трифосфатную группу на5'-конце и свободную ОН-группу на 3'-конце.

25.14. Цепи РНК синтезируютсяв направлении 5'—>3'В каком направлении синтезируется РНК?В направлении 5'—>3' или 3'—>5'? Двапротивоположных механизма роста цепипроиллюстрированы на рис. 25.16. При ро-сте в направлении 5'—>3' трифосфатныйконец образуется в начале роста цепи,а при росте 3'—>5' трифосфатный конецпоявляется с последним включеннымостатком. Кинетика включения радиоак-тивности в РНК, синтезированную изγ-32P-GTP (или АТР), указывает, какая изэтих возможностей имеет место. Если в ка-честве субстрата использовать γ-32P-GTP,то отношение включения 32Р к общемувключению нуклеотидов в продукт дости-гает максимума очень быстро после сме-шивания компонентов, а затем постепенноснижается во времени. При этом общая ра-диоактивность уже помеченной РНК неснижается при последующем добавлениибольшого избытка нерадиоактивного GTP

в инкубационную смесь. Таким образом,32Р включается в молекулу РНК в началесинтеза, а не в конце. Следовательно, ростцепи РНК идет в направлении 5 ' — > 3 ' , какпри синтезе ДНК.

Кор РНК-полимеразы движется вдольцепи матричной ДНК в направлении 3'—>—>5', так как матричная цепь антипарал-лельна новосинтезированной цепи ДНК.Одна и та же молекула РНК-полимеразысинтезирует весь транскрипт - иными сло-вами, транскрипция процессивна. По меретого как расплетается очередной участокДНК, транскрибированный участок восста-навливает свою двухспиральную конфор-мацию. Максимальная скорость элонгациисоставляет примерно 50 нуклеотидовв секунду.

Необходимо подчеркнуть, что РНК-по-лимераза не обладает нуклеазной актив-

Рис. 25.15. Продукты щелочного гидроли-за цепи РНК, меченной с по-мощью γ-32Р-АТР.


Рис. 25.16. Предполагаемое положение32Р-метки в случае роста в на-правлении 5'—>3' и 3'—>5'. На-блюдаемое в действительностиположение метки показывает,что РНК синтезируется в на-правлении 5'—>3'.

ностью. В отличие от ДНК-полимеразыРНК-полимераза не проверяет правильно-сти новообразованной полинуклеотиднойцепи. В связи с этим надежность тран-скрипции значительно ниже, чем надеж-ность репликации. Частота ошибок присинтезе РНК составляет примерно однуошибку на 104—105 нуклеотидов, что в 105

раз выше, чем при синтезе ДНК. Гораздоболее низкую надежность синтеза РНКклетка обходит тем, что с одного гена син-тезируется много копий РНК-транскрип-тов.

25.15. Матричная ДНК содержит стоп-сиг-налы для транскрипцииТерминирование транскрипции регулирует-ся так же тонко, как и инициирование.В матричной ДНК имеются стоп-сигналы,которые были расшифрованы путем срав-нения различных последовательностей ос-нований в этих участках. Все они имеютодну общую особенность: вслед за GC-бо-гатой областью перед участком термина-ции располагается АТ-богатая последова-тельность. Отличительная особенностьтерминирующих последовательностей —симметрия второго порядка этой GC-бога-


той области (рис. 25.17). Следовательно,РНК-транскрипт этой области самоком-плементарен, а это значит, что он способенк спариванию оснований, приводящемук образованию структуры шпильки(рис. 25.18). Кроме того, новообразованныецепи РНК кончаются несколькими остат-ками U, которые кодируются серией осно-ваний А в АТ-богатой области ДНК-ма-трицы. Одна или несколько подобныхструктурных особенностей заставляютРНК-полимеразу задержаться, сделатьпаузу, когда она сталкивается с таким сиг-налом. В некоторых участках терминацииновообразованные цепи РНК высвобо-ждаются без участия дополнительных бел-ков. В других местах для терминации цепинеобходимо участие белка ρ (ро).

25.16. Белок ρ участвует в терминированиитранскрипцииТот факт, что терминирование транскрип-ции в некоторых участках происходитс участием белка ρ, подтверждается сле-дующими данными: молекулы РНК, син-тезированные in vitro в присутствии белкаρ, короче молекул, полученных в его отсут-ствие. Например, РНК, синтезированная наДНК фага fd в присутствии белка ρ, имееткоэффициент седиментации 10S, тогда какРНК, синтезированная в отсутствие бел-ка ρ,- 23S. Дополнительные сведения о дей-ствии белка ρ были получены при добавле-нии этого фактора терминации в инкуба-ционную смесь через различные промежут-ки времени после начала синтеза РНК.Если белок ρ добавляли через несколькосекунд, через 2 и 10 мин после инициации,получали РНК с коэффициентами седимен-тации 13, 17 и 23S соответственно. Этот ре-

Рис. 25.17. Последовательность ДНК,соответствующая 3'-концуtrp-мРНК E.coli. Последова-тельности оснований, пока-занные желтым цветом, обла-

дают симметрией второго по-рядка относительно оси, обо-значенной зеленым цветом.

зультат свидетельствует о том, что матри-ца содержит но крайней мере три участкатерминации, чувствительных к белку ρ (онидают 10S-, 13S- и 17S-PHK), и один участок

терминации, не требующий белка ρ (дает23S-PHK). Следовательно, специфическаятерминация может происходить и в отсут-ствие белка ρ. Однако белок ρ выявляетдополнительные сигналы терминации, ко-торые сама по себе РНК-полимераза узна-вать не может.

Каким образом белок ρ вызывает терми-нацию синтеза РНК по достижении опре-деленных сигналов терминации? Одна извозможностей состоит в том, что этот бе-лок-тетрамер с массой 200 кДа - садитсяна РНК и движется по направлению к мо-лекуле РНК-полимеразы, останавливая еена участке терминации. Согласно этой мо-дели, белок ρ вытесняет РНК-полимеразус 3'-конца РНК, что приводит к высвобож-дению РНК-транскрипта. Интересно отме-тить, что при терминировании транскрип-ции белок ρ гидролизует АТР.

Как можно было предвидеть, термини-рование транскрипции некоторых геновконтролируется. В ходе дальнейшего изло-жения мы увидим, что бактериофаг λ син-тезирует белки-антитерминаторы, обеспе-чивающие возможность транскрипциии экспрессии некоторых генов (разд. 28.11),У Е. coli действует система регуляции с ис-пользованием специализированных терми-нирующих сигналов, называемых атте-нюаторами, для обеспечения пищевых по-требностей клетки (разд. 28.9).

Рис. 25.18. Последовательность основа-ний 3'-конца мРНК, транскри-бированной с триптофановогооперона E.coli. Возможно обра-зование стабильной структурышпильки.


Рис. 25.19. Влияние фактора ρ на размертранскрибируемых РНК.

25.17. Многие молекулы РНКпосле транскрипции расщепляютсяи химически модифицируютсяОбразование функционально активных мо-лекул РНК (процессинг) продолжается пос-ле завершения транскрипции. У прокариотмолекулы транспортных и рибосомныхРНК образуются путем расщепления и хи-мической модификации определенных ново-синтезированных цепей РНК. Например,у E.coli три вида молекул рибосомныхРНК и одна молекула транспортной РНКвырезаются из первичного РНК-тран-скрипта, который, кроме того, содержитспейсерные (разграничивающие) участки(рис. 25.20). Другие транскрипты содержатпо несколько различных видов тРНК илинесколько копий одной и той же тРНК.Нуклеазы, которые расщепляют и укорачи-вают эти предшественники рРНК и тPHK,действуют с высокой точностью. Напри-мер, рибонуклеаза Р образует правильные5'-концы всех молекул тРНК в клетке Е.coli. Рибонуклеаза III вырезает предше-ственники 5S-, 16S- и 23S-pPHK из первич-ного транскрипта, расщепляя опреде-ленные связи в двухспиральных шпи-лечных областях. Молекулы мРНК у про-кариот, наоборот, практически не претер-певают модификации. Более того, многиеиз них транслируются еще до того, как за-канчивается их транскрипция. В то же вре-мя некоторые вирусные мРНК (например,мРНК фага Т7) расщепляются рибонуклеа-зой III раньше, чем начинается трансляция.


Второй тип процессинга - присоединениенуклеотидов к концам некоторых РНК.Например, последовательность ССА при-соединяется к 3'-концам молекул тРНК.которые еще не обладают этой конце-вой последовательностью. У эукариот к3'-концу большинства молекул мРНКприсоединяется длинная последователь-ность poly(A), а метилированный нуклео-тид G (так называемый «колпачок», или«кеп») - к 5'-концу (разд. 29.22).

Модификации оснований и рибозныхостатков представляют собой третий типпроцессинга. У эукариот одна 2'-гидрок-сильная группа примерно на сто рибозныхостатков в рРНК ферментативно метили-руется за счет S-аденозилметионина.У бактерий в рРНК метилируются неостатки рибозы, а основания. Особенно ин-тересны необычные основания, которыевстречаются во всех молекулах тРНК(разд. 27.3). Они образуются путем фер-

ментативной модификации обычных рибо-нуклеотидов, входящих в состав предше-ственника тРНК. Например, псевдоуриди-лат и риботимидилат образуются путеммодификации уридиловых остатков послетранскрипции.

У эукариот все транскрипты подвер-гаются интенсивному процессингу.Расщепление и модификация предшествен-ников рРНК и тРНК напоминают соответ-ствующие процессы у прокариот. Удиви-тельное отличие состоит в том, что мРНКэукариот образуется путем расщеплениябольшого транскрипта и последующего сра-щивания (сплайсинга) получающихся приэтом фрагментов. Это явление мы рассмо-трим в одной из следующих глав(разд. 29.21). У эукариот транскрипцияи трансляция происходят в различных ком-партментах клетки. По всей вероятности,процессинг РНК играет ключевую рольв регуляции транспорта мРНК, рРНКи тРНК из ядра в цитозолъ.

25.18. Антибиотики - ингибиторы транскрип-ции: рифамицин и актиномицинАнтибиотики - очень интересные молекулы,так как многие из них представляют собойвесьма специфические ингибиторы биоло-гических процессов. Актиномицин и рифа-мицин - два антибиотика, ингибирующих

Рис. 25.20. При расщеплении этого пер-вичного транскрипта обра-зуются молекулы 5S, 16S и 23SрРНК и одна молекула тРНК.Спейсерные участки закра-шены желтым цветом.

транскрипцию совершенно различным пу-тем. Рифамицин, образуемый бактериямиStreptomyces, и его полусинтетическое про-изводное рифампицин специфически инги-бируют инициацию синтеза РНК. Эти ан-тибиотики не предотвращают связыванияРНК-полимеразы с ДНК-матрицей. Ри-фампицин препятствует образованию пер-вой фосфодиэфирной связи в цепи РНК.При этом антибиотик практически невлияет на элонгацию цепи. Столь высокаяизбирательность ингибирующего действияделает рифампицин ценным инструментомв молекулярно-биологических исследова-ниях. Например, его можно использоватьдля подавления инициации новых цепейРНК, не затрагивая транскрипции тех це-пей, синтез которых уже начался. Ми-шенью для рифампицина, видимо, служитβ-субъединица РНК-полимеразы. Были вы-делены мутанты Е. coli, устойчивые к ри-фампицину (так называемые rif-r-му-танты). В некоторых из них электрофоре-тическая подвижность β-субъединицы из-менена.

Механизм действия актиномицина D (со-

держащего полипептиды антибиотика, про-дуцируемого микроорганизмом Streptomy-ces) совершенно отличен от механизма дей-ствия рифампицина. Актиномицин D проч-но связывается с двухспиральной ДНК иза счет этого подавляет ее активностьв качестве матрицы для синтеза РНК.Он состоит из двух идентичных цикли-ческих пептидов, соединенных феноксазо-новой системой колец (рис. 25.22). Составэтих циклических пептидов необычен: онисодержат саркозин, метилвалин и D-валин.Кроме того, в их молекуле имеется эфир-


Рис. 25.21. Пространственная модельструктуры актиномицина D.Феноксазоновое кольцо обо-значено красным цветом, ци-клические пептиды - желтым.(По рисунку, любезно пред-оставленному д-ром HenrySobell.)

ная связь между гидроксильной группойтреонина и карбоксильной группой метил-валина.

Актиномицин D прочно связываетсяс двухспиральной ДНК, но не с одноцепо-чечными ДНК или РНК, двухспиральнойРНК или РНК-ДНК-гибридами. Крометого, связывание актиномицина с ДНК за-метно усиливается с увеличением содержа-ния остатков гуанина. Спектроскопическиеи гидродинамические исследования ком-плексов актиномицина D с ДНК свиде-тельствуют о том, что феноксазоновоекольцо актиномицина проникает в ДНКмежду двумя соседними парами основа-ний. Такой способ связывания называетсяинтеркаляцией (рис. 25.23). При низкихконцентрациях актиномицин D ингибируеттранскрипцию, не оказывая сколько-нибудьсущественного влияния на репликациюДНК. На синтез белка непосредственно ак-тиномицин также не влияет. Благодаряэтому актиномицин D широко использо-вался в качестве специфического ингибито-

62Часть IV,Информация

ра образования новых РНК как в прока-риотических, так и в эукариотических клет-ках.

Недавно структура кристаллическогокомплекса одной молекулы актиномицинас двумя молекулами дезоксигуанозина бы-ла изучена на уровне атомного разрешения(рис. 25.23). В этом комплексе феноксазо-новое кольцо актиномицина зажато междудвумя гуаниновыми кольцами. Один изциклических пептидов расположен над фе-ноксазоновым кольцом, другой - под ним.Каждый из этих пептидов образуетсильные водородные связи с 2-аминогруп-пой гуанинового остатка. Между антибио-тиком и нуклеозидами осуществляетсямного энергетически выгодных вандер-ваальсовых взаимодействий. Важная осо-бенность этого комплекса состоит в том,что он почти симметричен. Ось симметриивторого порядка проходит вдоль линии,соединяющей средние атомы О и N фенок-сазонового кольца. Конформация всегокомплекса показывает, что актиномицинузнает в ДНК последовательность основа-ний GpC. Обратите внимание, что еслив одной цепи ДНК имеется последователь-ность 5'GpC3', то в комплементарной цепипоследовательность будет 3'CpG5'. По-ви-димому, актиномицин интеркалируетв ДНК между двумя GC-парами основа-ний и взаимодействует с остатками G в ос-новном таким же образом, как и в ком-плексе с динуклеотидом. Согласно этоймодели, циклические пептидные остаткилокализованы в малой бороздке спиралиДНК. Главная особенность этой моделисостоит в том, что симметрия молекулыактиномицина соответствует симметрииопределенной последовательности в ДНК1.

25.19. Разработаны совершенные методыопределения последовательностинуклеотидов в РНКВысокая разрешающая способность мето-да гель-электрофореза дает возможностьбыстро определять последовательности ну-клеотидов как в молекулах РНК, так и

1 Изложенная точка зрения на структуру ком-плекса актиномицина D с ДНК не является об-щепризнанной. Существует и другая гипотеза,согласно которой актиномицин не интеркали-рует в ДНК, а связывается в малой бороздке,причем структура комплекса актиномицина Dс динуклеотидом GpC не отражает структурыего комплексов с протяженными молекуламиДНК. - Прим. перев.

Рис. 25.22. Структура актиномицина D.

в молекулах ДНК. Для этого 3'- или 5'-ко-нец цепи РНК метят радиоактивной груп-пой. Затем меченую цепь частично расще-пляют по одному из четырех оснований,чтобы получить набор фрагментов. Специ-фическое (или избирательное) расщеплениеможно провести с помощью ферментов,специфичных к определенному основаниюэндонуклеаз (табл. 25.4). Например, рибо-нуклеаза Т1 гидролизует РНК с 3'-стороныостатков G. Кроме того, РНК можно спе-цифически расщепить с помощью химиче-ской модификации одного из четырех осно-ваний. Затем остов расщепляют в месте,где расположено модифицированное осно-вание. После этого четыре набора фраг-ментов разделяют гель-электрофорезоми последовательность оснований РНК чи-тают непосредственно с радиоавтографа(рис. 25.24), как и в случае ДНК(разд. 24.28). Эти подходы позволяют лег-ко определять в молекулах РНК последо-вательность 100-200 нуклеотидов.

Другая стратегия сводится к тому,чтобы определять последовательность ну-клеотидов не в самой РНК, а в комплемен-

тарной ДНК. Но как получить комплемен-тарные фрагменты ДНК? Один из мето-дов состоит в следующем. С помощьюрестрикционных эндонуклеаз фрагменти-руют большие молекулы ДНК. Затем ме-тодом гибридизации идентифицируют ре-стрикционные фрагменты, содержащие по-следовательность, комплементарную ис-следуемой РНК. В другом случае компле-ментарную ДНК синтезируют фермента-тивно по РНК-матрице с помощью обрат-ной транскриптазы из опухолеродных ви-русов (разд. 30.19). Именно так была рас-шифрована полная последовательность 576нуклеотидов мРНК, колирующей β-цепьгемоглобина человека.

ЗаключениеПоток генетической информации в нор-мальных клетках происходит в направле-нии: ДНК —> РНК —> белок. Синтез РНКпо ДНК-матрице называется транскрип-цией, а синтез белка по РНК-матрице -трансляцией. Существует три типа моле-


Таблица 25.4. Ферменты, используемые при определении последовательности нуклеотндов в РНК1)

Фермент

Рибонухлеаза T1

Панкреатическая рибонукле-аза

Рибонуклеаза U2

Рибонуклеаза I(из P. polycephalum)

Щелочная фосфатаза (из Е. соli)

Фосфодиэстepaзa из селезен-ки крупного рогатого скота

Фосфодиэстераза змеиногояда

Полинуклеотидкиназа

Тип активности

Эндо- и экзонуклеаза

Эндо- и экзонуклеаза

Эндо- и экзонуклеаэа

Эндо- и экзонуклеазаN = A, G, U, но не С

Фосфатаза

Экзонуклеаза

Экзонуклеаза

Киназа

Субстрат Продукты

1) В эту таблицу необходимо внести еще один фермент - РНК-лигазу. С его помощью осуществляетсявключение метки в 3'-концы РНК: —XpY + pCp —> XpYpCp (pCp содержит 32Р-метку).- Прим. перев.

Рис. 25.23. Предполагаемая структуракомплекса актиномицина Dс ДНК. Феноксазоновое коль-цо актиномицина (показанокрасным цветом) интеркали-рует между двумя GС-парамиДНК (показаны синим цветом).Циклические пептиды актино-мицина D (желтые) связывают-


ся с малой бороздкой спиралиДНК. Между актиномициномD и соседними гуанинами воз-никает несколько водородныхсвязей. Ось симметрии субъе-диниц актиномицина D совпа-дает с осью симметрии сахаро-фосфатного остова и последо-вательности оснований ДНК.(По рисунку, любезно пред-оставленному д-ром HenrySobell.)

Рис. 25.24. Радиоавтограф фрагмента5S-PHK дрожжей. 3'-конец по-мечен радиоактивной меткой.Четыре дорожки соответ-ствуют расщеплению по остат-кам G, А, С и U. На геле можнопрочитать последовательность5'-CGAAACUCAGGUGCUG-CAAUC-3'. [Peattie D. А., Ргос.Nat. Acad. Sci., 76, 1762 (1979).]

кул РНК: информационная РНК (мРНК),транспортная РНК (тРНК) и рибосомнаяРНК (рРНК). Все эти РНК одноцепо-чечные. Транспортная РНК и рибосомнаяРНК содержат протяженные двухспи-ральные участки, которые образуются прискладывании цепи в шпильки. Самыми ма-ленькими молекулами РНК являютсятРНК; они содержат около 75 нуклеоти-дов. Самые длинные молекулы РНК встре-

чаются среди мРНК; они могут содержатьболее 5000 нуклеотидов. Последователь-ность нуклеотидов в длинных цепях РНКможно определить, расщепляя их и разде-ляя фрагменты гель-электрофорезом.

Все клеточные РНК синтезирует РНК-полимераза в соответствии с последова-тельностью ДНК-матрицы. Активиро-ванными промежуточными продуктамислужат рибонуклеозидтрифосфаты. СинтезРНК, как и синтез ДНК, происходит в на-правлении 5'—>3'. РНК-полимераза отли-чается от ДНК-полимеразы тем, что ненуждается в затравке и не обладает нук-леазными активностями. Еще одно отли-чие состоит в том, что ДНК-матрица присинтезе РНК полностью сохраняется, тог-да как при синтезе ДНК она сохраняетсянаполовину. РНК-полимераза Е. coli имеетсубъединичную структуру α2ββ'σ и массу,достигающую 500 кДа. Кор-фермент имеетсостав α2ββ'. Сигма-субъединица увеличи-вает скорость и специфичность транскрип-ции, так как она обеспечивает узнаваниеРНК-полимеразой сигналов начала тран-скрипции в матричной ДНК. СвязываниеРНК-полимеразы с такими промоторнымиучастками вызывает локальное расплета-ние матрицы, что создает условия дляобразования первой фосфодиэфирной свя-зи. Цепи РНК начинаются с pppG илирррА. После инициации синтеза новой це-пи сигма-субъединица отделяется от голо-фермента. Терминация транскрипции также тонко регулируется, как и инициация.Матричная ДНК содержит стоп-сигналытранскрипции. Некоторые из этих сигналовузнает белок ρ. Некоторые специфическиеингибиторы могут блокировать транскрип-цию. Например, антибиотик рифампицинингибирует инициацию синтеза РНК, а ак-тиномицин D блокирует элонгацию РНК.Многие молекулы РНК подвергаются по-сле транскрипции расщеплению и химиче-ской модификации (например, метили-руются). У прокариот молекулы тРНКи рРНК подвергаются интенсивному про-цессингу, а молекулы мРНК почти не пре-терпевают модификаций. У эукариот всетранскрипты сильно модифицируются.


РЕКОМЕНДУЕМАЯЛИТЕРАТУРАС чего начатьMiller О. 1973. The visualization ofgenes in action, Sci. Amer, 228(3),

34-42.Spiegelman S., 1964. Hydrid nucleicacids, Sci. Amer., 210(5), 48-56.Chamberlin M.J., 1976. RNApolymerase: an overview. In: Losick R.and Chamberlin M. (eds.), RNAPolymerase, pp. 17-67, Cold SpringHarbor Laboratory.Открытие информационной РНКJacob F., Monod J., 1961. Geneticregulatory mechanisms in the synthesisof proteins, J.Mol.Biol., 3, 318-356.Brenner S., Jacob F., Meselson M.,1961. An unstable intermediatecarrying information from genes toribosomes for protein synthesis,Nature, 190, 576-581.Hall B.D., Spiegelman S., 1961.Sequence complementarity of T2-DNAand T2-specific RNA, Proc. Nat. Acad.Sci., 47, 137-146.РНК-полимеразаLosick R., Chamberlin M. (eds.), 1976.RNA Polymerase, Cold Spring HarborLaboratory. (Книга содержит рядпревосходных статей.)Chamberlin M.J., 1974. The selectivityof transcription, Ann. Rev. Biochem.,43, 721-776.Travers A., 1976. RNA polymerasespecificity and the control of growth,Nature, 263, 641-646.

Инициирование транскрипцииHayashi M., Hayashi M.N.,Spiegelman S., 1963. Restriction of invivo genetic transcription to one of thecomplementary strands of DNA, Proc.Nat. Acad Sci., 50, 664-672.Taylor K., Hradecna Z., Szybalski W.,1967. Asymmetric distribution of thetranscribing regions on the com-plementary strands of coliphageλ DNA, Proc. Nat. Acad. Sci.,57, 1618-1625.Burgess R.R., Travers A.A., Dunn J.J.,Bautz E.K.F., 1969. Factor stimulatingtranscription by RNA polymerase,Nature, 221, 43-46. (Открытие сигма-фактора.)Gilbert W., 1976. Starting and stoppingsequences for the RNA polymerase. In:Losick R. and Chamberlin M. (eds.),RNA Polymerase, pp. 193-205, ColdSpring Harbor Laboratory.Reznikoff W.S., Abelson J . N . , 1978.The lac promoter. In: Miller J. H. andReznikoff W. S. (eds.), The Operon,pp. 221-243, Cold Spring HarborLaboratory. (Сопоставляются 29 про-моторных последовательностей.)

Терминирование транскрипцииAdhya S., Gottesman M., 1978. Controlof transcription termination, Ann. Rev.Biochem., 47, 967-996.Das A., Merril C., Adhya S., 1978.Interaction of RNA polymerase andrho in transcription termination:coupled ATPase, Proc. Nat. Acad. Sci.,75, 4828-4832.

Wu A.M., Platt T., 1978. Transcriptiontermination: nucleotide sequence at 3'end of tryptophan operon inEscherichia coli, Proc. Nat. Acad. Sci.,75, 5442-5446.

Антибиотики - ингибиторы синтезаРНКGoldberg J.H., Friedman P.A., 1971.Antibiotics and nucleic acids, Ann.Rev. Biochem., 40, 775-810.Sobell H.M., 1974. How actinomycinbinds to DNA. Sci. Amer., 231(2),82-91.

Процессинг РНКPerry R.P., 1976. Processing of RNA,Ann. Rev. Biochem., 45, 605-630.Steitz J.A., Young R.A., 1978.Complementary sequences 1700nucleotides apart from a ribonucleaseIII cleavage site in Escherichia coliribosomal precursor RNA, Proc. Nat.Acad. Sci., 75, 3593-3597.Altman S., 1978. Biosynthesis of tRNA.In: Atlman S. (ed.), Transfer RNA,pp. 48-77, MIT Press.

Определение последовательности ос-нований в РНКPeattie D.A., 1979. Direct chemicalmethod for sequencing RNA, Proc.Nat. Acad. Sci., 76, 1760-1764.Simoncsits A., Brownlee G.G.,Brown R.S., Rubin J.R., Guilley H.,1977. New rapid gel sequencing meth-od for RNA, Nature, 269, 833-836.

Вопросы и задачи1. Сравните ДНК-полимеразу I

и РНК-полимеразу Е. coli покаждому из следующих свойств.а) Субъединичная структура.б) Активированные предшественники.в) Направление элонгации цепи.г) Нуклеазные активности.д) Сохранение матрицы.е) Потребность в затравке.ж) Энергетика реакции элонгации.2. Напишите последовательность

молекулы мРНК, синтезиро-ванной на матричной цепи ДНК со сле-дующей последовательностью:

5'-ATCGTACCGTTA-3'.

3. РНК легко гидролизируетсящелочью, а ДНК нет. Почему?

4. Каким образом кордицепин(3'-дезоксиаденозин) блокирует

синтез РНК?5. Какие продукты должны полу-

читься при частичном гидроли-зе олигорибонуклеотида5'-pGCAGUACUGUC-3'следующими ферментами:а) панкреатической рибонуклеазой,б) рибонуклеазой Т1,в) рибонуклеазой U2,г) рибонуклеазой I из Physarum!6. Исчерпывающий гидролиз оли-

горибонуклеотида панкреатиче-ской рибонуклеазой дает следующие про-дукты: Ср 2Up, AGCp и GAAUp. Гидролизтого же олигонуклеотида рибонуклеазойT1 дает AAUp, UAGp и CCUGp. Каковаего последовательность?Дополнительные вопросы см.: Wood W. В.,Wilson J.H., Benbow R.M., Hood L.E.Biochemistry: A Problem Approach, ens. 16,17 Benjamin, 1974, chs. 16,17.

ГЛАВА 26Генетический код изависимость междугенами и белками

В главе 25 была описана роль информа-ционной РНК в качестве посредника ме-жду геном и его полипептидным продук-том. В настоящей главе мы рассмотримдальнейший поток информации от генак белку. В центре внимания находится ге-нетический код, связывающий последова-тельность оснований ДНК (или соответ-ствующего транскрипта) с последователь-ностью аминокислот в белке. Код универ-сален для всех организмов. Он восхищаетсвоей простотой. Три основания, соста-вляющие кодон, детерминируют одну ами-нокислоту. Кодоны считываются последо-вательно молекулами транспортных РНК(тРНК), играющих при синтезе белка рольадаптеров. Полная расшифровка генети-ческого кода в 60-х годах - одно из вы-дающихся достижений современной био-логии.

26.1. Транспортная РНК - адапторнаямолекула в синтезе белкаМы уже видели, что мРНК служит матри-цей для синтеза белка. Каким образом онаосуществляет соединение аминокислотв правильном порядке? В 1958 г. ФрэнсисКрик (Francis Crick) писал:

«Одно из первых предположений, до-вольно наивных, состояло в том, чтоРНК будет принимать конфигурацию,способную образовать двадцать раз-личных «полостей», по одной для боко-вой цепи каждой из двадцати аминокис-лот. Если бы это было так, можно былобы попробовать проиграть эту задачув обратном направлении, т.е. найти не-обходимую конфигурацию РНК, пы-таясь воссоздать форму этих полостей.

Все подобные попытки закончились не-удачей. Физико-химические соображениятакже не дают никаких оснований счи-тать это предположение правдопо-добным.»

Крик отметил, что РНК не имеет вы-пуклых гидрофобных поверхностей, позво-ляющих отличить валин от лейцина и изо-лейцина, и не содержит соответствующимобразом расположенных заряженныхгрупп, чтобы различать положительнои отрицательно заряженные боковые цепиаминокислот. Затем Крик предлагает прин-ципиально иной механизм для узнаваниямРНК:

«РНК - это прежде всего последователь-ность участков, способных образовыватьводородные связи. Поэтому независимоот того, что именно связывается с мат-рицей специфичным образом, связыва-ние, очевидно, происходит путем образо-вания водородных связей. Следователь-но, естественно предположить, что ами-нокислоты переносятся к матрице адап-торными молекулами и что именноадаптор соответствует РНК. В простей-шем случае потребуется 20 адаптеров,по одному на каждую аминокислоту».Эта новаторская гипотеза вскоре стала

доказанным фактом. Роль адаптера в бел-ковом синтезе играет тРНК. Структураэтих замечательных адапторных молекули реакции, в которых они участвуют, рас-сматриваются подробно в следующей гла-ве. Здесь же достаточно отметить, чтов тРНК имеются место прикрепления ами-нокислот и участок узнавания матрицы(рис. 26.1 и 26.2). Молекула тРНК перено-сит определенную аминокислоту в активи-рованной форме к месту синтеза белка.Карбоксильная группа аминокислоты свя-зана эфирной связью с 3'-гидроксильной

26. Генетический код.Зависимость гены-белки 67

или 2'-гидроксильной) группой рибозногоостатка, расположенного на 3'-конце цепитРНК. Во время синтеза белка связаннаяаминокислота может перемешаться с 2'- на3'-гидроксильную группу и обратно. При-соединение аминокислоты к тРНК с обра-зованием аминоацил-тРНК катализируетсяособым ферментом, называемым аминоа-цил-тРНК—синтетазой (или активирую-щим ферментом). Эта реакция этерифика-ции идет за счет энергии АТР. Для каждойиз 20 аминокислот имеется по крайней ме-ре одна специфическая синтетаза. Участокузнавания матрицы в тРНК представляетсобой последовательность из трех основа-ний, называемую антикодоном (рис. 26.2).Антикодон тРНК узнает кодон, т. е. ком-плементарную последовательность из трехоснований в мРНК.

26.2. Аминокислоты кодируются группамииз трех оснований, начиная со строгоопределенной точкиГенетический код связывает последова-тельность оснований в ДНК (или в со-ответствующих транскриптах) и последова-тельность аминокислот в белках. К 1961 г.благодаря экспериментам Фрэнсиса Крика,Сиднея Бреннера (Francis Crick, SydneyBrenner) и других исследователей былиустановлены следующие свойства генетиче-ского кода.

1. Чему равно кодирующее отношение?Поскольку в ДНК имеется четыре вида ос-нований, то при кодировании одной ами-нокислоты одним основанием могло быкодироваться всего лишь четыре амино-кислоты. При кодировании одной амино-кислоты двумя основаниями кодировалосьбы 16 аминокислот (4•4=16), а при коди-ровании тремя основаниями - 64 аминокис-лоты (4•4•4 = 64). Белки состоят из двад-цати аминокислот основного набора. Изэтого несложного подсчета было очевидно,что для кодирования одной аминокислоты,видимо, необходимы три или более осно-ваний. Генетические эксперименты показа-ли, что на самом деле одну аминокислотукодирует группа из трех оснований. Этагруппа оснований называется кодоном.

2. Является ли код перекрывающимся?В случае непрерывающегося триплетногокода каждая группа из трех оснований ко-


Рис. 26.1. Присоединение аминокислоты(показана красным цветом)к молекуле тРНК. Аминокис-лота связана эфирной связьюс 3'-гидроксильной группойконцевого аденозина РНК.Молекула тРНК, несущая ко-валентно привязанную амино-кислоту, называется аминоа-цил-тРНК или «нагруженная»тРНК, а тРНК без аминокис-лоты - «ненагруженная».

Рис. 26.2. Схематическое изображениеаминоацил-тРНК. Показаныучасток прикрепления амино-кислоты и антикодон (участокузнавания матрицы).

дирует только одну аминокислоту, тогдакак в случае полностью перекрывающегосятриплетного кода АБВ кодирует первуюаминокислоту, БВГ-вторую, ВГД-третьюи т.д.

Эту дилемму удалось решить путемопределения последовательности амино-кислот в мутантах. Предположим, что ос-нование В мутировало в В'. Если код неперекрывается, изменится только однааминокислота. При полностью перекры-вающемся коде мутация В в В' приведетк изменению аминокислот 1, 2 и 3. Изуче-ние последовательности аминокислот бел-ка оболочки мутантов вируса табачной мо-заики показало, что у этих мутантовизмененной обычно оказывалась толькоодна аминокислота. Напомним также, чтокак уже говорилось при обсуждении ано-мальных гемоглобинов в гл. 5, и в этомслучае у большинства мутантов происхо-дило изменение только одной аминокис-лоты. Отсюда был сделан вывод, что гене-тический код не перекрывается:

3. Как происходит правильное считыва-ние группы из трех оснований? A priori од-на из возможностей состоит в том, чтоодно из четырех оснований (оно обозначе-но Q) служит «запятой» между группамипо три основания:

. . . QAБBQГДEQЖЗИQКЛMQ. . .

Оказалось, что это не так. Последователь-ность оснований читается последователь-но, начиная со строго определенной точки:

Запятых в коде нет. Предположим, чтов результате мутации произошла делецияоснования Ж:

Первые две аминокислоты в этой полипеп-тидной цепи будут нормальными, ноостальная последовательность основанийбудет прочитана неправильно, так как в ре-зультате делеции Ж произошел сдвиг рамкисчитывания. Теперь предположим, чтомежду Е и Ж добавилось основание Ш:

Эта вставочная мутация также нарушаетрамку считывания, начиная с кодона ами-нокислоты 3. В действительности генетиче-ские исследования вставочных и деле-ционных мутантов позволили выяснитьмногие свойства генетического кода,

4. Как уже было сказано выше, суще-ствует 64 возможных триплета основанийи 20 аминокислот. Соответствует ли ка-ждой из 20 аминокислот только один три-плет, или некоторые аминокислоты коди-руются более чем одним триплетом? Гене-тические исследования показали, что боль-шинство из 64 триплетов кодируют амино-кислоты. В последующих биохимическихисследованиях было установлено, что 61триплет из 64 кодирует определенные ами-нокислоты. Таким образом, для большин-ства аминокислот имеется более одногокодового слова. Другими словами, генетиче-ский код вырожден.

26.3. Расшифровка генетического кода:синтетические РНК могут служитьинформационными РНККаково соотношение между 64 видами ко-довых слов и 20 аминокислотами? В прин-ципе на этот вопрос можно получить пря-мой ответ, если сравнить последователь-ность аминокислот в каком-либо белкес соответствующей последовательностьюоснований его гена или мРНК. Однаков 1961 г. этот подход был совершенно не-доступен, так как о последовательностяхоснований в генах и молекулах мРНК ни-чего не было известно. Тогда казалось, чтопроблема генетического кода не можетбыть решена в близком будущем, но вне-запно ситуация изменилась. Маршалл Ни-


ренберг (Marshall Nirenberg) обнаружил,что добавление полиуридилата [po ly(U) ]в бесклеточную систему синтеза белка при-водит к синтезу полифенилаланина. Оче-видно, poly(U) выполнил функцию инфор-мационной РНК. Первое кодовое словобыло расшифровано: UUU кодирует фени-лаланин Этот замечательный экспериментуказал путь к полной расшифровке генети-ческого кода.

Обсудим более подробно этот эпо-хальный эксперимент. В качестве двух ос-новных компонентов были использованыбесклеточная система, активно синтезиро-вавшая белок, и синтетический полирибо-нуклеотид, сыгравший роль информацион-ной РНК. Бесклеточная система синтезабелка была получена из Е. coli следующимобразом. Бактериальные клетки осторожноразрушали, перемалывая с тонко измель-ченным порошком окиси алюминия, чтобыполучить клеточный сок. Затем обрывкиклеточной стенки и клеточной мембраныудаляли центрифугированием. В результа-те получали экстракт, содержащий ДНК,мРНК, тРНК, рибосомы, ферменты и дру-гие клеточные компоненты. При добавле-нии ATP, GTP и аминокислот в этой бес-клеточной системе синтезировался белок.По крайней мере одна из добавленныхаминокислот была радиоактивной, что да-вало возможность обнаружить ее включе-ние в белок. Эту смесь инкубировали при37°С примерно в течение 1 ч. Затем доба-вляли трихлоруксусную кислоту, чтобыостановить реакцию и осадить белки. Приэтом свободные аминокислоты оставалисьв надосадочной фракции. Осадок промыва-ли и просчитывали его радиоактивность,определяя таким образом сколько меченойаминокислоты включилось в новосинтези-рованный белок. Важная особенность этойсистемы состоит в том, что синтез белкаможно остановить добавлением дезоксири-бонуклеазы, разрушающей матрицы длясинтеза новых мРНК. Поскольку тамРНК, которая уже имелась в смеси ковремени добавления дезоксирибонуклеазы,лабильна, синтез белка можно прекратитьв течение нескольких минут. Затем Нирен-берг обнаружил, что синтез белка возобно-вляется при добавлении неочищеннойфракции мРНК. Таким образом, в руках


Ниренберга была бесклеточная системасинтеза белка, зависящая от добавлениямРНК.

Другим важнейшим компонентом в этомэксперименте был синтетический полири-бонуклеотид poly(U). Poly(U) синтезирова-ли с помощью полинуклеотид-фосфори-лазы - фермента, открытого в 1955 г. Ма-рианной Грюнберг-Манаго и Северо Очоа(Marianne Grunberg-Manago, Severo Ochoa).Этот фермент катализирует синтез полири-бонуклеотидов из рибонуклеозиддифосфа-тов:

(РНК)n + Рибонуклеозиддифосфат(РНК)n + 1 + Pi.

Полинуклеотид-фосфорилаза и РНК-поли-мераза катализируют совершенно раз-личные реакции. В приведенной реакцииактивированными предшественниками слу-жат рибонуклеозиддифосфаты, а не три-фосфаты. Продукт реакции - ортофосфат,а не пирофосфат. Следовательно, равнове-сие в реакции не может быть сдвинутовправо в результате гидролиза пирофосфа-та. В самом деле, in vivo равновесие сдви-нуто в сторону распада РНК, а не ее син-теза. Принципиальное отличие состоитв том, что полинуклеотид-фосфорилаза неиспользует матрицы. Состав РНК, синте-зированной этим ферментом, определяетсясоотношением рибонуклеотидов в инкуба-ционной смеси, а последовательность близ-ка к случайной. Благодаря этому полину-клеотид-фосфорилаза оказалась ценней-шим инструментом в экспериментах порасшифровке генетического кода. Напри-мер, poly(U) синтезировали, инкубируяв присутствии фермента раствор высокой

Рис. 26.3. Синтез белка в бесклеточнойсистеме останавливается черезнесколько минут после доба-вления дезоксирибонуклеазыи возобновляется при добавле-нии мРНК.

концентрации UDP. Сополимеры двух ри-бонуклеотидов, например U и А, со слу-чайной последовательностью готовили,также инкубируя UDP и АТР с этимферментом.

Различные синтетические рибонуклео-тиды вводили в бесклеточную систему син-теза белка и измеряли включение меченно-го 14С L-фенилаланина. Результаты оказа-лись поразительными:

Добавленныйполинуклеотид

КонтрольPoly(A)Poly(С)Poly(U)

14С, имп./мин

445038

39800

Тот же эксперимент был проделанс различными 14С-аминокислотами в ка-ждой инкубационной смеси. Оказалось, чтоpoly(А) вызывает синтез полилизина,a poly(С) - синтез полипролина. Так былорасшифровано три кодовых слова:

Кодовое слово

UUUАААССС

Аминокислота

ФенилаланинЛизинПролин

Кодовое слово GGG невозможно былорасшифровать таким же образом, потомучто poly (G) не работает в качестве ма-трицы. Возможно, это объясняется тем,что он образует трехцепочечную спираль-ную структуру. Полирибонуклеотиды,образующие протяженные участки с упоря-доченной структурой, не эффективны в ка-честве матриц для синтеза белка.

26.4. Состав кодонов многих аминокислотбыл определен с помощью сополимеровв качестве матрицДля дальнейшего изучения генетическогокода были использованы в качестве ма-триц полирибонуклеотиды, состоящие изоснований двух типов. Например, слу-чайный сополимер U и G содержит восемь

Таблица 26.1. Ожидаемая встречаемость триплетовв случайном сополимере U (0,76) и G (0,24)

Триплет

UUUUUGUGUGUUUGGGUGGGUGGG

Вероятность

0,76•0,76•0,76=0,4390,75•0,24•0,24 = 0,1390,76•0,24•0,76 = 0,1390,24•0,76•0,76 = 0,1390,76•0,24•0,24 = 0,04380,24•0,76•0,24 = 0,04380,24•0,24•0,76 = 0,04380,24•0,24•0,24 = 0,0138

Относи-тельнаявстречае-мость, %

10031,631,631,610,010,010,03,1

различных триплетов: UUU, UUG, UGU,GUU, UGG, GUG, GGU и GGG. Относи-тельную частоту этих триплетов можнолегко вычислить, исходя из молярного со-отношения U и G в сополимере. Оно со-ставляло 0,76:0,24 (табл. 26.1). Относи-тельное включение различных аминокис-лот в присутствии этой матрицы приведе-но в табл. 26.2. В наибольшей степенивключался, как и можно было предпола-гать, фенилаланин, так как триплет UUUвстречался чаще всего. Затем шли валин,лейцин и цистеин. Уровень их включениясоставлял чуть больше трети от включенияфенилаланина, что соответствует вычис-ленной частоте встречаемости триплетов,содержащих два U и одно G. Включениедругих аминокислот было очень низким.Отсюда был сделан вывод, что валин, лей-цин и цистеин кодируются кодонами, содер-

Таблица 26.2. Включение аминокислот в присутствиислучайного сополимера U (0,76) и G (0,24)

Аминокислота

ФенилаланинВалинЛейцинЦистеинТриптофанГлицин

Относитель-ное включе-ние, %

1003736351412

Состав соот-ветствующегокодона

UUU2U, 1G2U, 1G2U, 1G1U, 2G1U, 2G


жащими 2U и 1G, а триптофан и глицинкодируются кодонами, которые содержат1U и 2G.

Эксперименты того же типа проводилии с другими случайными сополимерами,а именно с UA, UC, АС и AG, а такжес UGC, AGC, UAC и UAG. Таким образомв лабораториях Ниренберга и Очоа былопределен состав кодонов, соответствую-щих каждой из 20 аминокислот.

26.5. Тринуклеотиды способствуютсвязыванию определенных молекул тРНКс рибосомамиПри использовании смешанных сополиме-ров в качестве матриц удалось установитьсостав кодонов, соответствующих опреде-ленным аминокислотам, но не их последо-вательность (кроме UUU, ААА и ССС).Как уже говорилось, валин кодируетсятриплетом из 2U и 1G. Какой же это три-плет: UUG, UGU или GUU? Ответ наэтот вопрос был получен с помощью двухсовершенно различных экспериментальныхподходов: во-первых, с использованиемсинтетических полирибонуклеотидов с упо-рядоченной последовательностью и, во-вторых, с помощью зависимого от кодонаспецифического связывания молекул тРНКс рибосомами.

В 1964 г. Ниренберг установил, что три-нуклеотиды способствуют связываниюопределенных молекул тРНК с рибосомамив отсутствие синтеза белка. Например, до-бавление pUpUpU вызывает связываниефенилаланиновой тРНК, а рАрАрА значи-тельно увеличивает связывание лизиновойтРНК, как и рСрСрС - связывание проли-новой тРНК. Динуклеотиды не стимули-руют связывания тРНК с рибосомами. Этиработы показали, что тринуклеотид (каки триплет в мРНК) специфически связы-вается с определенной молекулой тРНК,для которой он является кодовым словом.Был разработан простой и быстрый тестна связывание: связанные с рибосомамимолекулы тРНК задерживаются на нитро-целлюлозном фильтре, а несвязанные мо-лекулы тРНК проходят через фильтр. Длятого чтобы определить, какие именно мо-лекулы тРНК садятся на фильтр, исполь-зовали молекулы тРНК, несущие опреде-ленную аминокислоту, меченную 14С.

72

С помощью методов органической хи-мии и биохимии были синтезированы все64 тринулеотида. Для каждого тринуклео-тида было проверено связывание молекултРНК, соответствующих всем 20 амино-кислотам. Например, было показано, чтоpUpUpG стимулирует связывание тольколейциновой тРНК, pUpGpU - только ци-стеиновой тРНК, a pGpUpU - связываниетолько валиновой тРНК. Отсюда был сде-лан вывод, что кодоны UUG, UGUи GUU соответствуют лейцину, цистеинуи валину соответственно. С несколькимикодонами не было получено избирательно-го связывания какой-либо тРНК, тогда какс несколькими другими связывалось болееодной тРНК. Для большинства кодоновбыли получены вполне четкие результаты.В общем этот простой и элегантный под-ход позволил расшифровать около 50 ко-донов.

26.6. Еще один инструмент расшифровкикода - сополимеры с определеннойпоследовательностьюПримерно в то же время Гобинду Коране(Gobind Khorana) удалось синтезироватьполирибонуклеотиды с определенной по-вторяющейся последовательностью. Соче-тая методы органической химии и фермен-тативные методы, он синтезировал рядсополимеров с повторяющейся последова-тельностью из двух, трех и четырех осно-ваний. Рассмотрим, к примеру, стратегиюсинтеза poly(GUA). Этот упорядоченныйсополимер имеет последовательность

GUAGUAGUAGUAGUAGUAGUAGUA...

Прежде всего Корана синтезировал с по-мощью методов органической химии двакомплементарных дезоксирибонуклеотидапо девять нуклеотидов длиной: d(TAC)3 иd(GTA)3. Затем эти два олигонуклеотидабыли использованы в качестве матрицыдля синтеза длинных цепей ДНК из четы-рех дезоксинуклеозидтрифосфатов под дей-ствием ДНК-полимеразы I. Ни один оли-гонуклеотид в отдельности не был эффек-тивной матрицей. Если же присутствовалиоба олигонуклеотида, то d(TAC)3 служилматрицей для синтеза poly(dGTA), ad(GTA)3 - для синтеза poly(dTAC). Этидлинные комплементарные ДНК обра-зовывали двухспиральные молекулы. Сле-дующим шагом было получение длинных

Рис. 26.4. Цепь этой двухспиральной ма-тричной ДНК, которая должнатранскрибироваться, опреде-ляется набором рибонуклео-зидтрифосфатов в инкубацион-ной смеси.

полирибонуклеотидных цепей с последова-тельностью, соответствующей poly (dTAC)и poly(dGTA). Для этого дуплексpoly(dTAC): poly(dGTA) использовалив качестве матрицы для РНК-полимеразы.Цепь ДНК для транскрипции можно вы-брать, добавляя три подходящих рибону-клеозидтрифосфата. Если в инкубацион-ную смесь добавить GTP, UTP и АТР, гона матричной цепи poly(dTAC) синтези-руется полирибонуклеотидный продуктpoly(GUA). Другая цепь не транскриби-руется, так как не хватает одного из необ-ходимых субстратов - СТР. Если же доба-вить СТР, UTP и АТР, то на другойматричной цепи синтезируется poly(UAC).Итак, органический синтез и вслед за нимматричный синтез с помощью ДНК-поли-меразы и РНК-полимеразы позволили син-тезировать два длинных полирибонуклеоти-да со строго определенной повторяющейсяпоследовательностью оснований (рис. 26.4).

Эти регулярные сополимеры были ис-пользованы в качестве матриц в бесклеточ-ной системе синтеза белка. Рассмотрим не-которые результаты такого эксперимента.Сополимер, состоящий из чередующейсяпоследовательности двух оснований - Аи Б:

АБА | БАБ | АБА | БАБ | АБА |. . .

содержит кодоны двух видов - АБА и БАБ.Поэтому полипептидный продукт долженпредставлять собой чередующуюся после-довательность из двух аминокислот (сокра-щенно обозначенных ак1 и ак2):

Стоит ли на N-конце полипептидного про-дукта aк1 или ак2, зависит от того, на-чинается ли рамка считывания с А или с Б.Если в качестве матрицы использовалиpoly(UG), то синтезировался полипептидиз чередующихся валина (Val) и цистеина(Суs):

UGU|GUG|UGU|GUG|UGU|GUG

Этот результат однозначно доказывал три-плетность кода и показывал, что один изтриплетов - UGU или GUG - кодирует ци-стеин, а другой - валин. В сочетаниис данными по связыванию тРНК былоочевидно, что UGU кодирует цистеин,a GUG - валин. В присутствии некоторыхчередующихся сополимеров из двух осно-ваний происходил синтез следующих поли-пептидов:

Матрица

Poly(UC)

Poly(AG)

Poly(AC)

Продукт

Poly(Ser-Leu)

Poly(Arg-Gln)

Poly(Thr-His)

Смысл кодонов

Рассмотрим теперь матрицу, состоящуюиз повторяющейся последовательноститрех оснований, поли(АБВ). Если рамкасчитывания начинается с А, образующийсяполипептид должен содержать аминокис-лоту только одного вида, кодируемую три-плетом АБВ:


Если рамка считывания начинается с Б,синтезирующийся полипептид должен со-держать другую аминокислоту, кодируе-мую триплетом БВА:

Если же рамка считывания начинается с В,должен образовываться полипептид треть-его типа, содержащий аминокислоту, коди-руемую триплетом ВАБ:

Таким образом, предполагаемые про-дукты - три различных гомополипептида.Действительно, именно такой результатполучался в случае большинства матриц,состоящий из повторяющейся последова-тельности трех нуклеотидов. Например, наpoly(UUC) синтезировались полифенилала-нин, полисерин и полилейцин. Этот резуль-тат в сочетании с результатами других экс-периментов показывал, что UUC кодируетфенилаланин, UCU-серин и CUU-лейцин.Полипептиды, которые синтезировались надругих матрицах этого типа, приведеныв табл. 26.3. Обратите внимание, чтов присутствии poly(GUA) и poly(GAU)происходил синтез двух, а не трех гомопо-

Таблица 26.3. Гомополнпептнды, синтезирующиеся наматрицах , которые состоят нз повторяющихся последова-тельностей тринуклеотидов

Матрица

Poly(UUC)Poly(AAG)Poly(UUG)PoIy(CCA)Poly(GUA)Poly(UAC)Poly(AUС)Poly(GAU)

Синтезирующиеся полипептиды

Phe; Ser; LeuLys; Glu; ArgCys; Leu; ValGln; Thr; AsnVal; SerTyr; Thr; LeuIle; Ser; HisMet; Asp


липептидов. Причина этого явления станетясна чуть ниже.

Корана синтезировал также ряд сополи-меров, состоящих из повторяющегося те-трануклеотида, например poly(UAUC). Наэтой матрице шел синтез полипептидас повторяющейся последовательностьюTyr-Leu-Ser-Ile независимо от рамкисчитывания:

UAU|CUA|UCU|AUC|UAU|CUA|UCU|AUC

Туr—Leu—Ser—Ilе—Туr—Leu—Ser—Ilе

Отсюда можно было сделать выводо смысле четырех кодонов.

Совершенно иной результат был полу-чен при использовании в качестве матрицыpoly(GUAA). Единственными продуктамибыли ди- и трипептиды. Почему не былоболее длинных цепей? Объясняется этотем, что один из триплетов, встречающих-ся в этом сополимере, а именно UAA, ко-дирует не аминокислоту, а терминациюсинтеза белка:

GUA | AGU | AAG | UAA | GUA|A. . .

Val—Ser —Lys— Стоп

На матрице poly(AUAG) также получалисьтолько ди- и трипептиды, так как UAG-второй сигнал терминации цепи:

AUA|GAU|AGA|UAG|AUA|G. . .

Ile — Asp—Arg—Стоп

Посмотрим теперь снова на табл. 26.3. Наматрице poly(GUA) синтезировались два,а не три гомополипептида по той причине,что третья рамка считывания соответ-ствует последовательности

G | UAG | UAG | UAG- - -

Стоп — Стоп — Стоп

т. е. представляет собой повторяющуюсяпоследовательность сигнала терминации.Как же обстоит дело с poly(GAU)? Наэтой матрице синтезировались только двагомополипептида, потому что третья рам-ка считывания соответствует еще одномусигналу терминации - UGA:

GA | UGA | UGA | UGA | U. . .

Стоп — Стоп — Стоп

Таблица 26.4. Генетический код1)

Первоеположение(5'-конец)

U

С

А

G

Второе положение

U

PhePheLeuLeu

LeuLeuLeuLeu

lleMeMeMet

ValValValVal

С

SerSerSerSer

ProProProPro

ThrThrThrThr

AlaAlaAlaAla

A

ТуrТуrСтоп

Стоп

HisHisGlnGln

AsnAsnLysLys

AspAspGluGlu

G

CysCysСтопTrp

ArgArgArgArg

SerSerArgArg

GlyGlyGlyGly

Третьеположение(3'-конец)

UСАG

UСАG

UСАG

UСАG

1) Зная положение оснований в кодоне, можно найти соответствующуюаминокислоту. Например, кодон 5'-AUG-3' в мРНК детерминируетметионин, тогда как CAU детерминирует гистидин. Кодоны UAA, UAGи UGA - сигналы терминации (стоп-кодоны). AUG является частью сиг-нала инициации помимо того, что он кодирует внутренние остатки ме-тионина.

В действительности оказалось, что толькотри кодона не кодируют никакой аминокис-лоты: UAG, UAA и UGA.

Синтез полинуклеотидов с определеннойпоследовательностью в лаборатории Ко-раны был выдающимся достижением. Ис-пользование этих полимеров в качестве ма-триц для синтеза белка в сочетаниис работами Ниренберга по связываниютРНК с рибосомами в присутствии трину-клеотидов привели к полной расшифровкегенетического кода к 1966 г. Еще за шестьлет до этого такое событие казалось несбы-точной мечтой. Благодаря разработке со-вершенных методов синтеза в лабораторииКораны стало возможным и еще одно до-стижение: полный синтез молекулы ДНК,соответствующей последовательности мо-лекулы транспортной РНК.

26.7. Основные свойства генетического кодаБыли расшифрованы все 64 кодона(табл. 26.4). 61 триплет соответствует опре-деленным аминокислотам, а три кодируюттерминацию. Поскольку существует 20 ами-нокислот и 61 триплет для их кодирования,очевидно, что код в высокой степени выро-жден. Иными словами, многие аминокис-лоты детерминируются более чем однимтриплетом. Только триптофан и метионинкодируются всего одним триплетом.Остальные 18 аминокислот кодируютсядвумя и более триплетами. Так, в частности,лейцин, аргинин и серин кодируютсяшестью кодонами каждый. В нормальныхфизиологических условиях код однозначен:каждый кодон обозначает только однуаминокислоту.


Кодоны, соответствующие одной амино-кислоте, называют синонимами. Например.CAU и САС - синонимы для гистидина.Обратите внимание, что синонимы не раз-бросаны случайным образом по таблице ге-нетического кода (табл. 26.4). Аминокисло-та, кодируемая двумя или более синонима-ми, занимает одну клетку в таблице (заисключением тех случаев, когда для даннойаминокислоты существует более четырехсинонимов). Аминокислоты, располо-женные в одной клетке, кодируются кодона-ми, у которых два первых основания одина-ковые, а третье различается, напримерGUU, GUC, GUA и GUG. Большинство си-нонимов различается только последним ос-нованием триплета. Рассмотрение кода по-казывает, что XYC и XYU всегда кодируютодну и ту же аминокислоту, a XYG и X Y Aчаще (но не всегда) кодируют одну и ту жеаминокислоту. Структурные основы такойэквивалентности кодонов станут понятныпосле обсуждения природы антикодоновв молекулах тРНК (разд. 27.6).

Каков биологический смысл сильной вы-рожденности генетического кода? Один извозможных ответов состоит в том, что выро-жденность сводит к минимуму пагубноедействие мутаций. Если бы код не был вы-рожден, 20 кодонов кодировали бы амино-кислоты, а 44 вызывали бы терминациюцепи.

Таким образом, вероятность превраще-ния кодона в сигнал терминации была быгораздо выше в случае невырожденного ко-да, чем в существующем коде. Важно учесть,что мутации, приводящие к образованиюсигнала терминации цепи, обычно приводятк синтезу неактивных белков, тогда как за-мещение одной аминокислоты другой обыч-но относительно безвредно. Кроме того, вы-рожденность кода может иметь определен-ное значение постольку, поскольку онапозволяет нуклеотидному составу ДНК ме-няться в широких пределах, не влияя на ами-нокислотную последовательность белков, ко-дируемых этой ДНК, ([G] ++ [С])-содержание бактериальных ДНК ко-

леблется от 30% до более 70%. МолекулыДНК с сильно различающимся содержа-нием [G] + [С] могут кодировать одни и теже белки благодаря систематическому ис-пользованию различных синонимов.


26.8. Сигналы инициации и терминациисинтеза белкаКак мы уже упоминали, UAA, UAG и UGA(стоп-кодоны) обозначают терминацию це-пи. Эти кодоны считываются не молекуламитРНК, а особыми белками - факторамитерминации. Сигнал начала (инициации)синтеза белка более сложен. Полипеп-тидные цепи у бактерий начинаются с моди-фицированной аминокислоты формилме-тионина (fMet).

Существует особая тРНК, которая пере-носит fMet. Эта fMet-тРНК узнает кодонAUG (или реже GUG). Однако AUG являет-ся также кодоном для метионина, располо-женного внутри полипептида, а GUG-ко-дон внутреннего валина. Это значит, чтосигнал для первой аминокислоты полипеп-тидной цепи должен быть сложнее, чем длявсех последующих аминокислот. AUG (илиGUG) представляет собой часть сигналаинициации. Существует другой сигнал, пред-шествующий AUG (или GUG), которыйопределяет, будет ли кодон считан как сиг-нал инициации цепи или как кодон для вну-треннего остатка метионина (или валина).Механизмы инициации и терминации синте-за белка мы рассмотрим в следующей главе(разд. 27.13).

26.9. Генетический код универсаленКак мы уже сказали, генетический код былрасшифрован в результате исследований по-ведения тринуклеотидов и синтетическихматричных РНК в бесклеточных системах,полученных из бактерий. Возникают два во-проса. Одинаков ли генетический код in vivoи in vitro? Одинаков ли генетический коду всех организмов? Убедительный ответ наэти вопросы был получен при анализе мута-ций у вирусов, бактерий и высших организ-мов. Известно множество аминокислотныхзамен, возникающих в результате мутацийв генах гемоглобина человека, белка обо-

лочки вируса табачной мозаики (ВТМ)и α-цепи триптофан-синтазы E.coli. Почтивсе эти аминокислотные замены объясняют-ся заменами всего лишь одного основания(табл. 26.5). Это - надежная проверка пра-вильности всего генетического кода и егоуниверсальности.

Почему код не изменился за миллионылет эволюции? Обсудим действие мутации,изменяющей считывание мРНК. Такая му-тация изменит последовательность амино-кислот в большинстве, если не во всех бел-ках, синтезируемых в клетках мутантногоорганизма. Многие их этих изменений, бе-зусловно, окажутся губительными, и, следо-вательно, должно существовать сильное да-вление отбора против таких мутаций.

26.10. Последовательность оснований генаи последовательность аминокислотсоответствующего полипептида коллинеарныОбратимся теперь к взаимоотношениям ме-жду генами и белками. Как показала работаСеймура Бензера (Seymour Benzer) по гене-тическому картированию высокого разре-шения, гены - неразветвленные структуры.Этот важный результат согласовывалсяс установленным фактом, что ДНК предста-вляет собой линейную последовательностьпар оснований. Полипептидные цепи такжеимеют неразветвленную структуру. Поэто-му в начале 60-х годов возник следующийвопрос: существует ли линейное соответ-ствие между геном и его полипептиднымпродуктом?

Подход Чарлза Янофски (CharlesYanofsky) к этой проблеме состоял в исполь-зовании мутантов E.coli, у которых обра-зуется измененная молекула фермента. Бы-ло выделено много мутантов по α-цепитриптофан-синтазы и определена локализа-ция мутаций на генетической карте α-цепис помощью рекомбинационных эксперимен-тов с трансдуцирующим фагом. Некоторыеиз этих мутаций были локализованы близкодруг к другу на генетической карте, тогдакак другие были сильно удалены в пределаходного гена. Следующей важной задачейбыло определить положение аминокислот-ной замены для каждого из этих десяти му-тантов. Прежде всего была определена по-следовательность 168 аминокислот α-цепидикого типа. Затем с помощью метода «от-печатков пальцев» были установлены местои природа аминокислотной замены в ка-ждом случае. Порядок расположения мута-

ций на генетической карте был таким же,как порядок соответствующих замен в по-следовательности аминокислот полипептид-ного продукта (рис. 26.5). Другими словами,ген, кодирующий α-цепь, и его полипеп-тидный продукт коллинеарны.

26.11. Некоторые последовательностивирусных ДНК кодируют более одного белкаОткрытие того факта, что ДНК фага φХ174кодирует больше белков, чем позволяетимеющееся в ней количество нуклеотидов,было совершенно загадочным. Как этот ви-рус может кодировать более 2000 аминокис-лотных остатков, если он содержит всеголишь 5375 нуклеотидов? Ответ был получениз полной последовательности оснований(разд. 24.29), когда обнаружилось, чтов ДНК фага φХ174 некоторые гены перекры-ваются. Определенные участки соответству-ющих транскриптов транслируются в раз-личных рамках считывания, что приводит кобразованию белков с различными последо-вательностями аминокислот (рис. 26.6).Например, одни и те же 300 нуклеотидовкодируют белок гена Е и большую частьбелка гена D. Еще более поразительныйТаблица 26.5. Мутации в гемоглобине человека, трипто-фан-синтазе E.coli и белке оболочки вируса табачной мо-заики (ВТМ)

Белок

Гемоглобин

Гемоглобин

ГемоглобинТриптофан-синтазаТриптофан-синтазаТриптофан-синтазаБелок оболочкиВТМБелок оболочкиВТМБелок оболочкиВТМ

Заменааминокислоты

Glu—>Val1)

Glu—>Lys1)

Glu —>GlyGly —>ArgGly—>GluGlu —>AlaLeu —>Phe

Glu —>Gly

Pro —>Ser

Предполагае-мое изменениекодона

GAA—>GUA

GAA — > A A AGAA —>GGAGGA —>AGAGGA —>GAAGAA —>GCACUU—>UUU

GAA —>GGA

CCC —>UCC

1) Замена Glu—>Val и Glu—>Lys происходит в положе-нии 6 в β-цепи гемоглобинов S и С человека соответ-ственно.


Рис. 26.5. Коллинеарность гена и амино-кислотной последовательно-сти α-цепи триптофан-синтазы.Положение мутаций в ДНК(желтая линия) было определе-но методами генетическогокартирования. Аминокис-лотные замены в последова-тельности аминокислот (синяялиния) расположены в том жепорядке, что и соответствую-щие мутации. (Yanofsky С.,Gene Structure and ProteinStructure, Sci. Amer., 1967.)

пример представляет родственный бакте-риофаг G4, в ДНК которого некоторые ко-роткие участки кодируют три различных

белка. Эти вирусы используют перекрываю-щиеся гены, чтобы ввести больше информа-ции в маленькие молекулы ДНК. Однако заэту генетическую экономию приходитсяплатить: на последовательности аминокис-лот, кодируемые перекрывающимися гена-ми, накладываются строгие ограничения.Поэтому перекрывающиеся гены, по-види-мому, широко используются лишь в тех слу-чаях, когда количество ДНК строго лимити-ровано, как в случае вирусов с белковойоболочкой строго определенных размеров.


26.12. Гены эукариот представляют собоймозаику из транслируемых и нетрансли-руемых последовательностей ДНКУ бактерий полипептидные цепи кодируют-ся непрерывной последовательностью три-плетных кодонов. В течение многих лет счи-талось, что гены высших организмов такженепрерывны. Эта точка зрения была неожи-данно опровергнута в 1977 г., когда в не-скольких лабораториях было открыто, чтонекоторые гены имеют прерывистое строе-ние. Например, ген β-цепи гемоглобина пре-рывается в области, кодирующей аминокис-лотную последовательность, длинной неко-дирующей вставочной последовательностьюиз 550 пар оснований и короткой последова-тельностью из 120 пар оснований. Такимобразом, ген β-глобина разделен на три ко-дирующие последовательности:

Эта удивительная структура была открытас помощью электронно-микроскопическихисследований гибридов между β-глобино-вой мРНК и фаргментом ДНК мыши, со-держащим ген β-глобина (рис. 26.7). Двухце-почечная ДНК частично денатурируется,что позволяет мРНК гибридизоватьсяс комплементарной цепью ДНК. Затемодноцепочечный участок ДНК образуетпетлю и на электронных микрофотографияхвыглядит как тонкая линия в отличие отдвухцепочечной ДНК или ДНК-РНК-ги-бридных участков, которые выглядят значи-тельно толще. Если бы ген β-глобина был

Рис. 26.6. Перекрывающиеся геныв ДНК фага φХ174. Рядом споследовательностью основа-ний показаны две последова-тельности аминокислот, детер-минируемые различными рам-ками считывания.

непрерывен, была бы видна одна петля. Од-нако на электронных микрофотографиях та-ких гибридов (рис. 26.8) отчетливо виднытри петли. Это показывает, что ген преры-вается по крайней мере одним участкомДНК, которого нет в соответствующеймРНК. Дополнительные данные о вста-вочных последовательностях были полу-чены при картировании рестрикционныхфрагментов гена β-глобина и продуктаобратной транскрипции мРНК. Большиеразличия между этими картами показали,что геномная ДНК содержит нетрансли-руемые последовательности между коди-рующими последовательностями. Рестрик-ционные карты позволили уточнить локали-

зацию таких вставочных последовательно-стей.

На каком этапе экспрессии гена удаляют-ся вставочные последовательности? Ново-синтезированные РНК, выделенные из ядра,значительно длиннее молекул мРНК, ко-торые из них получаются. В частности, пер-вичный транскрипт гена β-глобина содер-жит две нетранслируемые области. Этивставочные последовательности в первич-ном 15S-транскрипте вырезаются, а коди-рующие последовательности одновременносоединяются под действием ферментасплайсинга. Этот фермент обладает высо-кой точностью. Так, образуется зрелая9S-мРНК (рис. 26.9). Кодирующие последо-вательности прерывистых («разорванных»)генов называются экзонами, а вставочныепоследовательности - интронами (от англ.слов expressed regions - экспрессирующиесяучастки и intervening sequence - прерываю-щая последовательность).

Еще один прерывистый эукариотическийген - ген овальбумина куриного яйца, ко-торый состоит из восьми экзонов, разде-ленных семью длинными интронами(рис. 26.10). Еще более удивителен ген ко-нальбумина: он содержит не менее 17 экзо-нов. Общее свойство экспрессии этих ге-нов - то, что их экзоны располагаютсяв мРНК и в ДНК в одной и той же последо-вательности. Таким образом, прерывистыегены, подобно непрерывным генам, колли-неарны своим полипептидным продуктам.

Все картированные до настоящего време-ни гены птиц и млекопитающих, кроме геновгистонов (разд. 29.13), содержат интроны.Почему практически все гены высших эука-риот содержат вставочные последователь-ности? Один из возможных ответов состоитв том, что прерывистые гены отражают про-цесс эволюции. Экзоны могут соответство-вать крупным структурным или функцио-нальным элементам (доменам), которыесоединились и образовали белки с новымисвойствами. Другая возможность состоитв том, что вырезание вставочных последова-тельностей регулирует поток мРНК из ядрав цитозоль. В соответствии с этой гипотезойсплайсинг (сращивание) первичного тран-скрипта играет ключевую роль: он опреде-ляет, какие белки синтезирует клетка. От-крытие прерывистых генов у высших орга-низмов ввело нас в увлекательную область


Рис. 26.7. Выявление вставочных после-довательностей с помощьюэлектронной микроскопии.Молекула мРНК (красная ли-ния) гибридизуется с геномнойДНК, содержащей соответ-ствующий ген. А - если ген не-прерывен, видна одна петляодноцепочечной ДНК (показа-но синим цветом); Б - если генсодержит вставочную последо-вательность, видны две петлиодноцепочечной ДНК (показа-но синим цветом) и одна петлядвухцепочечной ДНК (синийи желтый цвет).

познания, которая, по-видимому, имеетбольшое значение для понимания ростаи дифференцировки клеток.

26.13. Мутации возникают в результатеизменений последовательности основанийДНКСуществуют мутации нескольких типов:1) замена одной пары оснований (или не-скольких пар) другой парой; 2) делецияодной или более пар оснований; 3) вставка(включение, инсерция) одной или более пароснований (рис. 26.11). Наиболее распро-страненный тип мутаций - замена однойпары оснований другой парой. Частота спон-танных мутаций у бактериофага Т4 былаоценена в 1,7•10-8 на одну пару оснований


за один цикл репликации. Для E.coliи Drosophila melanogaster эти величины со-ставляют 4•10 - 1 0 и 7•10-1 соответствен-но.

Существует два типа одиночных заменпары оснований. Транзиция - замещениеодного пурина другим пурином или одногопиримидина другим пиримидином. Транс-версией, наоборот, называется замещение

Рис. 26.8. Электронная микрофотогра-фия гибрида β-глобиновоймРНК и фрагмента геномнойДНК, содержащего ген β-гло-бина. Толстые петли двухспи-ральной ДНК - вставочные по-следовательности в ДНК, ко-торых нет в мРНК (как нарис. 26.7, Б). Верхняя стрелкауказывает на большую вста-вочную последовательность,нижняя стрелка - на малень-кую. (Печатается с любезногоразрешения д-ра Philip Leder.)

Рис. 26.9. Транскрипция гена β-глобинаи удаление вставочных после-довательностей из первичногоРНК-транскрипта. Образова-ние «колпачка» и присоедине-ние poly(A) обсуждаютсяв разд. 29.22.

пурина пиримидином или пиримидина пу-рином:

Механизм спонтанного возникновениятранзиций был предложен Уотсоном и Кри-ком в их классической работе о двойнойспирали ДНК. Они отметили, что неко-торые атомы водорода каждого из четырехоснований могут менять свое положение.Такие таутомерные формы, которые возни-кают с низкой вероятностью, могут обра-

Рис. 26.10. Структура гена овальбуминакуриного яйца. Интроны (неко-дирующие участки) показаныжелтым цветом, а экзоны - си-ним.

завывать необычные пары оснований, от-личные от А-Т и G-C. Например, тауто-мерная иминоформа аденина может спари-ваться с цитозином (рис. 26.12). В следую-щем цикле репликации этот аденин, воз-можно, снова перейдет в свое обычноетаутомерное состояние и будет спариватьсяс тимином, тогда как цитозин будет спари-ваться с гуанином. В результате одна из до-черних молекул ДНК будет содержать паруG-C вместо пары А-Т (рис. 26.13).

Кроме того, мутации могут вызывать де-фектные ДНК-полимеразы. Существует му-тант E.coli, у которого частота мутацийв 1000 раз выше, чем в норме, возможно, из-за измененной полимеразы. Отличительнаяособенность мутаций этих клеток состоитв том, что почти все они являются трансвер-сиями А-Т—>G-C.

26.14. Некоторые химические мутагенывесьма специфичны

В ДНК можно включить аналоги основа-ний, например 5-бромурацил и 2-аминопу-рин. Они вызывают транзиции, нарушаяправила спаривания оснований в процессеих собственного включения в состав ДНКили в следующем цикле репликации(рис. 26.14). Аналог тимина 5-бромурацилв норме спаривается с аденином. Однакодоля енольного таутомера в 5-бромурацилевыше, чем в тимине, возможно, из-за высо-кой электроотрицательности атома бромапо сравнению с метильной группой при С-5.Енольная форма 5-бромурацила спаривает-ся с гуанином, и это вызывает транзицииА-Т—>G-C. 2-аминопурин в норме спари-вается с тимином. В отличие от аденинаобычный таутомер 2-аминопурина можетобразовать одну водородную связь с цито-зином. Поэтому 2-аминопурин способен вы-зывать транзиции А-Т—>G-C.

В основе действия других мутагенов ле-жат химические модификации основанийДНК. Например, азотистая кислота реаги-рует с основаниями, имеющими аминогруп-


На примере типогралских ошибокЗамена

На примере типожграфских ошибокВставка

На примере тпографских ошибокДелеция

На примере типограф-савдкмьыэмНонсенс

Рис. 26.11. На примере типографскихошибок можно проиллюстри-ровать различные типы мута-ций.

Рис. 26.12. Редкая таутомерная формааденина спаривается с цитози-ном вместо тимина. Этот тау-томер образуется при сдвигепротона 6-аминогруппы к ато-му N-1.

Рис. 26.13. Спаривание редкой таутомер-ной формы аденина (А*) с цито-зином (С) привоцит к появле-нию пары G—С в следующемпоколении.


пу. При этом происходит окислительное де-заминирование аденина до гипоксантина,цитозина до урацила, гуанина до ксантина.Образующийся при этом гипоксантин спа-ривается с цитозином, а не с тимином, ура-цил спаривается с аденином, а не с гуани-ном. Ксантин, как и гуанин, спариваетсяс цитозином. Поэтому азотистая кислотавызывает транзиции А-Т—>G-C. Гидро-ксиламин (NН2ОН) - высокоспецифичныймутаген. Он реагирует почти исключитель-но с цитозином и дает производное, котороеспаривается с аденином, а не с гуанином.Гидроксиламин вызывает транзицию толь-ко в одном направлении: G-С—>А-Т.

Другой тип мутаций вызывают плоскиеароматические молекулы, например акри-дины. Эти соединения интеркалируютв ДНК, т.е. проскальзывают между сосед-ними парами оснований в двойной спиралиДНК (разд. 25.18). Интеркаляторы, видимо,стабилизируют спаривание оснований сосдвигом в повторяющихся последователь-ностях, таких, например, как CGCGCGCG.В результате они вызывают включения илиделеции одной или более пар оснований. Дей-ствие таких мутаций заключается в измене-нии рамки считывания, если только общеечисло делетированных или включившихсяоснований не кратно трем. Именно анализтаких мутантов позволил доказать триплет-ность генетического кода.

26.15. Многие мутагенные канцерогеныможно выявить по их мутагенному действиюна бактерииМногие опухоли у человека возникают в ре-зультате воздействия токсичных химиче-ских веществ. Поскольку эти химическиеканцерогены обычно мутагенны, можно ду-мать, что повреждение ДНК лежит в основеи канцерогенеза, и мутагенеза. Эти соедине-ния важно идентифицировать и оценить ихпотенциальную биологическую активность,чтобы свести к минимуму то воздействие,которое они оказывают на человека. БрюсЭймс (Bruce Ames) разработал простойи чувствительный тест для выявления хими-ческих мутагенов. На чашку Петри поме-щают тонкий слой агара, содержащийоколо 109 клеток специально сконструиро-ванного тест-штамма Salmonella. Эти бакте-рии не способны расти в отсутствие гисти-дина, поскольку они несут мутацию в одномиз генов биосинтеза этой аминокислоты.Добавление мутагена в центр чашки инду-цирует появление множества новых мута-

Рис. 26.14. Аналог тимина 5-бромурацилиногда спаривается с гуаниномвместо аденина. Присутствиеатома брома при С-5 увеличи-вает долю редкого таутомера,образующегося при сдвигепротона от N-3 к атому кисло-рода при С-4.

ций. Небольшая часть этих мутаций приво-дит к реверсии исходной мутации (возвратк дикому типу), так что клетки приобретаютспособность синтезировать гистидин. Этиревертанты размножаются в отсутствие эк-зогенного гистидина и появляются в видеотдельных колоний на чашке после инкуба-ции чашки в течение двух дней при 37°С(рис. 26.15). Например, 0,5 мкг 2-аминоан-трацена дают 11.000 колоний ревертантовпо сравнению всего лишь с 30 спонтаннымиревертантами в отсутствие этого мутагена.Можно легко поставить опыт с различнымиконцентрациями исследуемого соединения,чтобы получить кривую доза-ответ. Обыч-но эта зависимость имеет линейный харак-тер; отсюда следует, что пороговой концен-трации в процессах мутагенеза нет.

Некоторые тест-линии чувствительнык заменам пар оснований, тогда как другиеможно использовать для выявления делецийили вставок пар оснований (сдвигов рамки).Чувствительность этих штаммов, скон-струированных специально для оценки му-тагенов, увеличена генетически: они лишенысистемы эксцизионной репарации. Крометого, у них нет липополисахаридной обо-лочки, которая обычно окружает клеткиSalmonella. Отсутствие этого барьера облег-чает проникновение в клетку потен-циальных мутагенов. Еще одна важная осо-бенность этой системы выявления мутаге-

нов - добавление гомогената печени млеко-питающих. Напомним, что некоторые по-тенциальные канцерогены превращаютсяв активную форму под действием фермента-тивных систем печени или других тканеймлекопитающих (разд. 20.21). В бактерияхэти ферменты отсутствуют, в связи с чем начашку наносят несколько миллиграммов го-могената печени, чтобы активировать по-добные мутагены. Например, соединение

Рис. 26.15. Тест на мутагены с использова-нием сальмонеллы. А. На чаш-ку Петри посеяно примерно 109

бактерий, неспособных синте-зировать гистидин. Б. На чаш-ку помещен кружок фильтро-вальной бумаги, пропитанныймутагеном. В результате воз-никает множество ревертан-тов, способных синтезироватьгистидин. Эти ревертантывидны в виде ореола колонийвокруг белого кружочка. Не-большое число колоний начашке А - спонтанные ревер-танты. [Ames B.N., McCann J.,Yamasaki E., Mutation Res., 31,347 (1975).]


с реакционноспособной боковой цепью(дающее ему возможность образовать кова-лентную связь с ДНК) и с ароматическойгруппой (которое позволяет ему интеркали-ровать) обладает значительно большей му-тагенностью, чем такое же соединение, со-стоящее из одной ароматической группы.

В настоящее время тест с использованиемSalmonella широко используется для оценкиопасности мутагенного и канцерогенногодействия множества разнообразных хими-ческих соединений. Эта быстрая и недорогаябактериологическая проба на мутагенностьдополняет эпидемиологические обследова-ния и пробы на животных, которые всегдаоказываются более трудоемкими, мед-ленными и дорогими. Тест на мутагенностьс использованием Salmonella - ответвлениеисследований взаимосвязи гена и белкау бактерий. Это - удивительный пример то-го, как фундаментальные исследованияв области молекулярной биологии могут не-посредственно внести важный вклад в здра-воохранение.

ЗаключениеПоследовательность оснований гена колли-неарна аминокислотной последовательно-сти полипептидного продукта. Генетиче-ский код - это взаимосвязь между последо-вательностью оснований в ДНК (или со-ответствующего РНК-транскрипта) и по-следовательностью аминокислот в белках.Аминокислоты кодируются группами потри основания (они называются кодонами),начиная с фиксированной точки. 61 кодон из64 кодирует определенную аминокислоту,а остальные три кодона (UAA, UAG и UGA)служат сигналами терминации. Таким обра-зом, для большинства аминокислот имеетсяболее одного кодового слова. Другими сло-вами, код вырожден. Кодоны, определяю-щие одну и ту же аминокислоту, называют-ся синонимами. В большинстве случаевсинонимы различаются только последнимоснованием триплета. Некоторые последо-вательности вирусных ДНК кодируют бо-лее одного белка, так как их транскриптытранслируются в различных рамках считы-вания.


Генетический код един у всех живых орга-низмов. Он был расшифрован в результатеэкспериментов трех типов. Во-первых, син-тетические полирибонуклеотиды (полу-ченные с помощью полинуклеотид-фосфо-рилазы) были использованы в качествемРНК в бесклеточных системах синтезабелка, после того как было открыто, чтоpoly(U) кодирует фенилаланин. Во-вторых,тринуклеотид (подобный кодону в мРНК)специфически связывается с определеннойтРНК, для которой он является кодовымсловом. Были синтезированы все 64 трину-клеотида и проверена их способность сти-мулировать связывание определенныхтРНК с рибосомами. В-третьих, в качествемРНК были использованы синтетическиеполирибонуклеотиды с известной последо-вательностью. Например, на матрицеpoly(UAUC) синтезировался poly(Tyr-Leu-Ser-Ile).

Многие гены высших эукариот имеют«разорванное» строение. Кодирующие по-следовательности (экзоны) в таких генахразделены вставочными последовательно-стями (интронами), которые удаляютсяв ходе превращения первичного транскрип-та в мРНК. Например, ген β-глобина млеко-питающих содержит два интрона. Преры-вистые гены, как и непрерывные гены,коллинеарны своим полипептидным про-дуктам.

Мутации обусловлены изменениями в по-следовательности оснований ДНК. Ос-новные типы мутаций - замены, делециии включения. Самый распространенный типмутаций - замена одной пары оснований надругую. Замена одного пурина другим илиодного пиримидина другим пиримидиномназывается транзицией. Трансверсия - заме-щение пурина пиримидином и наоборот.Мутации могут возникать вследствие спон-танной таутомеризации оснований или поддействием аналогов оснований (например,5-бромурацила) или других химических му-тагенов (например, азотистой кислоты). По-тенциальную канцерогенную активностьмногих веществ можно выявить по их мута-генному действию на бактерии.


С чего начатьYanofsky С., 1967. Gene structure andprotein structure, Sci. Amer, 216(5),80-94. (Статья содержит данные, сви-детельствующие о коллинеарностигена и пептида.)Nirenberg M.W., 1963. The geneticcode II. Sci. Amer., 208(3), 80-94. (Опи-сано использование синтетическихполирибонуклеотидов для расши-фровки кода.)Crick F.Н.С., 1966. The genetic codeIII, Sci. Amer., 215(4), 55-62. (В статьерассматриваются представленияо генетическом коде в тот момент,когда он был почти полностью рас-шифрован.)Kourilsky P., Chambon Р., 1978. Theovalbumin gene: an amazing gene ineight pieces, Trends Biochem. Sci., 3,244-247.

Гипотеза адаптера (роль тРНК)Crick F.H.C., 1958. On proteinsynthesis, Symp. Soc. Exp. Biol, 12,138-163. (Блистательное предвидениемеханизма белкового синтеза. Изло-жена гипотеза адаптера.)

Генетический кодCrick F.Н.С., Barnett L., Brenner S.,Watts-Tobin R.J., 1961. General natureof the genetic code for proteins, Nature,192, 1227-1232.Khorana H.G., 1968. Nucleic acidsynthesis in the study of the geneticcode. In: Nobel Lectures: Physiology or

Medicine (1963-1970), pp. 341-369,American Elsevier (1973).Nirenberg M., 1968. The genetic code.In: Nobel Lectures: Physiology orMedicine (1963-1970), pp. 372-395,American Elsevier (1973).Garen A., 1968. Sense and nonsense inthe genetic code, Science, 160, 149-159.Woese C.K., 1967. The Genetic Code,Harper and Row.Cold Spring Harbor Laboratory, 1966.The Genetic Code (Cold Spring HarborSymposia on Quantitative Biology,vol. 31). (Сборник выдающихся ста-тей, в которых установлены ос-новные свойства кода.)

Перекрывающиеся геныBarrell B.C., Air G.M., Hutchin-son С.A., III, 1976. Overlapping genesin bacteriophage φX174, Nature, 264,34-40.

Коллинеарность гена и белкаYanofsky С., Carlton В.С., Guest J .R. ,Helinski D.R., Henning U., 1964. On thecolinearity of gene structure and proteinstructure, Proc. Nat. Acad. Sci., 51,266-272.Sarabhai X.S., Stretton O.W., Bren-ner S., Bolle A., 1964. Colinearity ofgene with polypeptide chain, Nature,201, 13-17.

Разорванные гены н вставочные по-следовательностиCrick F., 1979. Split genes and RNAsplicing in evolution of eukaryotic cells,Science, 202, 1257-1260.Jeffreys A.J., Flavell R.A., 1977. The

rabbit β-globin gene contains a largeinsert in the coding sequence, Cell, 12,1097-1108.Breathnack R., Mandel J.L., Cham-bon P., 1977. Ovalbumin gene is split inchicken DNA, Nature, 270, 314-319.Cochet M., Gannon F., Hen R.,Maroteaux L., Perrin F., Chambon P.,1979. Organisation and sequencestudies of the 17-piece chickenconalbumin gene, Nature, 282, 567-574.Tilghman S.M., Tiemeier D.C., Seid-man J.G., Peterlin B.M., Sullivan M.,Maijel J.V., Leder P., 1978. Interveningsequence of DNA identified in the struc-tural portion of a mouse β-globin gene,Proc. Nat. Acad. Sci., 75, 725-729.

МутагенезHayes W., 1968. The Genetics ofBacteria and Their Viruses (2nd ed.),Wiley. (В гл. 13 четко и кратко опи-сана природа мутаций.)Drake J. W., Baltz R.H., 1976. Thebiochemistry of mutagenesis, Ann. Rev.Biochem., 45, 11-38.Drake J.W., 1970. The Molecular Basisof Mutation, Holden-Day.

Выявление канцерогеновAmes B.N., 1979. Identifying envi-ronmental chemicals causing mutationsand cancer, Science, 204, 587-593.Devoret R., 1979. Bacterial tests forpotential carcinogens. Sci. Amer,241(2), 40-49.McCann J., Spingarn N.E., Kobori J.,Ames B.N., 1975. Detection ofcarcinogens as mutagens: bacterialtester strains with R factor plasmids,Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 979-983.

Вопросы и задачи

1. Какую последовательностьаминокислот кодирует следую-

щая последовательность оснований моле-кулы мРНК? Считайте, что рамка считыва-ния начинается с 5'-конца: 5'-UUGCCU-AGUGAUUGGAUG-3'.2. Какова последовательность по-

липептида, который образуетсяпри добавлении poly(UUAC) в бесклеточ-ную систему синтеза белка?3. Одноцепочечную РНК вируса

табачной мозаики обработалихимическим мутагеном. Были получены му-танты, у которых в определенном положе-нии вместо пролина располагается серинили лейцин. Повторная обработка мутант-

ной РНК тем же мутагеном привела к по-явлению в том же положении фенилала-нина:

а) Каковы предполагаемые кодоны дляэтих четырех аминокислот?б) Что применялось в качестве мутагена:5-бромурацил, азотистая кислота или акри-диновый краситель?4. Специалист по химии белка ска-

зал молекулярному генетику,что он нашел новый мутантный гемогло-бин, в котором аспартат замещает лизин.


Молекулярный генетик удивился и отпра-вил своего приятеля еще повозитьсяв лаборатории.а) Почему молекулярный генетик выразилсомнения в возможности такой аминокис-лотной замены?б) Какая аминокислотная замена показа-лась бы молекулярному генетику болееприемлемой?5. Ниже приведены последова-

тельности аминокислот в фраг-менте лизоцима бактериофага Т4 дикого ти-па и мутанта:

а) Могла ли эта мутация возникнуть путемзамены одной пары оснований в ДНК фагаТ4? Если нет, то как мог возникнуть такоймутант?б) Какова последовательность основаниймРНК, кодирующей пять аминокислотв белке дикого типа, отличающихся от тойже последовательности у мутанта?6. РНК-транскрипт одного участ-

ка ДНК фага G4 содержит по-следовательность 5'-AAAUGAGGA-3'. Этотфрагмент кодирует три различных белка.Каковы их последовательности?

Дополнительные вопросы см.: Wood W.В.,Wilson J. H., Benbow R. M., Hood L. Е,Biochemistry: A Problems Approach,Benjamin, 1974, ch. 19.

ГЛАВА 27Синтез белка

Из предыдущей главы нам известно, что по-следовательность аминокислот в белкахопределяется последовательностью кодо-нов в мРНК, считываемых молекуламитРНК. Обратимся теперь к механизму син-теза белка. Этот процесс называется транс-ляцией (от англ. translation - перевод), таккак информация, записанная на четырехбук-венном языке нуклеиновых кислот, перево-дится на язык белков, состоящий из 20 букв.Как и следовало ожидать, трансляция - про-цесс более сложный, чем репликация илитранскрипция ДНК, которые происходятс использованием одного и того же языкаспаривания оснований. Трансляция осу-ществляется в результате согласованноговзаимодействия более чем сотни видов ма-кромолекул. Помимо рибосом, необходимымолекулы тРНК, активирующих фермен-тов, растворимых факторов и мРНК.

Прежде чем перейти к подробному описа-нию синтеза белка, рассмотрим процессв общих чертах. Белок синтезируется в на-правлении от аминоконца к карбоксильно-му концу путем последовательного присое-динения аминокислот к карбоксильномуконцу растущей пептидной цепи. Амино-ацил-тРНК, в которых карбоксильная груп-па аминокислоты присоединена к 3'-концутРНК, играют в этом процессе роль активи-рованных предшественников. Присоедине-ние аминокислоты к соответствующейтРНК катализирует аминоацил-тРНК—синтетаза. Эта реакция активации,будучи аналогична активации жирных кис-лот, также запускается энергией гидролизаАТР. Для каждой аминокислоты имеется покрайней мере один вид тРНК и специфиче-ский активирующий фермент. Синтез белкаосуществляется в три стадии, называемыеинициацией, элонгацией и терминацией.

Инициация приводит к связыванию инициа-торной тРНК с сигналом начала транскрип-ции в мНРК. Инициаторная тРНК занимаетР-участок рибосомы (от англ. peptidyl - пеп-тидильный) - один из двух участков связы-вания тРНК. Элонгация начинается сосвязывания аминоацил-тРНК с другимучастком связывания тРНК на рибосоме,называемым А-участком (от англ.aminoacyl - аминоацильный). Затем обра-зуется пептидная связь между аминогруп-пой второй аминоацил-тРНК и карбоксиль-ной группой fMet, связанного с инициатор-ной тРНК. Теперь образовавшаяся в резуль-тате дипептидил-тРНК перемещается изА-участка в Р-участок, в то время как осво-бодившаяся молекула тРНК покидает рибо-сому. Связывание аминоацил-тРНК, пере-мещение пептидил-тРНК из А-участкав Р-участок и одновременное перемещениерибосомы к следующему кодону мРНК тре-буют гидролиза GТР. Затем новая амино-ацил-тРНК связывается со свободным А-участком и начинается новый цикл реакцииэлонгации, подобный уже описанному.Терминация происходит тогда, когда стоп-кодон (сигнал терминации) в молекулетРНК считывается фактором освобождениябелка. Это приводит к отделению завершен-ной полипептидной цепи от рибосомы. В на-стоящей главе мы будем говорить главнымобразом о синтезе белка в клетках E.coli, гдеэтот процесс лучше всего изучен. Некоторыеразличия между синтезом белка у прока-риот и эукариот будут рассмотреныв разд. 29.25.

27.1. Аминокислоты активируютсяи присоединяются к транспортным РНКпод действием специфических синтетазОбразование пептидной связи между ами-ногруппой одной аминокислоты и СООН-группой другой аминокислоты термодина-

27. Синтез белка 87

мически невыгодно. Этот термодинамиче-ский барьер преодолевается путем актива-ции СООН-группы аминокислот-предше-ственников. Активированными промежу-точными продуктами синтеза белка слу-жат эфиры аминокислот, в которых карбок-сильная группа аминокислоты связана с 2'-или 3'-гидроксильной группой рибозногоостатка на 3'-конце тРНК. Аминоацильнаягруппа может быстро перемещаться из2'-положения в 3'-положение и обратно.Этот активированный промежуточный про-дукт называется аминоацил-тРНК(рис. 27.1).

Присоединение аминокислоты к тРНКимеет значение не только потому, что приэтом активируется ее карбоксильная группаи она может образовать пептидную связь,но и потому, что аминокислоты сами по се-бе не способны узнавать кодоны в мРНК.Аминокислоты переносятся к рибосомамспецифическими тРНК, которые и узнаюткодоны в мРНК. Таким образом, эти тРНКвыполняют роль адапторных молекул.

В 1957 г. Пол Замечник и Малон Хогланд(Paul Zamecnik, Mahlon Hoagland) установи-ли, что активация аминокислот и их после-дующее присоединение к тРНК катализи-руются специфическими аминоацил-тРНК—синтетазами, которые также на-зывают активирующими ферментами.В реакциях, катализируемых некоторымисинтетазами, первая стадия состоит в обра-зовании аминоациладенилата из аминокис-лоты и АТР. Это активированное соедине-ние представляет собой смешанный анги-дрид, в котором карбоксильная группааминокислоты присоединена к фосфатнойгруппе AMP. Другие синтетазы катализи-руют реакцию АТР, аминокислоты и тРНКбез промежуточного образования доступно-го для обнаружения аминоациладенилата.

Следующий этап - перенос аминоациль-ной группы аминоацил-АМР на молекулутРНК с образованием аминоацил-тРНК-активированного промежуточного продук-та в синтезе белка. Переносится ли аминоа-


Рис. 27.1. В аминоацил-тРНК аминокис-лота связана эфирной связьюс 2'- или 3'-гидроксильной груп-пой концевого аденозина.

цильная группа на 2'- или 3'-гидроксильнуюгруппу рибозного остатка на 3'-конце тРНК,зависит от того, о какой аминокислоте и ка-кой аминоацил-тРНК—синтетазе идетречь. Активированная аминокислота можеточень быстро перемещаться из 2'- в 3'-поло-жение и обратно.

Аминоацил-АМР + тРНКАминоацил-тРНК + AMP.

Суммарная реакция этапов активациии переноса описывается следующим уравне-нием:

Аминокислота + АТР + тРНКАминоацил-тРНК + AMP + РР i .

ΔG' для этой реакции близко к нулю, таккак свободная энергия гидролиза эфирнойсвязи аминоацил-тРНК соответствует сво-бодной энергии гидролиза концевой фосфо-

рильной группы АТР. Что же в таком случаезапускает синтез аминоацил-тРНК? Каки можно было ожидать, реакция запускаетсягидролизом пирофосфата. Суммарная реак-ция этих превращений высокоэкзергонична:

Аминокислота + АТР + тРНК + Н2ОАминоацил-тРНК + AMP + 2Р i.

Таким образом, на синтез аминоацил-тРНК затрачиваются две богатые энергиейфосфатные связи. Одна из них расходуетсяна образование эфирной связи аминоацил-тРНК, другая сдвигает равновесие реакциив сторону образования продукта.

Стадии активации и переноса определен-ной аминокислоты катализируются однойи той же аминоацил-тРНК—синтетазой.В действительности аминоацил-АМР не дис-социирует из комплекса с синтетазой. Онпрочно связывается с активным центромфермента нековалентными взаимодействия-ми. В норме аминоацил-АМР, образующий-ся в качестве промежуточного продукта син-теза аминоацил-тРНК, существует в течениенепродолжительного времени, но он вполнестабилен и может быть легко выделен, еслив реакционной смеси нет тРНК.

Мы уже встречались с ациладенилатнымпромежуточным продуктом при активациижирных кислот (разд. 17.6). Интересно от-метить, что Пол Берг (Paul Berg) первым от-крыл этот промежуточный продукт в реак-ции активации жирных кислот, и он жепозже выяснил, что этот продукт образуетсятакже при активации аминокислот. Основ-ное различие между этими реакциями со-стоит в том, что в первом случае роль акцеп-тора ацильных групп играет СоА, а вовтором - тРНК. Энергетика этих биосинте-тических реакций очень сходна: обе они ста-новятся необратимыми благодаря гидроли-зу неорганического пирофосфата.

Для каждой аминокислоты имеется покрайней мере одна аминоацил-тРНК—син-тетаза. Эти ферменты различаются по раз-меру, субъединичной структуре и аминокис-лотному составу (табл. 27.1).

Таблица 27.1. Свойства некоторых аминоацнл-тРНК-сннтетаз

Источник

E.coliE.coliE.coliE.coliДрожжиДрожжиПоджелудоч-ная железа бы-ка

Специфич-ность к ами-нокислоте

ГистидинИзолейцинЛизинГлицинЛизинФенилалакинТриптофан

Масса,кДа

85114104227138270108

Субъеди-ничнаяструктура

α2

Одна цепь

α2

α2β2

α2

α2β2

α2

Рис. 27.2. Пространственные моделивалина и изолейцина. Синте-тазы, активные в отношенииэтих аминокислот, высоко спе-цифичны.

27.2. Надежность синтеза белкаопределяется высокой специфичностьюаминоацил-тРНК-синтетазПравильная трансляция генетических ма-триц обеспечивается высокой специфич-ностью аминоацил-тРНК—синтетаз. Этиферменты весьма избирательны в отноше-нии активируемых аминокислот и соответ-ствующей тРНК-акцептора. Как будет ука-зано несколько ниже, молекулы тРНК,акцептирующие различные аминокислоты,имеют различные последовательности ос-нований, благодаря чему синтетазы легкоузнают их. Гораздо более сложная задачадля этих ферментов - различать сходныеаминокислоты. Например, единственноеразличие между изолейцином и валином со-стоит в том, что изолейцин содержит лиш-нюю метиленовую группу (рис. 27.2). До-полнительная энергия связывания, которуювносит эта лишняя группа —СН2—, благо-приятствует тому, что активация изолей-цина происходит примерно в 200 раз чаще,чем активация валина. Концентрация ва-лина in vivo примерно в 5 раз выше концен-трации изолейцина, так что валин должен


был бы неправильно включаться вместоизолейцина в одном случае из 40. Однаконаблюдаемая частота ошибок in vivo соста-вляет всего одну на 3000. Это указывает, чтодолжна существовать еще какая-то стадиякоррекции ошибок для увеличения надежно-сти. Действительно, синтетаза исправляетсобственные ошибки. Валин, активиро-ванный по ошибке, не переносится на тРНК,специфичную к изолейцину. Вместо этоготРНК способствует гидролизу валин-АМРи таким образом предупреждает его непра-вильное включение в белки. Кроме того, этагидролитическая реакция освобождает син-тетазу для активации и переноса изолей-цина правильной аминокислоты. Какимобразом синтетаза избегает гидролизаизолейцин-АМР - правильного промежу-точного продукта? Скорее всего, гидроли-тический участок достаточно велик, чтобытам поместился валин-АМР, но слишкоммал для связывания изолейцин-АМР.

Многие другие аминоацил-тРНК—син-тетазы также содержат, помимо участковсинтеза, гидролитические участки. Возмож-но, эти участки действуют как двойныефильтры, обеспечивающие высокую надеж-ность. Участок синтеза отбрасывает амино-кислоты, превышающие по размеру нужнуюаминокислоту, а гидролитический участокразрушает те активированные промежу-точные продукты, которые меньше по раз-меру, чем требуется. Очевидно, высокая на-дежность синтеза белка в первую очередьзависит от механизма коррекции с помощьюгидролитической активности, которой обла-дают многие аминоацил-тРНК—синте-тазы.

27.3. Молекулы транспортных РНК имеютобщий план строенияВ 1965 г, Роберт Холли (Robert Holley) послесеми лет упорных поисков впервые опреде-лил последовательность оснований однойиз транспортных РНК. При исследованиидрожжевой аланиновой тРНК была получе-на первая полная последовательность ну-клеиновой кислоты. Эта работа стала источ-ником новых идей, касающихся биологиче-ской активности молекулы тРНК. В процес-се расшифровки последовательности Холлиразработал общие методы для определенияпоследовательности нуклеотидов в нуклеи-новых кислотах. Последовательность дрож-


Рис. 27.3. Исправление ошибок с по-мощью гидролиза ошибочногопродукта.

Рис. 27.4. Последовательность основа-ний дрожжевой аланиновойтРНК. Модифицированные ну-клеозиды (отмечены зеленым)сокращенно обозначаются сле-дующим образом: инозин - I,метилинозин - mI, дигидро-уридин - UH2, риботимидин -Т, псевдоуридин - ψ, метилгу-анозин - mG и диметилгуано-зин - m2G.

жевой аланиновой тРНК показана нарис. 27.4. Молекула представляет собой од-ну цепь из 76 рибонуклеотидов. 5'-конецфосфорилирован (pG), а 3'-конец имеет сво-бодную 3'-гидроксильную группу. Харак-терная особенность этой молекулы - высо-кое содержание оснований, отличных от А,U, G и С. В ней содержится девять необы-чных нуклеотидов: инозин, псевдоуридин,дигидроуридин, риботимидин и метилиро-ванные производные гуанозина и инозина.Участок прикрепления аминокислоты пред-ставляет собой 3'-гидроксильную группуостатка аденозина на 3'-конце молекулы.Последовательность IGC в середине моле-кулы - антикодон. Он комплементаренGCC - одному из кодонов аланина.

Вскоре были определены последователь-ности нескольких других молекул тРНК.К настоящему времени уже известны после-довательности более 70 тРНК. Самое уди-вительное, что все эти последовательностиможно изобразить в форме клеверного ли-ста, в котором около половины нуклеоти-дов образует пары оснований. Следователь-но, молекулы тРНК обладают многимиобщими структурными особенностями.В этом факте нет ничего неожиданного, так

как все молекулы тРНК должны взаимодей-ствовать примерно одинаковым образомс рибосомами и мРНК. Говоря конкретно,все молекулы тРНК должны укладыватьсяв А- и Р-участки рибосомы и должны взаи-модействовать с ферментом, катализирую-щим образование пептидной связи.

Все молекулы транспортных РНК обла-дают следующими общими свойствами.

1. Все они представляют собой одну цепьдлиной от 73 до 93 рибонуклеотидов (массаоколо 25 кДа).

2. Они содержат много необычных осно-ваний, как правило, от 7 до 15 на молекулу.Многие из этих необычных оснований пред-ставляют собой метилированные или диме-

тилированные производные A, U, С и G, ко-торые образуются путем ферментативноймодификации тРНК-предшественника(разд. 25.17). Роль этих необычных основа-ний неизвестна. Вполне возможно, что мети-лирование препятствует спариванию неко-торых оснований и делает их таким образомдоступными для других взаимодействий.Кроме того, метилирование изменяет ги-дрофобность некоторых участков тРНК,что может иметь важное значение для ихвзаимодействия с синтетазами и рибо-сомными белками.

3. 5'-конец тРНК фосфорилирован. На5'-конце обычно расположен остаток pG.

4. На 3'-конце всех тРНК находится по-следовательность ССА. Активированнаяаминогруппа прикрепляется к 3'-гидрок-сильной группе концевого аденозина.

5. Примерно половина нуклеотидовтРНК спарена и образует участки двойнойспирали (рис. 27.5). Не спарены пять группоснований: 3'-концевая область ССА (акцеп-торная ветвь); ТψC-петля, которая получи-ла свое название по последовательности ри-ботимидин - псевдоурацил - цитозин;добавочная петля, число остатков которойразлично в разных тРНК; дигидроуридило-вая петля, которая содержит несколькоостатков дигидроуридина; антикодоноваяпетля.

6. Антикодоновая петля состоит из семиоснований, расположенных в следующейпоследовательности:

27.4. Транспортная РНК имеет L-образнуюформуК настоящему времени трехмерная структу-ра молекулы тРНК установлена на атом-ном уровне благодаря рентгеновским кри-сталлографическим исследованиям, осу-ществленным в лабораториях АлександраРича и Арона Клуга (Alexander Rich, AaronKlug). В результате проведенного ими неза-висимого рентгенографического изученияфенилаланиновой тРНК получено множе-ство новых данных о структуре молекулытРНК.


Рис. 27.5. Общая схема строения моле-кул тРНК.

1. Молекула имеет L-образную форму(рис. 27.6 и 27.7).

2. В молекуле имеется два участка двой-ной спирали. Каждая из этих спиралей содер-жит примерно десять пар оснований, что со-ответствует одному витку спирали. Спи-ральные участки расположены перпендику-лярно друг другу, что и придает молекулеL-образную форму. Схема спаривания осно-ваний, постулированная в модели клеверно-го листа, построенной по результатам опре-деления последовательности, оказалась пра-вильной.

3. Большинство оснований вне спи-ральных участков образует необычные во-дородные связи. Эти третичные взаимодей-ствия возникают между основаниями, ко-торые обычно не комплементарны другдругу (например, G—G, А—А и А—С). Бо-лее того, рибозофосфатный остов взаимо-


действует с некоторыми основаниями и да-же с другим участком самого остова. Вомногих подобных взаимодействиях 2'-ОН-группа остатков рибозы выступает в каче-стве донора или акцептора при образованииводородных связей. Кроме того, значитель-ная часть оснований упакована в стопки(межплоскостные взаимодействия). Эти ги-дрофобные взаимодействия между соседни-ми ароматическими кольцами играют ос-новную роль в молекулярной архитектуре.

4. ССА-конец - участок прикрепленияаминокислоты - расположен на одном изконцов L. Другой конец L представляет со-бой антикодоновую петлю. Таким образом,аминокислота, связанная в аминоацил-тРНК, удалена от антикодона (на расстоя-ние примерно 80 А). Дигидроуридиловаяпетля и ТψC-петля образуют угол буквы L.

5. ССА-конец и прилегающая к нему спи-ральная область не очень сильно взаимо-действуют с остальной молекулой. Этачасть молекулы может изменять конформа-цию при активации аминокислоты и присинтезе белка на рибосоме.

Определение трехмерной структурытРНК - важный шаг в изучении процесса

трансляции на молекулярном уровне. Ещесовсем недавно решение этого вопроса каза-лось делом далекого будущего. Теперь идеии усилия исследователей в данной областиобращаются к еще более сложным задачам,таким, как изучение трехмерной структурыкомплексов аминоацил-тРНК—синтетазыс тРНК и даже тРНК, связанной с мРНКи рибосомными белками.

27.5. В узнавании кодона участвуетантикодон, а не активированнаяаминокислотаМы уже упоминали, что антикодонтРНК - участок, узнающий кодон мРНК,и что узнавание происходит путем спарива-ния оснований. Играет ли какую-нибудьроль в этом процессе аминокислота, присое-диненная к тРНК? Ответ на этот вопросбыл получен следующим путем. Вначале ци-стеин присоединили к соответствующейтРНК (она обозначается тРНКСуs). Затем

Рис. 27.6. Фотография скелетной моделидрожжевой фенилаланиновойтРНК, основанная на картеэлектронной плотности с раз-решением 3 А. (Печатаетсяс любезного разрешения д-раSung-Hou Kim.)

присоединенный остаток цистеина превра-тили в аланин, обработав Cys-тРНКCys ни-келем Ренея. В результате атом серы отде-лился от активированного остатка цисте-ина; связь цистеина с тРНК при этом незатрагивалась.Так была получена гибридная аминоацил-тРНК, в которой аланин ковалентно при-соединен к тРНК, специфичной к цистеину.

Рис. 27.7. Схематическое изображениетрехмерной структуры дрож-жевой фенилаланиновойтРНК. (По рисунку, любезнопредоставленному д-ром Sung-Hou Kim.)


Какой кодон узнаёт эта гибриднаятРНК - аланина или цистеина? Ответ былполучен при использовании этой гибриднойтРНК в бесклеточной системе синтеза бел-ка. Матрицей служил случайный сополимер,построенный из U и G в соотношении 5 : 1 ;в норме он вызывает включение цистеина(UGU), но не аланина (GCX). Но когда в ин-кубационную смесь добавили Ala-тРНКCys,произошло включение аланина в полипеп-тид. Другими словами, аланин включалсятак, как если бы к тРНК, специфичной к ци-стеину, был присоединен цистеин. Был сде-лан вывод, что узнавание кодона не зависитот аминокислоты, прикрепленной ктРНК.

Такой же результат был получен в техслучаях, когда роль матрицы выполнялагемоглобиновая мРНК. В качестве гиб-ридной аминоацил-тРНК использовали14С-аланил-тРНКCys. Единственный ра-диоактивный триптический пептид (т. е. пеп-тид, содержащий 14С-аланин) соответство-вал пептиду, который в норме содержитцистеин, а не аланин. С другой стороны, нив одном пептиде, который в норме содержиталанин, а не цистеин, не было обнаруженометки. Этот эксперимент, равно как и пре-дыдущий, убедительно доказал, что амино-кислота в аминоацил-тРНК не играет ника-кой роли в выборе кодона.

27.6. Молекула транспортной РНКможет узнавать более одного кодонаблагодаря «качаниям»По каким правилам происходит узнаваниекодона антикодоном в тРНК? Проще всегопредположить, что каждое из оснований ко-дона образует уотсон-криковскую пару ос-нований с комплементарным основаниемантикодона. Тогда кодон и антикодон дол-жны полностью соответствовать друг другус учетом антипараллельности (на схемештрих обозначает комплементарное осно-вание):


Так, X и X' должны быть либо А и U (илиU и А), либо G и С (или С и G). Из этой мо-дели следует, что каждый антикодон можетузнавать только один кодон. Однако факты,которыми мы располагаем, противоречатэтому. Некоторые выделенные в чистом видемолекулы тРНК могут узнавать болееодного кодона. Например, дрожжевая алани-новая тРНК, изученная Холли, связываетсяс тремя кодонами: GCU, GCC и GCA.Только первые два основания этих кодоноводинаковы, третье различается. Можетбыть, узнавание третьего основания кодонаиногда менее избирательно, чем узнаваниедвух других? Общая картина вырожденно-сти генетического кода показывает, что деломожет обстоять именно так. XYU и XYCвсегда кодируют одну и ту же аминокисло-ту, a XYA и XYG обычно имеют одинаковыйсмысл. Исходя из этих данных, Крик пред-положил, что на спаривание третьего осно-вания должны накладываться менее строгиестерические ограничения, чем на спариваниедвух других. Были построены модели раз-личных вариантов спаривания оснований,чтобы определить, какие из них сходны состандартными А—U- и G—С-парами в от-ношении расстояния и угла между глико-зидными связями. В это исследование былвключен инозин, так как он встречается в не-которых антикодонах. Если предположить,что в спаривании третьего основания кодо-на допустима некоторая стерическая свобо-да («качание», или неоднозначное соответ-ствие), то комбинации, приведенныев табл. 27.2, кажутся вполне возможными.

В настоящее время правомочность гипо-тезы «качаний» доказана. АнтикодонытРНК с известной последовательностьюсвязываются с теми кодонами, которыепредсказывает эта теория. Например, анти-кодоном дрожжевой аланиновой тРНК

Таблица 27.2. Допустимые типы спаривания третьего ос-нования кодона в соответствии с гипотезой «качаний»

Первое основаниеантикодона

CАUGI

Третье основаниекодона

GUА или GU или СU, С или А

является IGC. Эта тРНК узнает кодоныGCU, GCC и GCA:

Итак, I спаривается с U, С и А, как и пред-сказывает теория.

Фенилаланиновая тРНК, имеющая анти-кодон GAA, узнает кодоны UUU и UUC, ноне UUA и UUG:

Таким образом, G спаривается с U или с Св третьем положении кодона, как и пред-сказывает гипотеза качаний.

Можно сделать два обобщения, касаю-щихся кодон-антикодонового взаимодей-ствия.

1. Первые два основания кодона спари-ваются обычным образом. Узнавание про-исходит точно. Следовательно, кодоны, ко-торые различаются по одному из первыхдвух оснований, должны узнаваться раз-личными тРНК. Например, и UUA, и CUAкодируют лейцин, но считываются раз-личными тРНК.

2. Первое основание антикодона опреде-ляет, считывает ли данная молекула тРНКодин, два или три типа кодонов: С и А уз-нают по одному кодону, U и G - по два ко-дона, I - три кодона. Итак, одна из причинвырожденности генетического кода заклю-чается в неточности, или неоднозначности,спаривания («качании») третьего основаниякодона. Именно в этом мы усматриваем ос-новную причину распространенности не-обычного нуклеозида инозина в антикодо-нах. Инозин увеличивает число кодонов,которые способна считывать данная мо-лекула тРНК (рис. 27.8).

27.7. Мутантные молекулы транспортныхРНК могут подавлять другие мутацииНовый этап в изучении процесса узнаваниякодона начался в связи с исследованиямимутантных тРНК, в которых изменено одно

основание в антикодоне. Эти спонтанныесобытия противоположны по своей сути хи-мической модификации in vitro аминокис-лоты, прикрепленной к тРНК. Любопытнаистория открытия таких мутантных тРНК.В течение многих лет генетики знали, чтоповреждающее действие некоторых мута-ций может быть подавлено другой мута-

Рис. 27.8. Благодаря «качаниям» инозинможет давать пары основанийс цитозином, аденином и ура-цилом.


Рис. 27.9. Супрессия мутации, приво-дящей к терминации цепи, вто-рой мутацией в молекулетРНК.

цией. Предположим, какой-то фермент сталнеактивным из-за превращения кодонаGCU (аланин) в кодон GAU (аспартат). Му-тации какого рода могли бы восстановитьактивность этого фермента?

1. Обратная мутация того же основанияА—>С даст исходное кодовое слово.

2. Другая мутация A—>U даст валин(GUU), который, возможно, полностью иличастично восстановит активность фермента.

3. Мутация в другом месте того же генаможет обратить действие первой мутации.Такой измененный белок будет отличатьсяот белка дикого типа двумя аминокислота-ми.

4. Мутация в другом гене может преодо-леть повреждающее действие первой мута-ции. Это явление называется межгеннойсупрессией.

В течение долгого времени механизм дей-ствия межгенных супрессоров оставался за-гадкой. Теперь мы знаем из генетическихи биохимических исследований, что боль-шинство таких супрессоров действует, из-меняя считывание мРНК. Рассмотримк примеру мутацию, которая приводит к по-явлению терминирующего кодона UAG(т. е. стоп-кодона, или сигнала терминации).Результатом мутации будет образованиенеполных полипептидных цепей. Такие му-тации называются нонсенс-мутациями (отангл. nonsense - бессмысленный), так как не-полные полипептиды обычно неактивны.Действие нонсенс-мутации UAG можетбыть подавлено мутациями в нескольких


различных генах. Один из этих супрессоровсчитывает UAG как кодон тирозина,

что может привести к синтезу активногобелка вместо неполной полипептидной цепи(рис. 27.9). Почему же эта мутантная РНКвставляет тирозин в ответ на кодон UAG?В норме тирозиновая тРНК узнает кодоныUAC и UAU. Эта мутантная тРНК идентич-на нормальной тирозиновой тРНК, за ис-ключением одной замены основания в анти-кодоне: GUA—>CUA. Мутация G—>С пер-вого основания антикодона меняет специ-фичность узнавания. Как предсказываеттеория «качаний», измененный антикодонможет узнавать только UAG.

Супрессорная тРНК этого типа будет за-креплена отбором скорее всего в том случае,если мутировавшая тРНК не была необхо-димой. Иными словами, должна существо-вать другая разновидность тРНК, котораяузнает те же кодоны, что и мутировавшаятРНК. Действительно, у E.coli имеются дверазличные тРНК, которые в норме узнаюткодоны UAC и UAU. Изменяется та тРНК,которая присутствует в небольшом количе-стве. Функция этой минорной разновидно-сти тирозиновой тРНК в норме неясна.В связи с существованием такой супрессор-ной мутации возникает еще один вопрос. Ес-ли мутантный кодон в UAG считываетсякак тирозин, а не как сигнал терминации,что происходит при нормальной термина-ции цепей? Как ни странно, большинствополипептидных цепей в клетках супрессор-ного мутанта терминируется нормально,возможно, по той причине, что сигнал тер-

Рис. 27.10. Электронные микрофотогра-фии 70S-рибосом (А), 50S-суб-частиц (Б) и 30S-субчастиц (В).(Печатается с любезного разре-шения д-ра James Lake.)

минации представляет собой нечто боль-шее, чем просто кодон UAG. Действитель-но, известно, что некоторые кодирующиепоследовательности заканчиваются двумяразличными стоп-кодонами. Кроме того,

супрессия не обладает стопроцентной эф-фективностью.

Были обнаружены и другие виды му-тантных тРНК. Миссенс-супрессоры изме-няют считывание мРНК, так что в ответ нанекоторые кодоны вставляется измененнаяаминокислота (например, глицин вместо ар-гинина). Особенно интересны супрессорысдвига рамки. Одна из таких тРНК содержитлишнее основание в антикодоновой петле.Благодаря этому она считывает в качествекодона четыре основания вместо трех. На-пример, UUUC считывается как кодон фе-нилаланина вместо UUU. Такая измененнаятРНК может супрессировать вставку лиш-него основания.

27.8. Рибосомы - органеллы,в которых происходит синтез белка,-состоят из большой и малой субчастицПерейдем теперь к механизму синтеза бел-ка. Этот сложный процесс происходит в ри-босомах, которые можно рассматривать какорганеллы синтеза белка, подобно тому какмитохондрии считают органеллами окисли-тельного фосфорилирования. Рибосома -весьма специализированная и сложнаяструктура. Ее диаметр - примерно 200 А.Лучше всего изучены рибосомы E.coli. Мас-са этой рибосомы составляет 2500 кДа,а коэффициент седиментации 70S. Ее можнодиссоциировать на большую (50S) и малую(30S) субчастицы. Далее эти субчастицыможно диссоциировать на составляющие ихбелки и РНК. 30S-субчастица содержит 21белок и одну молекулу 16S-PHK. 50S-субча-стица содержит примерно 34 белка и 2 моле-кулы РНК (23S и 5S). Рибосома E.coli при-мерно на две трети состоит из РНК и наодну треть - из белка.

Рибосомы цитоплазмы эукариотическихклеток несколько крупнее бактериальныхрибосом. Интактная эукариотическая рибо-сома имеет коэффициент седиментации 80S.Подобно бактериальной рибосоме, она дис-социирует на большую (60S) и малую (40S)субчастицы. Малая субчастица содержитодну молекулу 18S-PHK, а большая субча-стица - три молекулы РНК (28S, 7S1) и 5S).Рибосомы митохондрий и хлоропластов от-личаются от цитоплазматических рибосом

1 Эту рРНК по сложившейся традиции чащеобозначают 5,8S-PHK.- Прим. перев.


Рис. 27.11. Рибосомы можно диссоцииро-вать примерно на 55 белкови три молекулы РНК.

эукариот. Они больше похожи на 70S-ча-стицы, а не на 80S. Между синтезом белкав митохондриях, хлоропластах и бактерияхимеется много общего.

27.9. Рибосомы можно реконструировать изсоставляющих их молекул белков и РНКРибосомную 30S-субчастицу можно рекон-струировать из смеси 16S-PHK и 21 белка,входящего в ее состав. Сборку этих компо-нентов с образованием функционально ак-тивной 30S-субчастицы впервые осуществилМасаясу Номура (Masayasu Nomura)в 1968 г. Через несколько лет была рекон-струирована 50S-субчастица. Эти экспери-менты имели важное значение в двух отно-шениях. Во-первых, они продемонстрирова-ли, что вся информация, необходимая длясборки этой органеллы, содержится в струк-туре ее компонентов. Для сборки не нужныникакие внерибосомные факторы. Такимобразом, образование рибосом in vitro пред-ставляет собой процесс самосборки. Во-вторых, реконструкцию можно использо-вать для того, чтобы выяснить, необходимли тот или иной компонент для сборки ри-босомы или собственно для ее функциони-рования. Например, таким образом был вы-явлен компонент рибосомы, отвечающий заее чувствительность к антибиотику стрепто-мицину (разд. 27.20). Из работ по рекон-струкции 30S-субчастицы были сделаны сле-дующие выводы.

98Часть IV.Информации

1. 16S-PHK необходима для ее сборкии функционирования. Эта потребность весь-ма специфична, так как 16S-PHK из дрож-жей не может заменить 16S-PHK из E.coli.Роль молекул рибосомной РНК остаетсяобластью пристального интереса со сто-роны исследователей.

2. В опытах по реконструкции каждыйраз из системы исключали один из белков,чтобы выяснить, может ли интактная30S-субчастица образоваться из остальных20 белков и 16S-PHK. Оказалось, что покрайней мере шесть белков необходимо длясборки 30S-частицы.

3. Для сборки функционально активной30S-частицы необходимо большинство вхо-дящих в нее белков. Итак, 30S-субчастицапредставляет собой кооперативную целост-ную в функциональном отношении структу-ру.

27.10 Белки синтезируются в направленииот аминоконца к карбоксильному концуОдним из первых вопросов, касающихся ме-ханизма синтеза белка, был вопрос о том,синтезируются ли белки в направлении отаминоконца к карбоксильному концу илинаоборот. Четкий ответ на этот вопрос далиопыты Говарда Динциса (Howard Dintzis)с импульсной меткой. Ретикулоциты, актив-

Рис. 27.12. Разделение белков рибосом-ной 50S-субчастицы с по-мощью двумерного электро-фореза в полиакриламидномгеле. (Печатается с любезногоразрешения д-ра CharlesCantor.)

Рис. 27.13. Электрофоретическое разделе-ние в полиакриламидном гелебелков нативной рибосомной30S-субчастицы (слева) и рекон-струированной 30S-субча-стицы (справа). В реконструи-рованной субчастице присут-ствуют все те же белки, что ив нативной. (Печатается с лю-безного разрешения д-раMasayasu Nomura.)

но синтезирующие гемоглобин, инкубиро-вали в присутствии 3Н-лейцина в течениекоротких промежутков времени, недоста-точных для синтеза полных цепей. Синтези-рованный в этих условиях гемоглобин раз-деляли на α- и β-цепи и обрабатывалитрипсином. Затем определяли удельную ра-диоактивность полученных пептидов, т.е.отношение их радиоактивности к общемусодержанию лейцина. В пептидах, располо-женных в нативном белке вблизи карбок-сильного конца, было больше радиоактив-ности, чем в пептидах вблизи аминоконца.Наблюдалось постепенное возрастание ра-диоактивности от аминоконца к карбоксиль-ному концу (рис. 27.14). Сильнее всего былпомечен карбоксильный конец, так как онсинтезировался последним. Следовательно,направление роста цепей — от аминоконцак карбоксильному концу.

27.11. Информационная РНК транслируетсяв направлении 5'—>3'Направление считывания мРНК определя-ли с помощью синтетического полинуклео-тида

использованного в качестве матрицы в бес-клеточной системе синтеза белка. ААА ко-дирует лизин, а ААС-аспарагин. Полипеп-тидный продукт имел структуру

Поскольку аспарагин был расположен накарбоксильном конце, кодон ААС был счи-тан последним. Следовательно, трансляцияидет в направлении 5'—>3'. Напомним, чтомРНК также синтезируется в направлении5'—>3' (разд. 25.14). Это означает, что мРНКможет транслироваться уже в то время, ког-да она еще синтезируется. Действительно,

Рис. 27.14. Распределение 3Н-лейцинав α-цепи гемоглобина, синтези-рованного после инкубации ре-тикулоцитов в течение корот-кого времени в присутствииметки. Более высокая радиоак-тивность С-конца по сравне-нию с N-концом указывает, чтоС-конец синтезируется послед-ним.


у E.coli 5'-конец мРНК взаимодействуетс рибосомами вскоре после того, как он син-тезируется (рис. 27.15). Таким образом,трансляция тесно сопряжена с транскрип-цией.

27.12. Одну молекулу мРНК одновременнотранслирует несколько рибосомОдну молекулу мРНК могут одновременнотранслировать несколько рибосом. Это су-щественно увеличивает эффективность ис-пользования мРНК. Группа рибосом, свя-занных с одной молекулой мРНК, назы-вается полирибосомой или полисомой. Рибо-сомы, входящие в состав этой структуры,работают независимо, и каждая из них син-тезирует полную полипептидную цепь. Примаксимальной плотности рибосом намРНК одна рибосома приходится на 80 ну-клеотидов. Полирибосомы, синтезирующиегемоглобин (цепь гемоглобина содержит145 аминокислот, а мРНК - соответственно500 нуклеотидов), обычно состоят из пятирибосом. Рибосомы, расположенные ближевсего к 5'-концу мРНК, несут самые корот-кие полипептидные цепи, а те, что ближек 3'-концу,- почти полные цепи. После осво-бождения полипептидного продукта рибо-сомы диссоциируют на 30S- и 50S-субча-стицы.

27.13. Синтез белка в бактерияхинициируется формилметиониновой тРНККак начинается синтез белка? A priori про-стейшая возможность состоит в том, чтотранслируется вся мРНК, и никакие особыесигналы начала синтеза не нужны. Однакоэксперименты показали, что трансляция неначинается непосредственно на 5'-концемРНК. На самом деле первый трансли-руемый кодон почти всегда расположен нарасстоянии не менее чем 25 нуклеотидов от5'-конца. К тому же многие молекулымРНК у прокариот полицистронны, т.е. ко-дируют две или более полипептидные цепи.Например, одна молекула мРНК длинойоколо 7000 нуклеотидов кодирует пять фер-ментов пути биосинтеза триптофана у E.coli.Каждый из этих пяти ферментов имеетсобственные сигналы начала и конца транс-ляции в мРНК. На деле все изученные моле-кулы бактериальных мРНК содержат сиг-налы начала и конца каждой кодируемойими полипептидной цепи.


Рис. 27.15. Транскрипция участка ДНКE.coli и трансляция новообра-зующейся мРНК. Транскриби-руется лишь часть хромосомы.[Miller О. L, Hamkalo В. А.,Thomas С. A., Jr., Visualizationof Bacterial Genes in Action,Science, 169, 392 (1970).]

Ключом к изучению механизма инициа-ции цепи стало открытие того факта, чтопримерно половина N-концевых аминокис-лот белков E.coli - метионин, хотя в другихположениях полипептидной цепи эта амино-кислота встречается редко. Кроме того, N-конец новообразованных белков обычномодифицирован, из чего следует, что в ини-циации, очевидно, участвует какое-то про-изводное метионина. Действительно, синтезбелка у бактерий начинается с формилме-тионина (fMet). Существует особая тРНК,которая переносит формилметионин к ри-босоме для инициации синтеза белка. Этаинициаторная тРНК (сокращенно обозна-чается mPHKf) отличается от той тРНК, ко-торая вводит метионин во внутренние поло-жения (сокращенно тРНКm). Буква f указы-вает, что метионин, присоединенныйк инициаторной тРНК, может быть форми-лирован, тогда как метионин, присоеди-ненный к тРНКm,- нет.

Метионин присоединяет к этим двум раз-

Рис. 27.16. Схематическое изображениеорганизации полирибосомы(полисомы). Рибосомы дви-жутся вдоль мРНК в направле-нии 5'—>3'. Рибосомы рабо-тают независимо друг от друга.

новидностям тРНК одна и та же аминоа-цил-тРНК—синтетаза. Затем специальныйфермент формилирует аминогруппу ме-тионина, присоединенного к тPHK f. Донорактивированной формильной группы в этойреакции N10-формилтетрагидрофолят.

Рис. 27.17. Образование формилметио-нил-тРНКf.

27.14. Сигналом инициации служит кодонAUG (или GUG), которому предшествуетнесколько оснований, способных спариватьсяс 16S-PHKКакие структурные особенности мРНК по-зволяют системе синтеза белка различатькодоны AUG? Первым шагом на пути к ре-шению этого вопроса было выделение ини-циаторных участков ряда мРНК. Для этогокомплексы мРНК с рибосомами, образо-вавшиеся в условиях, допускающих инициа-цию, но не элонгацию, расщепляли панкреа-тической рибонуклеазой. Во всех случаях отрасщепления была защищена последова-тельность длиной около 30 нуклеотидов.Как и предполагалось, каждый из этих ини-циирующих участков содержал кодон AUGили GUG (рис. 27.18).

Кроме того, каждый участок инициациисодержит богатую пуринами последова-тельность, центр которой находится на рас-стоянии примерно 10 нуклеотидов в 5'-сто-рону от инициирующего кодона. Роль этогобогатого пуринами участка стала ясна, ког-да была расшифрована последовательность16S-PHK. 3'-конец этой рибосомной РНКсодержит последовательность из несколь-ких оснований, комплементарную богатомупурином участку в областях инициации


Рис. 27.18. Последовательности участковинициации синтеза белка неко-торых бактериальных и ви-русных РНК.

мРНК. Из продуктов ферментативного рас-щепления инициирующего комплекса уда-лось выделить комплекс 3'-концевого фраг-мента 16S-мРНК и области инициациимРНК (рис. 27.19). Последовательности бо-лее чем 70 изученных участков инициациипоказывают, что число пар оснований, ко-торые мРНК образует с 16S-PHK, колеблет-ся от 3 до 9. Интересно, что изменение силыэтого взаимодействия дает возможность ре-гулировать эффективность инициации.Итак, место начала синтеза белка опреде-ляется взаимодействиями двух типов: спа-риванием оснований мРНК с 3'-концом16S-pPHK и с формилметиониновой инициа-торной тРНК.

27.15. В результате образованияинициирующего 70S-комплекса формил-метиониновая тРНК связываетсяс Р-участкомСинтез белка начинается с ассоциациимРНК, рибосомной 30S-субчастицы и фор-милметиониновой тРНК. Они образуют30S-комплекс инициации (рис. 27.20). Дляобразования этого комплекса необходимыGTP и три белковых фактора, называющих-ся IF-1, IF-2 и IF-3. Один из этих факторовинициации - IF-3 - участвует в связываниимРНК с 30S-субчастицей. Кроме того, IF-3препятствует ассоциации 50S- и 30S-субча-стиц с образованием непродуктивного 70S-


комплекса без мРНК, a IF-1 и IF-2 способ-ствуют связыванию инициаторной тРНКс комплексом мРНК и 30S-субчастицы.

Затем 50S-cyбчастица присоединяетсяк инициаторному 30S-комплексу, образуяинициаторный 70S-комплекс. На этом этапепроисходит гидролиз связанного GTP. 70S-инициаторный комплекс (рис. 27.20) готовк стадии элонгации белкового синтеза. Мо-лекула fMet-тPHK f занимает Р-участок (пеп-тидильный участок) рибосомы. Второй уча-сток на рибосоме для связывания молекулытРНК-А-участок (аминоацильный) - ещепуст. Существование раздельных участковР и А было показано при изучении пуроми-цина - антибиотика, о котором говоритсяниже (разд. 27.21). Сейчас важно отметить,что fMet-тPHK f располагается таким обра-зом, что антикодон спаривается с иниции-рующим кодоном AUG (или GUG) в мРНК.Таким образом, рамка считывания устана-вливается специфическим взаимодействиемрибосомы и fMet-тPHK f с мРНК. Напом-ним, что в этом взаимодействии участвуетбогатый пурином участок, расположенныйсо стороны 5'-конца от инициирующего ко-дона. Он спаривается с 3'-концом 16S-PHK,входящей в состав 30S-субчастицы. Выясне-ние этого сложного способа, которым до-стигается правильная ориентация инициа-торной тРНК, породило любопытную про-блему. Каким же образом в опытах порасшифровке генетического кода(разд. 26.3) могли транслироваться poly(U)и другие синтетические полипептиды безсигналов начала трансляции? Ответ заклю-чается в том, что, к счастью, в этих экспери-ментах происходила неспецифическаятрансляция благодаря тому, что концентра-ция Mg2+ в реакционной смеси была выше,чем это имеет место in vivo.

Рис. 27.19. Спаривание богатого пуриномучастка (показано синим цве-том) в области инициациимРНК и 3'-концевого участка16S-pPHK (красный цвет). Ко-дон AUG (зеленый цвет) опре-деляет начало полипептиднойцепи. Показанная на рисункемРНК кодирует А-белок фагаR17.

27.16. Фактор элонгации Тu доставляетаминоацил-тРНК в А-участок рибосомыЦикл элонгации белкового синтеза вклю-чает три этапа: 1) связывание аминоацил-тРНК (узнавание кодона); 2) образованиепептидной связи; 3) транслокация. Циклначинается с введения аминоацил-тРНКв пустой А-участок рибосомы. Выбор опре-деленной разновидности тРНК зависит оттого, какой кодон мРНК находитсяв А-участке. Комплементарная аминоацил-тРНК доставляется в А-участок белком,который называется фактором элонгацииEF-Tu. Когда аминоацил-тРНК занимаетправильное положение на рибосоме, проис-ходит гидролиз GTP, связанного с EF-Tu.GDP остается прочно связанным с EF-Tuдо тех пор, пока он не вытесняется другимфактором элонгации, а именно EF-Ts.Образовавшийся комплекс Тu с Ts распа-дается при связывании GTP с Тu; новыйкомплекс Tu-GTP готов для следующегораунда элонгации. Эта ассоциация и диссо-циация белков (рис. 27.21) ускоряетсяи приобретает характер повторяющегосяцикла за счет энергии гидролиза GTP.

Важно отметить, что EF-Tu не взаимо-действует с fMet-mPHK f . Поэтому ини-циаторная тРНК не попадает в А-участок.В то же время Меt-тРНКm связываетсяс EF-Tu, подобно всем другим аминоацил-тРНК. Этим и объясняется тот факт, чтовнутренние кодоны AUG не считываютсяинициаторной тРНК.

27.17. После образования пептидной связипроисходит транслокацияТеперь у нас имеется комплекс, в которомаминоацил-тРНК занимает А-участок,

Рис. 27.20. Стадия инициации синтеза бел-ка: образование 30S-комплексаинициации и затем 70S-ком-плекса инициации.


Рис. 27.21. Цикл реакций с участием фак-тора элонгации Тu.

а fMet-тРНК занимает Р-участок. Все гото-во к образованию пептидной связи(рис. 27.22). Эту реакцию катализирует пеп-тидилтрансфераза - фермент, представляю-щий собой составную часть 50S-субча-стицы. Активированный формилметиони-новый остаток fMet-TPHKf (расположеннойв Р-участке) переносится на аминогруппуаминоацил-тРНК (в А-участок), образуядипетидил-тРНК.

После образования пептидной связи не-нагруженная тРНК занимает Р-участок,а дипептидил-тРНК занимает А-участок.Следующий этап цикла элонгации - транс-локация. Происходят три перемещения: не-нагруженная тРНК покидает Р-участок,пептидил-тРНК переходит из А-участкав Р-участок и мРНК продвигается на тринуклеотида. В результате следующий ко-дон занимает нужное положение длясчитывания очередной мРНК. Для транс-локации необходим третий фактор элонга-ции - EF-G (называемый также транслока-зой). Во время транслокации происходитгидролиз GTP, связанного с EF-G. Гидро-лиз GTP обусловливает отделение EF-Gот рибосомы. Следовательно, GTP может


действовать каталитически. Транслока-ция - еще один пример направленного дви-жения, энергию для которого обеспечиваетгидролиз нуклеозидтрифосфата. Послетранслокации А-участок освобождаетсяи подготавливается к связыванию аминоа-цил-тРНК, чтобы начать новый цикл элон-гации (рис. 27.23).

27.18. Синтез белка терминируетсяфакторами освобожденияЕсли А-участок рибосомы занят кодонамиUAA, UGA или UAG, то связывания ами-ноацил-тРНК обычно не происходит. Нор-мальные клетки не содержат тРНК с анти-кодонами, комплементарными сигналамтермииации. Их узнают белковые факторыосвобождения. Один из этих факторов ос-вобождения - RF-1 - узнает кодоны UAAили UAG. Второй фактор освобождения —RF-2 - узнает UAA или UGA. Таким обра-зом, белки способны узнавать тринуклео-тидные последовательности с высокой спе-цифичностью.

Связывание одного из факторов освобо-ждения с терминирующим кодономв А-участке каким-то образом активируетпептидилтрансферазу, и она гидролизуетсвязь между полипептидом и тРНК в Р-участке. Фактор освобождения изменяетспецифичность пептидилтрансферазы та-ким образом, что акцептором активиро-ванного пептидильного остатка становится

Рис. 27.22. Образование пептидной связи.

Н2О, а не аминогруппа. Затем полипептид-ная цепь покидает рибосому. 70S-рибосомадиссоциирует на 30S- и 50S-субчастицыи приготавливается к синтезу новой белко-вой молекулы.

27.19. Многие белки модифицируютсяпосле трансляцииМногие полипептиды, образующиеся притрансляции мРНК,- еще не окончательныепродукты. Они могут быть впоследствиимодифицированы различными способами.

1. Формильная группа на N-конце бакте-риальных белков гидролизуется деформи-

лазой. Под действием аминопептидазы мо-жет произойти отщепление одного илинескольких N-концевых остатков. И у про-кариот, и у эукариот концевой метионининогда отщепляется в то время, когда син-тез остальной полипептидной цепи ещепродолжается.

2. При окислении двух цистеиновыхостатков могут образоваться дисульфидныесвязи.

3. Боковые цепи некоторых аминокислотмогут быть специфически модифициро-ваны. Например, некоторые остатки про-лина и лизина в коллагене гидроксили-руются. Гликопротеины образуются путемприсоединения сахаров к боковым цепямаспарагина, серина и треонина. Некоторыебелки фосфорилируются. К ферментам ко-валентно присоединяются простетическиегруппы, например липоевая кислота.

4. Полипептидные цепи могут подвер-гаться специфическому расщеплению, на-пример при превращении проколлагенав коллаген и проинсулина в инсулин.Трансляция мРНК вируса полиомы даеточень длинную полипептидную цепь, кото-рая гидролизуется с образованием не-скольких белков.

27.20. Стрептомицин ингибирует инициациюи вызывает неправильное считываниеинформационной РНКМы уже видели, что антибиотики - чрезвы-чайно важный инструмент в биохимиче-ских исследованиях, так как действие мно-гих антибиотиков весьма специфично. На-пример, рифампицин - мощный ингибиторинициации синтеза РНК (разд. 25.18). Из-вестно много антибиотиков, ингибирую-щих синтез белка (табл. 27.3). В случаенекоторых из них установлен и меха-низм действия. Стрептомицин - сильно ос-новной трисахарид - препятствует связыва-нию формилметионил-тРНК с рибосомамии нарушает таким образом правильнуюинициацию белкового синтеза. Кроме того,стрептомицин вызывает неправильноесчитывание мРНК. Если в качестве матри-цы используется poly(U), то наряду с вклю-чением фенилаланина (UUU) происходитвключение изолейцина (AUU). Место дей-ствия стрептомицина в рибосоме былоопределено в результате опытов по рекон-струкции компонентов рибосом из чув-


Рис. 27.23. Стадия элонгации синтеза бел-ка: связывание аминоацил-тРНК, образование пептиднойсвязи и транслокация.

ствительных и устойчивых к стрептомици-ну бактерий. Такие штаммы бактерийразличаются мутацией в единственномгене. Чем же различаются эти рибосомы?Поскольку рибосомы можно диссоцииро-вать и реконструировать in vitro, предста-влялась возможность выяснить, где распо-ложен детерминант чувствительностик стрептомицину - в 50S- или 30S-субчасти-це. Гибридные рибосомы из 50S-субчастицустойчивых бактерий и 30S-субчастиц чув-ствительных бактерий оказались чувстви-тельными к стрептомицину, а рибосомы, по-лученные из субчастиц в обратной комбина-ции, устойчивы к нему. Этот экспериментпоказал, что детерминант чувствительно-сти к стрептомицину локализован в 30S-суб-


Таблица 27.3. Антибиотики - ингибиторы синтеза белка

Антибиотик

Стрептомицин

Тетрациклин

Хлорамфеникол

Циклогексимид

Эритромицин

Пуромицин

Действие

Ингибирует инициацию и вызы-вает неправильное считываниемРНК (у прокариот)Связывается с 30S-субчастицейи ингибирует связывание аминоа-цил-тРНК (у прокариот)Ингибирует пептидилтрансфе-разную активность 50S-субча-стицы рибосом (у прокариот)Ингибирует пептидилтрансфе-разную активность 60S-субча-стины рибосом (у эукариот)Связывается с 50S-субчастицейи ингибирует транслокацию (упрокариот)Вызывает преждевременнуютерминацию цепи, действуя в ка-честве аналога аминоацил-тРНК(у прокариот и эукариот)

частице. Следующий эксперимент проде-монстрировал, что чувствительностьк стрептомицину определяется каким-тобелком 30S-субчастицы, а не молекулой16S-PHK. Наконец, после ряда сложныхэкспериментов оказалось, что чувствитель-ность к стрептомицину детерминируетсятолько одним белком, входящим в состав30S-субчастицы S12.

27.21. Пуромицин вызывает преждевремен-ную терминацию цепи, так как имитируетамииоацилированную транспортную РНКАнтибиотик пуромицин ингибирует синтезбелка, поскольку он освобождает ново-образованные полипептидные цепи еше дотого, как завершается их синтез. Пуроми-цин-аналог концевого участка аминоацил-тРНК аминоациладенозина (рис. 27.24). Онсвязывается с А-участком рибосомы и пре-пятствует связыванию аминоацил-тРНК.Кроме того, пуромицин содержит α-амино-группу. Эта аминогруппа, подобно амино-группе аминоацил-тРНК, образует пептид-ную связь с карбоксильной группой расту-щей пептидной цепи в результате реакции,катализируемой пептидилтрансферазой.Образующийся продукт представляет со-бой пептид с ковалентно присоединеннымостатком пуромицина на карбоксильномконце. Затем пептидилпуромицин сходит

Рис. 27.24. Структура пуромицина напо-минает аминоацилированныйконец аминоацил-тРНК.

с рибосомы. Пуромицин был использовандля изучения функционального состояниярибосом. Концепция существования А-и Р-участков возникла в результате опытовс использованием пуромицина для выясне-ния локализации пептидил-тРНК. Когдапептидил-тРНК находится в А-участке (дотранслокации), она не может вступать в ре-акцию с пуромицином.

27.22. Некоторые короткие пептидысинтезируются без участия рибосомТеперь мы перейдем к другому механизмуобразования пептидной связи в биологиче-ских системах. Рассмотрим в качестве при-мера биосинтез грамицидина S - цикличе-ского пептидного антибиотика, состоящегоиз двух идентичных пентапептидов, соеди-ненных «голова к хвосту» (рис. 27.25). Этотантибиотик продуцируют некоторыештаммы спорообразующей бактерииBacillus brevis.

Биосинтез грамицидина S происходитв отсутствие рибосом или мРНК. Для негонеобходим гораздо более простой синтети-ческий аппарат, состоящий всего лишь издвух ферментов - EI и ЕII. Фермент ЕII

(масса 100 кДа) активирует фенилаланин,остальные четыре аминокислоты пентапеп-тидного фрагмента активируются EI (масса180 кДа). Кроме того, оба фермента уча-


Рис. 27.25. Последовательность амино-кислот в грамицидине S, цикли-ческом пептиде, состоящем издвух одинаковых пентапеп-тидных групп.

ствуют в образовании пептидной связи.В этой системе аминокислоты активи-

руются путем образования тиоэфиров, свя-занных с ферментами. Вместо 3'-концевойгидроксильной группы тРНК активиро-ванные аминокислоты присоединяютсяк сульфгидрильной группе EI и EII:

Если инкубировать L-пролин, L-валин,L-орнитин и L-лейцин с EI в присутствииАТР, они образуют тиоэфирные связис определенными сульфгидрильными груп-пами ЕI. Точно так же D-фенилаланинв присутствии АТР образует тиоэфирнуюсвязь с ЕII.

Синтез пептида в этой системе иниции-руется взаимодействием EI и ЕII. ОстатокD-фенилаланина, присоединенный к ЕII,

переносится на иминогруппу L-пролиново-го остатка, присоединенного к EI, с обра-зованием дипептида. В последующих ре-акциях участвует только EI. Активирован-ная карбонильная группа остатка пролинав составе дипептида реагирует с амино-группой валинового остатка, прикреплен-ного к тому же ферменту, и дает трипеп-тид. Этот процесс повторяется с участиеморнитина и затем лейцина, образуя в ре-зультате пентапептид, связанный с фермен-том. С возникновением каждой новой пеп-тидной связи растущий пептид переноситсяна новую сульфгидрильную группу. Нако-

нец, активированные пентапептиды, при-соединенные к двум различным молекуламEI, реагируют друг с другом с образова-нием циклического грамицидина S.


Следует отметить две особенности этогобиосинтетического пути.

1. Аминокислотная последовательностьграмицидина S определяется простран-ственной организацией и специфичностьюферментов EI и ЕII. На каждую пептиднуюсвязь приходится по меньшей мере однасубъединица белка. Выходит, что этот спо-соб синтеза уступает по экономичностирибосомному механизму. Поэтому пеп-тиды, содержащие более чем примерно 15остатков, не синтезируются с помощьюэтого механизма.

2. Синтез грамицидина S напоминаетсинтез жирных кислот в том отношении,что активированными промежуточнымипродуктами в обоих процессах служаттиоэфиры. Кроме того, EI содержит кова-лентно связанный остаток фосфопантете-ина. Возможно, этот тиол переносит расту-щую пептидную цепь с одного участка ЕI

на следующий. Фриц Липман (FritzLipmann) предположил, что синтез полипеп-тидных антибиотиков, возможно, предста-вляет собой как бы атавизм, напоминаю-щий о примитивном механизме синтезабелка, который использовался на заре эво-люции. Синтез рибосомных белков могвозникнуть в результате эволюции синтезажирных кислот.

ЗаключениеСинтез белка (трансляция) зависит откоординированного взаимодействия болеечем 100 макромолекул, к которым, помиморибосом, относятся мРНК, тРНК, активи-рующие ферменты и белковые факторы.Синтез белка начинается с активации ами-нокислот аминоацил-тРНК-синтетазами(активирующими ферментами) за счетэнергии АТР. Синтетазы соединяют кар-боксильную группу аминокислоты с 2'- или3'-гидроксильной группой остатка аденози-на на 3'-конце тРНК. Для каждой амино-кислоты имеется по меньшей мере одинактивирующий фермент. Кроме того, длякаждой аминокислоты имеется хотя бы од-

на специфическая тРНК. Все транспортныеРНК, обладающие различной специфич-ностью, характеризуются общим планомстроения. Это - одиночные цепи РНК дли-ной примерно 80 нуклеотидов, содержащиенекоторые модифицированные (например.метилированные) производные обычныхоснований. Последовательности основанийвсех известных тРНК могут быть напи-саны в виде клеверного листа, в которомпримерно половина нуклеотидов спарена.Кристаллографические исследования с по-мощью рентгеновских лучей показали, чтомолекула тРНК имеет L-образную форму.На одном конце L-образной структуры на-ходится 3'-концевая ССА-последователь-ность, являющаяся местом присоединенияаминокислоты, на другом конце, на рас-стоянии около 80А,- антикодон. Информа-ционная РНК узнает антикодон тРНК,а не присоединенную к тРНК аминокисло-ту. Кодон мРНК образует пары основанийс антикодоном тРНК. Некоторые тРНКузнают более одного кодона благодаря то-му, что спаривание третьего основания ко-дона менее избирательно, чем спариваниедвух других (гипотеза «качаний», неодноз-начного соответствия; wobble-hypothesis).Синтез белка происходит на рибосомах,образованных из больших и малых субъе-диниц. В каждом из них примерно две тре-ти массы приходится на долю РНК и однатреть-на белок. 70S-рибосома E.coli (мас-са 2500 кДа) состоит из 30S- и 50S-субча-стиц.

Синтез белка происходит в три этапа,называемых соответственно инициацией,элонгацией и терминацией. Информацион-ная РНК, формилметионил-тРНКf и 30S-субчастица рибосомы соединяются, образуя30S-комплекс инициации. Сигналом началатрансляции служит кодон AUG (илиGUG), которому предшествует богатая пу-рином последовательность, способная спа-


риваться с 16S-pPHK. Затем 50S-субчасти-ца рибосомы присоединяется к этому ком-плексу, что приводит к образованию 70S-комплекса инициации, готового к следую-щему этапу. Цикл элонгации включаетсвязывание аминоацил-тРНК (узнаваниекодона), образование пептидной связии транслокацию. Рост цепи происходитв направлении от N-конца к С-концу.Терминацию синтеза белка осуществляютфакторы освобождения, которые узнаюттерминирующие кодоны UAA, UGA

и UAG, что приводит к гидролизу связимежду полипептидом и тРНК. При обра-зовании 70S-комплекса инициации, присвязывании аминоацил-тРНК с рибосомойи на стадии транслокации происходит ги-дролиз GTP. Различные стадии синтезабелка избирательно ингибируются токси-нами и антибиотиками. Пептидные анти-биотики и другие короткие полипептидысинтезируются без рибосом, причем меха-низм их образования напоминает синтезжирных кислот.


С чего начать

Miller О.L., Jr., 1973. The visualizationof genes in action, Sci. Amer., 228(3),34-42.Rich A., Kim S.H., 1978. The three-dimensional structure of transfer RNA,Sci. Amer., 238(1), 52-62.Clark B.F.C., Marcher K.A., 1968.How proteins start, Sci. Amer., 218(1),36-42.

Книги, посвященные синтезу белкаWeissbach H., Pestka S. (eds.), 1977.Molecular Mechanisms of ProteinBiosynthesis, Academic Press. (Содер-жит статьи о синтетазах, структуреи функции рибосом, инициации, элон-гации, транслокации, терминациии антибиотиках-ингибиторах белко-вого синтеза.)

Cold Spring Harbor Laboratory, 1969.Mechanisms of Protein Biosynthesis(Cold Spring Harbor Symposium onQuantitative Biology, vol. 34).

РибосомыNomura M., Tissieres A., Lengyel P.(eds.) 1975. Ribosomes, Cold SpringHarbor Laboratory. (Содержит вели-колепные статьи о структуре, функ-ции и сборке рибосом.)Brimacombe К., Staffer G., Witt-тапп H.G., 1978. Ribosome structure,Ann. Rev. Biochem., 47, 217-249.Wittman H.G., 1977. Structure andfunction of Escherichia coli ribosomes,Fed. Proc., 36, 2025-2080.Nomura M., 1973. Assembly of bacterialribosomes, Science, 179, 864-873.

Транспортная РНКSchimmel P., Soil D., Abelson J. (eds.)1979. Transfer RNA. Cold SpringHarbor Laboratory. (В части I рассмо-трены структура, свойства и узнава-ние, а в части II - биосинтез и генетикатРНК. Авторитетный и содержа-тельный труд.)Kim S.-H., 1978. Three-dimensionalstructure of transfer RNA and itsfunctional implications, Advan. Enzy-mol, 46, 279-315.Jack A., Ladner J.E., Klug A., 1976.Crystallographic refinement of yeastphenylalanine transfer RNA ot 2,5 Aresolution, J. Mol. Biol., 108, 619-649.Sussman J.L., Kim S.-H., 1976. Three-dimensional structure of a transfer RNAin two crystal forms, Science, 192,853-858.

Амноацил-тРНК синтетазыSchimmel P.R., Soil D., 1979. Aminoacyl-tRNA synthetases: general featuresand recognition of transfer RNAs, Ann.Rev. Biochem., 48, 601-648.

Инициация, элонгация и терминацияDintzis H.М., 1961. Assembly ofthe peptide chains of hemoglo-bin, Proc. Nat. Acad. Sci., 47, 247-261. (Важные эксперименты поимпульсной метке, показавшие, чтобелки синтезируются в направленииот аминоконца к карбоксильномуконцу.)Steitz J.A., 1979. Genetic signals andnucleotide sequences in messenger RNA.In: Goldberger R.F. (ed.), BiologicalRegulation and Development, vol. I,pp. 349-399, Plenum.Shine J., Dalgarno L., 1974. The3'-terminal sequence of Escherichia coli16S ribosomal RNA: complementarity

to nonsense triplets and ribosome bindi-ng sites, Proc. Nat. Acad. Sci., 71,1342-1346.Steitz J.A., Jakes K., 1975. Howribosomes select initiator regions inmRN A: base pair formation between the3'-terminus of 16S rRNA and the mRNAduring initiation of protein synthesis inEscherichia coli, Proc. Nat. Acad. Sci., 72,4734-4738.Gupta S.L, Waterson J., Sopori M.,Weissman S.M., Lengyel P., 1971., Mo-vement of the ribosome along themessenger ribonucleic acid duringprotein synthesis, Biochemistry, 10,4410-4421.Kaziro Y., 1978. The role of GTP inpolypeptide chain elongation, Biochim.Biophys. Acta, 505, 95-127.

Надежность трансляцииFersht A., Dingwall C., 1979. Evidencefor the double-sieve editing mechanismin protein biosynthesis, Biochemistry,18, 2627-2631.

Антибиотики и токсиныPestka S., 1971. Inhibitors of ribosomefunction, Ann. Rev. Microbiol., 25,487-562.Jimenez A., 1976. Inhibitors of trans-lation, Trends Biochem. Sci., 1, 28-29.Tai P.-C., Wallace B.J., Davis B.D.,1978. Streptomycin causes misreading ofnatural messenger by interacting withribosomes after initiation, Proc. Nat.Acad. Sci., 75, 275-279.

Нерибосомный синтез пептидовLipmann F., 1971. Attempts to mapa process evolution of peptidebiosynthesis, Science, 17 , 875-884.Perlman D., Bondanszky M., 1971. Bio-synthesis of peptide antibiotics, Ann.Rev. Biochem., 40, 449-464.Lipmann F., 1973. Nonribosomal poly-peptide synthesis on polyenzymetemplates, Ace. Chem. Res., 6, 361-367.110

Часть IV.Информация

Вопросы и задачи1. Образование Ile-тРНК происхо-

дит через связанный с фермен-том промежуточный продукт Ilе-АМР. Бу-дет ли, по вашему мнению, образовываться

32Р-меченный АТР из 3 2 РР i , если инкубиро-вать каждый из следующих наборов компо-нентов в присутствии специфического акти-вирующего фермента?а) АТР и 32PPi.б) тРНК, АТР и 3 2 РР i .в) Изолейцин, АТР и 3 2 Р Р i .2. Из бактерий, выращенных на

«тяжелой» (содержащей 13С и15N) и на «легкой» (1 2С и l4N) среде, получи-ли рибосомы. Эти 70S-рибосомы добавилив систему с активным синтезом белка invitro. Через несколько часов из смеси ото-брали пробу и проанализировали ее центри-фугированием в градиенте плотности.Сколько полос 70S-рибосом вы ожидаетеувидеть в градиенте плотности?3. Сколько богатых энергией фос-

фатных связей затрачивается насинтез белка из 200 остатков, если исходитьиз готовых аминокислот?4. Существует два основных меха-

низма элонгации биологическихмолекул (рис. 27.26). 1-й механизм основан

Рис. 27.26. Два механизма элонгации.

на отщеплении активирующей группы (по-меченной на рисунке крестиком) от расту-щей цепи. При синтезе по 2-му механизму

активирующая группа отщепляется от при-соединяющегося к растущей цепи мономе-ра. Укажите, по какому из механизмов, 1-муили 2-му, протекают следующие реакциибиосинтеза.а) Синтез гликогена.б) Синтез жирных кислот.в) С5 —> С10 —> С15 при синтезехолестерола.г) Синтез ДНК.д) Синтез РНК.е) Синтез белка.5. Мутации, в результате которых

возникают терминирующие ко-доны, называются нонсенс-мутациями. Этимутации могут быть супрессированы изме-ненными тРНК. Например, мутантная РНКсчитывает кодон UGA как триптофановыйкодон. Какое наиболее вероятное замеще-ние основания произошло в этой мутантнойтРНК?6. Придумайте реактив для кова-

лентного мечения по сродствуучастков связывания тРНК в рибосоме. Какбы вы синтезировали такой реактив?7. мРНК-транскрипт одного гена

фага Т7 содержит следующуюпоследовательность оснований:

Предскажите, к какому результату приведетмутация отмеченного стрелкой G при егозамене на А.8. Что общего между коррекцией

ошибок при синтезе белкаи ДНК?

Дополнительные вопросы см.: Wood W. В.,Wilson J.H., Benbow R.M., Hood L. E.,Biochemistry: A Problems Approach,Benjamin, 1974, ch. 18.

ГЛАВА 28Регуляция выражениягена в фенотипеМы уже видели, что активность многих бел-ков регулируется с помощью различных ме-ханизмов, например протеолитической ак-тивации, аллостерических взаимодействийи ковалентной модификации. В этой главерассматривается регуляция скорости синте-за белка, которая также играет принци-пиально важную роль в обшей картине ме-таболизма клетки. У бактерий активностьгена регулируется в основном на уровнетранскрипции, а не трансляции. Мы сосредо-точим внимание на лактозном и триптофа-

новом оперонах Е. coli и на регуляторныхаспектах цикла развития бактериофага λ,так как молекулярные механизмы регуля-ции в этих системах хорошо изучены. Болеетого, именно интенсивное исследованиеэтих систем позволило сформулировать не-которые общие принципы регуляции выра-жения гена в фенотипе (экспрессии гена)у прокариот и вирусов. Экспрессия гена у эу-кариот регулируется иначе, как это станеточевидно из следующей главы.

28.1. β-Галактозидаза -индуцибельный ферментЕ. coli может использовать лактозу в каче-стве единственного источника углерода.


Главный фермент в метаболизме этого са-хара - β-галактозидаза, гидролизующаялактозу на галактозу и глюкозу (рис. 28.1).При выращивании на лактозе клетка Е. coliсодержит несколько тысяч молекул β-галак-тозидазы. Если же выращивать Е. coli надругих источниках углерода, например наглюкозе или глицероле, то число молекулβ-галактозидазы на клетку не достигает де-сяти. Лактоза индуцирует значительное уве-личение количества β-галактозидазы в клет-ке Е. coli, причем она вызывает синтез новыхмолекул фермента, а не активирует профер-мент (рис. 28.2). Следовательно, β-галакто-зидаза - индуцибельный фермент. Одновре-менно и согласованно с β-галактозидазойсинтезируются еще два белка - галактозид-

пермеаза и тиогалактозид-трансацетилаза.Пермеаза необходима для переноса лак-тозы через бактериальную клеточную мем-брану, трансацетилаза же не имеет суще-ственного значения для метаболизма лак-тозы. Физиологическая роль трансацети-лазы пока не установлена, in vitro она ката-лизирует перенос ацетильной группы аце-тил-СоА на гидроксильную группу при С-6тиогалактозида.

Физиологическим индуктором β-галакто-зидазы является аллолактоза, которая обра-зуется из лактозы в результате реакциитрансгликозилирования. Синтез аллолак-тозы катализируется теми несколькими мо-лекулами β-галактозидазы, которые имеют-ся в клетке еще до индукции. Изучениеприроды индукторов показало, что неко-торые β-галактозиды служат индукторами,

Рис. 28.1. β-Галактозидаза гидролизуетлактозу.

не являясь при этом субстратами β-галакто-зидазы, тогда как другие соединения ведутсебя как субстраты, не будучи при этом ин-дукторами. Например, изопропилтиогалак-тозид (ИПТГ) неметаболизируемый индук-тор (его также называют холостым индук-тором).

28.2. Открытие регуляторного генаКлючом к изучению механизма индукцииβ-галактозидазы стало открытие того фак-та, что под действием всех исследованныхиндукторов количество пермеазы и транса-цетилазы возрастало прямо пропорцио-нально количеству β-галактозидазы. Даль-нейший прогресс был достигнут при изуче-нии мутантов. Оно показало, что β-галакто-зидаза, пермеаза и трансацетилаза коди-руются тремя генами - z, у и а соответствен-но - которые расположены друг за другом.Были получены мутанты, утратившие спо-собность к синтезу одного из этих белков.Например, генотип z - -y+a+ обозначает, чтоу данного мутанта нет β-галактозидазы, ноимеются в нормальном количестве пермеа-за и трансацетилаза. Наибольший интереспредставляет класс мутантов, у которогомутацией затронуты все три белка. Такиеконститутивные мутанты синтезируют безвсякого индуктора большие количестваβ-галактозидазы, пермеазы и трансацети-лазы. Франсуа Жакоб и Жак Моно (FrancoisJacob, Jacques Monod) пришли к выводу, чтоскорость синтеза этих трех белков зависит

от какого-то общего элемента, отличногоот генов, кодирующих их последовательно-сти. Ген этого общего регуляторного эле-мента был обозначен i. Индуцибельные бак-терии дикого типа имеют генотипi+z+y+a+, а конститутивные мутанты полактозным генам - генотип i - - z + y + a + .

Каким образом осуществляется влияниегена i на скорость синтеза белков, коди-руемых генами z, у и а? Проще всего былопредположить, что ген i кодирует синтез не-коего компонента цитоплазмы, названногорепрессором, которого либо совсем нет вi---клетках, либо он там неактивен. Эта идеябыла проверена в ряде изящных генетиче-ских экспериментов с частично диплоидны-ми бактериями, имевшими два набора геновлактозной области. Один набор содержалсяв бактериальной хромосоме, а второй - в по-ловом факторе F', введенном в клетку приконъюгации. Например, был получен ди-плоид i + z - - / F i - - z + . У этого диплоида геныi + z - - находятся в хромосоме, а гены i - -z+ - вэписоме. Является ли этот диплоид индуци-бельным или конститутивным в отношенииβ-галактозидазы? Другими словами, можетли ген i+ бактериальной хромосомы подав-лять экспрессию гена z+, расположенногов эписоме? Эксперимент дал совершенно

Рис. 28.2. Увеличение количества β-га-лактозидазы идет параллельноувеличению числа клеток в рас-тущей культуре E.coli. Наклонэтого графика указывает, что

β-галактозидаза составляет6,6% всего синтезируемого бел-ка.

28. Регуляция выражениягена в фенотипе 113

Рис. 28.3. Карта лактозного оперонаи его регуляторного гена.В карте масштаб не соблюден:участки р и о в действительно-сти гораздо меньше, чем коди-рующие участки генов.

Рис. 28.4. Схема лактозного оперонав репрессированном (А) и инду-цированном (Б) состояниях.

четкий результат: диплоид индуцибелен, а неконститутивен. Такой же результат был по-лучен и в отношении диплоида i - - z + / F i + z - - .Следовательно, ген i кодирует способныйк диффузии репрессор.


28.3. Оперон - единица координированнойгенетической экспрессииНа основе только что описанных экспери-ментов Жакоб и Моно постулировали мо-дель оперона, объясняющую регуляцию бел-кового синтеза. Генетические элементы этоймодели - регуляторный ген, операторныйген и набор структурных генов (рис. 28.3).Регуляторный ген продуцирует репрессор,который может взаимодействовать с опера-торным геном. В дальнейшем выяснилось,что репрессор представляет собой белок.Операторный ген расположен рядом по со-седству со структурными генами, которые

он контролирует. Связывание репрессорас операторным геном препятствует тран-скрипции структурных генов. Операторныйген в совокупности со структурными гена-ми, рядом с которыми он расположен, назы-вается опероном. В случае лактозного оперо-на ген i - регуляторный ген, ген о - ген-опе-ратор, а гены z, у и а - структурные гены.Кроме того, существует еще промоторныйучасток (обозначаемый символом р) длясвязывания РНК-полимеразы. Этот участокинициирования транскрипции расположенперед операторным геном. Индуктор, на-пример изопропилтиогалактозид (ИПТГ),связывается с репрессором и тем самым на-рушает его взаимодействие с операторнымгеном. Теперь гены z, у и а могут транскри-бироваться. При этом образуется однадлинная молекула РНК, кодирующая всетри белка (рис. 28.4). Молекулу мРНК, ко-дирующую более одного белка, называютполицистронным (или полигенным) тран-скриптом.

28.4. lас-Репрессор - тетрамерный белокПри выделении репрессора лактозного опе-рона (lас-репрессор) была использована его

Рис. 28.5. Электронная микрофотогра-фия lас-репрессора, связанногос ДНК, содержащей lас-опера-тор. (Печатается с любезногоразрешения д-ра Jack Griffith.)

способность связываться с ИПТГ. УолтерГилберт и Бенно Мюллер-Хилл (WalterGilbert, Benno Muller-Hill) установили, чтоlас-репрессор - белок, который связываетсяс ДНК, содержащей lас-оперон, но не связы-вается ни с одной другой ДНК. Как и пред-полагалось, ИПТГ подавляет связываниеlас-репрессора с lас-операторной ДНК.Клетка Е. coli дикого типа содержит всегооколо десяти молекул lас-репрессора. Приочистке репрессора возникли трудности,связанные с тем, что он составляет всего0,001% общего содержания белка. Однакосуществуют isq-мутанты, имеющие, по-види-мому, более эффективный промотор гена i.У этих мутантов образуется гораздо боль-ше lас-репрессора. Количество lас-репрессо-ра увеличивается еще сильнее, если исполь-зовать трансдуцирующие фаги, несущиеобласть lас. Зараженные таким фагом клет-ки Е. coli содержат около 20 000 молекул ре-прессора (примерно 2% всего белка). Этопрекрасный исходный материал для выделе-ния lас-репрессора.

Репрессор - тетрамер из идентичныхсубъединиц с массой 37 кДа, каждая из ко-торых имеет один участок связывания с ин-дуктором. Константа диссоциации ИПТГсоставляет примерно 10-6 М. Репрессорочень прочно и быстро связывается с опера-тором. Константа диссоциации комплексарепрессор-оператор составляет примерно10 - 1 3 М. Такое высокое сродство обуслов-лено тем, что в клетке Е. coli дикого типа со-держится всего несколько молекул реп-рессора. Константа скорости ассоциациипоразительно высока - 7•109 м-1•с-1. Изэтого следует, что репрессор находит опера-торный участок, диффундируя вдоль моле-кулы ДНК (одномерный поиск), а не ищетего, находясь в водной среде (трехмерныйпоиск)1.

28.5. Последовательность оснований вlас-операторе симметричнаНаличие чистого lас-репрессора сделаловозможным выделение lас-оператора

1 Недавно проведенные исследования показали,что ситуация намного сложнее: поиск операторарепрессором включает оба указанных механиз-ма и в очень большой степени зависит от ион-ного состава среды.- Прим. перев.


Рис. 28.6. lас-Репрессор защищает lас-оператор от расщепления пан-креатической дезоксирибону-клеазой.

и определение его последовательности ос-нований. Гилберт и его сотрудники, воздей-ствовав ультразвуком на ДНК фага, содер-жащего lас-область, получили фрагментыдлиной примерно 1000 пар оснований.К смеси фрагментов добавили lас-рспрессори затем профильтровали раствор через ни-троцеллюлозную мембрану. ФрагментыДНК, не связанные с lас-репрессором, про-шли через фильтр, а комплексы ДНК-ре-прессор прочно связались с ним. СвязаннуюДНК сняли с фильтра с помощью ИПТГ.Эти элюированные фрагменты ДНК обра-ботали панкреатической дезоксирибону-клеазой в присутствии репрессора. Идеяэтого этапа эксперимента состояла в том,что операторный участок, связанный в ком-плексе с репрессором, должен быть защи-щен от расщепления дезоксирибонуклеазой(рис. 28.6). Затем установили последова-тельность оснований этих операторныхфрагментов, определив последовательностьтранскрибированной с этих фрагментовРНК. Последовательность оснований этогоучастка оказалась очень интересной: 28 пароснований расположены симметрично отно-сительно оси второго порядка (рис. 28.7).Симметрия репрессора, по-видимому, со-ответствует симметрии оператора. Этотпринцип узнавания приложим также к сиг-


налам терминирования транскрипции(разд. 28.8) и к связыванию пептидногоантибиотика актиномицина D с ДНК(разд. 25.18)1.

28.6. Циклический AMP стимулируеттранскрипцию многих индуцибельныхкатаболических опероновДавно уже известно, что в клетках Е. coli,растущих на глюкозе, активность катаболи-ческих ферментов, таких, как β-галактозида-за, галактокиназа, арабинозо-изомеразаи триптофаназа, находится на очень низкомуровне. Очевидно, было бы совершенно из-лишним синтезировать эти ферменты в ус-ловиях изобилия глюкозы2. Молекулярныймеханизм такого ингибирующего действияглюкозы, получивший название катаболит-ная репрессия, был расшифрован. Ключомк выяснению этого вопроса явились данныео том, что глюкоза понижает концентрациюциклического AMP в клетках Е. coli. Затемобнаружилось, что экзогенный циклическийAMP снимает состояние репрессии, обусло-вленное присутствием глюкозы. Последую-щие биохимические и генетические исследо-вания показали, что циклический AMPстимулирует инициирование транскрипциимногих индуцибельных оперонов.

Циклический AMP, синтезированныйв отсутствие глюкозы, связывается с БАК(белковый активатор катаболизма) - бел-ком, представляющим собой димер изсубъединиц массой 22 кДа. Комплекс БАКс циклическим AMP стимулирует тран-скрипцию, связываясь вблизи от многихпромоторных участков; БАК без AMP та-кой способностью не обладает. Опытами порасщеплению дезоксирибонуклеазой былоустановлено, что в случае lас-оперона БАКсвязывается рядом с участком связыванияРНК-полимеразы. Точнее, БАК защищаетот расщепления нуклеотиды от —87 до—49, а РНК-полимераза - нуклеотиды от

1 При детальном изучении механизма воздей-ствия laс-репрессора с оператором оказалось,что вазимодействию не свойственна такая сим-метрия, так что пока остается не совсем ясным,почему последовательности laс-оператора (имногих других операторов) обладают элемента-ми симметрии,- Прим. перев.2 Далеко не очевидно, почему клетки E.coli, каки многие другие клетки, предпочитают именноглюкозу всем остальным источникам углеродаи энергии и используют ее до тех пор, пока еесодержание не будет исчерпано даже в присут-ствии значительного избытка других сахаров.—Прим. перев.

Рис. 28.7. Нуклеотидная последователь-ность lac-оператора. Симме-тричные участки закрашеныодинаковым цветом.

—48 до +5 (рис. 28.8). При этой системенумерации первый транскрибируемый ну-клеотид обозначается +1. Последователь-ность оснований ДНК, узнаваемая БАК,обладает симметрией второго порядка, с ко-торой мы постоянно сталкиваемся при рас-смотрении взаимодействий белков с ДНК.Каким образом БАК стимулирует инициа-цию синтеза лактозной мРНК в 50 раз? По-следовательное расположение неперекры-вающихся участков связывания БАКи РНК-полимеразы дает основание думать,что связывание БАК с ДНК порождаетновые участки взаимодействия РНК-поли-меразы с ДНК. Лактозный репрессор, на-против, связывается с нуклеотидами от —3до +21, которые в значительной степениперекрываются с участком РНК-полиме-разы (нуклеотиды от —48 до +5). Такимобразом, репрессор препятствует инициа-ции, блокируя связывание РНК-полимеразы.По всей вероятности, комплекс циклическийAMP-БАК действует таким же образоми на другие индуцибельные опероны. Итак,индуцибелъные опероны контролируютсяс помощью комплементарных механизмов,которые используют в качестве сигнальныхмолекул циклический AMP и специфическиеиндукторы.

28.7. Различные формы одного и того же бел-ка активируют и ингибируюттранскрипцию арабинозного оперонаБактерии могут использовать арабинозув качестве источника энергии, превра-щая ее в ксилулозо-5-фосфат - промежуточ-ный продукт пентозофосфатного пути(разд. 15.4). Превращение арабинозы в кси-лулозо-5-фосфат происходит в результатепоследовательного действия арабинозо-изомеразы, рибулокиназы и рибулозо-5-фосфат-эпимеразы - ферментов, кодируе-мых генами araА, araВ и araD соответ-ственно. Эти структурные гены вместе

с промотором (araI) и оператором (araО)образуют арабинозный оперон (рис. 28.9).Этот оперон регулируется геном (araС), рас-положенным рядом с операторным участ-

ком. Подобно лактозному оперону, араби-нозный оперон может быть активированкомплексом БАК с циклическим AMP. Ара-

Рис. 28.8. На схеме показаны БАКи РНК-полимераза, сидящиена ДНК-матрице. Положениеэтих белков было определенос помощью расщепления ну-клеазой.


Рис. 28.9. Карта арабинозного оперонаи его регуляторного гена.

бинозный оперон был первым, в отношениикоторого было установлено наличие и поло-жительной, и отрицательной регуляций.Продукт гена аrаС - белок, который суще-ствует в двух функционально различных со-стояниях Р1 и Р2. В отсутствие арабинозыэтот белок действует как репрессор (Р1).Форма P1 связывается с оператором, чтопрепятствует транскрипции оперона. Араби-ноза снимает Р1 с оператора и смещает кон-формационное равновесие в сторону Р2 (ак-тивирующей формы). Затем форма Р2

Рис. 28.10. Схема trp-оперона. Показаныконтрольные участки - промо-тор (р), оператор (о) и аттенюа-тор (а), а также гены, кодирую-щие лидерную последователь-ность (L), и ферменты путибиосинтеза триптофана (E, D,С, В и А).

Рис. 28.11. Последовательность основа-ний trp-оператора. Ось симме-трии второго порядка обозна-чена зеленым. Пара оснований,отмеченная +1,- начало тран-скрибируемой части оперона.


вместе с комплексом БАК-сАМР связы-вается с промоторным участком, что даетвозможность РНК-полимеразе начать тран-скрипцию. Таким образом, один и тот жерегуляторный белок служит положи-тельным и отрицательным регулятором.

28.8. Транскрипция триптофанового оперонарегулируется и аттенюатором, и операторомЕще один регуляторный элемент был от-крыт Чарльзом Янофски (Charles Yanofsky)и его коллегами при изучении триптофано-вого оперона E. coli. Транскрибируемаяс этого оперона мРНК длиной 7kb кодируетпять ферментов, превращающих хоризматв триптофан (разд. 21.9). Эти пять белковсинтезируются при трансляции полици-стронной trp-мРНК последовательно, коор-динированно и в эквимолярных количе-ствах. Трансляция начинается раньше, чемзаканчивается транскрипция. trp-мРНК син-тезируется примерно за 4 мин и затем бы-стро разрушается. Короткое время жизни

trp-мРНК, составляющее всего около 3 мин,позволяет бактериям быстро реагироватьна изменяющуюся потребность в триптофа-не. Е. coli может менять скорость образова-ния ферментов биосинтеза триптофана бо-лее чем в 700 раз.

Как осуществляется эта регуляция?Первый уровень регуляции достигается пу-тем взаимодействия специфического репрес-сора с trp-операторным участком ДНК. trp-репрессор - белок с массой 58 кДа, коди-руемый геном trpR, удаленным от trp-оперо-на на довольно большое расстояние. Ком-плекс этого репрессора и триптофана прочносвязывается с оператором, тогда как сам посебе репрессор с ним не связывается. Други-ми словами, триптофан является корепрессо-ром. Мишень, на которую действует ком-плекс триптофана с репрессором,- участокДНК, обладающий симметрией второго по-рядка (рис. 28.11); и в этом случае симме-трия играет важную роль во взаимодей-ствии белка с ДНК. Этот операторныйучасток перекрывается с промоторнымучастком инициирования транскрипции. Та-

Рис. 28.12. Последовательность основа-ний аттенюаторного участкаtrp. Связанные симметриейвторого порядка пары основа-ний GC-богатой области пока-заны синим цветом; такие жепары AT-богатой области по-казаны желтым цветом.

ким образом, связывание trp-penpeccopaс оператором препятствует связываниюРНК-полимеразы с trp-промотором, и геныtrp не транскрибируются.

В течение некоторого времени считалось,что ингибирование конечным продуктом ка-талитической активности первого фермен-тативного комплекса в пути биосинтезатриптофана (разд. 21.11) и система ингиби-рования транскрипции с участием репрессо-ра и оператора - основные регуляторные си-стемы биосинтеза триптофана. Эта точказрения была неожиданно опровергнута, ког-да было обнаружено, что у некоторых му-тантов с делециями между оператором и ге-ном первого фермента ( t rpE) в оперонепроисходит повышенное образованиеtrp-мРНК. К тому же анализ 5'-концевой по-следовательности trp-мРНК показал, чтотам имеется лидерная последовательностьдлиной 162 нуклеотида, расположеннаяперед инициирующим кодоном trpE. Затемоказалось, что делеции, повышающие со-держание trp-мРНК, картируются в этой ли-дерной области, примерно в 30-60 нуклеоти-дах от начала гена trpE. Следующеепоразительное наблюдение состояло в том,что при высокой концентрации триптофанаобразовывался транскрипт, содержащийвсего 130 нуклеотидов лидерной последова-тельности ; при нехватке же триптофана син-тезировалась trp-мРНК длиной 7000 ну-клеотидов, включающая полную лидернуюпоследовательность. Отсюда Янофски сде-лал вывод, что транскрипция trp-оперонадолжна регулироваться участком контро-лируемой терминации, называемым атте-нюатором. Он локализован между операто-

ром и геном первого фермента путибиосинтеза триптофана. Этот участоктерминации, регулируемый физиологиче-скими условиями, подобен участкам тер-минации в конце других оперонов(разд. 25.15); он содержит GC-богатую по-следовательность и следом за ней АТ-бо-гатый участок. Каждый из этих участков ат-тенюатора обладает симметрией второгопорядка (рис. 28.12). Кроме того, термини-рованный лидерный транскрипт заканчи-вается несколькими U подряд.

Аттенюаторный участок дополняет опе-ратор в регуляции транскрипции trp-генов.При изобилии триптофана инициация тран-скрипции блокируется в результате связыва-ния комплекса триптофан-репрессор с опе-ратором. По мере снижения концентрациитриптофана в клетке репрессия снижаетсяи начинается транскрипция. Однако неко-торые молекулы РНК-полимеразы поки-дают матрицу, дойдя до аттенюатора, тогдакак другие продолжают синтезировать пол-ную trp-матрицу. По мере исчерпания трип-тофана увеличивается доля молекул РНК-полимеразы, проходящих через аттенюа-торный участок.

28.9. Аттенюация опосредуется трансляциейлидерной мРНККаким образом аттенюаторный участок trp-оперона улавливает концентрацию трипто-фана в клетке? В решении этого вопросаособенно важную роль сыграли данныео том, что часть лидерной мРНК трансли-руется. Весьма существенно, что в 14-член-ном лидерном полипептиде (рис. 28.13)имеются остатки триптофана в положениях10 и 11. Когда триптофан находится в избы-тке, синтезируется полный лидерный пеп-тид. Но если триптофана не хватает, рибо-сома задерживается на двух располо-женных тандемом кодонах UGG, посколькув этом случае оказывается недостаточнымсодержание триптофанил-тРНК. Застряв-


Рис. 28.13. Последовательность амино-кислот в лидерном пептиде trpи последовательность основа-ний в соответствующей лидер-ной мРНК.

шая рибосома каким-то образом меняетструктуру мРНК, так что РНК-полимеразатранскрибирует оперон за пределами атте-нюаторного участка. Ключевой аспект это-го регуляторного механизма состоит в том,что трансляция и транскрипция тесно сопря-жены между собой. Рибосомы, транслирую-щие лидерную trp-мРНК, следуют непос-редственно за молекулой РНК-полимеразы,транскрибирующей ДНК-матрицу. Иссле-дования, проведенные в последние годы, по-казали, что застрявшая рибосома изменяетвторичную структуру мРНК: конформация,при которой основания спариваются, благо-приятствуя тем самым терминированиютранскрипции, изменяется таким образом,что РНК-полимераза проскакивает атте-нюатор (рис. 28.14). Мы начинаем пони-мать, что молекулы нуклеиновых кислот,как и белковые молекулы, могут приниматьразличные конформации и что измененияконформации регулируются и имеют дале-ко идущие физиологические последствия.

28.10. Аттенюаторный участокгистидинового оперона содержит семьгистидиновых кодонов подрядВ настоящее время известны еще два оперо-на биосинтеза аминокислот у E. coli, содер-жащих аттенюаторные участки. Фенилала-ниновый оперон и гистидиновый оперон,подобно триптофановому оперону, содер-жат регулируемые участки терминацииперед первым геном, кодирующим фермент.И в этих случаях лидерная область передучастком терминации транслируется. Уди-вительна последовательность аминокислотв лидерном пептиде фенилаланинового опе-рона: 7 из 15 остатков - фенилаланины(рис. 28.15). Еще поразительнее лидерныйпептид гистидинового оперона: он содер-жит семь остатков гистидина подряд. Оче-видно, что эти лидерные мРНК предназна-


чены, чтобы улавливать концентрации фе-нилаланина и гистидина. Если соответ-ствующих аминоацилированных тРНК нехватает, трансляция лидера останавливает-ся. Как уже обсуждалось выше на примереtrp-оперона, считается, что застрявшая ри-босома таким образом изменяет конформа-цию мРНК, что у нее происходит спарива-ние оснований. Это дает возможностьРНК-полимеразе проскакивать аттенюа-торный участок1. Присутствие семи после-довательно расположенных кодонов ги-стидина в лидерной мРНК гистидиновогооперона существенно увеличивает чувстви-тельность этого детектора. Действительно,падение концентрации гистидил-тРНК на15% вызывает троекратное увеличение чис-ла молекул мРНК, транскрибируемых с это-го оперона.

28.11. Репрессоры и активаторыдетерминируют развитие умеренных фаговОбратимся теперь к роли репрессоров и ак-тиваторов транскрипции в регуляции жиз-ненного цикла бактериофага лямбда (λ). Зре-лая вирусная частица состоит из линейнойдвухспиральной молекулы ДНК (48 kb), упа-кованной в белковую оболочку. Существуетдва пути развития вируса: он может разру-шить клетку-хозяина или он может стать еекомпонентом (отсюда и название - уме-ренный). При литическом пути развитияпроисходит полное выражение (экспрессия)фаговых генов, что приводит к лизису бакте-рии и образованию примерно 100 вирусныхчастиц потомства. В другом случае развитиефага λ может пойти по пути лизогенизацииклетки, когда его ДНК становится кова-лентно связанной с ДНК клетки-хозяинав строго определенном месте (сайт-специфи-ческая интеграция). Этот процесс рекомби-нации, в котором участвует кольцевая моле-кула ДНК фага λ, мы обсудим ниже(разд. 30.16). Когда ДНК фага интегрируетс ДНК клетки-хозяина, большинство фа-говых функций выключается. Фаговая ДНКв таком состоянии называется профагом,а клетка-хозяин, содержащая профаг - лизо-генной бактерией. Профаг реплицируется1 Автор противоречит собственному утвержде-нию, что застрявшая рибосома разворачиваетмРНК (см. предыдущий разд.); рибосома дей-ствительно способствует именно разворачива-нию мРНК.- Прим. перев.

Рис. 28.14. Схематическое изображениеаттенюации trp-оперона E.coli.Когда триптофан имеется визбытке (А), лидерный учас-ток (обозначен цифрой 1)trp-мРНК полностью трансли-руется. Участок 2 взаимодей-ствует с рибосомой, что позво-ляет основаниям участков 5 и4 спариваться. Эта спареннаяобласть каким-то образом сиг-нализирует РНК-полимеразео том, что следует закончитьтранскрипцию. Если же трип-тофана не хватает (Б), участки3 и 4 не взаимодействуют, таккак рибосома застревает наtrp-кодонах участка 1. Участок2 взаимодействует с участком3 вместо того, чтобы входитьв рибосому, и в результатеучастки 3 и 4 не могут спари-ваться. Вследствие этого тран-скрипция продолжается.[Oxender D. L., Zurawski G.,Yanofsky C., Proc. Nat. Acad.Sci., 76, 5524 (1979).]

в лизогенной бактерии как часть клеточнойхромосомы обычно на протяжении многихпоколений. В лизогенном состоянии литиче-

ские функции молчат, но не теряются(рис. 28.17). Многие агенты, нарушающиенормальную репликацию ДНК в клетке-хо-зяине, индуцируют профаг, и он переходитна путь литического развития.

Вначале рассмотрим выражение генов фа-га λ при литическом пути. Цель разви-тия - образование многочисленного потом-ства - достигается путем последовательнойтранскрипции вирусных генов. Вначале обра-зуются белки, необходимые для репликациии рекомбинации ДНК, затем белки головкии отростка вирусной частицы и белки, необ-ходимые для лизиса клетки-хозяина.Чрезвычайно важное значение имеет стро-гая очередность этих событий; преждевре-менное разрушение клетки-хозяина для ви-руса, конечно, невыгодно. Выражение геновпри литическом развитии происходит в тристадии: предраннюю, раннюю и позднюю(рис. 28.18). На предранней стадии начинает-ся синтез РНК с двух промоторов - PL и PR.Один из образующихся при этом тран-скриптов служит матрицей для синтеза бел-ка N, которому принадлежит важнейшаярегуляторная роль. В отсутствие белкаN предранние транскрипты заканчиваютсяна одном из двух участков терминации. Бе-лок N препятствует терминированию тран-скрипции в этих участках и обеспечивает та-


Рис. 28.15. Последовательность амино-кислот в лидерном пептидеи последовательность основа-ний соответствующего участкамРНК фенилаланинового (А)и гистидинового (Б) оперонов.

ким образом дальнейшее выражение геновфага λ. Белок N включает раннюю стадию.В это время синтезируются белки, необхо-димые для репликации ДНК фагаи рекомбинации. Кроме того, на ранней ста-дии транскрибируется ген Q. Белок Q - ещеодин важный регуляторный элемент выра-жения генов фага λ. Он необходим для пере-хода в позднюю стадию. На поздней стадиитранскрибируются гены, необходимые дляобразования головки и отростка фага и длялизиса клетки-хозяина. Белок Q, подобнобелку N, подавляет терминацию транскрип-ции. Короче говоря, последовательная регу-ляция литического развития осуществляет-ся двумя белками - положительными регуля-торами, кодируемыми генами N и Q. Ихдействие заключается в том, что они позво-ляют РНК-полимеразе продолжать тран-скрипцию, проскочив несколько участковтерминации.

В лизогенном цикле различают три ста-дии: установление лизогенного состояния,его поддержание и выход из лизогенного со-стояния. Для установления состояния про-фага необходимо, чтобы вирусная ДНК ин-тегрировалась с ДНК клетки-хозяинаи литические функции вируса были инакти-вированы. Эти процессы протекают оченьсложно, и до конца они не изучены. Поддер-жание состояния профага, наоборот, срав-нительно несложный процесс. А. Дейл Кей-зер (A. Dale Kaiser) показал, что из всехгенов профага экспрессируется только генсI. Этот ген кодирует λ-репрессор, которыйсвязывается с двумя операторными участка-ми OL и OR (рис. 28.19). Связывание λ-ре-прессора с OL непосредственно препят-


ствует транскрипции ранних генов в левуюсторону. В частности, не синтезируется бе-лок N, и поэтому литический путь оказы-вается закрытым. Связываясь с OR, λ-ре-прессор препятствует выражению генов croи Q в правую сторону. Таким образом, ког-да λ-репрессор связан с OL и OR, весь геномфага молчит, кроме гена сI, кодирующегоλ-репрессор. Как будет указано чуть ниже,λ-репрессор сам контролирует работу генасI, регулируя таким путем собственную кон-центрацию. Инактивация λ-репрессораобеспечивает возможность транскрипциигенов, участвующих в литическом процессе.Профаг исключается из хромосомы клетки-хозяина, и литические функции экспресси-руются.

28.12. Два оператора фага лямбда содержатряд участков связывания репрессора

λ-Репрессор был выделен и подробно изу-чен Марком Пташне (Mark Ptashne). Моно-

Рис. 28.16. Электронная микрофотогра-фия фагов λ. (Печатается с лю-безного разрешения д-раA. Dale Kaiser.)

Рис. 28.17. Генетическая карта фага λ. По-казаны лишь некоторые гены.После проникновения в бакте-риальную клетку линейнаядвухцепочечная ДНК перехо-дит в кольцевую форму.

мере массой 26 кДа находится в равновесиис олигомерами. С ДНК связываются имен-но олигомеры. Два операторныхучастка - ОL и ОR - узнаются одним и тем жерепрессором. Ген сI, кодирующий этот ре-прессор, расположен между ОL и OR

(рис. 28.19). Каждый их этих операторов со-держит три участка связывания λ-репрессо-ра. Расщепление с помощью нуклеаз пока-зало, что участки связывания представляютсобой последовательность из 17 пар основа-ний и отделены друг от друга АТ-богатымиучастками длиной от 3 до 7 пар оснований.Последовательности оснований всех этихучастков связывания λ-репрессора сходны,но не идентичны. Узнаваемая последова-тельность - 5'-TATCACCGC-3' или что-ни-будь в этом роде. Как и lас-оператор, эти

Рис. 28.18. Три стадии транскрипции прилитическом цикле развития фа-га λ. Белок N образуется напредранней стадии и активи-рует раннюю стадию. Тогдав свою очередь синтезируетсябелок Q, который активируетпозднюю стадию. [Echols H.,The Bacteria, 8, 502 (1979).]

операторные участки обладают частичнойсимметрией второго порядка.

Самые сильные места связывания репрес-сора в операторах OL и OR расположеныближе всего к началу первого структурногогена оперона. Промоторный участок генаN расположен в пределах OL а промоторгена cro - внутри OR. Как и в лактозном, ив арабинозном оперонах, связывание ре-прессора с этими операторами препятствуетсвязыванию РНК-полимеразы с соответ-ствующим промотором, и, следовательно,транскрипция не начинается. Связывание

λ-репрессора с двумя участками в OL и OR

более эффективно блокирует промотор, чемсвязывание только с одним участком.

28.13. λ-Репрессор регулируетсобственный синтезЧисло молекул λ-репрессора в лизогенныхклетках Е. coli строго регулируется. Сниже-ние количества репрессора (даже кратковре-менное) переводит клетку на литическийпуть. С другой стороны, избыток репрессо-ра затруднит выход фага, если условия егосуществования в бактерии станут неблаго-

приятными. Как регулируется концентрацияλ-репрессора? Проведенные сравнительнонедавно исследования показали, что это ре-прессор регулирует собственный синтез.Для этого λ-репрессор связывается с OR3операторным участком, локализованным


Рис. 28.19. Схематическое изображениеоператорных участков OL и OR

и прилегающих генов. Самоевысокое сродство к λ-репрессо-ру имеют ОL1 и ОR1. сI - ген-ре-прессор. Левый транскрипт на-чинается с гена N, правый - сгена crо.

ближе всего к гену cI, и выключает тран-скрипцию этого гена (рис. 28.20). Связываниерепрессора с О R 1 , напротив, усиливает тран-скрипцию гена cI. Напомним, что сродствоλ-репрессора к ОR1 выше, чем к OR3. Такимобразом, транскрипция гена cI усиливается

Рис. 28.20. Саморегуляция концентрацииλ-репрессора. А - когда репрес-сора мало, он связывается сOR1 и стимулирует транскрип-цию гена сI. Б - по мере увели-чения концентрации λ-репрес-сора он связывается с ОR3и ингибирует дальнейшуютранскрипцию гена cI.


при низкой концентрации λ-репрессора и по-давляется при высокой концентрации тогоже белка. Другими словами, выражение ге-на сI - саморегулирующаяся система.

Описанная регуляция по принципу обрат-ной связи стремится поддерживать концен-трацию репрессора на таком уровне, чтобыостальной геном фага не экспрессировался.Как же тогда фаг может выйти из состояниялизогении? Литический цикл запускаетсяпри снижении числа молекул λ-репрессора;содержание λ-репрессора должно умень-шаться до такого уровня, которого доста-точно только для транскрипции гена crо.Новообразованный белок cro связывается сОR3 и подавляет транскрипцию гена cI.

Самое главное, что OR3 имеет более высо-кое сродство к белку cro, чем OR1. Такимобразом, небольшое количество белка croподавляет синтез λ-репрессора, не выключаясинтеза самого белка cro. Вследствие этогоλ-репрессор уже не может руководить хо-дом событий. С этого момента необратимозапускается цепь реакций, ведущих к лизису.Таким образом, тонкое взаимодействие все-го нескольких белков и операторных участ-ков определяет путь развития фага. Былобы интересно выяснить, имеют ли неко-

торые регуляторные системы, такие, какмножественные операторные участки с раз-личным сродством к белкам, более общеезначение в регуляции развития прокариоти-ческих клеток.

ЗаключениеКлетки регулируют количество синтези-руемых белков различными способами. У E.coli выражение генов регулируется в первуюочередь на уровне транскрипции, а не транс-ляции. Многие гены организованы в опе-роны - координированные единицы генети-ческой экспрессии. Оперон состоит изрегуляторных участков (оператора и промо-тора) и нескольких структурных генов. Внеоперона имеется регуляторный ген, коди-рующий белок, который взаимодействуетс операторным участком. Последователь-ность оснований лактозного оператора сим-метрична. Вообще симметрия играет основ-ную роль в узнавании определенных участ-ков в ДНК белками. lac-Оперон индуци-руется β-галактозидами, например аллолак-тозой и изопропилтиогалактозидом. Связы-вание индуктора с lac-репрессором приво-дит к его вытеснению с оператора. ТеперьРНК-полимераза может пройти через опе-ратор и транскрибировать lас-оперон. Трип-тофановый оперон репрессируется трипто-фаном, который связывается со специфиче-ским репрессором и дает ему такимобразом возможность связаться с операто-ром. В результате транскрипция генов, ко-дирующих ферменты биосинтеза триптофа-на, выключается.

Кроме того, некоторые опероны биосин-теза аминокислот, в том числе trp-оперон,находятся под контролем аттенюаторов.Если конечный продукт биосинтеза - амино-кислота - имеется в изобилии, транскрипцияв аттенюаторном участке прекращается.Для аттенюации необходима трансляциялидерной мРНК. Регуляция широкого спек-тра генов осуществляется циклическимAMP, который связывается с особым бел-ком (БАК). Этот комплекс взаимодействуетс промоторными участками нескольких ин-дуцибельных оперонов и стимулирует ини-циирование транскрипции. Концентрацияциклического AMP повышается только принедостатке глюкозы. Таким образом, глю-коза косвенно подавляет синтез различныхферментов катаболизма.

Бактериофаг λ может размножатьсяи разрушать клетки-хозяева (литическийпуть); в другом случае его ДНК может инте-грировать с хромосомой клетки-хозяина(лизогенный путь). При литическом разви-тии происходит последовательная тран-скрипция трех групп генов. На предраннейстадии образуется белок N, активирующийтранскрипцию ранних генов. При этомв свою очередь синтезируется белок Q - ак-тиватор поздней стадии транскрипции. Ли-зогенное состояние поддерживается λ-ре-прессором, который кодируется геном cI.Репрессор связывается с операторами OR иOL и препятствует транскрипции предран-них генов. Присутствие многочисленныхучастков связывания в этих операторах по-зволяет λ-репрессорам регулировать соб-ственный синтез.


С чего начатьJacob F., Monod J., 1961. Geneticregulatory mechanisms in the synthesisof proteins, J. Moi. Biol., 3, 318-356. (Bэтой блистательной статье былапредложена модель оперона и сфор-мулировано представление об ин-формационной РНК.)Ptashne M., Gilbert W., 1970. Geneticrepressers, Sci. Amer, 222(6), 36-44.Maniatis Т., Ptashne M., 1976. A DNAoperator-repress or system, Sci. Amer.,234(1), 64-76.

Лактозный оперонMiller J.H., Reznikoff W.S., 1978. TheOperon, Cold Spring HarborLaboratory. (Превосходный сборникстатей, касающихся регуляторныхмеханизмов Е. coli и фага λ. Детальнорассмотрены лактозный, триптофа-новый, арабинозный, гистидиновыйи галактозный опероны.)Gilbert W., Muller-Hill В., 1966.Isolation of the lac represser, Proc. Nat.Acad. Sci., 56, 1891-1898.Dickson R., Abelson J., Barnes W.,

Reznikoff W., 1975. Genetic regulation:the lac control region, Science, 187,27-35.

Арабинозный оперонWilcox G., Meuris P., Bass P., Englesbe-rg E., 1974. Regulation of the arabinoseoperon in vitro, J. Biol. Chem., 249,2946-2952.Hirsh J., Schleif R., 1976. Electronmicroscopy of gene regulation: theL-arabinose operon, Proc. Nat. Acad.Sci., 73, 1518-1522.


Триптофановый игистидиновый опероныPlatt Т., 1978. Regulation of geneexpression in the tryptophan operon ofEsherichia coli. In: Miller J. H. andReznikoff W. S.(eds.), The Operon,pp. 213-302, Cold Spring HarborLaboratory. (Четко изложены пред-ставления о trp-опероне.)Oxender D.L., Zurawski G.,Yanofsky C., 1979. Attenuation in theEscherichia coli tryptophan operon: therole of RNA secondary structureinvolving the Trp codon region, Proc.Nat. Acad. Sci., 76, 5524-5528.Bertrand K., Korn L., Lee F,r Platt Т.,Squires C.L., Squires C., Yanofsky C.,1975. New features of the regulation ofthe tryptophan operon, Science, 189,22-26. (Рассказ об истории открытияаттенюации транскрипции.)Barnes W.M., 1978. DNA sequencefrom the histidine operon controlregion: seven histidine codons in a row,

Proc. Nat. Acad. Sci., 75, 4281-4285.Stephens J. C., Artz S. W., Ames B. N.,1975. Guanosine 5'-diphosphate 3'-di-phosphate (ppGpp): positive effector forhistidine operon transcription andgeneral signal for amino acid deficiency,Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 4389-4393.

Циклический AMP и катаболитнаярепрессияPastan L, Adhya S., 1976. Cyclicadenosine 3',5'-monophosphate inEscherichia coli, Bacteriol. Rev., 40,527-551.Zubay G., Schwartz D., Beckwaith J.,1970. Mechanism of activation ofcatabolite-sensitive genes: a positivecontrol system, Proc. Nat. Acad. Sci., 66,104-110.

Регуляция транскрипции фага λPtashne M., Backman К., НитауипМ.Z., Jeffrey A., Maurer R., Meyer В.,Sauer R. Т., 1976. Autoregulation and

function of a represser in bacteriophagelambda, Science, 194, 156-161.Johnson A., Meyer B.J., Ptashne M.,1978. Mechanism of action of the crоprotein of bacteriophage λ, Proc. NatAcad. Sci., 75, 1783-1787.Ptashne M., Jeffrey A., Johnson A.D.,Maurer R., Meyer B.J., Pabo C.O.,Roberts T.M., Sauer R.T, 1980. Howthe λ represser and crо work, Cell, 19,1-11.Hershey A.D. (ed.), 1971. TheBacteriophage Lambda, Cold SpringHarbor Laboratory. [Имеется пере-вод: Фаг лямбда.- М.: Мир, 1975.](Содержит множество сведений о фа-ге λ.)Reichardt L., Kaiser A.D., 1971.Control of λ represser synthesis, Proc.Nat. Acad. Sci., 68, 2185-2189.

Вопросы и задачи

1. К какому результату приведутследующие мутации?

а) Делеция регуляторного гена lас-оперона.б) Делеция регуляторного гена trp-оперона.в) Делеция регуляторного гена аrа-оперо-на.г) Делеция гена сI фага λ.д) Делеция гена N фага λ.2. Суперрепрессированные му-

танты по lас-оперону (iS) ведутсебя как неиндуцибельные мутанты. Ген iS

доминирует над геном i+ в частичных ди-плоидах. Каким может быть молеку-лярный механизм этой мутации?3. Имеется мутант Е. coli, синте-

зирующий большие количестваβ-галактозидазы независимо от того, при-сутствует ли в среде индуктор. Частичныедиплоиды, образованные из этого мутантаи F i + o + z - - , также синтезируют много β-га-лактозидазы независимо от присутствияиндуктора. Какая мутация могла бы при-вести к такому результату?4. Из культуры дикого типа выде-

лен мутант, неспособный растина галактозе, лактозе, арабинозе и ряде

других источников углерода. Концентра-ция циклического AMP в клетках мутантанормальна. Какая мутация могла бы при-вести к такому результату?5. Клетка Е. coli, несущая профаг

λ, иммунна к литическому ин-фицированию этим фагом. Почему?6. Транскрипция сI может быть

инициирована с промотораpRE, предназначенного для установлениялизогении, или pRM, предназначенного дляее поддержания. Транскрипты с pRM на-чинаются с 5'-концевого кодона AUG λ-pe-прессора, а в транскрипте pRE этому кодо-ну инициации предшествует последова-тельность, комплементарная 3'-концевойпоследовательности 16S-pPHK. Для ини-циации на участке pRE необходимы белки,кодируемые фагом, которые не экспресси-руются в лизогенном состоянии.а) Какой транскрипт будет транслировать-ся с большей эффективностью?б) Каково возможное физиологическое зна-чение этого различия?

Дополнительные вопросы см.: Hood L.E.,Wilson J. H, Wood W. В., Molecular Biologyof Eucaryotic Cells, Benjamin, 1975, ch. 1.

ГЛАВА 29Эукариотическиехромосомы и выражениегенов у эукариотЭукариотическая клетка содержит гораздобольше генетической информации, чемпрокариотическая. Например, в клетке че-ловека в 1000 раз больше ДНК, чемв клетке Е. coli, и примерно в 100000 разбольше, чем в одном вирионе фага λ. Этоизобилие ДНК наделяет эукариот больши-ми потенциальными возможностями, ко-торых нет у прокариот. Другое отличие со-стоит в том, что ДНК высших организмовассоциирована с основными белками - ги-стонами, а хромосомы низших организмовтаких белков не содержат. Предназначениеэтих основных белков - упаковывать ДНК,с тем чтобы при контурной длине, равноймногим сантиметрам, она могла бы поме-ститься в объеме диаметром несколько ми-крометров. Характерная морфология эука-риотических хромосом, которую легко на-блюдать в световом микроскопе, показы-вает, что они организованы значительносложнее, чем геномы прокариотическихклеток. К тому же форма эукариотическиххромосом резко меняется в ходе клеточно-го цикла. Еще одна важная особенность,которая собственно и отличает эукариотот прокариот, состоит в том, что эукарио-тические хромосомы окружены ядерноймембраной. Этой мембраны у прокариотнет, равно как нет и других внутреннихмембран. Благодаря наличию мембранытранскрипция и трансляция у эукариотразделены во времени и в пространстве,тогда как у прокариот они тесно сопря-жены. В ядрах высших организмов пер-вичные транскрипты подвергаются значи-тельной модификации, расщепляются и ихфрагменты соединяются. Лишь небольшаячасть синтезированных в ядре РНК выхо-дят в цитозоль в виде мРНК. Очевидно,

что у эукариот выражение (экспрессия) ге-нов осуществляется значительно болеесложным путем, чем у прокариот. Иссле-дования в этой области быстро развивают-ся, поскольку мы научились выделятьи клонировать гены эукариот, определятьв них последовательность нуклеотидови осуществлять их выражение в хорошоизученных системах. По всему чувствуется,что мы находимся на пороге раскрытияодной из важнейших проблем биологии —механизма клеточной дифференцировки.

Рис. 29.1. Фазово-контрастная микрофо-тография хромосомы типаламповой щетки из ооцита.(Печатается с любезного разре-шения д-ра Joseph Gall.)

29. Хромосомы и выражениегенов у эукариот 127

Рис. 29.2. Радиоавтограф молекулыДНК Drosophila melanogaster.Контурная длина этой ДНКравна 1,2 см. [Kavenoff R.,Klotz L. С., Zimm В. Н., ColdSpring Harbor Symp. Quant.Biol., 38, 4 (1974).]

29.1. Эукариотическая хромосома содержитодну молекулу двухспиральной ДНКМожно ли утверждать, что хромосома со-держит одну длинную молекулу ДНК?В течение многих лет на этот вопрос былотрудно ответить, так как очень длинныемолекулы ДНК невероятно чувствительнык разрыву под действием сил сдвига. Бру-но Зимм (Bruno Zimm) решил эту пробле-му с помощью метода вязкостной эласто-метрии, позволяющего измерять длинусамых крупных молекул ДНК в смеси. Мо-лекулы ДНК растягивают в потоке жидко-сти, и затем им дают свернуться в нор-мальное состояние. Время, за котороесвертывается половина молекул, зависитот их молекулярной массы. Клетки пло-довых мушек лизировали в камере для из-мерений, чтобы избежать разрывов ДНКпри переносе образцов. Нуклеазы инакти-вировали, инкубируя образцы в присут-ствии детергента при 65°С. Кроме того,для гидролиза связанных с ДНК белковдобавляли проназу.

Масса самых крупных молекул ДНКв полученной смеси составляла 41•106 кДа.Эта величина хорошо согласуется с из-вестным содержанием ДНК в самойбольшой хромосоме Drosophila melano-


gaster - 43•106 кДа. Превосходное совпаде-ние результатов наблюдалось также в слу-чае мутанта с транслокацией, затрагиваю-щей самую большую хромосому. В этойхромосоме содержится дополнительный ку-сок ДНК, благодаря которому содержа-ние ДНК в ней достигает 59•106 кДа. Из-меренное количество ДНК в этой моле-куле составило 58•106 кДа. Радиоавтогра-фы ДНК D. melanogaster (рис. 29.2) под-тверждают существование очень длинныхмолекул ДНК. Эти исследования показа-ли, что хромосома дрозофилы содержитодну непрерывную молекулу ДНК. Крометого, эта молекула ДНК линейная и не-разветвленная.

29.2. Эукариотическая ДНК прочно связанас основными белками - гистонамиДНК эукариотических хромосом находит-ся не в свободном виде, а прочно связанас группой небольших основных белков, на-зываемых гистонами. На долю гистоновприходится около половины массы эука-риотических хромосом; вторую половинусоставляет ДНК. Этот нуклеопротеиновыйматериал хромосомы называется хромати-ном. Если обработать хроматин солью илиразбавленной кислотой, гистоны и ДНКможно диссоциировать. Образовавшуюсясмесь можно затем разделить с помощьюионообменной хроматографии. Гистоныподразделяются на пять типов, обозна-чаемых соответственно H1, H2A, Н2В, Н3и Н4. Они имеют массу от 11 до 21 кДа(табл. 29.1). Удивительная особенность ги-стонов - высокое содержание положительнозаряженных боковых цепей: примернокаждый четвертый остаток - лизин или ар-гинин.

Благодаря посттрансляционным моди-

фикациям определенных боковых цепейкаждый гистон существует в несколькихформах. Например, лизин-16 гистона Н4может быть ацетилирован. Кроме того, ги-стоны могут быть метилированы, ADP-ри-бозилированы и фосфорилированы. Изме-нения заряда, способности к образованиюводородных связей и формы молекул ги-стонов в результате таких ковалентныхмодификаций могут играть важную рольв регуляции доступности ДНК для репли-кации и транскрипции.

29.3. Последовательности аминокислотв гистонах Н3 и Н4 почти одинаковыу всех животных и растенийЭмиль Смит и Робер Де-Ланж (EmilSmith, Robert DeLange) показали, что по-следовательности аминокислот в гистонеН4 из проростков гороха и из тимуса те-ленка различаются только по двум поло-жениям из 102. Замены эти очень незначи-тельны: валин - вместо изолейцина и ли-зин - вместо аргинина. Таким образом, по-следовательность аминокислот гистона Н4сохранилась почти без изменений на протя-жении 1,2•10 9 лет, прошедших со времениразделения всего живого на царства расте-ний и животных. Гистон Н3 также малоизменился на протяжении этого колоссаль-ного периода эволюции. Последовательно-сти аминокислот в гистоне Н3 из пророст-ков гороха и из тимуса теленка различают-ся по четырем положениям. Интересносравнить скорость изменения последова-тельности этих гистонов в ходе эволюциисо скоростью изменения других белков.Обычно для этого используется величинаединичного эволюционного периода. Онаравна времени, за которое последователь-ность аминокислот изменяется на 1% по-

Таблица 29.1. Гистоны

Тип

Н1Н2А

Н2ВН3Н4

Отноше-ние

[Lys]/[Arg]

20,01,25

2.50,720,79

Числоаминокис-лотныхостатков

215129

125135102

Мас-са, кДа

21,014.5

13,815,311,3

Локализа-ция

ЛинкерСердцеви-на

Рис. 29.3. Последовательность амино-кислот в гистонах Н4 из тимусателенка. Несколько остатковмодифицированы. α-Амино-группа ацетилирована, равнокак и ε-аминогруппа Lys-16. ε-Аминогруппа Lys-20 метили-рована или диметилирована.Гистон Н4 из проростков горо-ха имеет такую же последова-тельность аминокислот, за ис-ключением положений 60(изолейцин) и 77 (аргинин).

сле того, как дивергируют две эволю-ционные линии. Эта величина для гистоновН3 и Н4 составляет 3•108 и 6•108 лет со-ответственно и значительно выше, чем длядругих исследованных до настоящеговремени белков, Например, для цитохромас единичный эволюционный период соста-вляет 2•107 лет, для гемоглобина - 6•106

лет, для фибринопептидов - 1•106 лет. За-мечательная консервативность структурыгистонов Н3 и Н4 свидетельствует о том,что они выполняют какую-то чрезвычайноважную функцию, возникшую на заре эво-люции эукариот и сохранившуюся с техпор почти без изменений.

29.4. Нуклеосомы - повторяющиесясубъединицы хроматинаКак происходит взаимодействие гистоновс ДНК и образование нити хроматина?Основываясь на данных, полученных раз-личными методами, Роджер Корнберг(Roger Kornberg) высказал в 1974 г. пред-положение, что хроматин состоит из по-вторяющихся субъединиц, каждая из ко-торых включает 200 пар оснований ДНК


Рис. 29.4. Электронная микрофотогра-фия хроматина. Частицы, похо-жие на бусины, имеют диаметроколо 100 А. (Печатается с лю-безного разрешения д-ра AdaOlins и д-ра Donald Olins.)

и по 2 молекулы гистонов Н2А, Н2В, Н3и Н4. Теперь эти повторяющиеся единицыназывают нуклеосомами. Большая частьДНК намотана на гистоновую сердцевину(гистоновый кор). Остальная ДНК, так на-зываемый линкер, или межнуклеосомнаяДНК, соединяет соседние нуклеосомыи обеспечивает гибкость хроматиновой ни-ти. Таким образом, хроматиновая нитьпредставляет собой гибкую цепочку нуклео-сом, напоминающую бусины на нитке.


Целый ряд экспериментальных данныхсвидетельствует в пользу этой моделиструктуры хроматина.

1. Электронная микроскопия. На элек-тронных микрофотографиях хроматинавидны группы расположенных друг за дру-гом бусин диаметром 100 А, соединенныхтонкой нитью (рис. 29.4). Степень растяже-ния хроматиновой нити зависит от способаподготовки образцов для микроскопии.Некоторые методы дают электронные ми-крофотографии с более компактным рас-положением 100-ангстремных бусин. Сле-довательно, электронная микроскопия пря-мо подтверждает, что хроматин - цепочкапочти сферических частиц, между которы-ми расположены гибкие участки.

2. Дифракция рентгеновских лучейи нейтронов. При рентгеновской дифракциина нитях хроматина также виден повтордлиной 100 А. Нейтронная дифракция по-казывает, что ДНК расположена снаружинуклеосомы.

3. Нуклеазный гидролиз. СвободнуюДНК в растворе можно расщепить по лю-бой из ее фосфодиэфирных связей с по-мощью панкреатической дезоксирибону-клеазы I (ДНКазы I) или микрококковойнуклеазы. ДНК в хроматине, за исключе-нием нескольких участков, наоборот, защи-щена от гидролитического действия ну-клеазы. Характер расщепления хроматинапоражает своей простотой: на электрофо-реграмме видна лесенка четко выраженныхполос (рис. 29.5). В этих фрагментах содер-жатся фрагменты ДНК, кратные основно-му повтору длиной примерно 200 пар ос-нований. Электронные микрофотографиипоказывают, что число сферических частицво фрагменте хроматина равно числу200-парных повторов (рис. 29.6). Например,фрагмент, содержащий ДНК длиной 600пар оснований, состоит из трех 100-анг-стремных частиц. Следовательно, бусина,видимая на электронной микрофотогра-фии, соответствует нуклеосоме, получае-мой при нуклеазном гидролизе.

4. Реконструкция. Если добавить ги-стоны к ДНК аденовируса или обезьяньеговируса SV-40, можно получить in vitro xpo-матиноподобную нить. Количество ДНК,связанной с нуклеосомой в таких системахреконструкции, составляет около 200 пар ос-нований. Кроме того, для образования ну-клеосомы необходимо эквимолярное коли-чество гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Если

какого-либо гистона в смеси для рекон-струкции оказывается недостаточно, обра-зования характерных бусин не происхо-дит. Однако гистон H1 для реконструкциине нужен; этот факт перекликается с тем, чтогистон H1 присутствует не во всех нуклеосо-мах эукариотических клеток. Исследованиядифракции рентгеновских лучей также по-казывают, что для получения картины, ха-рактерной для хроматина, необходимо до-бавить гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4.

29.5. Минимальная нуклеосома(«ядро» нуклеосомы) состоит из ДНКдлиной 140 пар оснований, намотаннойна октамер гистоновСодержание ДНК в нуклеосомах различныхорганизмов и типов клеток колеблется от160 до 240 пар оснований (табл. 29.2). Чтолежит в основе этих различий? И в этом слу-чае использование нуклеаз оказалось весьма

Рис. 29.5. Гель-электрофорез фрагмен-тов ДНК хроматина, полу-ченных с помощью ограничен-ного гидролиза микрококко-вой нуклеазой. На дорожкуА была нанесена нефракциони-рованная смесь. При центрифу-гировании в градиенте концен-трации сахарозы были полу-чены фракции мономеров (Б),димеров (В), тримеров (Г) и те-трамеров (Д). [Finch J. Т.,Noll M., Kornberg R. D., Ргос.Nat. Acad. Sci., 72, 3321 (1975).]

Рис. 29.6. Электронные микрофотогра-фии мономеров (А), димеров(Б), тримеров (В) и тетрамеров(Г) нуклеосом, полученных, какописано в подписи к рис. 29.5.[Finch J. Т., Noll M, KornbergR.D., Ргос. Nat. Acad. Sci., 72,3321 (1975).]


информативным. Нуклеосомы можнов свою очередь гидролизовать микрококко-вой нуклеазой; при этом получаются ча-стицы минимальной нуклеосомы (нуклео-сомного «ядра»), содержащие 140 пароснований, независимо от исходного содер-жания ДНК в расчете на одну нуклеосому.Эта минимальная нуклеосома, по всей ве-роятности, практически одинакова у всех эу-кариот. Она состоит из фрагмента ДНКдлиной 140 пар оснований, связанного с окта-мером гистонов (по два гистона Н2А, Н2В,Н3 и Н4).

Минимальные нуклеосомы были полу-чены в кристаллическом виде и в настоящеевремя исследуются с помощью электронноймикроскопии (рис. 29.7) и дифракции рент-геновских лучей. Кристаллизация этих ча-стиц показывает, что нуклеосомы хрома-тина весьма гомогенны. Арон Клуг и ДжонФинч (Aaron Klug, John Finch) установили,что минимальная нуклеосома (нуклеосом-ное «ядро») представляет собой уплощен-ную частицу размером 110 х 100 x 55 Аи состоит из двух слоев. Фрагмент ДНК

Рис. 29.8. Схематическое изображениенуклеосомы. Двойная спиральДНК (красная полоса) намота-на на октамер гистонов (по двемолекулы Н2А, Н2В, Н3 и Н4;изображены голубым). ГистонH1 (желтый цвет) связываетсяс наружной стороной этой ми-нимальной нуклеосомы ис линкерной ДНК. (KornbergA., DNA Replication. Freemanand. Co., 1980.)


Рис. 29.7. Электронная микрофотогра-фия кристалла минимальныхнуклеосом. Центры соседнихнуклеосом в этом гексагональ-ном слое находятся на расстоя-нии 100 А друг от друга.[Finch J. Т. et al, Nature, 269, 31(1977).]

Таблица 29.2. Содержание ДНК в нуклеосомах

Тип клеток

ДрожжиКлетки HeLaКостный мозг крысыПечень крысыПочки крысыЯйцевод курицыЭритроциты курицыГаструла морского ежаСперма морского ежа

Число пар основа-ний

165183192196

196196

207218241

длиной 140 пар оснований намотан снаружина сердцевину и образует 13/4 оборота лево-закрученной суперспирали с шагом пример-но 28 А (рис. 29.8).

Как уже упоминалось, гистон H1 не всег-да присутствует в нуклеосоме. Последова-тельность аминокислот в гистоне H1 наибо-лее вариабельна из всех пяти гистонов.К тому же гистон H1 отличается от другихгистонов пo стехиометрии: на нуклеосомуприходится одна молекула гистона H1. Кро-ме того, гистон H1 легко отделяется от ну-клеосом, что указывает на его перифериче-скую локализацию, т.е. он не являетсячастью гистоновой сердцевины. Нуклео-сомы теряют гистон H1, когда ДНК в их со-ставе укорачивается со 160 до 140 пар осно-ваний. Таким образом, гистон H1 почтинаверняка расположен вне нуклеосомы, бли-же к линкерной ДНК. Гистон H1 может слу-жить мостиком между различными нуклео-сомами и способствовать таким образомповышению компактности хроматина.

29.6. Нуклеосома - первый уровеньконденсации ДНКНакручивание ДНК на нуклеосомную серд-цевину обеспечивает конденсацию ДНК, таккак уменьшает ее линейные размеры. Уча-сток ДНК длиной 200 пар оснований имеетв растворе длину 680 А. В нуклеосоме этоколичество ДНК укладывается в частицудиаметром 100 А. Таким образом, плот-ность упаковки (степень конденсации) ну-клеосомы составляет примерно 7. Сравнимали эта величина со степенью конденсацииДНК в хромосоме? Метафазные хромо-сомы человека, которые находятся в сильноконденсированном состоянии, содержат5,3•109 пар оснований, что соответствуетконтурной длине ДНК 180 см. Эта ДНКупакована в 46 цилиндрических структур,общая длина которых составляет 200 мкм.Таким образом, плотность упаковки ДНКв метафазных хромосомах равна приблизи-тельно 104. В интерфазных ядрах, где хрома-тин находится в более дисперсном состоя-нии, плотность упаковки для ДНК соста-вляет примерно 102-103. Очевидно, нуклео-сома представляет собой лишь первыйуровень конденсации ДНК.

Каков следующий уровень организацииДНК? Одна из возможностей состоитв том, что сами нуклеосомы укладываютсяв спираль. Например, предложена соленоид-ная модель хроматина диаметром 360 А

Рис. 29.9. Предполагаемая соленоиднаямодель хроматина. На одиноборот спирали приходитсяшесть нуклеосом (показаны си-ним цветом). Двойная спиральДНК (красная) намотана на ка-ждую нуклеосому. [Finch J.T.,Klug A., Proc. Nat. Acad. Sci., 73,1900 (1976).]

с плотностью упаковки около 40 (рис. 29.9).Складывание таких соленоидов в петли мо-жет дать дополнительную конденсацию. Повсей вероятности, в стабилизации струк-туры хромосомы высших порядков уча-ствуют различные негистоновые белки. На-пример, в лишенных гистонов метафазныххромосомах выявляется центральный бел-ковый остов, окруженный множествомочень длинных петель ДНК (рис. 29.10). По-видимому, эти петли ДНК закреплены наостове. Такая организация может иметьважное значение для передвижения хромо-сом в митозе и мейозе.

29.7. Репликация эукариотической ДНКначинается во многих местах и идетв двух направленияхПодобно другим молекулам ДНК, эукарио-тическая ДНК реплицируется полуконсерва-


Рис. 29.10. Электронная микрофотогра-фия ДНК, с которой удаленыгистоны. ДНК прикрепляетсяк центральному белковомуостову. Гистоны удалили изметафазных хромосом клетокHeLa, обработав их полианио-нами. (Печатается с любезногоразрешения д-ра UlrichLaemmli.)

тивно. Кроме того, реплицированная ДНКполуконсервативно распределяется междусестринскими хроматидами метафазныххромосом (рис. 29.11). Методом электрон-ной микроскопии было показано, что репли-кация эукариотической ДНК начинается вомногих точках и идет в двух направлениях.Использование многих точек инициации не-обходимо для быстрой репликации, так какэукариотические ДНК имеют огромнуюдлину. Например, самая длинная хромосо-


ма дрозофилы содержит ДНК длиной2,1 см, или 62000 kb. Репликационная вилкаДНК дрозофилы движется со скоростью 2,6kb/мин (сравните со скоростью движениявилки у Е. coli 16 kb/мин). Если бы в самойбольшой хромосоме дрозофилы существо-вала только одна точка начала репликации,то ее удвоение заняло бы более 16 сут. Насамом деле время репликации составляетменее 3 мин. Это достигается коопера-тивным действием более чем 6000 реплика-ционных вилок на одну молекулу ДНК. Мо-лекула ДНК из ядра дрозофилы, находяще-гося на стадии дробления, представляетсобой набор следующих один за другимучастков репликации, или «глаз»(рис. 29.12). Активирование каждой точкиинициации порождает две расходящиеся ре-пликационные вилки. Расширяющиесяв обоих направлениях «глаза» сливаютсяи образуют две дочерние молекулы ДНК(рис. 29.13). «Глаз» внутри другого «глаза»никогда не наблюдался. Из этого следуетчто начало репликации не может снова реак-тивироваться, пока не закончится реплика-

Рис. 29.11. Флуоресцентная микрофото-графия метафазных хромосоммужчины. ДНК в клеткахдважды реплицироваласьв среде, содержащей аналог ти-мидина 5-бромдезоксиуридин(BrdU). Хромосомы сначалаокрасили хинакрином (А),отмыли и снова окрасили бис-бензимидазольным красите-лем Хехст 33258 (Б). BrdU ту-шит флуоресценцию второгокрасителя, поэтому сестрин-ские хроматиды, содержащиеДНК, в которой только однаполинуклеотидная цепь заме-щена BrdU, флуоресцирует яр-че, чем ДНК с BrdU в обеих це-пях. (Печатается с любезногоразрешения д-ра SammuelLatt.)

ция всей молекулы ДНК.В эукариотических клетках имеются

ДНК-полимеразы трех типов (табл. 29.3).α-Полимераза играет основную роль в ре-пликации хромосомы, а β-фермент уча-ствует в репарации ДНК. Когда покоящиесяклетки начинают быстро делиться, количе-ство α-полимеразы возрастает более чемв 10 раз. γ-Полимераза отвечает за реплика-цию митохондриальной ДНК. Как и прока-риотические ДНК-полимеразы, эти фер-менты используют в качестве активиро-ванных предшественников дезокси-рибонуклеозидтрифосфаты и осуществляютэлонгацию затравки по матрице в направле-нии 5'—>3'. Но в отличие от прокариот эука-риотические ДНК-полимеразы не обладают

Рис. 29.12. Электронная микрофотогра-фия реплицирующейся хромо-сомной ДНК из дробящегосяядра эмбриона дрозофилы.«Глаза» - только что реплици-рованные участки. (Печатаетсяс любезного разрешения д-раDavid Hogness.)


Рис. 29.13. Схематическое изображениерепликации эукариотическойхромосомы. РодительскаяДНК показана синим цве-том, новообразованная ДНК-красным.

нуклеазной активностью. Скорее всегофункцию исправления ошибок выполняютнуклеазы, ассоциированные с этими поли-меразами в мультиферментных комплексах.

Рис. 29.14. Фазы клеточного цикла эука-риотической клетки: митоз(М); фаза покоя 1, перед синте-зом ДНК (G l); период синтезаДНК (S); фаза покоя 2, послесинтеза ДНК (G2). Продолжи-тельность фаз зависит от типаклеток и условий культивиро-вания. Митоз - обычно самаякороткая фаза.


29.8. Новые гистоны образуютновые нуклеосомы на отстающейдочерней цепи ДНКВ репликационных вилках синтез ДНК идетв направлении 5'—>3' по одной дочерней це-пи и в направлении 3'—>5' по другой. Каки при репликации прокариотической ДНК(разд. 24.19), это происходит следующимобразом: одна цепь, ведущая, синтезируетсянепрерывно, а другая, отстающая,- преры-висто. Как распределяются старые и новыегистоны? Чтобы решить этот вопрос, синтезДНК проводили в присутствии ингибиторабелкового синтеза циклогексимида. В этихусловиях синтез ДНК прекращается в тече-ние примерно 15 мин. При действииДНКазы I половина новообразованнойДНК полностью распадается, а другая по-ловина расщепляется на фрагменты длиной200 пар оснований. Этот эксперимент, а так-же данные, полученные с помощью меткитяжелыми изотопами, показали, что роди-тельские гистоны ассоциированы толькос одной из двухспиральных дочерних ДНК,тогда как другая остается голой из-за отсут-

Таблица 29.3. Эукариотические ДНК-полимеразы

Тип

α

β

γ

Локализация

Ядро

»

Митохондрии

Основнаяфункция

Репликацияядерной ДНК

Репарацияядерной ДНК

Репликациямитохондриаль-ной ДНК

Масса,кДа

140

40

150

Рис. 29.15. Асимметричная репликацион-ная вилка, возникшая в резуль-тате синтеза ДНК в присут-ствии циклогексимида, блоки-рующего образование новыхгистонов. Одна из дочернихмолекул ДНК покрыта бусина-ми, другая остается голой. Этопоказывает, что родительскиегистоны связаны толькос одной из дочерних молекул.[Riley D., Weintraub H., Proc.Nat. Acad. Sci., 76, 331 (1979).]

ствия новых гистонов. Эта интерпретациянаходит прямое подтверждение на элек-тронных микрофотографиях, где видно, чтов области репликационной вилки одна издочерних нитей покрыта бусинами, а дру-гая - нет (рис. 29.15). Иными словами, роди-тельские гистоны распределяются во времярепликации консервативно1. Такое поведе-ние гистонов показывает, что гистоны не от-деляются от ДНК во время репликации.Старые гистоны остаются на двухцепочеч-ной ДНК, содержащей ведущую цепь, тогдакак новые гистоны садятся на ДНК, содер-жащую отстающую цепь. Причина этогоразличия между дочерними молекуламиДНК заключается, очевидно, в том, что ги-стоны гораздо прочнее связываются с двух-цепочечной ДНК, чем с одноцепочечной.Старые гистоны, по-видимому, не удержи-

1 Недавно этот вывод подвергался серьезнойкритике в связи с тем, что по некоторымданным циклогексимид нарушает нормальноераспределение гистонов во время репликации.—Прим. перев.

ваются на отстающей цепи по той причине,что до соединения фрагментов Оказаки онасодержит одноцепочечные участки.

29.9. Митохондрии и хлоропласты содержатсобственную ДНКНе вся наследственная информация эука-риотических клеток содержится в ядернойхромосомной ДНК. В результате генетиче-ских исследований дрожжей был открыт ми-тохондриальный геном, отличный от ядер-ного генома. В 1949 г. Борис Эфрусси (BorisEphrussi) обнаружил, что некоторые му-танты пекарских дрожжей не способнык окислительному фосфорилированию. Этидефектные по дыханию мутанты медленнорастут за счет брожения. Они называютсяpetites (что по-французски означает «ма-ленькие»), так как образуют очень малень-кие колонии. Генетический анализ привелк неожиданному открытию, что мутацииpetites сегрегируют независимо от ядра; этонавело на мысль о том, что митохондрииобладают собственным геномом. И дей-ствительно, через несколько лет в митохон-дриях была обнаружена ДНК. Более того,митохондриальная ДНК из штамма petiteотличалась по плавучей плотности от мито-хондриальной ДНК дрожжей дикого типа;из этого следовало, что у мутанта измененазначительная часть митохондриального ге-нома. Вслед за этим было показано, что хло-ропласты фотосинтезирующих эукариот то-же содержат ДНК и что она реплицируется,транскрибируется и транслируется.

Митохондриальная ДНК животных кле-ток - кольцевая двухцепочечная молекулас контурной длиной около 5 мкм, что со-ответствует 15 kb. Дрожжевая митохон-дриальная ДНК обычно примерно в 5 раздлиннее, а хлоропластная - в 10 раз длиннее.Молекулы ДНК в митохондриях и хлоро-пластах не связаны с гистонами. Они отно-сительно невелики, сравнимы по величинес вирусными геномами. Лучше всего изученмитохондриальный геном дрожжей, коди-рующий примерно десять белков, две моле-кулы рибосомной РНК и около 26 видовтранспортной РНК. Молекулы, кодируемыемитохондриальной ДНК и синтезируемыевнутри этой органеллы, составляют всегооколо 5% митохондриального белка. Такимобразом, большая часть белков митохон-дрии кодируется ядерным геномом. Однако


генетический вклад митохондриальнойДНК необходим. Например, три из семисубъединиц цитохромоксидазы и три из де-сяти субъединиц АТРазы внутренней мем-

Рис. 29.16. Электронно-микроскопиче-ское изображение молекулымитохондриальной ДНК, со-держащей два генома, соеди-ненных «голова к хвосту»с образованием кольца. Репли-кация этой молекулы ДНКтолько что началась. Стрелка-ми показаны две петли, распо-ложенные на противопо-ложных сторонах кольца. Этипетли с вытесненной цепью(D-петли, от англ. displa-cement - вытеснение) содержатновосинтезированную ДНК.Более тонкая линия в каждойпетле - вытесненный одноцепо-чечный участок родительскойДНК. (Печатается с любезногоразрешения д-ра DavidClayton.)


браны митохондрий кодируются митохон-дриальным геномом. Существование от-дельных геномов влечет за собой рядвопросов. Каким образом репликация мито-хондриальной ДНК координируетсяс удвоением хромосом и делением клетки?Как белки, синтезированные в цитозоле,проникают в митохондрии и взаимодей-ствуют с продуктами митохондриальныхгенов? Но самое загадочное состоит в сле-дующем: зачем митохондриям нужны со-бственные геномы, если 95% их белков коди-руются ядерным геномом? Ответов на этиинтригующие вопросы пока нет.

29.10. Эукариотическая ДНК содержитмного повторяющихся последовательностейоснованийРой Бриттен (Roy Britten) и его сотрудникиисследовали кинетику реассоциации ДНК,денатурированной нагреванием, и обнару-жили, что эукариотическая ДНК в отличиеот прокариотической ДНК содержитмного повторяющихся последовательно-стей оснований. В этих экспериментахДНК дробили на короткие фрагментыи затем денатурировали нагреванием рас-твора выше температуры плавления ДНК(Тпл). Затем полученный раствор одноцепо-чечной ДНК охлаждали до температурыпримерно на 25°С ниже Тпл, оптимальнойдля реассоциации комплементарных цепейс образованием двухспиральной ДНК. Ки-нетику реассоциации можно регистриро-вать самыми различными способами.Один из методов состоит в измерении по-глощения раствора при 260 нм (разд. 24.9).При этой длине волны коэффициент погло-щения двухцепочечной ДНК примерно на40% ниже, чем соответствующая величинадля одноцепочечной ДНК; это явление на-зывается гипохромизмом. В основе другогоэкспериментального подхода лежит тотфакт, что двухцепочечная ДНК связывает-ся колонками с гидроксиапатитом (фосфа-том кальция), а одноцепочечная проскаки-вает. В этом методе привлекает то, что онпозволяет фракционировать большие коли-чества ДНК на основе скорости ее реассо-циации после тепловой денатурации.

Наблюдаемая кинетика реассоциацииДНК Е. coli или фага Т4 соответствуетожидаемой кинетике бимолекулярной реак-ции

Рис. 29.17. Кривые зависимости f от C0t(«кривые C0t») отображают ки-нетику реассоциации несколь-ких денатурированных нагре-ванием ДНК. По оси ординатотложена доля одноцепо-чечных молекул, по осиабсцисс - C0t. Быстрая реассо-циация сателлитной ДНК мы-ши показывает, что она содер-жит огромное количествоповторяющихся последова-тельностей. [Britten R. J., Koh-ne D. E., Science, 161, 530(1968).]

где S и S' - комплементарные одноцепо-чечные молекулы, D - реассоциировавшаядвойная спираль и k - константа скоростиассоциации. В такой реакции доля одноце-почечных молекул f снижается со временемв соответствии с уравнением

где С0 - исходная концентрация ДНК (вы-раженная в молях нуклеотидов в 1 л),а t - время в секундах. Для определеннойДНК и заданных экспериментальных усло-вий (т. е. ионной силы, температуры, разме-ра фрагментов ДНК) f зависит только отC0t - произведения концентрации ДНК навремя. Кинетику реассоциации удобно гра-фически изображать, откладывая зависи-мость f от десятичного логарифма C0t. Та-кая кривая C0t имеет сигмоидную форму(рис. 29.17). Характеристикой того илииного препарата ДНК служит величинаC0t0,5, которую легко определить с по-

мощью этой кривой. C0t0,5 - значение C0t,при котором происходит реассоциация по-ловины ДНК (f= 0,5). Для ДНК Е. coli зна-чение C0t0,5 составляет примерно 9 М•с,для фага Т4 C0t0,5 = 0,3 М•с. Эти числапоказывают, что ДНК Е. coli реассоции-рует примерно в 30 раз медленнее, чемДНК фага Т4. Объясняется это тем, чтоДНК Е. coli длиннее и число разных видовфрагментов, которые содержатся в препа-рате ДНК, разрушенной силами сдвига,больше, чем в препарате ДНК Т4. Итак,концентрация комплементарных фрагмен-тов в растворе фрагментированной ДНКЕ. coli ниже, чем в растворе ДНК фага Т4(содержащем такое же количество нуклео-тидов), и, следовательно, скорость реассо-циации ниже. Исследование ряда прока-риотических ДНК показало, что величинаC0t0,5 прямо пропорциональна размеру ге-нома.

Когда с помощью этого метода сталиисследовать ДНК мыши, получили неожи-данный результат. Геномы млекопитаю-щих примерно на три порядка величиныбольше, чем геном Е. coli, и предполага-лось, что будет получена величина C0t0 , 5

порядка 104М•с. Раствор ДНКс концентрацией 10-4 М и с такой величи-ной C0t0,5 должен реассоциировать напо-ловину за 108 с (примерно 3 года). К уди-влению исследователей, они обнаружили,что 10% ДНК мыши реассоциирует напо-ловину за несколько секунд. Эта фракцияДНК мыши реассоциирует быстрее, чемдаже самые маленькие вирусные ДНК, и,следовательно, содержит много повторяю-щихся последовательностей. Анализ кри-


вой зависимости f от C0t показал, что этафракция мышиной ДНК содержит порядкамиллиона копий повторяющейся последова-тельности длиной около 300 пар оснований.Примерно 20% мышиной ДНК ренатури-рует с промежуточной скоростью. Этотфакт, согласно интерпретации авторов,указывал, что данная фракция содержит103—104 копий определенных последова-тельностей. Остальные 70% мышинойДНК ренатурировали очень медленно. Ве-личина C0t0,5 для этой фракции показыва-ла, что она состоит из уникальных или по-чти уникальных последовательностей осно-ваний.

Все изученные до настоящего времениэукариотические геномы, кроме, возможно,дрожжей, содержат повторяющиеся по-следовательности ДНК, тогда как прока-риоты ее не содержат. Например, челове-ческая ДНК на 30% состоит из последова-тельностей, повторяющихся по меньшеймере 20 раз. Относительное содержаниевысокоповторяющейся, умеренно повто-ряющейся и уникальной ДНК различноу разных видов.

29.11. Высокоповторяющаяся ДНК(сателлитная ДНК) локализованав центромерахМногие высокоповторяющиеся ДНК мож-но выделить методом центрифугированияв градиенте плотности, так как их плавучаяплотность отличается от плотности основ-ной ДНК. Например, ДНК Drosophila virilisдает главный пик и три сателлитных пикас меньшей плотностью (рис. 29.18). Эти са-теллитные пики содержат исключительноповторяющуюся ДНК. Каждая из нихпредставляет собой повторяющуюся по-следовательность гептануклеотидов:

Роль высокоповторяющейся ДНК не-известна. Но хромосомная локализацияэтой фракции была определена с помощьюметода гибридизации in situ, разработанно-го Джозефом Голлом и Мэри Лу Пардью(Joseph Gall, Mary Lou Pardue). Клетки им-мобилизовали под тонким слоем агара


Рис. 29.18. На этой кривой седиментациивидны три отчетливых пика са-теллитной ДНК (ρ = 1,692,1,688 и 1,671). Показан резуль-тат равновесного центрифуги-рования ДНК D. virilis в ней-тральном градиенте CsCl.[Gall J. G., Cohen E. H., Ather-ton D. D., Cold Spring HarborSymp. Quant. Biol., 38, 417(1974).]

и обрабатывали щелочью для денатурацииДНК. Затем этот препарат инкубировалис меченной тритием РНК, транскрибиро-ванной in vitro очищенной сателлитнойДНК в качестве матрицы. Гибриды ра-диоактивной РНК с участками хромосомы,содержащими сателлитную ДНК, вы-являли с помощью радиоавтографии(рис. 29.19). Был получен очень четкий ре-зультат: сателлитная ДНК мыши встре-чается только в области центромер. Лока-лизация этих последовательностей и отсут-ствие в клетке комплементарных им РНКобъясняются, по-видимому, тем, что са-

теллитные последовательности участвуютв перемещениях хромосом во время мито-за и мейоза.

29.12. Гены, кодирующие рибосомные РНК,расположены один за другим тандемнои повторяются несколько сот разГены, кодирующие молекулы рибосомныхРНК, отличаются двумя особенностями.Во-первых, они повторяются тандемно

Рис. 29.19. Радиоавтограф мышиных кле-ток, на котором видна локали-зация сателлитной ДНК. (Пе-чатается с любезного разреше-ния д-ра Joseph Gall.)

Рис. 29.20. Микрофотография ядра, выде-ленного из ооцита ксенопуса.Ядро окрашено, чтобы быливидны сотни ядрышек, обра-зующихся при амплификациигенов рибосомной РНК.[Brown D. D., Dawid I. В., Sci-ence, 160, 272 (1968).]

один за другим. Почти у всех эукариотимеется более 100 копий этих генов. Во-вто-рых, большинство генов рРНК расположе-но в особых участках хромосом, ассоцииро-ванных с ядрышками. В клетках мутантов,лишенных ядрышек, синтезируется оченьмало рРНК; поэтому они нежизнеспо-собны. Об этих генах многое известно,главным образом благодаря работам Мак-

са Бернстила, Доналда Брауна, ОскараМиллера (Max Birnstiel, Donald Brown,Oscar Miller) и их сотрудников. Гены, коди-рующие четыре рибосомные PHK - 18S-,5,8S-, 28S- и 5S-рРНК,- были выделеныв чистом виде из ДНК африканских шпор-цевых лягушек Xenopus laevis и Xenopusmulleri. Выбор пал на шпорцевых лягушекпо той причине, что их ооциты содержатособенно много этих генов.

Гены 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK собранывместе (образуют кластеры) и тандемноповторяются. Гибридизация in situ показа-ла, что эти гены расположены в ядрышках.Повторяющаяся единица состоит из гена,кодирующего 40S-предшественник РНКи спейсер (рис. 29.21). 40S-предшественник(8kb) модифицируется и расщепляется, да-вая зрелые 18S-, 5,8S- и 28S-рРНК

Рис. 29.21. Организация генов 40S-пред-шественника 18S- 5,8S-и 28S-рРНК у ксенопуса. Тан-демно повторяющиеся геныразделены нетранскриби-руемыми участками (спейсера-ми). Длина повторяющегосяэлемента 13 kb.


Рис. 29.22. На этой электронной микрофо-тографии ядрышковой ДНКясно видна тандемная укладкагенов 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK.Толстая осевая нить - ДНК.Тонкие нити, отходящие в сто-роны,- новообразованные мо-лекулы РНК со связаннымибелками. Острый конец каждой«елочки», образованной синте-зирующимися молекуламиРНК, соответствует точке ини-циации транскрипции. Голыеучастки между острыми конца-ми «елочек» - нетранскриби-руемые спейсеры. [Miller О. L.,Jr., Beatty В. R., J. Cell Physiol.,74 (suppl. 1), 225 (1969).]

(разд. 29.21). Спейсер (нетранслируемыйучасток) не транскрибируется (рис. 29.22).Соматические клетки лягушек содержатпримерно 500 копий этой повторяющейсяединицы, и все они расположены друг задругом. В процессе оогенеза происходитудивительная избирательная амплифика-ция (увеличение количества) этих генов.Они реплицируются несколько тысяч раз


и дают примерно 2•106 копий. Количествогенов, кодирующих рРНК, достигает 75%всей ДНК ооцита. АмплифицированнаяДНК представляет собой внехромосомныекольца, прикрепленные к множеству новыхядрышек. Такая избирательная амплифика-ция гена позволяет ооцитам накопить 1012

рибосом, необходимых для очень быстрогосинтеза белка во время дробления. Еслибы амплификации гена не было, образова-ние 1012 рибосом заняло бы нескольковеков!

Ген, кодирующий самую маленькую мо-лекулу рибосом - 5S-pPHK, также тандем-но повторяется. И соматические клетки,и ооциты содержат около 24000 копийэтого гена, кодирующего молекулу РНКдлиной 120 нуклеотидов. Эти гены со-браны в группы (в кластеры) и распола-гаются на концах большинства хромосомлягушки. И в этом случае между генамиданной рРНК имеется область нетранскри-бируемого спейсера (рис. 29.23). На самомделе спейсер в несколько раз длиннеесамого гена. Любопытно, что он содержитнетранскрибируемый псевдоген, последова-тельность оснований которого сходна с са-мим геном. Роль спейсера в этом и в дру-гих эукариотических генах остается загад-кой.

29.13. Гены гистонов собраны вместеи повторяются тандемно много разКак организованы гены, кодирующие бел-ки? Одними из первых были выделеныи охарактеризованы гены гистонов благо-даря изобилию гистоновой мРНК в бы-стро делящихся эмбрионах морского ежа.Эти морские беспозвоночные развиваютсяот стадии зиготы до стадии бластулы, со-держащей 1000 клеток, за 10 ч. Поэтомудля сборки нового хроматина необходимосинтезировать большое количество гисто-нов. Действительно, в период раннего эм-бриогенеза гистоны составляют более чет-верти всего синтезированного белка. Ги-стоновая мРНК содержится в еще боль-шем количестве - на ее долю приходитсяоколо 70% всех информационных РНК,синтезируемых на этой стадии, поэтому еесравнительно легко выделить. После выде-ления гистоновой мРНК была исследованакинетика ее гибридизации с ДНК морскогоежа для определения числа копий гисто-новых генов. Скорость гибридизации былав несколько сот раз выше, чем она должнабыть в случае уникальных последовательно-стей: это показывало, что для гистоновыхгенов характерна очень высокая повторяе-

Рис. 29.23. Организация генов 5S-pPHKXenopus laevis. Эти тандемноповторяющиеся гены такжеразделены нетранскриби-руемыми спейсерами. Повто-ряющийся элемент имеет дли-ну примерно 750 пар основа-ний.

Рис. 29.24. Световая микрофотографияэмбриона морского ежа на ста-дии четырех клеток. (Печатает-ся с любезного разрешенияд-ра Annamma Spudich.)

мостъ. Число копий гистоновых генову различных видов морского ежа колеблет-ся от 300 до 1000. У других организмов по-вторяемость ниже (табл. 29.4). Число ко-пий гистоновых генов у того или иногоорганизма, по-видимому, коррелируетс потребностью в быстром синтезе гисто-новых мРНК.

Как организованы в геноме многократноповторяющиеся гены гистонов? Для полу-чения фракции ДНК, обогащенной генамигистонов, использовали тот факт, что этигены содержат больше пар G—С (55%),чем большая часть ДНК морского ежа(42%), и, следовательно, имеют более высо-кую плавучую плотность. При расщепле-

Таблица 29.4. Повторяемость гистоновых генов1

Вид

Морской ежПлодовая мушка (Drosophilamelanogaster)Шпорцевая лягушка (Xenopus laevis)МышьКурицаЧеловек

Число копий

300-1000

11020-5010-201030-40

1 У дрожжей Saccharomyces cerevisiae имеется только двагистоновых гена на гаплоидный геном.- П р и м . перев.


Рис. 29.25. Карта сгруппированных в кла-стеры гистоновых генов мор-ского ежа (Strongylocentrotuspurpuratus) и плодовой мушки(Drosophila melanogaster). Коди-рующие участки закрашены си-ним цветом, спейсеры (нетран-скрибируемые участ-ки) - желтым. Стрелки показы-вают направление тран-скрипции.

нии такой обогащенной ДНК одной из ре-стриктирующих эндонуклеаз получалисьфрагменты длиной 7kb, которые гибриди-зовались с гистоновой мРНК. Затем этифрагменты клонировали в клетках Е. coliи исследовали с помощью ферментов ре-стрикции и электронной микроскопии. Ре-зультаты исследований показали, что гены,кодирующие пять основных гистонов,сгруппированы вместе в составе основногоповторяющегося элемента длиной 7 kb(рис. 29.25). В этом повторяющемся эле-менте пять кодирующих участков чере-дуются с пятью спейсерами. Кодирующиепоследовательности не прерываются вста-вочными последовательностями в отличиеот других эукариотических генов, опи-санных выше (разд. 26.12). Группа из пятигистоновых, генов повторяется тандемномного раз. Повторы очень сходны другс другом, но не идентичны. Это согласует-ся с тем, что гистоны H1, H2A и Н2В пред-ставляют собой группы очень сходныхбелков, а не совершенно однородные поли-пептиды. В различных тканях и на разныхстадиях развития экспрессируются раз-личные гистоновые гены.

Какова функциональная роль такой ор-ганизации генов? Их повторяемость, не-сомненно, имеет важное значение для бы-строго синтеза большого количества ги-


стоновой мРНК. Но причина, по которойповторы собраны тандемно вместе, неочень ясна. Соседство генов, кодирующихпять гистонов, может быть, играет важнуюроль в координации их синтеза, чтобы ги-стоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4 образовывалисьв эквимолярном количестве, а гистонH1 - в половинном.

29.14. Многие белки, синтезирующиесяв больших количествах, кодируютсяуникальными генамиМы уже видели, что гены рибосомныхРНК и гистонов повторяются много раз.Представлены ли гены, кодирующие боль-шое количество продукта, большим чис-лом копий? Для ответа на этот вопрос До-налд Браун (Donald Brown) выделил генфиброина шелка шелковичного червяBombyx mori. Выбор пал на эту систему по-тому, что мРНК, кодирующая фиброиншелка, имеет характерные структурныеособенности. Она служит матрицей для по-вторяющихся последовательностей амино-кислот, богатых глицином. Кроме того, ги-гантские клетки только одного типа синте-зируют огромные количества фиброинашелка на определенной стадии развития.Для очистки РНК использовали ее боль-шой размер (9,1 kb) и высокое содержаниеG по сравнению с рРНК и молекуламидругих РНК. Ген фиброина шелка такжебыл частично очищен благодаря его не-обычно высокой плавучей плотности. Гиб-ридизация очищенной фиброиновой мРНКс ДНК показала, что в гаплоидном геномеимеется только один ген фиброина шелка.

Этот результат имел чрезвычайно важ-ное значение для изучения экспрессии ге-нов и дифференцировки у эукариот. Он по-казал, что большие количества одногоопределенного белка могут быть синтези-рованы, даже если в геноме имеется толь-ко одна копия кодирующего его гена.Единственный ген фиброина шелка служит

Рис. 29.26. Шелковичный червь (Фотогра-фия любезно представленад-ром Karen Spraque.)

матрицей для синтеза примерно 104 моле-кул мРНК, сохраняющихся в течение не-скольких дней. Каждая молекула мРНКслужит матрицей для синтеза порядка 105

молекул белка. Таким образом, одного генахватает для синтеза порядка 109 молекулбелка в течение четырех дней. Создаетсявпечатление, что повторяющиеся гены ри-босомных РНК и гистонов скорее предста-вляют собой исключение, чем правило.Единственный ген фиброина шелка гораздотипичнее для генов, кодирующих белки, да-же белки, синтезирующиеся в больших ко-личествах. Например, ретикулоциты содер-жат одну или несколько копий генов,кодирующих субъединицы гемоглобина(разд. 29.26). Подобно этому, большие ко-личества овальбумина - основного компо-нента яичного белка - синтезируются в яй-цеводе пасущихся кур, клетки которогосодержат только одну копию овальбуми-нового гена на гаплоидный геном. Однаконе следует упускать из виду и возможностьизбирательной амплификации гена какспособ увеличения синтеза того или иногобелка в клетках определенного типа. Неко-торые опухолевые клетки в культуре при-обретают устойчивость к аналогам фолие-вой кислоты путем синтеза 200-кратногоколичества дигидрофолят-редуктазы посравнению с нормальными чувствительны-ми клетками. Такое количество ферментавозникает вследствие избирательной ампли-фикации гена дигидрофолят-редуктазы.Очевидно, эукариотический геном предста-вляет собой весьма динамичную систему.

29.15. Большинство уникальных геновперемежается повторяющимисяпоследовательностямиПримерно 70% ДНК самых разнообразныхэукариот представляет собой уникальныепоследовательности. Как расположены этиуникальные гены относительно повторяю-щихся последовательностей? Анализ эука-риотических хромосом различными мето-дами показал, что уникальные последова-тельности обычно чередуются с умеренноповторяющимися последовательностями,длина которых в типичном случае состав-ляет 300 пар оснований. Существует не-сколько тысяч различных умеренно повто-ряющихся последовательностей. Они пов-торяются в геноме несколько сот раз ив совокупности составляют 20% ДНК.Функция рассеянных, умеренно повторяю-щихся последовательностей ДНК неизвест-на. Возможно, они служат участкамисвязывания специфических регуляторныхмакромолекул, которые могут контролиро-вать транскрипцию соседних уникальныхструктурных генов.

29.16 Почти все гены высших эукариот,кодирующие белки, имеют разорванноестроениеСуществование у эукариот повторяющихсягенов и их чередование с уникальными ге-нами не имеют никаких аналогий у прока-риот. Еще одно удивительное отличие в ор-ганизации генома - присутствие у высшихэукариот вставочных последовательностейпрактически во всех генах, кодирующихбелки. Как уже обсуждалось (разд. 26.12),эти вставочные последовательности (ин-троны) транскрибируются вместе с коди-рующими последовательностями (экзона-ми), а затем удаляются в процессе образо-вания зрелой мРНК. Число интроновв изученных до сих пор разорванных генахколеблется от 2 до 17 (табл. 29.5и рис. 29.27)1. Некоторые интроны имеютбольшую длину. Например, ген β-глобинамыши содержит интрон длиной 550 пар ос-нований, т.е. он длиннее, чем его экзоны.Два фрагмента иммуноглобулинового генаразделены еще более длинным интро-ном - длиной 1250 пар оснований. В неко-

1 Ген миозина содержит свыше 50 интронов! —Прим. перев.


Рис. 29.27. Карта гена кональбумина.Вставочные последовательно-сти (интроны), которые тран-скрибируются, но не входятв состав зрелой мРНК, пока-заны желтым цветом.

торых генах общая длина интронов превы-шает длину экзонов. Так, ген овальбуминасодержит около 7700 пар оснований, а егомРНК имеет длину всего 1859 нуклеоти-дов. Как правило, вставочные последова-тельности разорванных генов длиннее, чемэкспрессирующиеся последовательности.Интересно отметить, что эволюционныеизменения в последовательностях интро-нов происходят быстрее, чем в экзонах.Последовательности оснований меньшегои н т р о н а генов β-глобина мыши и кроликасовершенно различны. Однако по длинеони близки, а их положение в гене иден-тично. Еще более существенно, что после-довательности на стыке интронов и экзо-нов, по которым происходит сплайсинг(сращивание), консервативны.

Были обнаружены и разорванные гены,кодирующие РНК. Например, один из ге-нов транспортных РНК дрожжей содержитинтрон длиной 14 пар оснований рядомс антикодоновой петлей зрелой тРНК. Ми-тохондриальный ген, кодирующий рибо-сомную РНК, также имеет разорванноестроение. В то же время многие рРНКи тРНК непрерывны. Гены гистонов мор-ского ежа и плодовой мушки, по-видимо-му, также не содержат вставочных после-довательностей. До настоящего временитакие «разорванные» структурные геныбыли обнаружены только у птиц и млеко-питающих. Интересно выяснить, много лиразорванных генов у низших эукариот1.

Открытие разорванных генов было пол-ной неожиданностью и повлекло за собойвозникновение ряда увлекательных проб-лем. Может быть, интроны отражаютобразование в эволюции новых белков из

1 В настоящее время вырисовывается следую-щая тенденция: чем выше эволюционное поло-жение организма, тем, как правило, больше ин-тронов содержат его гены и тем они длиннее.—Прим. перев.


фрагментов старых? Участвуют ли ин-троны в регуляции выражения генов? Яс-но, что появилась новая важная областьисследований. Быстро накапливаютсяданные, касающиеся существенного вопро-са - вырезания вставочных последователь-ностей из первичного транскрипта. Вскоремы рассмотрим эти данные.

29.17. РНК в эукариотических клеткахсинтезируется тремя различнымиРНК-полимеразамиПерейдем теперь к транскрипции. В эука-риотических клетках существует три видаРНК-полимераз, синтезирующих РНК.Они различаются по специфичности к мат-рице, локализации и чувствительностик ингибиторам. Полимераза типа I локали-зована в ядрышках, где она транскриби-рует тандемные повторы, кодирующие ри-босомные 18S-, 5,8S- и 28S-PHK. Другиемолекулы РНК - 5S-pPHK и всетРНК - синтезируются другой РНК-поли-меразой типа III, которая находится нев ядрышке, а в нуклеоплазме. Большие мо-лекулы РНК-предшественники, из которыхобразуются мРНК, синтезируются РНК-полимеразой II, также содержащейся в ну-клеоплазме. У прокариот же все виды кле-точной РНК синтезируются одной и тойже РНК-полимеразой. Общее свойство эу-кариотических РНК-полимераз заключает-ся в том, что в их состав входят две боль-шие и несколько маленьких субъединиц.

29.18. Грибной яд α-аманитин -мощный ингибитор РНК-полнмеразы IIКаждый год во всем мире более 100 чело-век погибает от отравления ядовитымигрибами, в частности Amanitia phalloides,(бледной поганкой). Один из токсинов этих

Таблица 29.5. Некоторые эукариотические гены, имею-щие разорванное строение

Ген

ОвальбуминОвомукоидКональбумии

α-Глобин

Числоинтро-нов

76

17

2

Ген

β-Глобинδ-ГлобинL-цепъ имму-ноглобулинаН-цепь имму-ноглобулина

Числоинтро-нов

22

2

4

грибов - α-аманитин - циклический пептид,содержащий несколько необычных амино-кислот. α-Аманитин очень прочно связы-вается с РНК-полимеразой II (К = 10-8 М)и блокирует таким образом синтез пред-шественников мРНК. Полимераза III инги-бируется при более высоких концентрацияхα-аманитина (10-6 М), а полимераза I нечувствительна к этому токсину. α-Амани-тин блокирует стадию элонгации в синтезеРНК.

29.19. Специфические гены могутактивироваться для транскрипцииВыражение генов у эукариот, как и у про-кариот, регулируется в значительной степе-ни на уровне транскрипции. Одно из наи-более надежных доказательств было полу-чено при исследовании хромосом разви-вающихся насекомых. Гигантские поли-тенные хромосомы из слюнных железDrosophila содержат более тысячи молекулДНК, не разошедшихся при репликациии лежащих бок о бок друг с другом. В ка-

Таблица 29.6. Эукариотическне РНК-полимеразы

Тип

I

II

III

Локализация

Ядрышко

Нуклеоплазма

Нуклеоплазма

Клеточныетранскрипты

18S-, 5,8S- и28S-рРНК

Предшествен-ники мРНК игяРНК

тРНК и 5SрРНК

Вирусныетранскрипты

Не обнаруже-ны

Предшествен-ники мРНК

Малые РНК

ждой политенной хромосоме имеется рядхарактерных полос (диски, или хромо-меры), видимых под световым микроско-пом. При развитии личинки в куколку не-которые диски временно увеличиваются(образуют пуфы), так как ДНК в этойобласти переходит из конденсированногосостояния в разрыхленное (рис. 29.29).Пуфы соответствуют транскрипционно ак-тивным участкам. Был обнаружен порази-тельный факт: пуфы могут быть индуциро-

Рис. 29.28. Ядовитый гриб Amanita phallo-ides, содержащий α-аманитин.(Lincoff G., Mitchell D. H., Toxicand Hallucinogenic MushroomPoisoning, Van Nostrand Reinh-old, 1977, p. 30.)


Рис. 29.29. Образование пуфа в политен-ной хромосоме на определен-ной стадии развития. Стрелкойпоказан наиболее крупный пуфв хромосоме дрозофилы. (Пе-чатается с любезного разреше-ния д-ра Joseph Gall.)

ваны в выделенных слюнных железах invitro экдизоном - стероидным гормоном на-секомых. Происходит увеличение и затемконденсация специфических дисков в опре-деленной временной последовательности,и одновременно происходят измененияв популяции синтезируемых мРНК.

29.20. Три вида рибосомных РНКобразуются в результате процессингаодного первичного транскриптаМолекулы РНК, синтезируемые тремяРНК-полимеразами, называются первичны-ми транскриптами. Эти новообразованныеРНК в очень большой степени модифици-руются в ядре, прежде чем они переходятв цитозоль в виде зрелых молекул рРНК,тРНК и мРНК. Образование рибосомныхРНК из первичного транскрипта было изу-чено детально, лучше, чем процессинг ка-ких-либо других видов РНК. Выше уже об-суждалось, что гены 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK


сгруппированы в единый кластер и этоткластер генов повторяется тандемно многораз. В ядрышках эта группа из трех геновтранскрибируется РНК-полимеразой Iи дает 45S-PHK (рис. 29.30). Предшествен-ник длиной 13 kb подвергается фермента-тивной модификации и расщеплениюи дает зрелые 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK(рис. 29.31). Примерно 100 нуклеотидов ме-тилируется, и почти все - по 2'-гидроксиль-ной группе рибозных остатков. Высокоспе-цифические участки метилирования сохра-няются в рРНК таких эволюционно дале-ких эукариот, как дрожжи и плодоваямушка. Кроме того, более 100 остатковуридина изомеризуются в остатки псевдоу-ридина. Во время созревания происходитассоциация множества рибосомных белковс этими РНК и их предшественниками.Возможно, именно взаимодействие РНКс рибосомными белками делает опреде-ленные участки чувствительными к дей-ствию нуклеаз.

29.21. Информационные РНК избирательнообразуются из больших ядерныхпредшественников РНК(гетерогенной ядерной РНК, гяРНК)Образование рибосомных РНК у эукариотсходно с ее образованием у прокариот(разд. 25.17). В то же время между эука-риотическими и прокариотическими мРНКимеются существенные различия.1. Первичные транскрипты у эукариот неиспользуются непосредственно в качествемРНК. Прежде чем они переходят из ядрав цитозоль, они подвергаются процессингу.Трансляция и транскрипция у эукариотразобщены во времени и в пространстве,тогда как у прокариот они тесно сопря-жены.

2. Первичные транскрипты у эукариотимеют в длину от 2 до 20 kb, в связи с чемих называют гетерогенной ядерной РНК(гяРНК). Обычно эти первичные тран-скрипты в несколько раз длиннее, чеммРНК, которые из них получаются. Обра-зование эукариотических мРНК сопряженосо сплайсингом и расщеплением. До сихпор неизвестно, выполняет ли гяРНК ещекакую-нибудь роль, кроме того, что онаслужит предшественником мРНК.

3. Эукариотические мРНК содержат на5'-конце «колпачки» (кэпы), которые пред-ставляют собой модифицированные нуклео-тиды. Кроме того, большинство мРНК не-

Рис. 29.30. Если расправить молекулу 45S-предшественника рибосомнойРНК из клеток HeLa и исследо-вать ее с помощью электронно-го микроскопа, видна весьмахарактерная картина шпилеки петель. Благодаря этомуможно картировать располо-жение молекул 28S- и 18S-PHK,образующихся из этого пред-шественника. А - электроннаямикрофотография 45S-пред-шественника. Б - схематиче-ское изображение молекулы,изображенной на рис. А.[Wellauer P. К., Dawid I. В.,Proc. Nat. Acad. Sci., 70, 2828(1973).]

Рис. 29.31. Образование рибосомнойРНК млекопитающих из пер-вичного транскрипта. Спей-серные участки показаныжелтым.

сет на 3 -коние длинную poly(А)-последова-тельность.

4. Эукариотические мРНК моноци-стронны, т.е. они являются матрицами длясинтеза только одной полипептидной цепи.Многие прокариотические мРНК, наобо-рот, полицистронны (например, мРНК лак-тозного оперона - матрица для синтеза трехполипептидных цепей).

5. Популяция молекул мРНК эукариоти-ческой клетки зависит не только от скороститранскрипции определенных генов; в эука-риотических клетках имеется и еще одинуровень принятия решений; должен ли тотили иной первичный транскрипт подверг-нуться деградации или процессингу с обра-зованием зрелой мРНК и последующимтранспортом ее в цитозоль1.

29.22. На 5'-конце мРНК находятся«колпачки», а на 3'-конце, как правило,poly(А)-последовательности5'-конец всех известных эукариотическихмРНК (но не тРНК или рРНК) модифици-рован особым образом. К мРНК присоеди-нен 7-метилгуанилат необычной пирофос-фатной связью 5'—5' (рис. 29.32). Этахарактерная структура называется «колпач-ком». Она присоединяется к первичномутранскрипту. 5'-трифосфатный конец ново-образованной цепи гидролизуется до дифос-фата, и на него переносится остаток гуани-лата GTP. Затем N-7 этого концевогогуанина метилируется S-аденозилметиони-

] Следует указать еще одно важное отличиепрокариотических мРНК от эукариотических —время жизни. У прокариот оно составляет неболее нескольких минут, а у эукариот - десяткиминут или часы, а в исключительных случаяхнедели и месяцы.- Прим. перев.


Рис. 29.32. Структура «колпачков», распо-ложенных на 5'-конце эукарио-тических мРНК. Все «колпач-ки» содержат 7-метилгуанилат(изображен синим цветом),присоединенный пирофосфат-ной связью к 5'-концу. В «кол-пачке» 0 ни одна рибоза не ме-тилирована, в «колпачке»1 метилирована одна рибоза,в «колпачке» 2 - две.

ном и образуется так называемый «колпа-чок» 0. Соседние остатки рибозы могутбыть метилированы, при этом образуется«.колпачок» 1 или «колпачок» 2 (рис. 29.32).Эти «колпачки» способствуют стабилиза-ции мРНК, защищая их 5'-концы от фосфа-таз и нуклеаз. Кроме того, «колпачки» по-вышают эффективность трансляции мРНК


в эукариотических системах синтеза белка.Кроме того, большинство эукариотиче-

ских мРНК имеет на 3'-конце poly(А)-после-довательности. Роlу(А)-полимераза присое-диняет 150-200 нуклеотидов к первичномутранскрипту, на 3'-конце которого располо-жен динуклеотид GC, а на расстоянии при-мерно 20 нуклеотидов от него - последова-тельность A A U A A . Исследования раз-личных мРНК, введенных в яйца Xenopus,показали, что роlу(А)-фрагмент увеличи-вает стабильность мРНК, но при этом неимеет никакого значения для трансляции.Кроме того, отсутствие poly(А) на конце ги-стоновых мРНК показывает, что он не обя-зательно должен присутствовать в мРНКдля ее транспорта из ядра в цитозоль.

29.23. Ферменты сплайсинга с высокойточностью удаляют интроны из первичныхтранскриптов разорванных геновПри сплайсинге (расщепление с последую-щим сращиванием) мРНК происходит раз-рыв двух фосфодиэфирных связей и обра-зование одной новой. Эндонуклеазнаяи лигазная активности, вероятно, содержат-ся в одном ферментном комплексе, и после-довательные реакции сплайсинга согласо-ваны между собой. В настоящее времямногие лаборатории пытаются выделитьферменты сплайсинга. Очевидно, их дей-ствие должно обладать высокой точностью.Ошибка в точке сплайсинга на один нуклео-тид приведет к сдвигу рамки считыванияв сторону 3'-конца от этого места, что дастсовершенно иную последовательность ами-нокислот. Как ферменты сплайсинга узнаютсвои мишени? В настоящее время известенряд нуклеотидных последовательностейв месте стыка экзонов и интронов, кодирую-щих РНК-транскрипты (табл. 29.7). В этихпоследовательностях есть общий мотив: ин-трон начинается с GU и кончается AG. Сле-дует отметить, что один и тот же сигналсплайсинга встречается у кур, кроликов, мы-шей и в ДНК вируса SV-40, который зара-жает клетки обезьян и человека1.1 В последнее время получен ряд данных, свиде-тельствующих об участии т.н. низкомолеку-лярных ядерных РНК в сплайсинге, а такжев созревании 3'-концов РНК. Эта фракция РНКисследуется уже давно. Она весьма консерватив-на и содержит последовательности, комплемен-тарные участкам экзонов, прилежащим к интро-нам. Низкомолекулярные ядерные РНК, по-ви-димому, обеспечивают узнавание участковсплайсинга соответствующими ферментами. -Прим. перев.

Таблица 29.7. Последовательности оснований транскриптов, содержащих интроны, вблизи участков сплайсинга

Участок гена

Овальбумин, интрон 2

Овальбумин, интрон 3

β-Глобин, интрон 1

β-Глобин, интрон 2

Иммуноглобулин λ1, интрон 1

Ранний Т-антиген вируса SV-40

Экзон Интрон Экзон

В молекулах транспортной РНК точкисплайсинга окружены совершенно другимипоследовательностями. Из этого, очевидно,следует, что существует по крайней мере двафермента сплайсинга: один для образова-ния мРНК, другой - тРНК. Процесс сплай-синга тРНК, по-видимому, очень сходену эволюционно далеких видов. Клониро-ванные гены одной из дрожжевых тРНКвводили в ооциты Xenopus с помощью ми-кроинъекции для того, чтобы выяснить, мо-жет ли ген одноклеточного эукариота тран-скрибироваться, а его продукт - процессиро-ваться в клетке амфибии. Самое порази-тельное, что в клетке Xenopus происходяттранскрипция дрожжевого гена и пра-вильный процессинг его продукта, несмотряна то что гены этой тРНК у двух видов со-вершенно различны. В частности, 14-нуклео-тидная вставочная последовательность пра-вильно удаляется (рис. 29.33). Итак, специ-фичность ферментов сплайсинга сохрани-лась на протяжении огромного периодаэволюции.

29.24. В настоящее время известныпоследовательности оснований многихинформационных РНКМногие эукариотические мРНК были выде-лены в очищенном виде. У некоторых из нихбыла определена последовательность осно-ваний. Выделение какой-либо мРНК на-чинается с выбора клеток, в которых она со-держится в большом количестве. Например,ретикулоциты богаты глобиновой мРНК,яйцеводы кур - мРНК овальбумина, плаз-матические клетки - мРНК иммуноглобули-нов, эмбрионы морского ежа - мРНК гисто-

нов. Выделение мРНК начинается с получе-ния клеточного экстракта, из которогоудаляют белки и ДНК. Затем большуючасть мРНК отделяют oт других видовРНК, используя наличие в них poly(А)-фраг-ментов. Эти мРНК прочно связываютсяс колонками, содержащими ковалентно при-вязанные полинуклеотиды poly(U)и poly(Т). После элюции с такой аффиннойколонки мРНК ее можно фракционироватьпо размеру молекул методом гель-электро-фореза или седиментации. Другой способвыделения индивидуальной мРНК - иммуно-преципитация. Например, если добавитьв белоксинтезирующий экстракт антитела,специфичные к овальбумину, это переведетв осадок полисомы, содержащие овальбу-миновую мРНК. Для того чтобы проверитьпрепарат мРНК, его добавляют в бескле-точную систему синтеза белка, которая ра-ботает только в присутствии экзогеннойРНК. Для этого часто используются эк-стракты проростков пшеницы.

Наличие очищенных индивидуальныхмРНК открывает возможности для ряда ин-тересных экспериментов. Во-первых, с по-мощью метода гибридизации соответ-ствующей мРНК (или комплементарной ейДНК-копии) с хромосомной ДНК можноопределить число определенных генов в ге-номе. Во-вторых, можно идентифицироватьфрагменты ДНК, содержащие данный ген,гибридизуя их с мРНК. Затем эти фраг-менты можно клонировать (разд. 31.11),чтобы получить сам ген и прилегающиек нему участки хромосомы в большом коли-


Рис. 29.33. Процессинг предшественни-ка дрожжевой тирозиновойтРНК. Происходит удаление14-нуклеотидной вставочнойпоследовательности (показаножелтым цветом), и ряд основа-ний модифицируется. Продуктдлиной 92 нуклеотида полу-чается из первичного тран-скрипта длиной 108 нуклеоти-дов путем отщепления 5'-кон-цевой лидерной последова-тельности и присоединенияССА к 3'-концу.

честве. В-третьих, с помощью электронноймикроскопии можно выявить вставочныепоследовательности в этом гене (разд.26.12). В-четвертых, можно определить по-следовательность нуклеотидов мРНК,чтобы идентифицировать регуляторные сиг-налы.

Недавно была определена последователь-ность овальбуминовой мРНК. Эта мРНКсодержит 1859 нуклеотидов на участке от«колпачка» на 5'-конце до p o l y ( A ) на 3'-кон-


це (рис. 29.34). 1158 нуклеотидов, кодирую-щих белок, обрамлены с обеих сторон не-транслируемыми последовательностями.С 5'-стороны она короче, чем с 3'-стороны.Нетранслируемый 5'-концевой участок дли-ной 64 нуклеотида содержит «колпачок»,инициирующий кодон AUG, взаимодей-ствует с белоксинтезирующим аппаратоми участвует в инициации синтеза белка.Весьма многозначителен тот факт, что этотучасток содержит последовательность, ком-плементарную 3'-концу 18S-pPHK. Напом-ним, что у прокариот инициирующая после-довательность в мРНК спариваетсяс 3'-концом 16S-pPHK (разд. 27.14). Рольочень длинной нетранслируемой последова-тельности, расположенной с 3'-стороны, не-известна. Для этого участка длиной 637 ну-клеотидов характерно обилие короткихповторяющихся последовательностей.Фрагменту poly(А) в овальбуминовоймРНК, как и в других мРНК, предшествуетGC, а примерно за 20 нуклеотидов доэтого - AAUAAA.

29.25. Эукариотическая рибосома (80S)состоит из малой (40S) и большой (60S)субчастицАппарат синтеза белка у эукариот аналоги-чен соответствующему аппарату у прока-

Рис. 29.34. Схема организации овальбу-миновой мРНК курицы.

Рис. 29.35. Электронная микрофотогра-фия эукариотических 80S рибо-сом. (Печатается с любезногоразрешения д-ра MiloslavBoublik.)

риот, но составляющие его белки и РНК от-личаются от прокариотических и, крометого, они содержатся в большем количестве.Цитоплазматические рибосомы эукариоти-ческих клеток несколько крупнее, чем рибо-сомы бактерий. Эукариотические рибосомы(рис. 29.35) имеют коэффициент седимента-ции 80S, а не 70S. Подобно бактериальнымрибосомам, они диссоциируют на большую(60S) и малую (40S) субчастицы. 40S-субча-стица содержит молекулу 18S-PHK и при-мерно 30 белков. Остальные три рибо-сомные PHK - 5S, 5,8S и 28S - локализованыв 60S-субчастице, в которую входит такжепримерно 45 белков.

Стадии трансляции - инициация, элонга-ция и терминация - в основном сходны у эу-кариот и прокариот. Однако в некоторыхчастностях механизмы реакции различают-ся. Так, эукариоты используют для инициа-ции особую тРНК (она называетсяmPHKi

Met ), но она у них не формилируется.Эукариоты и прокариоты различаются так-же по чувствительности к некоторым инги-биторам трансляции. Циклогексимид инги-бирует элонгацию только у эукариот, тогдакак эритромицин блокирует эту же стадиютолько у прокариот. Любопытно отметить,что рибосомы митохондрий и хлоропластовимеют больше общего с бактериальными ри-босомами, чем с рибосомами окружающегоих цитозоля. Кроме того, в митохондрияхи хлоропластах используется формилиро-ванная инициаторная тРНК, а их рибосомычувствительны к большинству ингибиторов,избирательно блокирующих трансляциюу прокариот.

Рис. 29.36. Структура циклогексимида -ингибитора стадии элонгациисинтеза белка у эукариот, но неу прокариот.


29.26. Талассемия - генетически обуслов-ленное нарушение синтезагемоглобинаИзучение гемоглобина внесло большойвклад в наши представления о структуреи функции белка (гл. 4 и 5). Точно так же ис-следования, посвященные генам гемогло-бина и их выражению, оказались важнымисточником данных о функционированииэукариотических генов. В процессе внутри-утробного развития происходит замена эм-бриональных гемоглобинов гемоглобиномплода (HbF, α2γ2), а затем гемоглобиномвзрослого типа (НbА, α2β2). Кроме того, вовзрослом организме образуется небольшоеколичество гемоглобина НbА2, субъединич-ная структура которого α2δ2. Напомним,что HbF имеет более высокое сродствок кислороду, чем НbА, так как он менеепрочно связывает бисфосфоглицерат (разд.4.7). Это повышенное сродство к кислородублагоприятствует его переносу из кровенос-ной системы матери в кровеносную системуплода. В действительности HbF предста-вляет собой смесь двух разновидностей, од-на из которых содержит в положении 136γ-цепи глицин, а другая - аланин. Эти разно-видности обозначаются Gγ и Aγ соответ-ственно.

Все гены гемоглобина картированы. На

Рис. 29.37. Карта генов γ-, δ- и β-глобиначеловека.


гаплоидный геном приходится два тесносцепленных α-гена глобина. Эти гены у всехлюдей, за исключением редких мутантов,по-видимому, идентичны. Другие геныглобина сгруппированы в кластеры в другойхромосоме в следующем порядке:Gγ-Aγ-δ-β (рис. 29.37). Интересно былобы выяснить, почему эти функциональнородственные гены расположены рядом другс другом в одной хромосоме. Вполне воз-можно, что для переключения экспрессиис γ-генов на δ- и β-гены в ходе развития не-обходимо, чтобы они соседствовали. Не ис-ключено также, что сцепление этих генов от-ражает историю их эволюции. По всейвероятности, γ-, δ- и β-гены имеют общегопредка, который подвергся тандемным ду-пликациям и затем дивергировал.

Талассемии - группа наследственных ане-мий, при которых скорость синтеза одной изцепей гемоглобина понижена. Название бо-лезни «талассемия» происходит от греческо-го слова, обозначающего «море», так какболезнь широко распространена у выходцевиз Средиземноморья. Большая и малая та-лассемии наблюдаются у гомозиготныхи гетерозиготных больных соответственно.Буквенное обозначение α или β указывает,какая цепь синтезируется с пониженной ско-ростью. В настоящее время в результатеизучения глобиновой мРНК и клонирован-ной глобиновой ДНК начинает прояснятьсяпричина этих заболеваний. Установленымолекулярные механизмы некоторых видовталассемий.

1. Делеция гена. При некоторых видахα-талассемий делетированы один или обаα-глобиновых гена.

2. Нестабильность мРНК. В гемоглобинеConstant Spring α-цепь содержит 172 остаткавместо 141 из-за мутации, приводящей к за-мене стоп-кодона UAA в кодон глутаминаСАА. Трансляция участка, который в нормене является кодирующим, каким-то обра-зом делает мутантную мРНК чувствитель-ной к действию нуклеаз.

3. Нарушение инициации цепей. При неко-торых видах β-талассемии инициированиетрансляции происходит слишком медленно,что, возможно, объясняется дефектомв 5'-нетранслируемой области.

4. Преждевременная терминация цепи.Один из видов β-талассемии возникает в ре-зультате замены одного основания в кодонелизина AAG, приводящей к образованиюстоп-кодона UAG в 17-м положении.

Рис. 29.38. Каскад фосфорилирования,инактивирующий фактор ини-циации eIF-2.

5. Пониженное образование мРНК. Примногих видах β-талассемии, как оказалось,ген β-глобина имеется, но β-глобиновоймРНК образуется очень мало. В настоящеевремя причина этого явления интенсивноизучается. Не исключена возможность, чтопри некоторых видах β-талассемии не про-исходит правильного вырезания вставочныхпоследовательностей1.

29.27. Трансляция регулируется каскадомпротеинкиназ, инактивирующим один из фак-торов инициацииВ экстрактах ретикулоцитов происходитс высокой скоростью синтез субъединиц ге-моглобина до тех пор, пока не иссякает гем.В отсутствие гема синтез белка останавли-вается из-за быстрого образования фермен-тативного ингибитора белкового синтеза.Этим ингибитором является протеинкиназа.Мишенью для киназы служит eIF-2 - факторинициации, связывающий GTP и доста-вляющий Met-тРНКf к 40S-субчастицерибосомы2. Инактивация eIF-2 в результатефосфорилирования приводит к блокирова-

1 В случае так называемой β+-талассемии этооказалось именно так, причем единственное от-личие мутантного гена от гена дикого типа-за-мена одного-единственного нуклеотида в интро-не. - Прим. перев.2 Каскадный механизм регуляции, описанныйавтором и предложенный в лаборатории Очоа,оказался ошибочным. Хотя сАМР-зависимаяпротеинкиназа фосфорилирует многие белки.она не затрагивает eIF-2 и никак не влияет наактивность протеинкиназы в физиологическихусловиях. [Hunt Т., Phil. Trans. R. Soc. Lond.,В 302. 127-134 (1983).] - Прим. перев.

нию инициации синтеза белка. Каким жеобразом гем регулирует активность этойкиназы? Действие это опосредуется ещеодной киназой (рис. 29.38). Киназа eIF-2,модифицирующая фактор инициации, самасуществует в двух формах - неактивной де-фосфорилированной и активной фосфори-лированной. Фосфорилирование киназыeIF-2 катализируется зависимой от цикличе-ского AMP киназой, состоящей из двух ти-пов субъединиц - двух регуляторных (R)и двух каталитических (С). Неактивный ком-плекс R2C диссоциирует под действием ци-клического AMP на две каталитически ак-тивные С-субъединицы и две R-субъеди-ницы. Гем блокирует процесс диссоциации.и как следствие этого активации двух киназрегуляторной системы не происходит. В ре-зультате фактор eIF-2 не фосфорилируетсяи сохраняет свою активность в инициациибелкового синтеза. Этот каскад протеинки-наз напоминает регуляцию метаболизмагликогена (разд. 16.15). Эти процессы имеютеще и то общее, что в обоих случаях регуля-торное действие этих киназ обращается спе-цифическими фосфатазами.

29.28. Дифтерийный токсин блокируетсинтез белка у эукариот, ингибируятранслокациюДо появления эффективной иммунизациидифтерия была основной причиной детскойсмертности. Летальное действие этой болез-ни обусловлено главным образом токсиномCorynebacterium diphteriae - бактерии, разви-вающейся в верхних дыхательных путях.Структурный ген токсина локализован в ли-зогенизирующем фаге, который содержатнекоторые штаммы С. diphteriae. Несколько


микрограммов этого токсина с массой 61кДа обычно представляют собой летальнуюдозу для неиммунизированного человека,так как этой дозы достаточно для ингибиро-вания синтеза белка. Дифтерийный токсинблокирует стадию элонгации синтеза белкау эукариот, инактивируя фактор элонгации,необходимый для транслокации. Этот фак-тор, называемый фактором элонгации2 (EF-2) или транслоказой, выполняет у эу-кариот роль, аналогичную EF-G у бактерий.Транслоказа необходима для GTP-зависи-мого перемещения пептидил-тРНК изА-участка в Р-участок и одновременногоперемещения информационной РНК сразупосле образования пептидной связи. Осо-бенно интересен механизм инактивациитранслоказы дифтерийным токсином. Ток-син катализирует ковалентную модифика-цию транслоказы. При этом NAD+ служитдонором остатка аденозиндифосфатрибозы

(ADPR); в результате реакции высвобо-ждается никотинамид.

Молекула дифтерийного токсина состоитиз двух частей. Ее можно расщепить на двафрагмента - с массой 21 кДа (фрагмент А)и 40 кДа (фрагмент В). Домен В связываетсяс поверхностью чувствительных клеток,а домен А катализирует ADP-рибозилирова-ние транслоказы. Точнее, домен В связы-вается с ганглиозидом GM1 плазматическоймембраны, что позволяет каталитическомудомену проникнуть в клетку. При этом свя-занный токсин расщепляется, так что фраг-мент В остается на поверхности клетки,а гидрофильный фрагмент А переноситсяв цитозоль. Интересно отметить, что мно-гие другие токсины, например холерныйтоксин (разд. 35.7), также состоят из домена,предназначенного для связывания с поверх-ностью клетки, и каталитического домена,который инактивирует какой-либо важныйкомпонент клетки.


29.29. Рибосомы, связанные с эндоплаз-матическим ретикулумом, синтезируютсекреторные и мембранныебелкиВ эукариотических клетках некоторые рибо-сомы свободно плавают в цитозоле, тогдакак другие связаны с обширной системоймембран - эндоплазматическим ретикулу-мом (ЭР). Участки ЭР, связанные с рибосо-мами, называются шероховатым ЭР, таккак на электронных микрофотографиях онпокрыт бугорками (рис. 29.39), в отличие отгладкого ЭР, не содержащего рибосом.Клетки, секретирующие большое количе-ство белка, например ацинарные клеткиподжелудочной железы, имеют сильно раз-витый шероховатый ЭР. В общем все из-вестные секреторные белки синтезируютсясвязанными с ЭР рибосомами. Кроме того,рибосомы, связанные с этой мембранной си-стемой, синтезируют многие белки клеточ-ной мембраны и таких органелл, как лизо-сомы.

Связанные с мембранами рибосомы в оо-цитах ящериц, впавших в зимнюю спячку,образуют кристаллические слои (рис. 29.40).Эти упорядоченные слои изучаются в на-стоящее время методами реконструкциитрехмерного изображения. На карте низко-го разрешения видно, что и большая (60S),и малая (40S) субчастицы лежат вблизи по-верхности мембраны. На большой субча-

Рис. 29.39. Электронная микрофотогра-фия шероховатого эндоплаз-матического ретикулума. (Пе-чатается с любезного разреше-ния д-ра George Palade.)

Рис. 29.40. Электронная микрофотогра-фия кристаллических слоев,связанных с мембранами рибо-сом в ооцитах ящериц, впав-ших в зимнюю спячку. (Печа-тается с любезного разрешенияд-ра Nigel Unwin.)

Рис. 29.41. Связанная с мембраной рибо-сома. Это изображение низко-го разрешения получено мето-дом реконструкции на основеанализа ряда электронныхмикрофотографий упорядо-ченных рибосом, сделанныхпод различными углами. (Посхеме, любезно предоставлен-ной д-ром Nigel Unwin.)

стице имеется выступ, вдающийся в мем-брану (рис. 29.41). Шероховатый ЭР (вотличие от гладкого ЭР) содержит дватрансмембранных белка, называемых рибо-форинами, которые специфически взаимо-действуют с большой рибосомной субчасти-цей.

В связи с синтезом и дальнейшей судьбойбелков, образованных на рибосомах ЭР,возникают три основных вопроса.

1. Существует ли два класса рибосом -свободные рибосомы цитозоля и связанныес мембранами рибосомы - или все рибосомыпо сути одинаковы? Если существует толькоодин класс рибосом, чем определяется,остается ли данная рибосома свободной илисвязывается с шероховатым ЭР?

2. Каким образом новообразованная поли-пептидная цепь, выходящая из связаннойс мембраной рибосомы, преодолевает барьерпроницаемости шероховатого ЭР? Напри-мер, такие секреторные белки, как профер-менты поджелудочного сока (разд. 8.1),вскоре после синтеза обнаруживаются в по-лости ЭР.

3. Чем определяется судьба белка, синте-зированного на связанной с мембраной рибо-соме? Некоторые из этих белков экспорти-руются из клетки, тогда как другие предназ-начены для органелл внутри клетки. Крометого, белки синтезированные шероховатымЭР, обнаруживаются в качестве составнойчасти плазматической и внутриклеточныхмембран.

29.30. Сигнальные последовательностипозволяют секреторным белкам проходитьчерез мембрану эндоплазматическогоретикулумаИсследования белоксинтезирующей актив-ности рибосом в бесклеточных системах да-ли ответ на первый вопрос. Выделяли сво-бодные рибосомы из цитозоля и добавлялиих к препарату мембран шероховатого ЭР,с которых были удалены рибосомы. Эта ре-конструированная система в присутствиисоответствующих мРНК и других раство-римых факторов активно синтезировала се-креторные белки. Точно так же рибосомы,полученные из препарата шероховатого ЭР,проявляли нормальную активность при син-тезе белков, которые остаются в цитозоле.Кроме того, никаких структурных различиймежду свободными рибосомами и рибосо-


Рис. 29.42. Гипотеза сигнальной последо-вательности, образующейсяпри биосинтезе секреторныхи мембранных белков. Соглас-но этой гипотезе, N-концеваяпоследовательность новообра-зованной полипептидной цепи(показана красным) привязы-вает рибосому к мембране ЭР.Затем сигнальная последова-тельность удаляется пептида-зой, расположенной на вну-тренней стороне ЭР. (Blobel G.In: International Cell Biology,Brinkley B. R., Porter K. R., eds.,Rockefeller Univ. Press, N. Y.,1977, p. 318.)

мами, полученными из шероховатого ЭР, необнаруживалось. Следовательно, связанныес мембранами рибосомы и свободные рибо-сомы, по сути, одинаковы. Остается ли дан-ная рибосома свободной или прикрепляетсяк шероховатому ЭР, определяется толькоприродой белка, который она синтезирует.

Какая же особенность синтезирующегосябелка определяет, плавает ли ассоциирован-ная с ним рибосома свободно в цитозолеили связывается с мембраной ЭР? В 1970 г.Дэвид Сабатини и Гюнтер Блобел (DavidSabatini, Gunter Blobel) постулировали, чтосигналом прикрепления служит последова-тельность аминокислотных остатков, при-легающая к N-концу новообразующейся по-липептидной цепи. Вскоре эта гипотеза сиг-нальной последовательности (рис. 29.42) на-


шла подтверждение в работах Сезара Мил-стайна и Джорджа Браунли (Cesar Milstein,George Brownlee), показавших, что иммуно-глобулиновая цепь, синтезированная in vitroсвободными рибосомами, содержит N-кон-цевую последовательность из 20 остатков,которой нет в зрелом белке, синтезирован-ном in vivo. Затем Блобел обнаружил, чтовсе основные секреторные белки поджелу-дочной железы, синтезированные in vitro насвободных рибосомах, содержат на N-концедополнительные фрагменты длиной околодвадцати аминокислот. В настоящее времясигнальные последовательности многих се-креторных белков расшифрованы. Ониимеют длину от 15 до 30 остатков и содер-жат много неполярных аминокислот(рис. 29.43).

Гидрофобные сигнальные последователь-ности, видимо, принимают конформации,которые узнаются белками мембраны ЭР,образующими каналы. По всей вероятно-

Рис. 29.43. Сигнальные последовательно-сти двух секреторных белков.Гидрофобные остатки отме-чены желтым. Место расще-пления указано красной чер-той.

Сокращения, принятые для обозначения сахаров:Fuc - фукозаGal - галактозаGlc - глюкозаGlcNAc - N-ацетилглюкозаминМаn - маннозаNAN - N-ацетилнейраминидат (сиаловая кислота)

сти, новообразующиеся полипептидные цепиактивно протягиваются через канал в ЭР помере синтеза. Затем особая пептидаза отше-пляет сигнальные последовательности навнутренней стороне ЭР (см. рис. 29.42). Но-вообразующиеся цепи, которые должныстать составной частью мембраны, по-види-мому, содержат специальные последова-тельности, блокирующие перенос полипеп-тида через мембрану ЭР до тех пор, покасинтез не доходит до С-конца. В случае жесекреторных белков, наоборот, через мем-брану ЭР транспортируется вся полипеп-тидная цепь.

Главная особенность механизма сиг-нальных последовательностей состоитв том, что перенос полипептида через мем-брану ЭР сопряжен с трансляцией. Однаконекоторые белки могут пересекать мембра-ну уже после того, как их синтез завершен.Например, белки митохондрий и хлоропла-стов в большинстве своем кодируютсяядерными генами и синтезируются па сво-бодных рибосомах. Эти белки выходят в ци-тозоль и затем проходят через мембрануорганеллы. Очевидно, транспорт этих бел-ков происходит посттрансляционно, а не вовремя трансляции. Интересно отметить, чтоэти митохондриальные и хлоропластныебелки, подобно секреторным белкам, содер-жат N-концевые последовательности, ко-торые удаляются вскоре после их проникно-вения через мембрану.

29.31. Присоединение сахарных остатков«ядра» к гликопротеинам происходитв эндоплазматическом ретикулумепри участии донора долихолаПочти ко всем белкам, синтезированнымрибосомами, связанными с ЭР, присоеди-няются ковалентно связанные углеводныеостатки. Растворимые белки, синтези-руемые свободными рибосомами в цитозо-ле, наоборот, почти никогда не связаныс углеводами. Как уже упоминалось (разд.10.12), остатки сахара, очевидно, ориенти-руют гликопротеины в мембранах. Крометого, углеводные группы могут в какой-то

степени предопределять судьбу гликопроте-ина. Обычно гликопротеин содержит однуили несколько олигосахаридных групп, при-соединенных к аспарагиновым боковым це-пям N-гликозидными связями. Реже сахараприкрепляются к сериновым или треони-новым боковым цепям О-гликозиднымисвязями. Непосредственно с остатками ас-парагина всегда связан N-ацетилглюкоза-мин, тогда как к серину и треонину присое-диняется N-ацетилгалактозамин.

В гликопротеинах встречаются самыеразнообразные олигосахариды (рис. 29.44).Однако в основе этого разнообразия лежитобщий план строения: углеводные остатки,


присоединенные к остаткам аспарагина (че-рез атом азота), имеют общее внутреннееолигосахаридное «ядро». Этот повторяю-щийся мотив отражает способ биосинтезаолигосахаридной части гликопротеинов: об-щий олигосахаридный блок (рис. 29.45) пере-носится с активирующего липидного перено-счика на растущую полипептидную цепь на

Рис. 29.44. Структура олигосахаридногоостатка, связанного с аспараги-ном в человеческом иммуно-глобулине (А) и в тиреоглобу-лине свиньи (Б).

Рис. 29.45. Структура активированногоолигосахаридного «ядра» (по-казано синим цветом). Перено-счик (показан желтым цве-том) - долихолфосфат (Дх).


внутренней стороне мембраны ЭР. Перенос-чиком служит долихолфосфат - липидс очень длинной цепью, содержащий околодвадцати изопреновых (С5) остатков.Концевая фосфатная группа этого весьмагидрофобного переносчика - место при-крепления активированного олигосахарида.

К долихолфосфату присоединяется оли-госахаридный блок, состоящий из двухостатков N-ацетилглюкозамина, девятиманноз и трех глюкоз. Его образование идетпутем последовательного присоединениямоносахаридов (рис. 29.46).

Активированные доноры сахаров в этих ре-акциях - производные UDP, GDP и долихо-ла. Ряд специфических трансфераз катализи-рует синтез активированного олигосахарид-ного «ядра». Затем оно переносится цели-ком на определенный остаток аспарагинарастущей полипептидной цепи. Активиро-ванный олигосахарид и специфическая

трансфераза расположены на внутреннейстороне ЭР. Об этом свидетельствует тотфакт, что белки в цитозоле не гликозилиро-ваны. Олигосахарид может быть присоеди-нен только к такому аспарагину, которыйвходит в последовательность Asn-X-Ser илиAsn-X-Thr. В большинстве случаев два изтрех остатков глюкозы присоединенногоолигосахарида быстро удаляются, когдагликопротеин еще связан с ЭР.

При переносе олигосахарида на белок вы-свобождается долихолпирофосфат, ко-торый под действием фосфатазы снова пре-вращается в долихолфосфат. Это превраще-ние блокируется антибиотиком бацитраци-ном (разд. 32.6). Еще один интересныйантибиотик-ингибитор - туникамицин, ги-дрофобный аналог UDP-N-ацетилглюко-замина. Туникамицин блокирует первыйэтап образования олигосахаридного«ядра» - присоединение N-ацетилглюкоза-мина к долихолфосфату.

29.32. Модификация и сортировкагликопротеинов происходит в аппаратеГольджиБелки, находящиеся во внутреннем про-странстве ЭР и в его мембране, переносятсяв аппарат Гольджи - стопку уплощенныхмембранных мешков (рис. 29.47). В этой ор-ганелле олигосахаридное «ядро» гликопро-теинов удаляется и к ним присоединяютсяновые сахара. Кроме того, аппарат Гольджисортирует и упаковывает гликопротеиныдля транспортировки в другие участки клет-ки. Гликопротеины доставляются из ЭРк выпуклой поверхности аппарата Гольджив пузырьках диаметром 500 А, окруженныхоболочкой, покрытой чем-то вроде щетинок(рис. 29.48). Эта оболочка представляет со-бой многогранную решетчатую структуру,состоящую из субъединиц клатрина массой180 кДа (рис. 29.49). Эти так называемыеокаймленные пузырьки отпочковываются отЭР и затем сливаются с аппаратом Гольд-жи. Кроме того, они переносят мембранныебелки от вогнутой поверхности аппаратаГольджи в лизосомы, к плазматическоймембране и в другие участки клетки. К томуже окаймленные пузырьки переносят белкии липиды от плазматической мембранык внутренним мембранам. Таким образом,клатрин играет ключевую роль в переносефрагментов мембраны в пределах клетки.Важно отметить, что во время этих процес-сов переноса асимметрия мембран сохра-няется. Внутренняя поверхность мембраны

Рис. 29.46. Активированное олигосаха-ридное ядро синтезируется пу-тем последовательного при-соединения отдельных остат-ков сахаров. Затем весь блокпереносится на боковую цепьопределенного остатка аспа-рагина новообразованногобелка во внутреннем простран-стве ЭР.

окаймленного пузырька и аппарата Гольд-жи соответствует внутренней стороне мем-браны ЭР. Когда окаймленные пузырькисливаются с плазматической мембраной, ихвнутренняя поверхность становится наруж-ной поверхностью плазматической мем-браны. Следовательно, внутренние поверх-


Рис. 29.47. Электронная микрофотогра-фия (вверху) и схематическоеизображение (внизу) аппаратаГольджи. В этой органеллепроисходит модификация,сортировка и упаковка глико-протеинов. (Электронная ми-крофотография печатаетсяс любезного разрешения д-раLynne Mercer.)

ности мембраны ЭР и других органеллсоответствуют наружной поверхности плаз-матической мембраны (рис. 29.50). По этойпричине углеводные группы гликопротеи-нов плазматической мембраны всегда рас-положены на ее наружной поверхности(разд. 10.12).

В аппарате Гольджи происходит пере-стройка олигосахаридных групп гликопро-теинов. Единственная оставшаяся глюкозаи несколько оставшихся манноз олигосаха-ридного «ядра» удаляются. На этом форми-рование углеводных остатков некоторыхгликопротеинов заканчивается. Болеесложные олигосахариды других гликопро-теинов образуются путем последовательно-го присоединения сахаров к остаткам


Рис. 29.48. Электронная микрофотогра-фия окаймленных пузырьков(вверху). Схема окаймленногопузырька. (Печатается с любез-ного разрешения д-ра BarbaraPearse.)

Рис. 29.49. Изображение реконструиро-ванного окаймленного пузырь-ка. Оно получено наложениеммногих электронных микрофо-тографий. [Woodwart M, Р.,Roth Т. F., J. Supramol. Struc-ture, 11, 240 (1979).]

Рис. 29.50. Асимметрия клеточных мем-бран. Внутренние поверхностиЭР и других органелл соответ-ствуют наружной поверхностиплазматической мембраны.

«ядра». Например, в качестве активиро-ванных доноров при синтезе концевого три-сахаридного остатка, обнаруженного в не-которых гликопротеинах, выступают UDP-N-ацетилглюкозамин, UDP-галактозаи СМР-нейраминидат (рис. 29.51). Этот по-следний этап биосинтеза, протекающийв аппарате Гольджи, получил названиеокончательного гликозилирования - в отли-чие от гликозилирования олигосахаридного«ядра», которое происходит в ЭР.

Как происходит сортировка гликопротеи-нов в аппарате Гольджи? Каким путем онидоставляются в места назначения? Ответана эти интригующие вопросы пока нет, ноключом к пониманию проблемы может по-служить болезнь I-клеток (ее также назы-вают муколипидозом II). Это нарушениефункции лизосом наследуется как ауто-сомный рецессивный признак и характери-зуется сильной задержкой психомоторногоразвития и деформацией скелета. Лизосомыв соединительных тканях больных содержаткрупные включения (название болезни про-исходит от англ. inclusion - включение) непе-реваренных гликозаминогликанов и глико-липидов. Наличие этих включений обусло-влено отсутствием в лизосомах больных поменьшей мере восьми ферментов, необхо-димых для их расщепления. В то же времяогромные количества этих ферментов обна-руживаются в моче и крови больных. Следо-вательно, синтез активных ферментов приболезни I-клеток происходит, но вместо то-

го, чтобы запасаться в лизосомах, они экс-портируются из клетки. Другими словами.при болезни I-клеток целый ряд ферментовлокализуется в неправильном месте. Этиферменты не содержат маннозо-6-фосфата,который обычно с ними связан. Следова-тельно, маннозо-6-фосфат, по всей вероят-ности, представляет собой маркер, напра-вляющий в норме многие гидролитическиеферменты из аппарата Гольджи в лизосомы.Интересно выяснить, участвуют ли угле-водные остатки других гликопротеиновв регуляции внутриклеточных передвиже-ний.

ЗаключениеЭукариотическая хромосома содержит однумолекулу двухспиральной ДНК, которая покрайней мере в 100 раз длиннее, чем моле-кулы ДНК в клетках прокариот. ДНК проч-но связана с основными белками, которыеназываются гистонами. Хроматиновая нитьпредставляет собой гибкую цепь нуклеосом.«Ядро» этого повторяющегося элемента(минимальная нуклеосома, кор) содержитфрагмент ДНК длиной 140 пар оснований,накрученный на октамер гистонов, в составкоторого входят по две молекулы гистоновН2А, Н2В, Н3 и Н4. Минимальные нуклео-сомы соединены между собой линкернойДНК, длина которой обычно составляет 60пар оснований, связанной с одной молеку-лой гистона H1. Благодаря нуклеосомамДНК может укорачиваться в семь раз.Это - первый уровень конденсации ДНК.Эукариотическая ДНК реплицируется полу-консервативным путем и наполовину не-прерывно (т.е. получает по одной из роди-тельских цепей), причем репликация на-


Рис. 29.51. Завершающая стадия синтезасодержащего нейраминидатуглеводного остатка гликопро-теина (трансферрина человека).Эта реакция происходит в ап-парате Гольджи.

чинается в нескольких тысячах мест. Боль-шое число точек инициации обусловленоогромной длиной эукариотической ДНК посравнению с прокариотической.

Кинетика реассоциации денатурирован-ной нагреванием ДНК показывает, что эука-риотическая ДНК в отличие от прокариоти-ческой содержит много повторяющихсяпоследовательностей оснований. ДНК


с большим числом повторов (сателлитнаяДНК) обычно расположена вблизи от цен-тромер. Некоторые сателлитные ДНК пред-ставляют собой гептануклеотидную после-довательность, повторенную более 104 раз.Другая фракция ДНК с умеренным числомповторов. В геноме многих эукариот генырибосомных РНК и гистонов присутствуютв количестве десятков или сотен копий.Большая часть ДНК с умеренным числомповторов играет, по-видимому, какую-торегуляторную роль. Третья фракция - уни-кальная ДНК. Она состоит из последова-тельностей, которые встречаются в га-плоидном геноме только один или несколь-ко раз. Многие из таких белков, какфиброин шелка, гемоглобин и овальбумин,кодируются уникальными генами. Эти геныдают большие количества стабильноймРНК. Уникальные последовательностиобычно перемежаются с умеренно повто-ряющимися последовательностями. Крометого, для высших эукариот характерно на-личие вставочных последовательностей вомногих генах, кодирующих белки.

РНК в эукариотических клетках синтези-руется тремя типами РНК-полимераз. Пер-вичные транскрипты претерпевают суще-ственные изменения, прежде чем они перей-дут из ядра в цитозоль в виде зрелыхмолекул рРНК, тРНК и мРНК. Информа-ционные РНК получаются из гораздо болеедлинных первичных транскриптов (гяРНК)путем расщепления и воссоединения фраг-ментов. Эукариотическая информационнаяРНК имеет на 5'-конце «колпачок» и на3'-конце обычно длинную роlу(А)-последо-вательность. Единственный транслируемыйучасток мРНК обрамлен некодирующимипоследовательностями, иногда оченьдлинными. Набор мРНК в эукариотическойклетке зависит от избирательного процес-синга первичных транскриптов, а также отскорости транскрипции различных генов.Регуляция на уровне трансляции, по-види-мому, играет менее важную роль при детер-минировании набора белков, синтези-руемых каждой данной клеткой. 80S-рибо-сома эукариот состоит из 60S- и 40S-субча-стиц. Как и у прокариот, у эукариот имеетсяособая инициаторная тРНК, но она не фор-милирована. Инициация у эукариот регули-руется каскадом протеинкиназ, инактиви-рующих один из факторов инициации(eIF-2). Митохондрии и хлоропласты содер-жат собственную ДНК, которая не связанас гистонами. Синтез белка в этих органел-

лах напоминает синтез белка у бактерий.Секреторные и мембранные белки синте-

зируются рибосомами, связанными с эндо-плазматическим ретикулумом. Многие изэтих белков содержат сильно гидрофобнуюN-концевую последовательность, котораяслужит сигналом для прикрепления рибо-сомы к мембране ЭР. Затем синтезирую-щаяся полипептидная цепь активно протя-гивается через мембрану ЭР, а сигнальнаяпоследовательность отщепляется на вну-тренней стороне. Почти ко всем белкам,синтезированным на связанных с мембрана-ми полисомах, ковалентно присоединяетсяодин или несколько углеводных остатков.В ЭР происходит перенос универсальногоолигосахаридного блока с активированногодонора долихола на специфическую аспара-гиновую боковую цепь. Гликопротеиныпереносятся из ЭР в аппарат Гольджив окаймленных пузырьках. Эти пузырьки,покрытые клатрином, участвуют во многихпроцессах обмена между мембраннымиструктурами. В аппарате Гольджи происхо-дит укорачивание и окончательное гликози-лирование олигосахаридных остатков. Кро-ме того, здесь гликопротеины сортируютсяи отправляются по назначению. Угле-водные остатки, по-видимому, играют важ-ную роль в этом процессе сортировки.

Рис. 29.52. Электронная микрофотогра-фия окаймленных пузырьков,лежащих на плазматическоймембране клетки. (Печатаетсяс любезного разрешения д-раJohn Heuser.)


С чего начатьCrick F., 1979. Split genes and RNAsplicing, Science, 204, 264-271.DeRobertis E.M., Gurdon J.B., 1979.Gene transplantation and the analysisof development, Sci. Amer., 241(6),74-82.Beerman W., Clever U., 1974.Chromosomal puffs, Sci. Amer., 210(4),50-58.Palade G., 1975. Intracellular aspects ofthe process of protein synthesis. Science,189, 347-358. (Доступная и весьма ин-формативная Нобелевская лекция.)Rothman J.E., Lodish H.F., 1979. Theassembly of cell membranes, Sci. Amer.,240(1), 48-63. (Превосходное обсу-ждение проблемы асимметрии мем-бран.)

ХроматинCold Spring harbor Symposia, 1978.Chromatin, Cold Spring HarborSymposia on Quantitative Biology,vol. 42.

McGhee J.D., Felsenfeld G., 1980.Nucleosome structure, Ann. Rev.Biochem., 49, 1115-1155.Kornberg R.D., 1977. Structure ofchromatin, Ann. Rev. Biochem., 46,931-954.Kornberg R.D., 1974. Chromatin struc-ture: a repeating unit of histones andDNA, Science, 184, 868-871.Sperling R., Wachtel E.J. The histones,Advan. Protein Chem., in press.

Репликация ДНКKornberg A., 1980. DNA Replication,Freeman. (В гл. 6 идет речь об эука-риотической ДНК-полимеразе и о ре-пликации у эукариот.)DePamphilis M.L., Wassarman P.M.,1980. Replication of eucaryoticchromosomes: a close-up of thereplication fork, Ann. Rev. Biochem., 49,627-666.Kriegstein H.J., Hogness D.S., 1974.The mechanism of DNA replication in

Drosophila chromosomes: structure ofreplication forks and evidence forbidirectionality, Proc. Nat. Acad. Sci.,71, 135-139.

Организация геномаBritten R., Kohn D., 1968. Repeatedsegments of DNA, Sci. Amer., 222(4),24-31.Davidson E.H., Britten R.J., 1979.Regulation of gene expression: possiblerole of repetitive sequences, Science,204, 1052-1059.Long E.O., Dawid I.B., 1980. Repeatedgenes in eucaryotes, Ann. Rev. Bio-chem., 49, 727-766.Schimke R.Т., Kaufman R.J., Alt F.W.,Kellems R.F., 1978. Gene amplificationand drug resistance in cultured murinecells, Science, 202, 1051-1055.Kedes L.H., 1979. Histone genes andhistone messengers, Ann. Rev. Bio-chem., 48, 837-870.Tzagoloff A., Macino G., Sebald W.,1979. Mitochondrial genes and


translation products, Ann. Rev. Bio-chem., 48, 419-441.

Разорванные гены, транскрипциян процессннг РНКDarnell J.E., Jr., 1979. Transcriptionunits for mRNA production ineukaryotic cells and their DNA viruses,Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 22,327-353.Abelson J., 1979. RNA processing andthe intervening sequence problem, Ann,Rev. Biochem., 48, 1035-1069.Royal A., Garapin A., Cami В.,Perrin F., Mandel J.L., LeMeur M.,Bregegegre F., Gannon F., LePen-nec J.P., Chambon P., Kourilsky P.,1979, The ovalbumin gene region:common features in the organisation ofthree genes expressed in chicken oviductunder hormonal control, Nature, 279,438-445.DeRobertis E.M., Olson M.V., 1979.Transcription and processing of clonedyeast tyrosine tRNA genesmicroinjected into frog oocytes, Nature,278, 137 143.Shatkin A.J. , 1976. Capping ofcucaryotic mRNAs, Cell, 9, 645 653.

ТрансляцияWool I.G., 1979, Structure and functionof eukaryotic ribosomes, Ann. Rev,Biochem., 48, 719-754.

Revel M., Groner Y., 1978. Post-transcriptional and translationalcontrols of gene expression ineukaryotes, Ann. Rev. Biochem., 47,1079-1126.Parrenheimer A.M., Jr., 1977. Diph-theria toxin, Ann. Rev. Biochem., 46,69-94.

Гены гемоглобина и талассемияWeatherall D.J., Clegg J.B., 1979.Recent developments in the moleculargenetics of human hemoglobin, Cell, 12,467-479,Leder A., Miller H.I., Hamer D.H.,Seidman J.G., Norman B., Sullivan M.,Leder P., 1978. Comparison of clonedmouse α- and β-globin genes:conservation of intervening sequencelocations and extragenic homology,Proc. Nat, Acad. Sci., 75, 6187-6191.Weatherall D.J., 1978. Thethalassemias. In: Stanbury J.В.,Wyngaarden J.B. and Fredrickson D.S.(eds.), The Metabolic Basis of InheritedDisease (4th ed.), pp. 1508-1523,McGraw-Hill

Синтез мембранных белков и секрети-руемые белкиBlobel G., Walter P., Chang G.N.,Goldman B.M., Erickson A . H . , Lin-gappa V.R., 1979. Translocation ofproteins across membranes; the signal

hypothesis and beyond, Symp. Soc. Exp.Biol., 33, 9-36.Unwin P. N. Т., 1977. Three-dimensional model of membrane-boundribosomes obtained by electronmicroscopy, Nature, 269, 118-122.Rothman J .E. , Lodish H.F., 1977.Synchronised transmembrane insertionand glycosylation of a nascentmembrane protein. Nature 269,775-780.Waechter С.J., Lennartz W.J., 1976.The role of polyprenol-linked sugars inglycoprotein synthesis, Ann, Rev.Biochem., 45, 95-112.Kornfeld R., Kornfeld S., 1976.Comparative aspects of glycoproteinstructure, Ann, Rev, Biochem., 45,217-237.Robbins P.W., Hubbard S.C., TurcoS.J., Winh D . F . , 1977. Proposal for

a common oligosaccharide intermediatein the synthesis of membraneglycoproteins, Cell, 12, 893-900,Pearse B.M.F., 1980, Coated vesicles,Trends Biochem, Sci., 5, 131-134,(Краткий обзор о структуре и функ-ции клатрина.)Rothman J.E., Fine R.E., 1980. Coatedvesicles transport newly synthesizedmembrane glycoproteins fromendoplasmic reticulum to plasmamembrane in two successive stages,Proc. Nat. Acad, Sci., 77, 780-784

ГЛАВА 30ВирусыВирусы представляют собой инфекционныенуклеиновые кислоты, упакованные в за-щитную оболочку. Это - наиболее эффек-тивные из внутриклеточных паразитов.В отличие от клеток вирусы не способны вы-рабатывать энергию с помощью метаболи-ческих реакций или синтезировать белки.Они отличаются от клеток и тем, что содер-жат только ДНК или только РНК, но никог-да не содержат и то и другое одновременно.Одни вирусы содержат одноцепочечную ну-клеиновую кислоту, другие - двухцепочеч-ную. По сложности строения вирусы широ-ко варьируют - от фага Qβ - PHK-содержа-щего фага, имеющего всего 4 гена,- довируса оспы, геном которого насчитываетпримерно 250 генов. Готовый внеклеточныйпродукт размножения вируса называется ви-рионом (или вирусной частицей). Нуклеино-вая кислота, входящая в состав вариона,одета белковым капсидом, защищающим ееот ферментативного расщепления и механи-ческих повреждений. Именно капсид обеспе-чивает внедрение нуклеиновой кислотыв клетки чувствительной клетки-хозяина.У некоторых более сложно устроенных ви-русов животных капсид окружен оболочкой,содержащей липид и гликопротеин.

Мы уже видели, что изучение вирусов ока-зало глубокое воздействие на развитие мо-лекулярной биологии. В качестве примераможно привести открытие информационнойРНК. Неослабевающий интерес исследова-телей к вирусам объясняется несколькимипричинами. Во-первых, размножение виру-са - модель развития клетки, так как оно со-провождается последовательным выраже-нием генов и сборкой макромолекулв весьма упорядоченные структуры. Отно-сительно небольшое число вирусных генов,высокая скорость репликации и легкость ге-нетического анализа также делают вирусы

весьма привлекательной моделью. Во-вторых, вирусы - источник представленийоб эволюционных процессах и молекулярныхаспектах взаимоотношений хозяин-пара-зит. В третьих, некоторые вирусы вызываюту экспериментальных животных рак. Ин-тенсивно изучается и возможная роль виру-сов в раковых заболеваниях человека.

30.1 Оболочка мелких вирусов состоит измножества идентичных белковых субъединицОбщее число аминокислот в оболочке виру-са всегда превосходит число нуклеотидовв его геноме. Например, белковая оболочка

Таблица 30.1. Типы вирусов (Davis В.D., Eisen H.N.,Ginsberg H.S., Wood W.B., Jr., Microbiology, Harper andRow., 1973)

Нуклеиноваякислота

Одноцепочечнаяднк

Двухцепочечнаяднк

ОднопепочечнаяРНК

ДвухцепочечнаяРНК

Представитель

Фаг φХ174

Вирус полиомы

Аденовирус 2Фаг Т4Вирус коровьей ос-пы

Фаг QβВирус саркомы Рау-саВирус табачной мо-заикиВирус полиомиели-таВирус гриппа

Реовирус

При-мерноечислогенов

5

6

30150240

34

6

8

12

22

30. Вирусы 167

Рис. 30.1. Электронная микрофотогра-фия вирионов Т4 в зараженныхклетках. (Печатается с любез-ного разрешения д-ра JonathanKing, д-ра Yoshiko Kikuchiи д-ра Elaine Lenk.)

одной частицы вируса табачной мозаики(ВТМ; рис. 30.2) содержит около 340000аминокислотных остатков, а его РНК - все-го 6400 нуклеотидов. В 1957 г. Френсис Крики Джеймс Уотсон (Francis Crick, JamesWatson) обратили внимание на то, что бел-ковая оболочка вируса не может состоять изодной большой молекулы или набора мно-жества различных мелких белков, так какколичество вирусной нуклеиновой кислотыслишком мало, чтобы кодировать такоеогромное число аминокислотных остатков.С другой стороны, белковую оболочку нель-зя уменьшить в размере, так как она должназакрывать всю нуклеиновую кислоту. Ви-русы решают эту задачу генетической бед-ности, образуя оболочку из большого числабелковых субъединиц одного или нескольких


видов. Например, оболочка ВТМ состоит из2130 идентичных субъединиц (каждая дли-ной 158 остатков).

Число способов построения вируснойоболочки из идентичных субъединиц весьмаограниченно. Стабильность достигается пу-тем образования максимального числа свя-зей и использования одинаковых контактовмежду субъединицами. Образующаясяструктура должна быть симметричной. На-иболее вероятны два способа укладки бел-ковой оболочки: цилиндрическая оболочка,обладающая спиральной симметрией, и сфе-рическая оболочка, обладающая икосаэдри-ческой симметрией (рис. 30.3). По существу,все мелкие вирусы представляют собой па-лочки или сферические частицы (или сочета-ние этих двух форм). Правила, определяю-щие структуру сферических вирусов, сфор-мулировали Дональд Каспар и Арон Круг(Donald Caspar, Aaron Klug). Толчком длявдохновения им послужили архитектурныепроекты Бакминстера Фуллера (BuckminsterFuller).

30.2. Самосборка вируса табачной мозаики(ВТМ)Самый простой и лучше всего изученныйпроцесс сборки вируса - сборка ВТМ. Этот

Рис. 30.2. Электронная микрофотогра-фия частицы вируса табачноймозаики (ВТМ). (Печатаетсяс любезного разрешения д-раRobley Williams.)

Рис. 30.3. Модель икосаэдра.

палочковидный вирус имеет длину 3000 А,диаметр 180 А (рис. 30.4) и массу примерно40000 кДа. 2130 идентичных субъединицбелка оболочки плотно упакованы в спи-раль вокруг одноцепочечной РНК, содержа-щей 6390 нуклеотидов. РНК глубоко погру-жена в белок, что делает ее неуязвимой длярибонуклеаз. Каждая белковая субъединицавзаимодействует с тремя нуклеотидами. От-делившись от белкового капсида, РНК весь-ма лабильна, тогда как интактный ВТМ со-храняет инфекционность десятилетиями.

Субъединицы ВТМ не связаны между со-бой ковалентно. Можно вызвать диссоциа-цию ВТМ на белок и РНК с помощью, на-пример, концентрированной уксусной кис-лоты. В 1955 г. Хайнц Френкель-Конрати Робли Уильяме (Heinz Fraenkel-Conrat,Robley Williams) показали, что в соответ-ствующих условиях диссоциированные субъе-диницы оболочки и РНК ВТМ спонтанно ре-ассоциируют и образуют вирусные частицы,неотличимые от исходного ВТМ по струк-туре и инфекционности. Это был первыйпример самосборки активной биологиче-ской структуры. Процесс самосборки - этотакой процесс, при котором в подходящихусловиях среды происходит спонтанная ас-социация компонентов и образуется специ-фическая структура.

30.3. При сборке вирусной частицы ВТМбелковые диски присоединяютсяк петле РНКA priori простейший механизм сборки ВТМзаключался бы в ступенчатом присоедине-нии отдельных белковых субъединицк РНК. Трудность, однако, состоит в этомслучае в том, что скорость нуклеации будетчрезвычайно мала. Прежде чем комплекс за-мкнется сам на себя, образовав один оборот

спирали, и таким образом стабилизируется,к гибкой молекуле РНК должно присоеди-ниться примерно 17 субъединиц оболочки.Эта проблема может быть решена присое-динением к РНК сразу целого комплекса измногих субъединиц. Действительно, белокоболочки легко образует двухслойный дискиз 34 субъединиц. Каждый слой диска пред-ставляет собой кольцо из 17 субъединиц;примерно столько субъединиц (16 1/3) при-ходится на один оборот спирали ВТМ. Клуги его сотрудники исследовали трехмернуюструктуру диска (рис. 30.5) и показали, чтоон представляет собой главный промежу-точный продукт при сборке ВТМ. Важней-шее свойство диска состоит в том, что егосубъединицы скользят относительно другдруга и образуют спираль их двух оборотов,так называемую «запорную шайбу»(рис. 30.6).

Диск гораздо быстрее взаимодействуетс РНК ВТМ, чем с чужеродной ДНК. Следо-вательно, РНК ВТМ, по-видимому, содер-жит последовательность оснований, кото-рую специфически узнает диск и которая

Рис. 30.4. Модель части ВТМ, на которойпоказана спиральная укладкабелковых субъединиц вокругодноцепочечной молекулыРНК. [Klug A., Caspar D. L. D.,Advan. Virus Res., 7, 274 (1960).]


Рис. 30.5. Карта электронной плотностибелкового диска ВТМ. Показанслой толщиной 6 А. (Печатает-ся с любезного разрешенияд-ра Aaron Klug.)

инициирует сборку. Эта область инициациибыла выделена следующим образом.К РНК ВТМ добавляли несколько дисков,чтобы покрыть область инициации, и затемрасщепляли остальную РНК нуклеазой. За-щищенный фрагмент содержит примерно 65нуклеотидов, которые прочно и специфичносвязываются с дисками. Последователь-ность оснований в этой области инициациидает все основания думать, что этот фраг-мент РНК образует структуру шпильки состеблем, состоящим из спаренных основа-ний, и петлей (рис. 30.7). Самое интересное.что петля содержит в каждом третьем поло-жении G. Такое расположение основанийв триплетах соответствует стехиометрии


субьединиц оболочки вируса - одна субъе-диница на три нуклеотида. Следовательно,по всей вероятности, петля связываетсяс первым диском, и с этого начинается сбор-ка вирусной частицы.

Неожиданно оказалось, что петля инициа-ции расположена далеко от обоих концовРНК. Точка начала сборки расположена нарасстоянии 5300 нуклеотидов от 5'-концаи примерно 1000 нуклеотидов от 3'-концаРНК. Другой неожиданностью было то, чтооба конца РНК выходят с одной и той жестороны растущей частицы ВТМ (рис. 30.8).Длина 3'-конца на протяжении процессасборки остается более или менее постоян-

Рис. 30.6. Схема превращения белковогодиска ВТМ в спиральную фор-му «запорной шайбы». [KlugA., Fed. Ргос., 31, 40 (1972).]

ной, а 5'-конец по мере удлинения вируснойчастицы становится короче.

Наиболее вероятная модель образованиячастиц проиллюстрирована на рис. 30.9.Сборка начинается с проникновения петлиинициации в центральное отверстие двух-слойного белкового диска. Петля связы-вается с первым оборотом диска, и приле-гающий стебель, состоящий из спаренныхоснований, раскрывается. Это взаимодей-ствие переводит диск в форму спиральнойзапорной шайбы, и диск захватывает РНК.Так начинается построение спирали вируса.Затем к новообразованной петле РНК, тор-чащей из центрального отверстия, присое-диняется еще один диск. Благодаря прота-скиванию 5'-конца через центральное отвер-стие растущей вирусной частицы при доба-влении каждого следующего диска обра-зуется новая петля. Наконец, происходитодевание 3'-конца каким-то пока непо-нятным способом.

Помимо того что двухслойный диск обес-печивает быструю нуклеацию, он суще-ственно увеличивает специфичность образо-вания оболочки. Диск может связываться сомногими нуклеотидами, тогда как однасубъединица - только с тремя. Следователь-но, диск обладает гораздо более высокой из-бирательностью по отношению к РНКВТМ по сравнению с мРНК клетки-хозяина,чем одна субъединица. Еще одно важноесвойство дисков состоит в том, что в физио-логических условиях они не образуют спи-ралей без РНК. В этом отношении важней-шую роль играют две карбоксильныегруппы в каждой субъединице. При ней-тральном значении рН в спиральной формеионизированы обе карбоксильные группы,а в диске - только одна. Электростатическоеотталкивание между близко расположенны-ми карбоксилат-ионами в спиральной фор-ме благоприятствует образованию диска.Связывание РНК со спиральной формой со-провождается достаточным изменениемсвободной энергии, чтобы преодолеть элек-тростатическое отталкивание карбокси-латных ионов. Итак, карбоксилат-ионы - негативный регулятор, препятствую-щий образованию спирали без РНК.

30.4. Заражение фагом Т4 полностьюперестраивает синтез макромолекулв клетке E.coliБактериофаг Т4 - гораздо более сложныйвирус, чем ВТМ. Его двухспиральная ДНКсодержит примерно 165 генов по сравнению

Рис. 30.7. Участок РНК ВТМ, обеспечи-вающий инициирование сбор-ки вирусной частицы ВТМ.

Рис. 30.8. Электронная микрофотогра-фия частично реконструиро-ванных частиц ВТМ. Видныдва хвоста РНК, отходящие откаждого растущего вириона.[Lebeurier G., Nicholaeff A.,Richards К. Е., Ргос. Nat. Acad.Sci. USA, 74, 150 (1977).]


Рис. 30.9. Схема сборки ВТМ. А -область инициации в РНКобразует петлю и проходитв центральное отверстие белко-вого диска. Б - диск переходитв спиральную форму «запор-ной шайбы». В - к тому концуРНК, где расположена петля,присоединяются новые диски.Г - одна из концов РНК всевремя протаскивается черезцентральное отверстие и взаи-модействует с новыми диска-ми. Д - схематическое изобра-жение молекулы РНК в частич-но собранном вирусе. Напра-вление движения РНК, обозна-чено стрелкой. (Butler P. J.G.,Klug A., Sci.Amer., 1978.)

с 6 генами ВТМ. Однако структура, размно-жение и процесс сборки фага Т4 изучены до-вольно хорошо, так как он подвергался ин-тенсивному генетическому и биохимическо-му анализу. Вирион Т4 состоит из головки.отростка и шести нитей (фибрилл) отрост-ка (рис. 30.10). Его молекула ДНК плотноупакована внутри икосаэдрической белко-вой оболочки и образует головку вируса.Отросток состоит из двух соосных трубок,соединенных с головкой короткой шейкой.В отростке сократительный чехол окружаетцентральный стержень, через который ДНКвводится в бактерию-хозяина. Отросток не-сет на конце базальную пластинку с шестьюкороткими зубцами, от которой отходитшесть длинных тонких нитей.

Концы нитей отростка связываютсяс определенными участками на клетке E.coli.В результате АТР-зависимого сокращения


чехол подтягивает головку фага к базальнойпластинке и нитям отростка, и в результатецентральный стержень проникает через кле-точную стенку, но не через мембрану клет-ки. Затем обнаженная фаговая ДНК прони-кает через клеточную мембрану. По истече-нии несколько минут все реакции синтезаклеточных Д Н К , РНК и белка останавли-ваются и начинается синтез вирусных ма-кромолекул. Другими словами, заразившийклетку вирус овладевает синтетическимимеханизмами бактериальной клетки и заме-щает ее гены своими.

В ДНК фага Т4 имеется три группы генов,которые транскрибируются на различныхстадиях заражения: предранние, ранние и по-

Рис. 30.10. Электронная микрофотогра-фия фага Т4. (Williams R. С., Fi-sher Н. W., An electronmicrographic atlas of viruses,С. С. Thomas, Springfield,Illinois, 1974. Печатается с лю-безного разрешения издателя.)

Таблица 30.2. Гены фага Т4 [Wood W.B., Revel H.R.,Bacteriol. Rev., 40, 860 (1976)]

Тип

Метаболические, необходимыеМетаболические, необходимыми не являют-сяСборка частицы, структурные белкиСборка частицы, другие белкиОбщее число идентифицированных генов

Число

22

604013135

здние. Предранние и ранние гены транскри-бируются и транслируются до того, как син-тезируется ДНК фага Т4. Некоторые белки,кодируемые этими генами, обеспечиваютвыключение синтеза клеточных макромоле-кул. Вскоре после заражения ДНК клетки-хозяина распадается под действием дезокси-рибонуклеазы, кодируемой одним из раннихгенов фага Т4. ДНК самого фага Т4 негидролизуется под действием этого фермен-та, поскольку в ней нет кластеров (сгруп-пированных остатков) цитозина. В ДНКфага Т4 вместо цитозина находится гидро-ксиметилцитозин (ГМЦ). К тому же остат-ки ГМЦ в ДНК Т4 глюкозилированы.

Эти производные цитозина включаютсяв ДНК бактериофага Т4 благодаря дей-ствию нескольких фагоспепифических фер-ментов, синтезирующихся на ранней стадиизаражения. Один из них гидролизует dCTPс образованием dCMP, чтобы воспрепят-ствовать включению dCTP в ДНК фага Т4.Затем второй фермент вводит в dCMP ги-дроксиметильную группу, и образуется

5-гидроксиметилцитидилат. Третий фер-мент превращает 5-гидроксиметилцитиди-лат в трифосфат, который служит субстра-том для ДНК-полимераз. Наконец, че-твертый фермент гликозилирует некоторыеиз содержащихся в ДНК остатки гидрокси-метилцитозина.

Синтез поздних белков сопряжен с репли-кацией ДНК фага Т4. На этом этапе обра-зуются белки капсида и лизоцим. Когдасборка вирионов потомства завершена, ли-зоцим гидролизует клеточную стенку бакте-рии и разрушает ее. Примерно через 20 минпосле заражения возникает около двухсотновых вирусных частиц.

30.5. В упорядоченной сборке фага Т4участвуют вспомогательные белки ипротеазыСборка фага Т4 - гораздо более сложныйпроцесс, чем сборка ВТМ, так как капсидфага Т4 значительно сложнее по своейструктурной организации и содержит при-мерно 40 различных белков. Еще тринад-цать дополнительных белков (по сравнениюс ВТМ) участвуют в сборке фага Т4, но невходят в состав капсида. Механизм сборкиэтого вируса был исследован с помощью со-четания генетических, биохимическихи электронно-микроскопических методов.Работы Вильяма Вуда и Роберта Эдгара(Will iam Wood, Robert Edgar), посвященныемутантам фага Т4, дефектным по способно-сти к сборке, позволили установить следую-щее.

1. Существует три основных пути пре-вращений, которые приводят к образованиювupуca. В результате этих превращений неза-висимо формируются головка, отростоки нити отростка (рис. 30.11). Если блокиро-вать образование одного из перечисленныхкомпонентов, это не повлияет на синтездвух других.

2. Каждая из этих последовательностейпревращений идет в строго определенномпорядке. Все белки капсида синтезируютсяодновременно во второй половине цикла за-ражения. Таким образом, строгой последо-вательности сборки головки, отростка и ни-тей отростка способствуют структурныеособенности самих промежуточных продук-тов. Ни один из этих процессов ассоциации неможет идти с заметной скоростью, пока незакончится предыдущий. Возможно, часть


Рис. 30.11. Морфогенез фага Т4. Числавозле стрелок обозначаютгены, продукты которых необ-ходимы для соответствующихэтапов сборки. (Wood W.В.,Genetic mechanisms ofdevelopment, Ruddle F. H., ed.,Academic Press, 1973, p. 29.)

энергии связывания на каждом этапе ис-пользуется для снижения энергии активацииследующего процесса ассоциации и такимобразом увеличивает его скорость.

3. Головка и отросток должны бытьполностью собраны, прежде чем они соеди-няются друг с другом. Затем готовые нитиотростка присоединяются к базальной пла-стинке. И в этом случае строгая последова-тельность событий обеспечивает выходтолько готовых вирусных частиц.

Образование вирионов фага Т4 идет нетолько путем самосборки. Важную роль нанекоторых этапах этого процесса играютвспомогательные ( морфопоэтические ) белки


и протеазы. Например, для образованияцентральной «втулки» базальной пластинкиотростка нужны три белка, которые не вхо-дят в состав собранного отростка. Эти вспо-могательные белки служат временными ша-блонами для ассоциации компонентов«втулки». Протеазы играют важную рольв сборке головки. Основной белок головкис массой 45 кДа, который называется gp23*(gp - от англ. gene product - продукт гена),образуется из предшественника gp23 с мас-сой 55 кДа. Расщепление происходит в тотмомент, когда головка частично собрана;это свидетельствует о том, что оно запу-скает механизм втягивания ДНК в головку.Известны еще три белка головки, которыерасщепляются в процессе сборки. Такимобразом, фаг Т4 образуется путем само-сборки и сборки с участием вспомога-тельных (морфопоэтических) белков и фер-ментов.

30.6. В репликации фага T4 участвуетконкатемерный промежуточный продуктПри репликации линейных молекул ДНК,в частности ДНК фага Т4, возникает особаяпроблема. 5'-концы новообразованной до-черней ДНК застроены не до конца, так какРНК-затравка была удалена, но не была за-мещена ДНК (рис. 30.12). Напомним, чтоДНК-полимераза не способна синтезиро-вать цепи ДНК de novo в направлении 3'—>5'(разд. 24.19). При репликации кольцевыхмолекул ДНК такой проблемы не возни-кает, так как 3'-конец новой цепи служит за-травкой для завершения синтеза дочернейцепи. Как же решают эту проблему фаг Т4и другие вирусы, геном которых предста-вляет собой линейную ДНК? Важным ука-занием на то, как решается эта проблема,послужило открытие, что эти линейные мо-лекулы обладают концевой избыточностью,т.е. последовательность оснований левогоконца ДНК в точности повторяется на пра-вом конце:

К тому же при репликации этих молекулДНК образуются длинные конкатемеры,Эти открытия позволили предложить меха-низм заполнения 5'-концов дочерних цепей.Поскольку одноцепочечные концы ново-образованных двухцепочечных молекулвзаимно комплементарны, они быстро реас-социируют (рис. 30.13). Эта комплементар-

Рис. 30.12. 5'-концы новосинтезиро-ванных линейных молекулДНК застроены не до конца.Родительские цепи ДНК пока-заны красным цветом, а дочер-ние - синим.

Рис. 30.13. Конкатемерный промежу-точный продукт репликациилинейных двухцепочечных мо-лекул ДНК. Двухцепочечныемолекулы ДНК с неза-строенными концами ассоции-руют друг с другом благодаряспариванию комплементарныходноцепочечных концов (АВс ab). Затем одноцепочечныепробелы застраиваются.

ность - следствие концевой избыточностипоследовательности оснований. В конкате-мерной цепочке, состоящей из повторяю-щихся звеньев - двухспиральных молекулфаговой ДНК, 3'-конец одной молекулыслужит затравкой для заполнения 5'-концадругой.

30.7. ДНК фага Т4 вводитсяв преобразованную головкуКак образуется молекула ДНК, соответ-ствующая одному фаговому геному, и какона упаковывается в головку? Эта проблеманевероятно сложна: ДНК имеет контурнуюдлину 56 мкм и при этом должна уместить-ся в головку, длина которой по большей оси0,1 мкм. К тому же объем ДНК(1,8•10-4 мкм3) ненамного меньше объемаголовки (2,5•10-4 мкм3). A priori имеютсядве возможности: ДНК может входитьв предобразованную головку или головкаможет собираться вокруг «ядра» конденси-рованной ДНК. Выделение пустых головокфага, способных упаковать ДНК, прямо до-казывает, что ДНК фага Т4 вводится в пред-образованные головки (рис. 30.14). В то вре-мя как ДНК входит в головку и свертывает-ся в структуру, напоминающую мотокпряжи, происходит расщепление несколькихбелков головки. Одновременно происходитразбухание головки. Наконец, когда в голов-ку входит фрагмент ДНК, соответствую-щий длине одного генома, конкатемерная

Рис. 30.14. Схема упаковки ДНК присборке головки фага Т4.


Рис. 30.15. Электронная микрофотогра-фия вируса кустистой карлико-вости томата. (Печатаетсяс любезного разрешения д-раRobley Williams.)

ДНК расщепляется. Нуклеаза действует непутем узнавания какой-либо определеннойпоследовательности, а расщепляет ДНКименно в тот момент, когда головка напол-нена. Этим и объясняется тот факт, чтоконцы молекул ДНК Т4 обладают концевойизбыточностью, ДНК упаковывается такимобразом, что она может быть очень быстровведена в бактерию при следующем циклезаражения. Чем обеспечивается такая пора-зительная подвижность, остается загадкой.

30.8. Гибкость белка оболочки ВККТпозволяет ему образовыватьикосаэдрический капсидВирус кустистостой карликовости томатов(ВККТ) - сферический вирус, иллюстрирую-щий другой принцип организации вируса(рис. 30.15). ВККТ содержит одну молекулуРНК длиной 4800 нуклеотидов, окруженнуюоболочкой из 180 идентичных белковыхсубъединиц массой 41 кДа. Как уложеныэти субъединицы оболочки? Максимальновозможная симметрия изотермической обо-лочки достигается в случае икосаэдраи имеет порядок 60 (рис. 30.16, А). Другими


словами, не более 60 идентичных субъеди-ниц могут быть упакованы в сферическуюоболочку с соблюдением абсолютной сим-метрии. Но ВККТ и ряд других сферическихвирусов содержат 180 идентичных субъеди-ниц. Биологическое преимущество построе-ния оболочки из 180 вместо 60 субъедиництакого же размера состоит в том, что в бо-лее крупный вирион можно упаковать боль-ше нуклеиновой кислоты. Это достигаетсяне нарушением симметрии, а некоторым ееослаблением (рис. 30.16, Б). Рентгенострук-турный анализ структуры ВККТ высокогоразрешения, проведенный Стивеном Харри-соном (Stephen Harrison), показал, что хими-чески идентичные субъединицы его оболоч-ки можно отнести к трем группам (А, В и С),каждая из которых состоит из 60 белков,подчиняющихся строгой икосаэдрическойсимметрии. В то же время молекулы из раз-ных групп расположены по отношению другк другу несколько по-разному; поэтому ихназывают квазиэквивалентными.

Как объяснить квазиэквивалентностьс физической точки зрения? Рентгенострук-турный анализ показал, что каждая субъеди-ница состоит из S-домена, образующегочасть поверхности оболочки; Р-домена, вы-ступающего наружу; N-концевого участка,направленного внутрь. Р- и S-домены всехсубъединиц имеют примерно одинаковоестроение. В то же время угол между Р- и S-доменами в субъединицах группы С сильноотличается от угла в субъединицах А и В. Р-и S-домены соединены шарниром, обеспечи-вающим поворот на угол до 20°. Еще одноотличие состоит в том, что N-концеваячасть в субъединицах группы С упорядоче-на, а в субъединицах А и В находится в бес-порядочной конформации. Благодаря такойгибкости структурной организации субъеди-ницы, принадлежащей к различным группам,могут взаимодействовать друг с другом по-чти идентичным образом, что необходимодля самосборки. С другой стороны, РНКвнутри частицы, по-видимому, не находитсяв какой-нибудь определенной конформации.Гибкие N-концевые участки субъединицоболочки проникают внутрь и взаимодей-ствуют с РНК.

30.9. Бактериальные рестрикционныеэндонуклеазы расщепляют чужеродныемолекулы ДНКМы уже видели, что фаг Т4 обладает фер-ментативной системой для избирательногорасщепления ДНК клетки-хозяина. Подоб-

Рис. 30.16. Икосаэдрическая поверхност-ная решетка, демонстрирую-щая упаковку 60 совершенноодинаковых субъединиц (А)и 180 квазиэквивалентныхсубъединиц (Б). Обратите вни-мание, что все контакты типа«хвост к хвосту» на рис. Аобразуются кольцевыми груп-пами по пять субъединиц, а нарис. Б некоторые такие кон-такты образуются группами попять, а другие — по шестьсубъединиц. [Harrison S.C.,Trends Biochem. Sci., 3,4 (1978).]

но этому, у бактерий имеются ферменты,называемые рестриктирующими эндону-клеазами, которые расщепляют чужеродныемолекулы ДНК. Эти ферменты были откры-ты в результате наблюдения, что фаги, вы-ращенные на одном штамме бактерий (на-пример, E.coli В), плохо растут на другомштамме (E.coli К) и наоборот. Такое явле-ние, когда фаг плохо растет на штамме, от-личном от того, на котором он был выра-щен, было названо рестрикцией. Однаконебольшая часть фага (примерно 10 - 5 ) из-бегает рестрикции и в дальнейшем хорошорастет на новом хозяине. При этом фагитеряют способность расти на старом хо-зяине.

Все эти данные показали, что специфиче-ская модификация в клетках-хозяевах защи-щает фаг от рестрикции. Затем Вернер Ар-бер (Werner Arber) продемонстрировал, чтоспецифическая модификация клеткой-хозяи-ном на самом деле воздействует на фаговуюДНК и что рестрикция обусловлена дегра-дацией ДНК фага. ДНК клетки-хозяина

и другие молекулы ДНК, содержащиесяв клетках-хозяевах, метилированы по опре-деленным участкам. Те же участки узнаети рестриктирующая эндонуклеаза, котораярасщепляет только неметилированные по-следовательности. Таким образом, метили-рование определенного основания в последо-вательности-мишени (участке узнавания)препятствует гидролизу ферментом ре-стрикции (рис. 30.17). Момент, в которыйпроисходит модификация, имеет принци-пиально важное значение: бактериальнаяДНК не подвергается расщеплению, потомучто она метилируется раньше. Только чтореплицированная бактериальная хромосо-ма, метилированная только по одной - ро-дительской - цепи, устойчива к действиюфермента рестрикции. Такая наполовинумодифицированная ДНК становится по-лностью метилированной до начала сле-дующего цикла репликации.

У бактерий обнаружено два типа системрестрикция-модификация. В системах типаI активность метилазы и нукдеазы ассоции-рована с крупным комплексом, состоящимиз нескольких субъединиц. Например, такиекомплексы у E.coli К и В состоят из поли-пептидных цепей трех типов. α-Цепь обла-дает эндонуклеазной активностью, β-цепь -метилазной активностью, а γ-цепь несетучасток узнавания ДНК. Ферменты типаI нуждаются в S-аденозилметионине ив АТР для проявления как нуклеазной, таки метилазной активности. Ферменты типаI расщепляют не модифицированную ДНКв случайном месте на расстоянии 1900 пароснований или более в 5'-сторону от участка


Рис. 30.17. Метилирование участков узна-вания (последовательностей-мишеней) защищает их от рас-щепления рестриктирующейэндонуклеазой.

узнавания1 и одновременно гидролизуютАТР. В системах типа II, наоборот, мети-лазы и нуклеазы разделены. S-аденозилме-тионин служит донором метальной группыв реакции модификации, но не участвуетв расщеплении ДНК. Еще одно отличие со-стоит в том, что нуклеазы и метилазы типаII не нуждаются в АТР. Самое удивитель-ное, что места расщепления нуклеазами ти-па II весьма специфичны. Как уже обсужда-лось в одной из предыдущих глав(разд. 24.27), многие из этих ферментов уз-нают определенную последовательность из4-6 пар оснований и гидролизуют в каждойцепи единственную строго определеннуюфосфодиэфирную связь в этой области. От-личительная особенность этих участков рас-щепления состоит в том, что они симме-тричны относительно оси вращения второгопорядка (рис. 30.18). Ферменты рестрик-ции - незаменимый инструмент в исследова-нии структуры ДНК (разд. 24.27) и созданииновых молекул ДНК (разд. 31.9).

1 Арбер изучал систему рестрикции—модифи-кации типа I на содержащем одноцепопечнуюДНК фаге fd, поэтому он мог указать положе-ние участка расщепления относительно участкаузнавания так, как это сделано в тексте.- Прим.перев.


30.10. Стратегия репликацииРНК-содержащих вирусовРепликация РНК-содержащих вирусовпредставляет собой особую проблему, таккак в незараженных клетках-хозяевах нетферментов для синтеза РНК по РНК-ма-трице. Следовательно, РНК-содержащиевирусы должны нести генетическую инфор-мацию для синтеза РНК-зависимой РНК-полимеразы (которую называют такжеРНК-репликазой или РНК-синтетазой) илидля РНК-зависимой ДНК-полимеразы (на-зываемой также обратной транскриптазой).РНК-содержащие вирусы удобно классифи-цировать в зависимости от РНК, содержа-щейся в вирионе, и мРНК. По определениюмРНК представляет собой ( + ) Р Н К , а ком-

Рис. 30.18. Специфичность рестриктирую-щей эндонуклеазы Hind III изHemophilus influenza и соответ-ствующей метилазы. Зеленымцветом показана ось симме-трии второго порядка.

Пикорнавирусы -группа мелких (pica) РНК-содержащих (рна - от айгл. RNA) вирусов. Одна одно-цепочечная молекула (+)РНК окружена икосаэдрической белковой оболочкойдиаметром 270 А. К пикорнавирусам относятся вирус полиомиелита, ринови-рус (вызывающий обычную простуду) и вирус ящура крупного рогатого скота.

Рис. 30.19. Способы экспрессии геновРНК-содержащих вирусов.[Baltimore D., Bacteriol. Rev.,35, 326 (1971).]

плементарная ей цепь - (—)РНК. Известнычетыре пути репликации и транскрипцииРНК-содержащих вирусов (рис. 30.19). Ви-русы 1-го класса (например, вирус полио-миелита) - вирусы, содержащие положи-тельную цепь РНК. Они синтезируют(—)РНК, которая используется в качествематрицы для образования (+)мРНК. Ви-русы 2-го класса (например, вирусы бешен-ства) содержат отрицательную цепь РНК,у них (—)РНК вириона служит матрицейдля синтеза (+)мРНК. Вирусы 3-го класса(например, реовирусы) содержат двухцепо-чечную РНК; (±)РНК вириона направляетасимметрический синтез (+)мРНК. Наибо-лее необычны вирусы 4-го класса - ретрови-русы (например, вирус саркомы Рауса).У них выражение генетической информации,содержащейся в (+)РНК вириона, опосре-довано образованием ДНК, которая служитматрицей для синтеза (+)РНК. Такимобразом, поток генетической информацииретровирусов направлен от РНК к ДНКи затем обратно к РНК.

30.11. Белки вируса полиомиелитаобразуются путем множественногорасщепления гигантского предшественникаВирус полиомиелита состоит из одноцепо-чечной (+)РНК длиной 7,5 kb, заключен-ной в икосаэдрический капсид. Проникнув

в цитоплазму клетки-хозяина, эта молекулаРНК вириона используется в качестве ма-трицы для синтеза белка. Она транслирует-ся рибосомами клетки-хозяина с образова-нием белков капсида и особой РНК-полиме-разы, работающей по РНК-матрице (РНК-репликазы). Затем РНК-репликаза синтези-рует (—)цепи на матрице (+)РНК вириона(рис. 30.21). (—)РНК в свою очередь служитматрицей для синтеза множества (+)цепей,которые участвуют в синтезе белка или упа-ковываются в капсиды и дают новые ви-рионы.

Рис. 30.20. Электронная микрофотогра-фия частиц вируса полиомие-лита. (Печатается с любезногоразрешения д-ра John Finch.)


Рис. 30.21. Репликация РНК вируса по-лиомиелита.

Поразительная особенность выражениягенов вируса полиомиелита состоит в том,что (+)РНК вириона служит матрицей длясинтеза непрерывной полипептидной цепи,содержащей более 2000 аминокислотныхостатков. Дэвид Балтимор (David Baltimore)показал, что этот гигантский полипептидрасщепляется протеазами клетки-хозяинана семь белков: четыре белка оболочки, однуРНК-репликазу и два белка, функция ко-торых пока еще неизвестна (рис. 30.22). Но-вообразованная полипептидная цепь расще-пляется на три куска, которые затемподвергаются дальнейшему расщеплению.В частности, два белка оболочки образуют-ся из предшественника на завершающейстадии сборки вириона.

Почему вирус полиомиелита синтезируетсвои белки таким на первый взглядсложным путем? По-видимому, у него нетвыбора. Напомним, что в эукариотическихклетках молекула мРНК по непопятной по-ка причине может при трансляции датьтолько одну полипептидную цепь. Прокарио-


тические мРНК, наоборот, сплошь и рядомполицистронны (например, мРНК лактоз-ного оперона). Таким образом, вирус полио-миелита использует расщепление полипро-теина, чтобы преодолеть ограничения, на-кладываемые особенностями животнойклетки-хозяина.

30.12. С геномной РНК вирусавезикулярною стоматита транскрибируетсяпять моноцистронных мРНКВирус везикулярного стоматита вызываю-щий легкое заболевание крупного рогатогоскота, и вирус бешенства - примеры второгоспособа выражения генов. Их вирионы со-держат одноцепочечную молекулу (—)РНК,которая не может служить матрицей.Поэтому первый этап ее экспрессии - синтез(+)РНК. Поскольку в незараженных клет-ках нет РНК-репликазы, вирусы должны со-держать этот фермент в составе вирионаи вводить его при заражении в клетку. Дей-ствительно, два из пяти белков вирионаВВС осуществляют репликацию РНК. Дляпроявления инфекционности вируса необхо-димы белок L массой 200 кДа (от англ.large - большой) и белок NS массой 45 кДа(от англ. nonstructural - неструктурный),присутствующие в небольших количествах.Геномная РНК находится в комплексес большим числом молекул белка нуклео-

Рабдовирусы -вирусы, имеющие форму пули. К ним относятся вирусы везикулярного стома-тита и бешенства. Название происходит от греческого слова rhabdo, что озна-чает «палочка».

Рис. 30.22. Синтез белков вируса полио-миелита путем множественно-го расщепления гигантскогополипептидного предшествен-ника.

капсида N массой 50 кДа - основного белкавириона. ВВС заключен в липидную дву-слойную мембрану, которую он захваты-вает из плазматической мембраны в процес-се отпочковывания от клетки (рис. 30.23).Белок G (от англ. glycoprotein - гликопро-теин) массой 65 кДа, кодируемый вирусом,образует шипы, выступающие из этой мем-браны. Белок матрикса М массой 29 кДарасполагается между оболочкой и нуклео-капсидом. Эти пять белков ВВС образуютсяпри трансляции пяти (+)мРНК, а не пу-тем расщепления одного полипротеина. Таже самая РНК-репликаза синтезируети длинную (+)РНК, содержащую всю гене-тическую информацию вируса. Эта полная(+)РНК в свою очередь служит матрицейдля синтеза (—)РНК, которая упаковывает-ся и дает новые вирионы.

30.13. Геном реовируса состоит из десятиразличных молекул двухцепочечной РНКРеовирус, содержащий двухцепочечнуюРНК, поражает клетки млекопитающихи представляет третий тип вирусных генети-ческих систем. Сердцевина вириона содер-жит десять различных двухцепочечных мо-лекул ( ± ) Р Н К , ассоциированных с белка-

ми. Проникнув в клетку-хозяина, вирионтеряет наружную икосаэдрическую оболоч-ку, состоящую из трех видов белков. Удале-ние этой оболочки активирует РНК-поли-меразу, содержащуюся в сердцевине вирио-на. Эта РНК-зависимая полимераза по-лностью транскрибирует 10 молекул(+)РНК, так что образующиеся (+)мРНКимеют такую же длину, как фрагменты ге-

Рис. 30.23. Электронная микрофотогра-фия вируса везикулярного сто-матита. (Williams R. С., FisherН. W., Electron MicrographicAtlas of Viruses, С. С. Thomas,1974. Печатается с любезногоразрешения издателя.)


Реовирус -вирус, содержащий двухцепочечную РНК, выделен из дыхательных путей и же-лудочно-кишечного тракта людей и других млекопитающих; насколько извест-но, он не вызывает заболевания. Приставка рео составлена из первых букв ан-глийских слов respiratory enteric orphan, что означает энтеро-респираторныйвирус-сирота (сирота, поскольку бродит «не пристроенный» ни к какойболезни).

Рис. 30.24. Электронная микрофотогра-фия реовируса. (Williams R. С.,Fisher H. W., An electronmicrographic atlac of viruses,С. С. Thomas, 1974. Печатаетсяс любезного разрешения изда-теля.)

Рис. 30.25. Синтез мРНК в сердцевине ре-овируса. Молекулы мРНК вы-глядят нитями, отходящими оттемных телец-сердцевин.[Bartlett N. М., Gillies S. G.,Bullivant S., Bellamy A. R.,J. Virol., 14, 324 (1974).]


нома. (±)РНК матрица транскрибируетсяасимметрично и консервативно, т.е. обра-зуются только (+)РНК, а исходные(±)РНК разрушаются. В сердцевине вирио-на к 5'-концам этих мРНК присоединяются«колпачки» под действием ферментов. За-тем эти концы выходят через каналы в серд-цевине (рис. 30.25). Следовательно, сердце-вина - высокоорганизованная система син-теза мРНК. Каждая из этих десяти мРНКдает при трансляции один белок. Затемвесь набор десяти (+)РНК соединяетсяс некоторыми вирусными белками и об-разует предшественник сердцевины («пре-кор»), в котором синтезируется десять(—)цепей.

Для чего геном реовируса разделен нафрагменты? Как уже было указано выше,вирусы животных не могут иметь полици-стронных мРНК. Вирус полиомиелита ре-шает эту проблему путем расщепления ги-гантского белка-предшественника, а вирусвезикулярного стоматита транскрибируетРНК вириона в виде коротких мРНК, ка-ждая из которых соответствует одному бел-ку. Стратегия реовируса состоит в том,чтобы иметь отдельную «хромосому» длякаждого синтезируемого белка.

Четвертый путь выражения генетическойинформации РНК-содержащих вирусов -использование ДНК-посредника, интегри-рующей с геном клетки-хозяина. Это болеесложная генетическая система, которую ис-пользуют ретровирусы (РНК-содержащиеопухолеродные вирусы). Мы обсудим ее ни-же в этой главе (разд. 30.19).

30.14. Мелкие РНК-содержащие фагисодержат перекрывающиеся геныТакие РНК-содержащие фаги, как R17 (MS2,F2) и Qβ, относятся к простейшим вирусам.Они имеют форму правильного многогран-ника и диаметр около 200 А. Капсид этихблизкородственных фагов содержит 180 мо-лекул белка оболочки массой 14 кДа и однумолекулу белка А (созревания) массой38 кДа. Кроме того, одноцепочечная(+)РНК кодирует одну из субъединиц ре-пликазы. До сих пор считалось, что эти мел-

кие РНК-содержащие вирусы содержаттолько три гена. Однако обнаружение му-танта фага, образующего нормальные ви-рионы, но не способного при этом лизиро-вать клетку-хозяина, повлекло за собойпоиск еще одного кодируемого вирусомбелка. Действительно, у РНК-содержашихфагов имеется четвертый ген, кодирующийбелок, необходимый для лизиса бактерии-хозяина. Ген этого белка лизиса перекры-вается с генами белка оболочки и субъеди-ницы репликазы (рис. 30.26). Эти мелкиеРНК-содержащие фаги, подобно маленько-му ДНК-содержащему фагу φX174(разд. 26.11), используют перекрывающиесягены для того, чтобы вместить больше ин-формации в свои маленькие геномы. Молеку-ла ( + ) Р Н К вириона служит матрицей и длясинтеза четырех белков, и для синтеза(—)РНК. Затем (—)РНК используется в ка-честве матрицы для образования множествакопий (+)РНК. Таким образом, по генети-ческой системе эти фаги напоминают вирусполиомиелита.

Репликаза, синтезирующая (+)- и (—)це-пи фаговой РНК,- очень интересный фер-мент. Он проявляет высокую специфич-ность к гомологичной фаговой РНК. Поэто-му молекулы РНК клетки-хозяина не конку-рируют с фаговой РНК при репликации.Qβ-репликаза состоит из четырех субъеди-ниц, из которых только одна кодируется фа-говой РНК. Три другие субъединицы репли-казы - белки клетки-хозяина, которые фагприспособил для собственных нужд. Два изних - факторы элонгации синтеза белкаEF-Tu и EF-Ts, а третий - один из компонен-тов 30S-субчастицы рибосомы. Так фаг Qβсоздает весьма специфичный фермент мак-симально экономичным способом.

Регуляторные механизмы обеспечиваютправильную временную последовательностьтрансляции и репликации. (+)РНК служитодновременно матрицей для синтеза белкаи для синтеза (—)РНК. Было бы нежела-тельно, чтобы оба процесса происходилиодновременно на одной и той же ( + ) Р Н К ,поскольку рибосомы, движущиеся в на-правлении 5'—>3', сталкивались бы с репли-казой, движущейся в направлении 3'—>5'.Этого не происходит, так как Qβ-репликазасильно ингибирует связывание рибосом с(+)РНК до тех пор, пока не синтезируетсядостаточное число молекул ( — ) Р Н К .

Четыре фаговых белка синтезируютсяв различных количествах. Белок оболочки,который синтезируется на протяжении всего

Рис. 30.26. Перекрывающиеся гены в РНКвирусов R17 и Qβ. Одна рамкасчитывания показана желтымцветом, другая - синим.

периода инфекции,- основной продукттрансляции. Одна из причин этого состоитв том. что рибосомы гораздо прочнее связы-ваются с участком инициации соответ-ствующего цистрона, чем с другими участ-ками инициации в (+)РНК. Кроме того,белок оболочки подавляет трансляцию генарепликазы, блокируя его участок инициа-ции. Таким образом, белок оболочки - спе-цифический релрессор трансляции. БелокА транслируется только с незаконченныхмолекул (+)РНК, так как в полных молеку-лах РНК его участок инициации блокированв результате спаривания оснований. Вторич-ная структура полной молекулы РНК по-зволяет транслировать лишь небольшое ко-личество белка А.

30.15. Дарвиновская эволюция фаговой РНКвне клеткиОчистка РНК фага Qβ и Qβ-репликазы отпримесей нуклеаз позволила Солу Спигел-ману (Sol Spigelman) изучать эволюционныесобытия вне живой клетки. Один из вопро-сов был сформулирован следующим обра-зом: что произойдет с молекулами РНК, ес-


ли единственное предъявляемое к ним требо-вание - это как можно быстрее размно-жаться? Молекулы РНК и репликазы фагаQβ и рибонуклеозидтрифосфаты инкубиро-вали в течение 20 мин. Такое время инкуба-ции способствует отбору мутантных моле-кул РНК, которые быстро реплицируются.Образец этой инкубационной смеси перено-сили и разводили в свежей порции стандарт-ной реакционной смеси, содержащей Qβ-ре-пликазу и рибонуклеозидтрифосфаты. Про-водили 75 переносов и затем анализировалиобразовавшиеся РНК. Продолжительностьинкубации постепенно снижали, так как мо-лекулы РНК на протяжении экспериментареплицировались все быстрее. Самым удиви-тельным было то, что после 75 переносов(«поколений») длина молекул РНК соста-вляла всего 12% длины исходной РНК фагаQβ. Нуклеотиды, ненужные для репликации,были утрачены, так как укороченные моле-кулы реплицировались быстрее. Основноеограничение, которое накладывали условияэтого эксперимента,- сохранение в му-тантных молекулах инициирующей после-довательности, которую узнает Qβ-репли-каза.

30.16. Лизогенные фаги могут включатьсвою ДНК в состав ДНК клетки-хозяинаУ некоторых бактериофагов существует двавозможных пути, по которым может пойтиих дальнейшее развитие после зараженияклетки-хозяина: они могут размножатьсяи лизировать зараженную клетку (литиче-ский путь развития) или же их ДНК можетвключиться в ДНК зараженной клетки, непроявляя способности к размножению и ли-зису (лизогенный путь развития). Вирусы,которые не всегда убивают клетку-хозяина,называются умеренными. Лучше всего изумеренных вирусов изучен фаг

λ (рис. 30.27); мы уже говорили о нем рань-ше в связи с регуляцией транскрипции(разд. 28.11). Напомним, что репрессор фагаλ связывается с двумя группами опера-торных участков OL и OR и что он регули-рует свой собственный синтез.

ДНК вириона λ - линейная двухцепочеч-ная молекула длиной 48 kb. 5'-конец каждойее цепи представляет собой одноцепочеч-ную последовательность из 12 нуклеотидов.Эти последовательности называются липки-


Рис. 30.27. Электронная микрофотогра-фия фага λ. (Печатается с лю-безного разрешения д-раA. Dale Kaiser.)

ми концами, так как они взаимно компле-ментарны и могут спариваться друг с дру-гом. На самом деле они соединяются сразупосле заражения. В результате 5'-фосфат ка-ждой цепи оказывается рядом со своимсобственным 3'-гидроксильным концом.ДНК-лигаза клетки-хозяина заделываетразрывы, и в результате образуется кольце-вая молекула ДНК фага λ (рис. 30.28).

Репликация этой кольцевой молекулыДНК фага λ происходит путем взаимодей-ствия белков, кодируемых фагом λ, с репли-кационными механизмами клетки-хозяина.В другом случае кольцевая ДНК фага λ мо-жет включиться в бактериальную хромосо-му с помощью одного акта реципрокной ре-комбинации между специфическими участ-ками ДНК фага λ и E.coli длиной по 15 пар

Рис. 30.28. Превращение линейной ДНКфага λ в кольцевую форму.

Рис. 30.29. Схема реципрокной рекомби-нации ДНК фага λ и ДНК Е.coli.

оснований. Сайт (участок) прикрепления фа-га λ в ДНК E.coli обозначается attλ и распо-лагается между генами галактозного и био-тинового оперонов galE и biоА. Последова-тельность оснований attλ можно символи-чески обозначать В-В' (от англ.bacterial - бактериальный). Специфическийсайт прикрепления в фаге λ называется attи локализован рядом с генами int (от англ.integrate - интегрировать) и xis (от англ.excise - вырезать). Последовательность ос-нований att обозначается Р-Р' (от англ.phage - фаг). Белок int узнает последователь-ность Р-Р' в фаговой ДНК и последователь-ность В-В' в ДНК E.coli. Затем происходитвзаимный перенос: Р соединяется с В', а В - сP'. Эта схема (рис. 30.29 и 30.30) была перво-начально предложена Алланом Кэмпбел-лом (Allan Campbell) на основании генетиче-ских данных.

Теперь ДНК фага λ составляет часть мо-лекулы ДНК E.coli. Эта форма называетсяпрофагом, а клетка E.coli, содержащая про-фаг,- лизогенной бактерией. Профаг стаби-лен в отсутствие белка xis. Транскрипция ге-на xis блокируется репрессором фага

λ (разд. 28.11). Когда репрессия снимается.белки xis и int совместно катализируют раз-рыв последовательностей В—Р' и Р—В',и снова происходит взаимный перенос(рис. 30.30): Р соединяется с Р', а В с В'; приэтом снова получаются кольцевая молекулаДНК фага λ и нелизогенная хромосомаE.coli. Главная особенность этой системырекомбинации заключается в том. что белокint сам по себе не может узнавать две новыепоследовательности на концах профага(В-Р' и Р-В'), поэтому они устойчивы. Та-ким образом, внедрение фага происходитв присутствии одного белка int, тогда каквырезание профага - только в присутствииобоих белков - int и xis.

Рис. 30.30. Интеграция и исключениеДНК фага λ. Это неполная схе-ма, так как некоторые факторы,участвующие в этих процессах,пока не идентифицированы.


30.17. Ретровирусы и некоторые ДНК-содержащие вирусы могут вызывать раку чувствительных клеток-хозяевВ 1911 г. Пейтон Раус (Peyton Rous) приго-товил бесклеточный фильтрат из опухолисоединительной ткани, которая спонтанновозникла у курицы и ввел его нормальнымцыплятам. Как ни странно, у реципиентовразвились высокозлокачественные опухолитакого же типа, которые называются сарко-мами. Кроме того, Раус обнаружил, что опу-холеродный фактор фильтрата, известныйв настоящее время под названием вирусасаркомы Рауса (RSV) или вируса саркомыптиц (ASV) (рис. 30.31), можно размножитьпутем последовательного пассированияв курах. Вирус саркомы птиц относитсяк группе РНК-содержащих опухолеродныхвирусов (онкогенных РНК-содержащих ви-русов). Эти вирусы содержат в составе вири-нов (+)РНК и размножаются с использова-нием двухспиральной ДНК-посредника. По-этому их называют ретровирусы. Ретрови-

Рис. 30.31. Электронная микрофотогра-фия вируса саркомы птиц (ви-руса саркомы Рауса), относя-щегося к ретровирусам. Силь-ноокрашивающиеся вирионырасположены вблизи поверх-ности зараженной клетки цы-пленка. (Печатается с любезно-го разрешения д-ра SamuelDales.)


Рис. 30.32. Электронная микрофотогра-фия ДНК-содержащего опухо-леродного вируса SV-40. (Печа-тается с любезного разрешенияд-ра Jack Griffith.)

русы - единственные РНК-содержащие ви-русы, способные вызывать рак. Кроме того,злокачественные опухоли может вызыватьряд ДНК-содержащих вирусов. Обезьянийвирус 40 (SV-40) и вирус полиомы принадле-жат к группе паповавирусов (рис. 30.32); извсех онкогенных ДНК-содержащих вирусовони изучаются наиболее интенсивно.Особый интерес к этим РНК- и ДНК-содер-жащим вирусам привлекает то, что они со-держат всего четыре-пять генов. В индукциирака участвует всего один или два вирусныхгена, и потому исследователи питают на-дежду выяснить механизм их действия.

Для изучения рака на молекулярномуровне были разработаны системы тка-невых культур. При проникновении онко-генного вируса в подходящие животныеклетки они становятся постоянно трансфор-мированными, т.е. похожими на раковые.Трансформированные клетки отличаютсяот нормальных особенностями своего ростаи характером клеточных поверхностей(табл. 30.3). Самое разительное изменениесостоит в том, что трансформированныеклетки растут непрерывно и хаотически не-зависимо от соседних клеток. Кроме того,трансформированные клетки содержат ви-русоспецифическую ДНК, интегрированнуюс геномом клетки-хозяина. Этим объясняет-

Таблица 30.3. Изменения свойств клеток при трансфор-мации ДНК- или РНК-содержащими опухолероднымн ви-русами (Tooze J., ed.. The molecular biology of tumourviruses. Cold Spring Harbor Laboratory, 1973, p. 351)

Характер роста

При введении чувствительным животным образуютопухолиРастут до гораздо более высокой плотностиРост становится не ориентированным в пространствеи клетки отделяются от поверхности, на которойрастутВ среду выделяются активаторы протеаз, что повы-шает инвазивность клетокСнижается потребность в факторах роста сыворотки

Свойства поверхности

Появляются новые вирусоспецифические антигеныОдин из белков наружной поверхности клеток - фи-бронектин - исчезаетПадает содержание ганглиозидовНа поверхности клетки появляются антигены плодаСкорость транспорта питательных веществ увеличи-ваетсяСпособность к агглютинации под действием расти-тельных лектинов увеличивается

Признаки присутствия опухолеродного вируса

Имеются последовательности вирусной ДНКИмеются вирусоспецифические мРНКВыявляются вирусоспецифические антигены

ся тот факт, что трансформация являетсянаследуемым изменением фенотипа. Куль-туры, полученные из трансформированныхколоний, навсегда сохраняют аномальныесвойства трансформированных клеток. Кро-ме того, некоторые трансформированныеклетки, полученные из культуры ткани, привведении в достаточном количестве в подхо-дящего хозяина образуют раковую опухоль.

30.18. Вирусы SV-40 и полиомы могутвызывать продуктивную инфекцию

или трансформацию клеток-хозяевВирусы SV-40 и полиомы содержат внутриикосаэдрической оболочки маленькую коль-

цевую двухспиральную ДНК. В некоторыхклетках (они называются пермиссивнымиклетками-хозяевами) развитие этих вирусовидет по пути литического цикла, что приво-дит к образованию множества новых вирио-нов (рис. 30.33).

При продуктивной инфекции эти вирусыубивают клетки. В клетках других типов (не-пермиссивных клеток-хозяев) некоторыестадии экспрессии вирусного генома по не-понятным причинам блокируются. Никако-го вирусного потомства в них не образуется.но небольшая часть клеток - порядка од-ной на 105 - трансформируется в резуль-тате интеграции вирусной ДНК с геномомклетки-хозяина.

К настоящему времени расшифрованаполная последовательность 5243 пар осно-ваний ДНК вируса SV-40, а многие аспектыего репликации и транскрипции интенсивноисследуются. Половина ДНК транскриби-руется на ранней стадии инфекции, другаяполовина ДНК - на поздней стадии, одно-временно с синтезом вирусной ДНК(рис. 30.34).

Точка начала репликации находится в тойже области, что и начало транскрипции ран-ней и поздней областей. Ранняя областьтранскрибируется в направлении против ча-совой стрелки и кодирует Т-антиген (белокА), необходимый для инициирования репли-кации ДНК. Другой, иммунологически от-личный белок - малый t-антиген - также ко-дируется ранней областью. При синтеземРНК для Т-антигена происходит выре-зание вставочной последовательности изпервичного транскрипта.

Таким образом, вирус SV-40 используетаппарат сплайсинга клеточного ядра. Заслу-живает внимания также последовательностьоснований в точке начала репликации. Здесьимеются две последовательности длиной по13 пар оснований, симметричных относи-тельно оси второго порядка, а рядом нахо-дится АТ-богатая область:


Паповавирусы -группа ДНК-содержащих вирусов. Название составлено по названиям трехпредставителей группы: вирусов папилломы, полиомы и вакуолизирующего ви-руса (SV-40).

Рис. 30.33. Электронная микрофотогра-фия фрагмента ядерной мем-браны клетки, зараженной ви-русом SV-40. Видны ядерныепоры и множество вирионов.(Печатается с любезного разре-шения д-ра Jack Griffith.)

С этим участком связывается Т-антиген.Транскрипция поздней области происхо-

дит по направлению часовой стрелки от на-чала репликации (рис. 30.34) и приводитк синтезу трех белков капсида: VP1, VP2и VP3. И в этом случае происходит удалениевставочных последовательностей из первич-ного транскрипта. Три мРНК, по-видимо-му, образуются в результате различных ре-акций сплайсинга. N-концевая последова-тельность аминокислот VP3 перекрывает70% С-концевой последовательности VP2.Кроме того, перекрывающийся участок из22 нуклеотидов читается в одной рамкесчитывания при синтезе VP2 и VP3 и в дру-гой рамке при синтезе VP1. Так, ограничен-ное количество генетической информацииу вируса SV-40 используется с максимальной


эффективностью. Еще один пример генети-ческой экономии - то, что SV-40 не синтези-рует собственных белков для упаковкиДНК. Новосинтезированная ДНК свя-зывается с гистонами клетки-хозяина(рис. 30.35). Затем этот сверхспирализован-ный комплекс упаковывается в капсид с по-мощью белков VP1, VP2 и VP3. В конце кон-цов вирионы потомства высвобождаются

Таблица 30.4. Белки, кодируемые вирусом SV-40

Белок

Т-антиген(белок А)

t-АнтигенVP1

VP2

VP3

Масса,кДа

94

2140

39

27

мРНК

Ранняя

РанняяПоздняя

Поздняя

Поздняя

Роль

Необходим дляинициации, репли-кации ДНК и длятрансформации

НеизвестнаОсновной белоккапсида

Минорный белоккапсида

Минорный белоккапсида

при лизисе клетки-хозяина, которая в ре-зультате гибнет.

В непермиссивных клетках происходитэкспрессия ранней области генома SV-40,поздняя же область не реплицируется и нетранскрибируется. Небольшая часть этихклеток трансформируется в результате ин-теграции генома SV-40 с клеточной ДНК.В отличие от интеграции ДНК фага λ в ме-ханизме интеграции ДНК SV-40, по-види-мому, не участвуют специфические участкини вирусной, ни клеточной ДНК. Для транс-формации, а также, по всей вероятности, дляподдержания трансформированного состоя-ния необходимы оба вирусных антигена (Ти t). Введение таких трансформированныхклеток чувствительным животным приво-дит к быстрому образованию опухолей. Ос-новная цель ведущихся в настоящее времяисследований вируса SV-40 состоит в том,чтобы выяснить, как экспрессия раннейобласти интегрированной формы этого ви-руса делает клетку раковой.

30.19. Ретровирусы содержат обратнуютранскриптазу, которая синтезируетдвухспиральную ДНК, используяв качестве матрицы ( + ) Р Н КЕще один класс опухолеродных вирусов -ретровирусы - содержит (+)РНК-геном викосаэдрическом «футляре». Это сфериче-ское нуклеопротеиновое «ядро» окруженооболочкой, состоящей из кодируемых виру-сом молекул гликопротеина в двуслойнойлипидной оболочке, происходящей из плаз-матической мембраны клетки-хозяина.Обычно диаметр ретровирусов составляет1000 А (см. рис. 30.31).

В 1964 г. Говард Темин (Howard Temin)наблюдал, что заражение такими РНК-со-держащими опухолеродными вирусами, каквирус саркомы птиц, блокируется ингибито-рами синтеза ДНК. Ингибиторы, напримераметоптерин, 5-фтордезоксиуридин и цито-зинарабинозид, эффективны в течениепервых двадцати часов после введения виру-сов. В результате этого открытия быловысказано предположение, что для ростаРНК-содержащих опухолеродных вирусовнеобходим синтез ДНК. К тому же образо-вание частиц вирусного потомства подав-ляется актиномицином D. Известно, чтоэтот антибиотик ингибирует синтез РНК поДНК-матрице (разд. 25.18). Так зародилосьпредположение о том. что для размноженияРНК-содержащих опухолеродных вирусов

Рис. 30.34. Генетическая карта ДНК виру-са SV-40, содержащая 5243пары оснований. Ранняяобласть (транскрибируетсяв направлении против часовойстрелки) показана желтым цве-том, поздняя область (тран-скрибируется по часовой стрел-ке) - синим, место начала ре-пликации (ori) - красным.

Рис. 30.35. Электронная микрофотогра-фия формирующихся частицопухолеродного вируса SV-40,ассоциированных с клеточнойхромосомой. (Печатается с лю-безного разрешения д-ра JackGriffith.)


Рис. 30.36. Синтез ДНК по РНК-матрицеобратной транскриптазой. За-травка не показана.

необходима транскрипция ДНК. Эти неожи-данные данные привели Темина к мысли,что ДНК-содержащий провирус служитпромежуточным продуктом в репликациии в онкогенном действии этих вирусов:

Выдвинутая Темином гипотеза, что генети-ческая информация может переходить отРНК к ДНК, была вначале холодно встрече-на большинством исследователей. Она тре-бовала существования неизвестного тогдаеще фермента, способного синтезироватьДНК по РНК-матрице (РНК-зависимойДНК-полимеразы). В 1970 г. Темин и Балти-мор (Temin, Baltimore) независимо открылитакой фермент, который называется обрат-ной транскриптазой, в вирионах некоторыхРНК-зависимых опухолеродных вирусов.Все вирусы этой группы, исследованныев дальнейшем, содержали обратную тран-скриптазу, поэтому их и называют ретрови-русами (от англ. reverse transcriptase - обрат-ная транскриптаза).

Жизненный цикл обычного ретровирусаначинается со связывания вирионов со спе-цифическими рецепторами на поверхностиклетки-хозяина и проникновения в клетку.В цитозоле вирусная (+)РНК скидываетоболочку. Затем обратная транскриптаза,


содержавшаяся в вирусной частице, синтези-рует (—)цепь ДНК. Тот же фермент расще-пляет цепь геномной РНК в составе гибридаРНК—ДНК. Теперь обратная транскрипта-за синтезирует (+)цепь ДНК, используяв качестве матрицы (—)цепь. Таким обра-зом, обратная транскриптаза осущест-вляет три последовательные реакции: РНК-зависимый синтез ДНК, гидролиз РНКи ДНК-зависимый синтез ДНК (рис. 30.36).

Подобно другим ДНК-полимеразам,обратная транскриптаза синтезирует ДНКв направлении 5'—>3' и неспособна к инициа-ции цепей de novo. Откуда же берется за-травка для синтеза вирусной ДНК? Процессинициации весьма экономичен: ( + ) Р Н К ви-русного генома содержит нековалентно свя-занную транспортную РНК (в вирусе сар-комы птиц это - триптофановая тРНК),которая была захвачена в клетке-хозяине вовремя предыдущего цикла заражения.3'-ОН-группа этой тРНК, основания кото-рой спарены с геномной РНК, действуетв качестве затравки синтеза ДНК. Как про-исходит репликация полной цепи (+)РНК?

Напомним, что при репликации любой ли-нейной ДНК возникает особая проблема за-полнения 5'-концов (разд. 30.6). Ретрови-русы нашли очень остроумный выход изэтого положения. Их геномы состоят не изодной, а из двух молекул (+)РНК(рис. 30.37). Эти молекулы связаны другс другом водородными связями вблизи5'-концов. К тому же (+)РНК содержит од-ну и ту же последовательность у 5'- иу 3'-конца. Эта концевая избыточность, по-видимому, необходима для процесса репли-кации, как и в случае фага Т4 (разд. 30.6).

30.20. Ретровирусная ДНКтранскрибируется только в том случае, еслиона интегрирована с геном клетки-хозяинаДвухспиральная вирусная ДНК переходитв кольцевую форму и проникает в ядро.Транскрипция ретровирусной ДНК проис-ходит только после того, как она интегри-рует с ДНК клетки-хозяина. Таким образом,в жизненном цикле ретровирусов интегра-ция — этап обязательный. В жизненном ци-кле онкогенных ДНК-содержащих вирусов,напротив, интеграция и продуктивная ин-

Рис. 30.37. Схематическое изображениегенома вируса саркомы птиц.Две идентичные молекулы (+)РНК связаны между собой не-ковалентно. На 5'-концах нахо-дятся «колпачки», а на 3'-кон-цах - poly(А)-последовательно-сти. Молекула тРНК, котораяслужит затравкой, присоедине-на посредством спаривания ос-нований к каждой молекулеРНК.

Рис. 30.38. Генетическая карта вируса сар-комы птиц. Геном имеет длину10 kb. Буквой Т обозначеныконцевые повторяющиеся по-следовательности.

фекция - альтернативные пути. Еще одно от-личие заключается в том, что частота ин-теграции ретровирусной ДНК очень высока,как и следовало ожидать исходя из ее клю-чевой роли в продуктивной инфекции.

Геном вируса саркомы птиц длиной 10 kbсодержит четыре гена (рис. 30.38). Три изних - gag, pol и env - необходимы для продук-тивной инфекции. Ген gag кодирует поли-протеин массой 76 кДа, который расще-пляется на четыре белка, образующихсердцевину вируса. Ген pol кодирует обрат-ную транскриптазу, состоящую из α- и β-субъединиц. α-Субъединица массой 65 кДапредставляет собой фрагмент (массой90 кДа) протеолиза β-цепи. Ген env кодируетгликопротеин оболочки вируса, необхо-димый для прикрепления вируса к поверх-ности клетки-хозяина. Четвертый ген - src(от англ. sarcomа - саркома) - не нужен дляразмножения вируса, но необходим длятрансформации, как будет показано чутьниже.

Различные вирусные мРНК, видимо,образуются в результате сплайсинга из пер-вичного транскрипта длиной 10 kb. Затемони транспортируются в цитозоль и здесьтранслируются. Геномная РНК и вирусныебелки перемещаются к плазматическоймембране и включаются в нее. Затем частьизмененной мембраны отпочковываетсяи образует новые вирусные частицы. Такимобразом, продуктивная ретровирусная ин-фекция в отличие от инфекции онкогеннымиДНК-содержащими вирусами не являетсялитической. Ретровирусы обычно не уби-вают клеток-хозяев. Ретровирусная ДНКостается в геноме зараженной клетки и про-должает экспрессироваться. Кроме того, ин-тегрированная вирусная ДНК реплицирует-ся вместе с клеточной ДНК, поэтомудочерние клетки наследуют вирусный геном.

30.21. Киназа, кодируемая геном src вирусасаркомы птиц, участвует в трансформацииИзучение некоторых температурочувстви-тельных мутантов принесло новые данныео механизме трансформации под действиемвируса саркомы птиц. При высокой темпе-ратуре эти мутанты нормально размно-жаются, но не трансформируют клеток-хо-зяев, а при низкой температуре оба процессапротекают нормально. Кроме того, фибро-


Рис. 30.39. Электронная микрофотогра-фия частиц вируса миелобла-стоза птиц. Введение этого опу-холеродного РНК-содержа-щего вируса новорожденнымцыплятам вызывает в течение3 недель злокачественную лей-кемию. (Печатается с любезно-го разрешения д-ра UrsulaHeine, Национальный институтраковых исследований.)

бласты, трансформированные этими мутан-тами при низкой температуре, при повыше-нии температуры возвращаются к нормаль-ному фенотипу. Сдвиг от трансформирован-ного состояния к нормальному оказываетсяполностью обратимым. Анализ этих мутан-тов показал, что в процессе трансформацииучаствует только один вирусный белок -продукт гена src. Ген src получил свое на-звание потому, что способен направлять син-тез какого-то белка, вызывающего саркому.Важно подчеркнуть, что в таких мутантныхклетках при высокой температуре вируснаяДНК остается интегрированной с кле-точным геном. Следовательно, интеграциясама по себе не приводит к трансформации.


Для этого должен экспрессироваться генrsc.

Что же представляет собой продукт генаsrc? Исследования, проведенные в последнеевремя, показали, что этот белок массой60 кДа - киназа, фосфорилирующая белки.Проводится изучение мишени этой киназы,что позволит выяснить механизм трансфор-мации. Поразительно, что один небольшойбелок может полностью изменить характерроста клетки и сделать ее раковой.

30.22. Двухцепочечная РНК подавляетсинтез белка в клетках, обработанныхинтерферономУстойчивость животных клеток ко многимвирусам заметно увеличивается под дей-ствием интерферонов - группы небольшихбелков, которые синтезируются и секрети-руются клетками позвоночных, инфициро-ванными вирусом. Двухцепочечные моле-кулы РНК оказывают некоторое стимули-рующее действие на образование интерфе-рона. Интерфероны связываются с плазма-тической мембраной других клеток организ-ма и стимулируют их способность сопроти-вляться вирусной инфекции. Клетки при-обретают устойчивость к широкому спектрувирусов. Иммунность, которую обеспечи-вают антитела, наоборот, весьма специфич-на. Интерфероны обладают очень высокойактивностью: всего 10-1 М достаточнодля проявления выраженного противови-русного действия.

Интерферон повышает противовируснуюустойчивость клеток путем увеличения син-теза трех ферментов: олигонуклеотид-син-тетазы, эндонуклеазы и киназы. До тех порпока сенсибилизированная клетка не зара-жается вирусом или не подвергается воздей-ствию двухцепочечной РНК, эти три фер-мента бездействуют. Активация этих фер-ментов блокирует синтез белков двумяразличными путями (рис. 30.40). Протеин-киназа фосфорилирует один из факторовинициации синтеза белка и тем самым инак-тивирует его. Напомним, что тот же факторинициации служит мишенью регуляторногокаскада в ретикулоцитах (разд. 29.27). Дру-гой важный результат воздействия двухспи-ральной РНК на сенсибилизированные ин-терфероном клетки - стимулирование дегра-дации мРНК. Эндонуклеаза активируетсяолигоаденилатом, который называется 2,5А.Двухцепочечная РНК стимулирует синтета-зу, образующую этот стимулятор эндону-

Рис. 30.40. Двухцепочечная РНК стимули-рует расщепление мРНК (А)и ингибирует инициацию син-теза белка в клетках, обрабо-танных интерфероном (Б).[Farrell P.J., Sen G.C, DuboisM. F., Ratner L., Slattery E.,Lengyel P., Proc. Nat. Acad.Sci.USA, 75, 5896 (1978).]

клеазы. Было бы крайне интересно выяс-нить, играют ли эти регуляторные путикакую-либо роль в незараженной клетке, по-мимо того что они защищают ее от вирусов.

ЗаключениеВирусы представляют собой плотно упако-ванную инфекционную нуклеиновую кисло-ту, окруженную защитной оболочкой. Онисодержат ДНК или РНК, которые могутбыть одно- или двухцепочечными. Простей-шие вирусы имеют всего 3 гена, а наиболеесложные - около 250 генов. Вирусные обо-лочки в большинстве случаев состоят из

большого числа белковых субъединиц одно-го или нескольких видов, так как вирусы со-держат крайне ограниченное количество ге-нетической информации. Два основныхспособа укладки - цилиндрическая оболоч-ка, обладающая спиральной симметрией,и сферическая оболочка, обладающая ико-саэдрической симметрией. Частица вируса(вирион) табачной мозаики состоит из 2130идентичных субъединиц, уложенных спи-ралью вокруг одноцепочечной молекулыРНК; она образуется в результате само-сборки, которая осуществляется путем при-соединения белковых дисков к петле РНК.Вирус кустистой карликовости томатовобразует икосаэдрическую оболочку, таккак домены, из которых состоит его белокоболочки, связаны друг с другом подвижно.Сборка фага Т4 - гораздо более сложныйпроцесс, в котором участвует примерно 50белков. Три основных пути сборки ведутк независимому образованию головки, от-ростка и нитей отростка. Формирование фа-га Т4 идет в строго определенном порядке,в нем участвуют процессы самосборкии сборки с участием ферментов. Кроме того,важную роль в сборке фага Т4 играют вспо-могательные (морфопоэтические) белки.

Незараженные клетки не могут синтези-ровать РНК по РНК-матрице. Следователь-но, общее свойство РНК-содержащих виру-


сов (кроме РНК-содержащих опухоле-родных вирусов) - это кодирование РНК-за-висимой РНК-полимеразы. РНК, содержа-щаяся в вирионах некоторых вирусов(например, фага Qβ), служит при зараженииинформационной РНК. У других вирусов(например, у реовирусов) геномная РНКдолжна сразу после заражения транскриби-роваться. Транскрипция осуществляетсяферментом, который имеется в вирионе.РНК-содержащие вирусы используют раз-личные способы синтеза белка. Белки виру-са полиомиелита образуются путем расщеп-ления гигантского предшественника. Реови-рус содержит отдельную «хромосому» длякаждого синтезируемого им белка, а вирусвезикулярного стоматита транскрибируетнесколько моноцистронных РНК с однойгеномной РНК.

Не все вирусы разрушают свои клетки-хо-зяева. Умеренный фаг λ может приниматьформу дремлющего профага, когда егоДНК интегрирована с бактериальной хро-мосомой путем реципрокной рекомбина-ции. Этот профаг сохраняет способностьк размножению и лизису, которую он про-являет, когда происходит его исключение изклеточной ДНК. Подобно этому, ДНК-со-держащие опухолеродные вирусы SV-40и полиомы либо размножаются и лизируют

свои клетки-хозяева, либо их ДНК интегри-рует с ДНК клетки-хозяина. Ретровирусымогут размножаться только путем интегра-ции с клеточной ДНК. Эти вирусы содержатобратную транскриптазу, катализирующуюсинтез двухспиральной ДНК с использова-нием в качестве матрицы геномной РНК.Продуктивная инфекция ретровирусамив отличие от онкогенных ДНК-содержащихвирусов не является литической. Клетки,в геноме которых содержится ДНК вирусаSV-40, полиомы или ретровируса, имеютаномальные поверхности и характеризуют-ся нарушениями роста. При введении чув-ствительным животным они образуют опу-холи. Эти вирусы - удобная модель дляизучения молекулярных основ рака, так какони имеют всего около пяти генов. Удалосьпоказать, что трансформацию вызываеткиназа, которую кодирует ген src вирусасаркомы птиц.

Устойчивость клеток животных ко мно-гим - вирусам заметно увеличивается поддействием интерферона - белка, которыйсинтезируют и выделяют клетки, зара-женные вирусом. Интерферон увеличиваетобразование трех ферментов, блокирующихсинтез белка путем ингибирования фактораинициации и стимулирования деградациимРНК.

Биологические исследования представляют собой, в частности, упражнения поэстетике природы. Занимаясь биологией, мы получаем удовольствие главнымобразом оттого, что снова и снова осознаем, насколько экономичны, изящныи целесообразны те механизмы, которые случайно возникли в ходе эволюциии были закреплены отбором. Вирусолог может чувствовать себя одним изсамых счастливых биологов, так как он может изучить избранный им объект доподробностей строения его отдельных молекул. Вирусолог наблюдает, как ви-рус - этот полнейший паразит - использует для своего существования наиболееобщие принципы биологии клетки...David Baltimore, Нобелевская лекция, 1976 г.


С чего начатьButler P.J.G., King A., 1978. Theassembly of a virus, Sci. Amer., 239(5),62-69. (Сборка вируса табачной мо-заики.)Bishop J.M., 1980. The molecularbiology of RNA tumor viruses:

a physician's guide, New Engl. J. Med.,303, 675-682.Campbell A.M., 1976. How virusesinsert their DNA into the DNA of thehost cell, Sci. Amer, 235(6), 102-113.Temin H.M ., 1972. RNA-directed DNAsynthesis, Sci. Amer., 226(1), 24-33.Nathans D., 1979. Restriction endo-nucleases, simian virus 40, and the newgenetics, Science, 206, 903-909.

КнигиLuria S.E., Darnell J.E., Jr.Baltimore D., Campbell A., 1978.General Virology (3rd ed.), Wiley.[Имеется перевод: Лурия С, Дар-нелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э.Общая вирусология.- М.: Мир, 1981.](Доступное и увлекательное введениев вирусологию.)Тooze J. (ed.), 1980, The MolecularBiology of Tumour Viruses (2nd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory.Williams R.С., Fisher H.W., 1974. An194


Electron Micrographic Atlas of Airuses,Thomas. (Сожержит превосходныеэлектронные микрофотографиии очень увлекательные объясненияк ним.)

Строение вирусовBloomer А.С., Champness J.N.,Bricogne G., Staden R., Klug A., 1978.Protein disk of tobacco mosaic virus at2,8 A resolution showing theinteractions within and betweensubunits, Nature, 276, 362-368.Stubbs G., Warren S., Holmes K., 1977.Structure of RNA and RNA binding sitein tobacco mosaic virus from 4-A mapcalculated from X-ray fibre diagrams,Nature, 267, 216-221.Harrison S.C., Olson A.J., Schutt C.E.,Winkler F.K., Bricogne G., 1978.Tomato bushy stunt virus at 2,9 Aresolution, Nature, 276, 368-373.Harrison S.C., 1978. Structure of simpleviruses: specificity and flexibility inprotein assemblies, Trends Biochem.

Sci., 3-6.Crick F.H.C, Watson J.D., 1957. Virusstructure: general principles. In:Wolstenholme G. E. W. (ed.), Ciba Fou-ndation Symposium on the Nature ofViruses, pp. 5-13.Caspar D.L.D., Klug A., 1962. Physicalprinciples in the construction of regularviruses, Cold Spring Harbor Symp.Quant Biol., 27, 1-24. (В этой класси-ческой статье рассматривается тео-рия строения сферических вирусов.)

Сборка вирусовLebeurier G., Nicolaieff A., Ric-hards К.E . , 1977. Inside-out model forself-assembly of tobacco mosaic virus,Proc. Nat. Acad. Sci., 74, 149-153.Butler P.J.G., Finch J. Т., Zimmern D.,1977. Configuration of tobacco mosaicvirus RNA during virus assembly,Nature, 265, 217-219.Wood W.В., 1978. Bacteriophage T4assembly and the morphogenesis ofsubcellular structures, Harvey Lectures,73, 203-223.Casjens S., King J., 1975. Virusassembly, Ann. Rev. Biochem., 44,555-611.

Рестрикция и модификацияSmith D.H., 1979. Nucleotide sequencespecificity of restriction endonucleases,Science, 205, 455-462.Arber W., 1979. Promotion andlimitation of genetic exchange, Science,205, 361-365.

ИнтерферонFriedman R.М., 1977. Antiviral activityof interferon, Bacteriol. Rev., 41.543-567.Farrell P.J., Sen G.C., Dubois M.F.,Ratner L., Slattery E., Lengyel P., 1978.Interferon action: two distinct pathwaysfor inhibition of protein synthesis bydouble-stranded RNA, Proc. Nat. Acad.Sci., 75, 5893-5897.Burke D.C., 1977. The status ofinterferon, Sci. Amer., 236(4), 42-50.

Внеклеточная эволюция РНК фага QβMills D.R., Peterson R.L., Spiegel-man S., 1967. An extracellularDarwinian experiment witha selfduplicating nucleic acid molecule,Proc. Nat. Acad. Sci., 58, 217-224.

ЛизогенняLwoff A., 1966. The prophage and I. In:Cairns J., Stent G. S. and Watson J. D.(eds.), Phage and the Origins ofMolecular Biology, pp. 88-99, ColdSpring Harbor Laboratory. (Захваты-вающий рассказ об открытии основлизогении.)

Опухолеродные вирусыBaltimore D., 1976. Viruses,polymerases, and cancer, Science, 192,632-636.Timin H., 1976. The DNA provirushypothesis: the establishment andimplications of RNA-directed DNAsynthesis, Science, 192, 1075-1080.Dulbecco R., 1976. From the molecularbiology of oncogenic DNA viruses tocancer, Science, 192, 437-440.Bishop J.M., 1978. Retroviruses, Ann.Rev. Biochem., 47, 35-88.Reddy V.В., Thimmappaya В., Dhar R.,Subramanian K.N., Zain B.S., Plan J.,Ghosh P.K., Celma M.L., Weiss-man S. M., 1978. The genome of simianvirus 40, Science, 200, 494-502.

ГЛАВА 31Перестройки генов:рекомбинация,транспозиция иклонирование

Тема настоящей главы - перестройка геновпутем перемещения крупных участков ДНК.Прежде всего мы обсудим процесс генетиче-ской рекомбинации, при котором новая мо-лекула ДНК возникает путем разрыва и вос-соединения цепей ДНК. Вероятность гене-тической рекомбинации существенно увели-чивается при наличии обширных участковгомологии между взаимодействующимимолекулами ДНК. Были выделены проме-жуточные продукты рекомбинации, а срав-нительно недавно был охарактеризовани фермент, катализирующий взаимный об-мен цепей ДНК. Затем мы обсудим транс-позицию - перемещение гена из одной хро-мосомы в другую или с одного места надругое в пределах одной хромосомы. В от-личие от общей рекомбинации для транспо-зиции не нужны протяженные участки гомо-логии. У прокариот присутствие так назы-ваемых последовательностей-вставок, илиIS-элементов (от англ. insertion sequences),сообщает подвижность неродственнымфрагментам ДНК, обеспечивая их соедине-ние. Рекомбинация и транспозиция сыграливажную роль в эволюции, так как они приво-дили к возникновению новых геномов. В кон-це настоящей главы мы рассмотрим кон-струирование новых комбинаций геновв пробирке и их выражение в клетках-хозяе-вах. Гены можно ковалентно соединитьс ДНК плазмид и вирусов с помощью ре-стриктирующих эндонуклеаз и ДНК-ли-газы. Такие рекомбинатные молекулы ДНК


могут реплицироваться и экспрессироватьсяв подходящих клетках-хозяевах. Кроме то-го, мы обсудим важность клонирования ге-нов и возможность его практического при-менения. Исследования рекомбинациии транспозиции и разработка методов кло-нирования идут исключительно быстрымтемпом. В результате этих работ возникаютновые плодотворные методы изучения гено-мов, которые позволяют глубже проник-нуть в механизмы их эволюции и выраже-ния.31.1 В основе генетической рекомбинации

лежат разрыв и воссоединение цепей ДНКПри генетической рекомбинации возникаетмолекула ДНК, последовательность кото-рой происходит частично от одной роди-тельской молекулы, а частично от другой.Исследования клеток Е. coli, зараженныхсмесью фагов Т4, меченных 32Р и бром-дезоксиурацилом, позволили получитьпредставление о молекулярной природе ре-комбинантных молекул. Плавучая плот-ность ДНК, меченной бромурацилом, зна-чительно выше, чем плотность ДНК, мечен-ной 32Р, так что родительские молекулыможно отделить друг от друга и от реком-бинантных молекул центрифугированием вградиенте плотности хлористого цезия(CsCl). Результаты опытов по центрифуги-рованию показали, что после заражениясмесью фагов рекомбинантные молекулысодержат и 32Р, и бромурацил. Структурагибридных молекул зависела от того, про-исходил ли во время их образования синтезДНК. В отсутствие синтеза ДНК 32Р-ДНКв составе рекомбинантных молекул не былаковалентно соединена с меченной бромура-цилом ДНК. При нагревании выше темпе-ратуры плавления двухспиральных молекулгибрид диссоциировал на легкий и тяжелыйкомпоненты. Фрагменты родительских мо-лекул в этом гибриде удерживаются вместев результате спаривания оснований; поэто-му этот промежуточный продукт называет-ся составным (рис. 31.3). Если же синтез

Рис. 31.1. Перенос генетической инфор-мации от одной клетки Е. coliк другой. На этой электронноймикрофотографии видны двеклетки Е. coli, соединенные припомощи пиля во время конью-гации. ДНК переносится через

пиль из донорной клетки в ак-цепторную. (Печатается с лю-безного разрешения д-раCharles Brinton и д-ра JudithCarnahan.)

31. Перестройки генов 197

Рис. 31.2. Электронная микрофотогра-фия кольцевой молекулы ДНК,содержащей гены устойчиво-сти к нескольким антибиоти-кам. Такие плазмиды (факторыR - от англ. resistance - устойчи-вость) сообщают клеткамустойчивость к различным ве-ществам, которая может пере-даваться другим клеткам. (Пе-чатается с любезного разреше-ния д-ра Stanley Cohen.)

Рис. 31.3. Составной промежуточныйпродукт рекомбинации ДНКфага Т4 в зараженных бакте-риях. Меченная 32Р ДНК пока-зана красным цветом, а ДНК,меченная бромурацилом,- си-ним.


ДНК происходил, одноценочечные пробелыв составном промежуточном продукте за-полнялись ДНК-полимеразой I и концы со-единялись ДНК-лигазой. Образовавшуюсярекомбинатную молекулу уже нельзя былоразделить на легкий и тяжелый компо-ненты, так как куски ДНК были ковалентносоединены. Эти эксперименты показали,что одноцепочечные участки ДНК являют-ся промежуточными продуктами генетиче-ской рекомбинации и что в этом процессеучаствуют ферменты.

31.2. При генетической рекомбинациипроисходит спаривание гомологичныхцепей ДНК с образованием двухцепо-чечного промежуточного продуктаИзображение промежуточных продуктов ге-нетической рекомбинации было полученометодом электронной микроскопии. В этихисследованиях была использована ДНКплазмид Е. coli. Как мы вскоре увидим (разд.

Рис. 31.4. Электронная микрофотогра-фия молекул ДНК в процессерекомбинации: А - промежу-точный продукт в форме вось-мерки, состоящий из двух мо-лекул ДНК ; Б - при расщепле-нии этого промежуточногопродукта рестриктирующейэндонуклеазой образуется х-форма. [Potter H., Dressier D.,Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76,1089 (1976).]

Рис. 31.5. Предполагаемая схема расще-пления двух молекул ДНК, со-единенных в негомологичных(А) и в гомологичных (Б) участ-ках. Наблюдаемая симметрия

χ-форм (как на рис. 31.4, Б) по-казывает, что молекулы ДНКв форме восьмерок соединеныв гомологичных участках.

31.4), эти небольшие кольцевые двухцепо-чечные ДНК автономно реплицируютсяв бактериальной клетке. В присутствиихлорамфеникола число плазмид в однойбактерии увеличивается примерно с 20 до1000. Этот антибиотик - ингибитор синтезабелка - подавляет репликацию бактериаль-ной хромосомы, но не ингибирует реплика-ции плазмид. Итак, бактериальная клеткаоказывается наполненной молекулами плаз-мид, способными к рекомбинации. Элек-тронная микроскопия плазмид, выделенныхиз этих клеток, показывает, что примерночетверть из них представляют собой ди-меры в форме восьмерок (рис. 31.4, А). За-тем эти димеры расщепили рестриктирую-щей эндонуклеазой EcoRI. разрезающеймономер плазмиды в строго определенномместе. Если бы димеры были взаимозаце-пленными друг с другом мономерами иликольцами двухкратной длины, то под дей-ствием рестриктирующей эндонуклеазыобразовались бы палочки одинаковой

длины. С другой стороны, если два плаз-мидных кольца ковалентно соединеныв области участка гомологии, должна бытьвидна структура с четырьмя ветвями в фор-ме греческой буквы χ. В действительностипочти все восьмерки превращаются в χ-форму (рис. 31.4, Б). Это служит надежнымподтверждением, что восьмерки представля-ют собой промежуточные продукты репли-кации. В пользу этого вывода говорит и то,что у некоторых мутантов Е. coli, дефект-ных по рекомбинации, восьмерки не обра-зуются.

Какова структура области перекресткадвух геномов в восьмерках? Точка контакта(пересечения) χ-форм всегда делит всюструктуру на две пары плеч равной длины.Это означает, что геномы соединяютсяв области гомологии (рис. 31.5). Если быплазмиды соединялись в области негомоло-гичных последовательностей, то длины всехчетырех плеч распределялись бы случайнымобразом. Кроме того, точка контакта распо-лагается примерно с равной вероятностьювдоль всей плазмиды; отсюда следует, чтоспаривание может происходить во многихположениях. Способ соединения нитейв области перекреста был исследован с по-мощью его избирательной денатурации. Наэлектронных микрофотографиях видно, чточетыре двухцепочечные молекулы в местахсоединения двух геномов отходят от кольца,


Рис. 31.6. А - электронная микрофото-графия χ-формы; Б - схема мо-лекулы, изображенной на фо-тографии. Участок гомологии(богатый АТ-парами основа-ний) был избирательно денату-рирован формамидом, чтобыбыло видно соединение цепейв области перекреста. [Pot-ter Н., Dressier D., Cold SpringHarbor Symp. Quant. Biol., 43,973 (1979).]

состоящего из одиночных нитей (рис. 31.6).Затем этот промежуточный продукт можетбыть расщеплен и лигирован, так что обра-зуются две пары различных рекомби-нантных молекул (рис. 31.7).

31.3. Белок г е c А катализируетАТР-зависимый обмен цепей ДНКпри генетической рекомбинацииПроцесс, который мы обсуждали до сих пор,называется общей генетической рекомбина-цией, поскольку обмены могут происходитьмежду любыми парами гомологичных по-следовательностей в родительских молеку-лах ДНК. У Е. coli общая рекомбинация за-висит от генов rec. В клетках rec-- бакте-риальная ДНК не может рекомбинироватьс экзогенными молекулами ДНК. Былиидентифицированы три гена rec: recА, recВи recС. Белки recВ (масса 140 кДа) и recС(128 кДа) - две субъединицы одной ну-клеазы, которая расплетает двухспираль-ную ДНК и расщепляет на куски сначалаодну из расплетенных цепей, а затем дру-


гую. Эти куски, содержащие несколько со-тен нуклеотидов, подвергаются дальнейше-му расщеплению ферментом recВС, обла-дающим активностью экзонуклеазы. Рас-плетающая и нуклеазная активности этогоферментного комплекса зависят от гидро-лиза АТР. Скорее всего роль белка recВСв рекомбинации сводится к образованиюодноцепочечной ДНК, способной внедритьсяв двухцепочечную молекулу ДНК.

Как одноцепочечная ДНК находит гомо-логичную последовательность в двухцепо-чечной молекуле, спаривается с компле-ментарной цепью и вытесняет вторую цепь?Недавно было показано, что эту реакцию ка-тализирует белок recА с массой 40 кДа, ко-торый гидролизует АТР и использует выде-ляющуюся энергию. Продукт этой реакциисостоит из двухцепочечного участка и вы-тесненной одноцепочечной петли и имеетформу буквы D; он называется D-петлей(рис. 31.8). Образованию D-петли способ-ствует белок, который специфически связы-вается с одноцепочечной ДНК. Этот белокиграет также важную роль в репликацииДНК (разд. 24.21); он стабилизирует одноце-почечную ДНК, образовавшуюся под дей-ствием нуклеазы recВС, и стимулирует вне-дрение этой цепи в гомологичную двухспи-ральную молекулу, катализируемую белкомrесА.

31.4. Бактерии содержат плазмиды и другиеподвижные генетические элементыОбщая генетическая рекомбинация приво-дит к возникновению новых комбинацийспецифических аллелей, но не изменяет рас-положения локусов. Другими словами, пригомологичной рекомбинации ABCDEс A'B'C'D'E' легко получится ABC'D'E', но неможет получиться ABXYZCDE или ABE.Такие крупные генетические перестройки

Рис. 31.7. Модель генетической реком-бинации, предложенная Роби-ном Холидеем (Robin Holliday).Одна из родительских двухце-почечных молекул изображенасиним цветом, а другаякрасным. Более темная нитьв каждом дуплексе - (+)цепь.Буквами X, Y и Z обозначенытри гена; х, у и z - их аллели. Ви Г - ковалентное соединениеродительских молекул ДНК.Е - иное представление ком-плекса молекул, изображенно-го на рис. Д. Обратите внима-ние, что эта структура на рис. Еможет быть разрезана по гори-зонтальной или по вертикаль-ной оси. Воссоединение нитейна рис. Ж и З дает два раз-личных набора рекомбинантов(И и К). Участки, содержащиепо одной цепи каждого из ро-дительских дуплексов, отме-чены звездочками. [Potter H.,Dressier D., Cold Spring HarborSymp. Quant. Biol., 43, 973(1979).]

происходят при участии подвижных генети-ческих элементов (табл. 31.1). Важный классподвижных генетических элементов - плаз-миды. Это кольцевые двухцепочечные моле-кулы ДНК (рис. 31.9), размер которых коле-блется от двух до нескольких сотен тысячпар оснований (kb). Плазмиды содержатгены, ответственные за инактивирование ан-тибиотиков, метаболизм природных соеди-нений и образование токсинов. В сущности,плазмиды представляют собой дополни-тельные хромосомы. Они отличаются отбактериальной хромосомы тем, что без нихв определенных условиях клетка можетобойтись. Кроме того, плазмиды обладаютспособностью реплицироваться независимоот клеточной хромосомы. Клетка Е. coliобычно содержит около 20 копий мелкиххромосом и 1-2 большие.

31.5. Фактор F позволяет бактериямпередавать гены реципиентам путемконъюгацииНекоторые плазмиды обусловливают пере-нос бактериями генетического материала


Рис. 31.8. Спаривание одноцепочечноймолекулы ДНК (показанакрасным цветом) с комплемен-тарной цепью (желтым) ду-плекса, катализируемое бел-ком rec A. В результате обра-зуется структура, называемаяD-петлей.

в другие бактерии путем образования непос-редственных межклеточных контактов.Этот процесс, названный конъюгацией, от-крыли в 1946 г. Джошуа Ледерберги Эдвард Татум (Joshua Lederberg, EdwardTatum). При конъюгации клеток Е. coli одинпартнер (мужского пола) служит доноромгенетического материала, другой (женскогопола) - реципиентом. Бактерии мужскогопола имеют на поверхности особые отрост-ки, получившие название половых пилей,а женские клетки несут рецепторные участ-ки, которые связывают пили. Пиль связы-


Таблица 31.1. Мобильные генетические элементы

Тип

Плазмиды

Фактор F (факторфертильности, фак-тор плодовитости)

Факторы F'

Факторы R (факто-ры устойчивости)

Факторы колицино-генности

Лизогенизирующие фа-кторы

Лямбда

Мю

Послeдовательности-вставки(IS-элементы)

Раз-мер,kb

93

>100

4-117

6-141

48

38

От 0,8до 1,4

Свойства

Сообщает клеткемужской фенотип,переносится приконъюгации

Переносят, помимогенов фактора F, ге-ны Е. coli

Содержат гены устой-чивости к различ-ным веществам:

кроме того, некото-рые из н и х с о д е р -жат гены, обеспечи-вающие конъюга-цию

Переносят гены, про-дуцирующие коли-цин (токсин); неко-торые содержат,кроме того, гены,

обеспечиваюшиеконъюгацию

Небольшая часть фа-гов переносит геныЕ. coli (gal или bio)наряду с вируснымигенами

Все фаги мю несуткороткий участокгенома Е. coli

Гены, обрамленныепарой IS-элементов,могут переноситьсяс места на местовнутри клетки

вает между собой мужскую и женскую клет-ки (рис. 31.1). Затем он сокращается, чтопозволяет клеткам вступить в непосред-ственный контакт для передачи ДНК(рис. 31.10). Бактерия мужского пола содер-жит плазмиду, называемую фактором F (отангл. fertility - плодовитость), которая несетгены, детерминирующие образование по-ловых пилей и других компонентов, уча-ствующих в конъюгации. При конъюгацииодна цепь плазмиды фактора F разрываетсяв одном месте, и происходит расплетаниедвухцепочечной молекулы (рис. 31.11). 5'-ко-нец разорванной цепи входит в реципиент-

ную клетку, и на ней синтезируется компле-ментарная цепь. При этом образуетсязамкнутая кольцевая двухцепочечная моле-кула. Присутствие плазмиды фактора Fв реципиентной клетке (первоначально F--)превращает ее в мужскую клетку (F+). Му-жская клетка может спонтанно терять свойфактор и ревертировать таким образом к ге-нотипу F--.

Плазмида фактор F может интегриро-вать с бактериальной хромосомой. Интегра-ция происходит путем кроссинговера с од-ним из множества мест в бактериальнойхромосоме. Частота интеграции составляетпримерно 10-5 в расчете на одну генерацию.Бактерии, несущие фактор F в своих хромо-сомах, называются клетками Hfr (от англ.high frequency of recombination - высокая ча-стота рекомбинации). Клетки Hfr, каки клетки F+ , участвуют в конъюгации в ка-честве доноров (рис. 31.12). Различие междуними состоит в том, что клетка Hfr пере-дает всю бактериальную хромосому (вклю-чая интегрированный фактор F), тогда какклетка F+ передает реципиенту только фак-тор F. При скрещивании Hfr x F-- вся хро-мосома переносится примерно за 90 мин.Порядок входа передаваемых генов в реци-пиентную клетку зависит от места, в кото-ром произошла интеграция фактора F и отего полярности. Поэтому порядок геновв хромосоме донора можно легко устано-вить, прерывая конъюгацию в различныемоменты времени и определяя, какие мар-керы успели перейти. Передаваемая хромо-сома донора может рекомбинировать с хро-мосомой реципиента. Частота рекомбина-ции выше всего для генов, которые вошлив реципиентную клетку первыми, так какони находятся там дольше всего. Такимобразом, можно строить генетическиекарты, определяя время входа и частоту ре-комбинации маркеров, передаваемых доно-ром.

При исключении фактора F из хромо-сомы Hfr-клетки она переходит в состояниеF+. Этот процесс, обратный интеграциифактора F, также происходит с частотойпримерно 10-5 за одну генерацию. В не-большой части ревертантов кроссинговерпроисходит в сайте, отличном от сайта ин-теграции. В результате образуется плазми-да, содержащая, помимо генов фактора F,хромосомные гены (рис. 31.13). Такая плаз-мида называется фактором F'; штрих обоз-начает, что в ней присутствуют хромосом-

ные гены. Конъюгация клетки F' с клеткойF-- приводит к переносу этих хромосомныхгенов из донора в реципиентную клетку,которая в результате становится диплоид-ной по этим генам.

Рис. 31.9. Электронная микрофотогра-фия небольшой плазмиды фак-тора R. (Печатается с любезно-го разрешения д-ра JackGriffith.)

Рис. 31.10. Электронная микрофотогра-фия двух клеток Е. coli во времяконъюгации. (Печатается с лю-базного разрешения д-раLucien Саrо.)


Рис. 31.11. Предполагаемый механизмпереноса нити фактора R приконъюгации. В суперспирали-зованную молекулу фактораR в клетке F+-донора вноситсяодноцепочечный разрыв, и по-сле этого он расплетается,Перенос одной цепи фактораR в клетку F---реципиента со-пряжен с репликацией этой це-пи донора. Затем в реципиент-ной клетке синтезируется ком-плементарная цепь. [War-ren G.J., Twigg A.J., Sher-ratt D. J., Nature, 274, 260(1978).]

Рис. 31.12. Схема образования Hfr-клетокпутем интеграции фактора Fс хромосомой Е. coli.


Таким образом, у бактерий имеется меха-низм для переноса целых хромосом или не-скольких генов из одной клетки в другую.Фактор F можно рассматривать как особыйпереносчик (вектор), возникший специальнодля обмена генетическим материалом. Ин-тересно отметить, что лизогенизирующиефаги также могут участвовать в обмене ге-нов клетки-хозяина. Например, ДНК фага

λ может интегрировать между генами galи bio хромосомы Е. coli (разд. 30.16). Исклю-чение профага из хромосомы обычно проис-ходит точно, но не всегда. Примернов одном вирионе на 105 ДНК фага λ содер-жит оперон gal или ген bio. При заражениитакими фагами, называемыми λgal и λbio,эти гены вводятся в клетку Е. coli вместес генами фага λ. Другой родственный фаг,который называется φ80, интегрирует вбли-зи оперона trp и может переносить гены trp

Рис. 31.13. Аномальное исключение фак-тора F приводит к образова-нию плазмиды F', содержащейчасть хромосомы Е. coli.

из одной зараженной клетки в другую. Бак-териофаг μ интегрирует почти в любом ме-сте хромосомы Е. coli и при исключениивсегда захватывает кусок бактериальнойхромосомы. Эти трансдуцирующие фаги,подобно фактору F, представляют собойподвижные генетические элементы, ко-торые обеспечивают взаимообмен бакте-риальных генов. Не исключено, что транс-дукция ускоряет эволюцию бактерий.

31.6. Плазмиды факторы R придаютбактериям устойчивость к антибиотикамПоразительным примером необычно бы-строй эволюции бактерий может служитьэпидемия бактериальной дизентерии, проте-кавшая в 1955 г. Один из штаммов Shigelladysenteriae приобрел устойчивость одновре-менно к хлорамфениколу, стрептомицину,сульфаниламидам и тетрациклину. Такогорода множественная устойчивость к лекар-ственным препаратам в настоящее времяшироко распространена среди многих пато-генных микроорганизмов. Гены, придаю-щие устойчивость к многим антибиотикам,соединены вместе в плазмидных факторахR (от англ. resistance - устойчивость), назы-ваемых также факторами устойчивости.Наиболее крупные из этих плазмид нарядус несколькими генами r содержат также фак-тор переноса устойчивости (resistancetransfer factor - RTF) (рис. 31.14). УчастокRTF позволяет плазмиде переноситьсяв другие бактерии с помощью конъюгации.В действительности гены участка RTF весь-ма сходны с аналогичными генами факто-ров F. Гены r кодируют ферменты, инакти-вирующие определенные лекарственные ве-щества. Факторы R, имеющие участок RTF,могут переноситься между различными ви-дами бактерий при совместном культивиро-вании. Следовательно, множественнаяустойчивость к антибиотикам может бытьтрансмиссивной.

Маленькие плазмиды факторы R лишеныобласти RTF и обычно придают клеткеустойчивость только к одному антибиотику.Например, плазмида R pSC101 длиной 8,2kb несет ген устойчивости к тетрациклину,но она не может быть перенесена путемконъюгации. Однако этот ген r может при-соединиться к другой плазмиде, несущейиной ген устойчивости к какому-либо веще-ству (рис. 31.15). Если эти гены r интегри-руют с плазмидой, содержащей областьRTF, возникает трансмиссивная R-плазми-

Рис. 31.14. Схематическое изображениефактора R. Гены RTF (ответ-ственные за конъюгацию и ре-пликацию) показаны зеленымцветом, а гены r (ответственныеза устойчивость к различнымлекарственным веществам) —красным. IS-элементы пока-заны желтым цветом.

Рис. 31.15. Инфекционный фактор R обра-зуется, когда ген r присоеди-няется к плазмиде RTF.


Рис. 31.16. Перенос гена (показано крас-ным цветом), граничащего собеих сторон с IS-элементами(желтый цвет). При транспози-ции реципиентный участок (си-ний цвет) удваивается. Одинконец транспозона предста-вляет собой обращенный по-втор другого конца.

да. Следовательно, плазмиды, являющиесясложными факторами R, образуются извесьма подвижных элементов, обусловли-вающих, устойчивость к отдельным химиче-ским соединениям. Такие генетические эле-менты, способные к переносу, теперь назы-вают транспозонами.

31.7. IS-элементы могут присоединятьсяк неродственным генамЧто лежит в основе высокой подвижноститранспозонов? Электронно-микроскопиче-ские исследования и определение последова-тельности нуклеотидов в ДНК показали,что последовательность, расположенная наодном конце транспозона, повторяется надругом конце. Например, концы Tn3-транс-позона, кодирующего устойчивость к ампи-циллину,- представляют собой обращенныеповторы длиной 38 пар оснований. После-довательности нуклеотидов в ДНК реце-пиенте, граничащие с обеих сторон с транс-позоном, являются прямым повтором по-следовательности 5-9 пар оснований, при-сутствовавшей до вставки транспозона(рис. 31.16). Между этими обрамляющими


последовательностями реципиентной ДНКи концевыми последовательностями транс-позона нет никакой гомологии. Кроме того,гены rec E. coli не участвуют в процессе ин-теграции транспозона, что в корне отличаетего от общей генетической рекомбинации.Концы транспозона, возможно, служат IS-элементами, направляя действие нуклеази других белков, участвующих в интеграции.Самое главное заключается в том, чтотранспозон не обязательно гомологичен ре-ципиентной ДНК, так как специфичностьинтеграции определяется в первую очередьДНК-белковыми взаимодействиями, а неспариванием оснований.

Самые маленькие подвижные генетиче-ские элементы - это последовательности-вставки (IS-элементы), которые имеют дли-ну около 1 kb. В отличие от транспозоновIS-элементы не несут никаких генов. Однакоони оказывают существенное влияние навыражение соседних генов. IS-элементыобычно блокируют транскрипцию ди-стальных генов транскрипционной единицы.Кроме того, они могут выступать в качественовых промоторов. К тому же IS-элементыспособствуют таким хромосомным пере-стройкам, как делеции и инверсии. В хромо-соме E. coli было обнаружено несколько ко-пий четырех различных IS-элементов (IS1,IS2, IS3 и IS4). К тому же концевые последо-вательности некоторых транспозонов иден-тичны одному из этих IS-элементов. По всейвероятности, транспозон образуется в томслучае, когда какой-либо ген оказываетсяокруженным парой IS-элементов.

Мы уже видели, что плазмиды и фаги мо-гут обмениваться блоками генов с бакте-риальными хромосомами. Кроме того,плазмиды и фаги способны рекомбиниро-

Рис. 31.17. Синтез и клонирование ре-комбинантных молекул ДНК.

вать друг с другом. Было показано, что ге-нетический элемент, отвечающий за устой-чивость к тетрациклину, перемещается изплазмиды фактора R в фаг, размножающий-ся в клетках Salmonella, а оттуда в хромосо-му Salmonella, затем в фаг λ и из фага λ в trp-оперон E. coli и обратно в фаг λ. Этозамечательное путешествие показывает, на-сколько подвижны гены прокариот. Былобы интересно выяснить, обладают ли геныэукариот столь же высокой подвижностью.

31.8. В лаборатории можно сконструироватьновые геномы и клонировать ихв клетках-хозяевахРазработанная в последние годы техноло-гия рекомбинантных ДНК - важнейшее до-стижение молекулярной биологии. Появи-

лась возможность создать в лабораторныхусловиях новые комбинации неродственныхгенов. Затем эти новые геномы можно вве-сти в подходящие клетки и размножить вомного раз с помощью механизмов синтезаДНК клетки-хозяина. Некоторые из такихвведенных в клетки генов могут также тран-скрибироваться и транслироваться в новомокружении. Основные этапы клонированияДНК сводятся к следующему (рис. 31.17).

1. Создание рекомбинантной молекулы.Интересующий исследователя фрагментДНК ковалентно присоединяется к ДНКвектора. Основное свойство вектора со-стоит в том, что он может автономно репли-цироваться в подходящем хозяине. Напри-мер, плазмиды и фаг λ наиболее удобныевекторы для клонирования генов в клеткахЕ. coli. Как будет описано ниже, молекулы


Химерная ДНК -рекомбинантная молекула ДНК, содержащая неродственные гены. От слова хи-мера - мифологическое существо с головой льва, телом козла и хвостом змеи.«...Коей порода была от богов, не от смертных: Лев головою, задом дракони коза серединой, Страшно дыхала она пожирающим пламенем бурным».

Гомер, «Илиада», пер. Н. Гнедича, гл. VI, стих 180.

ДНК можно соединить путем лигирования(т.е. воздействием лигазы) фрагментовс липкими одноцепочечными концами илиже с тупыми концами.

2. Введение в клетку-хозяина. Большин-ство бактериальных и эукариотических кле-ток поглощает голые молекулы ДНК изсреды. Эффективность поглощения низка(примерно 1 на 106 молекул ДНК), но в спе-циально подобранных экспериментальныхусловиях можно трансформировать значи-тельную часть клеток. Существует и другойметод: клетки заражают реконструиро-ванными вирионами, содержащими реком-бинантные молекулы ДНК. В таком синте-тическом вирусном геноме интересующийисследователя ген замещает участок вирус-

Рис. 31.18. Электронная микрофотогра-фия pSC101 - плазмидного век-тора, использованного дляклонирования ДНК. (Печа-тается с любезного разрешенияд-ра Stanley Cohen.)


ной ДНК, не имеющий существенного зна-чения для репликации.

3. Отбор. Следующий этап состоит в том,чтобы определить, какие клетки несут ре-комбинантную молекулу ДНК, содержа-щую нужный ген. Такие клоны можно ото-брать по признаку присутствия вектора илисамого встроенного гена. Например, неко-торые плазмидные векторы сообщают клет-ке устойчивость к какому-либо антибиоти-ку. Другой подход состоит в том, чтобыопределить, какие клетки связывают РНК,комплементарную нужному гену, или синте-зируют кодируемый им белок. Клоны, со-держащие рекомбинантную ДНК, ста-бильны, по крайней мере в течение несколь-ких сотен поколений.

Клонирование рекомбинантной ДНК ужевнесло большой вклад в наши представле-ния о структуре хромосомы и выражении ге-на. Многие встроенные гены удалось раз-множить путем клонирования, что далобольшие количества ДНК для определенияпоследовательности оснований и электрон-но-микроскопических исследований. Крометого, с помощью этих клонов были синтези-рованы в больших количествах белки, ко-торые в обычных условиях образуютсяв ничтожных количествах. Методырекомбинантных ДНК используются такжедля изучения сложных геномов и регуляцииих выражения.

31.9. Ферменты рестрикции и ДНК-лигаза -необходимые инструменты для получениярекомбинантных молекул ДНКМолекулы ДНК можно легко соединять invitro с помощью рестриктирующих эндону-клеаз (разд. 24.27), ДНК-лигаз (разд. 24.15)и других высокоспецифических ферментов,действующих на ДНК. В эксперименте пополучению рекомбинантной ДНК векторподготавливают к соединению с клони-руемым фрагментом путем расщепленияв одном определенном месте с помощью ре-стрикционной эндонуклеазы. Например, не-большую плазмиду pSC101 можно расще-пить в одном месте ферментом рестрикцииEcoR1. Если с помощью этого фермента две

Рис. 31.19. Соединение молекул ДНКс помощью метода липких кон-цов. Одна из родительских мо-лекул ДНК (показано зеленымцветом) несет гены Р и Q, разде-ленные участком рестрикции,а другая (красный цвет) несетгены X и У. Одна из реком-бинантных молекул несет геныР и У, а другая - Q и X.

Рис. 31.20. Соединение молекул ДНК с по-мощью наращивания poly (dA)-и poly(dT)-концов (коннек-торным методом).

цепи ДНК расщепить наискосок, то обра-зуются комплементарные одноцепочечныеконцы (липкие концы). Предположим те-перь, что фрагмент ДНК, который необхо-димо ввести в эту плазмиду, образован пу-тем расщепления большой молекулы ДНКэндонуклеазой EcoR1. Тогда одноцепо-чечные концы этого фрагмента будут ком-плементарны концам расщепленной плаз-миды. Теперь фрагмент ДНК и плазмидуможно подвергнуть отжигу и соединитьДНК-лигазой (рис. 31.19). Затем бактерииинкубируют в присутствии этой смеси моле-кул ДНК. Небольшую часть бактерий, несу-щих плазмиду, отбирают, исходя из тогочто pSC101 сообщает клеткам устойчивость

к тетрациклину. Затем используют другойметод отбора для выявления клонов, содер-жащих плазмиду со встроенной ДНК.

Второй метод соединения двух нерод-ственных молекул ДНК основан на присое-динении poly(dА)-фрагментов к обоим3'-концам одной молекулы и poly(dТ)-фраг-ментов к обоим 3'-концам другой молекулы(рис. 31.20). Эти гомополимерные последо-вательности синтезируются терминальной

дезоксинуклеотидил-трансферазой (терми-нальной трансферазой) - ферментом, при-соединяющим нуклеотиды к 3'-гидроксиль-ной группе цепи ДНК. Эта трансферазав отличие от ДНК-полимеразы не зависитот матрицы, поэтому с ее помощью можноприсоединить последовательности из ну-клеотидов только одного тина (обычно дли-ной 100 остатков). Ро1у(dА)-концы одной мо-лекулы ДНК отжигают с poly(dT)-конца-ми другой. Длины этих концевых последова-тельностей могут несколько колебаться,поэтому, прежде чем соединить цепи ДНК-лигазой, бреши заполняют с помощьюДНК-полимеразы I. Точно так же можно ис-пользовать для соединения различных мо-лекул ДНК и концевые poly(dG)- и poly(dC)-последовательности.

Третий подход к соединению молекул


Рис. 31.21. Образование липких концовпутем присоединения и расще-пления химически синтезиро-ванного линкера.

ДНК сочетает преимущества метода липкихконцов с универсальным характером(dA—dТ)-метода (коннекторного). К концамфрагмента ДНК или вектора ковалентноприсоединяют химически синтезированныйлинкер, т.е. связующую цепь (длиной от ше-сти до десяти пар оснований), чувстви-тельный к расщеплению каким-либо фер-ментом рестрикции. 5'-концы десятинуклео-тидного линкера и молекулы ДНК фосфо-рилируют полинуклеотидкиназой и соеди-няют лигазой фага Т4, которая можетобразовывать ковалентную связь между мо-лекулами ДНК с тупыми концами. Еслиобработать эти концевые участки соответ-ствующим ферментом рестрикции, обра-зуются липкие концы (рис. 31.21). Такимобразом, почти у любой молекулы ДНКможно вызвать образование липких концов,соответствующих специфичности данногофермента рестрикции.

31.10. Плазмиды и фаг лямбда -наиболее подходящие векторыдля клонирования ДНК в бактерияхДля увеличения эффективности проникнове-ния рекомбинантных ДНК в клетку и облег-чения отбора содержащих такие молекулыбактерий создаются новые векторы. Напри-мер, плазмида pBR322 содержит гены


устойчивости к тетрациклину и ампицилли-ну (сходный с пенициллином антибиотик).Эту плазмиду пять различных рестриктазрасщепляют в каком-то одном определен-ном месте каждая (рис. 31.22). ВведениеДНК в участок рестрикции EcoR1 не затра-гивает генов устойчивости к антибиотикам.В то же время введение ДНК в участки ре-стрикции HindIII, SalI или BamHI приводитк инактивации гена устойчивости к тетраци-клину; это явление называется инактива-цией вставкой (инсерционной инактива-цией). Клетки, содержащие pBR322 совставленной ДНК, устойчивы к ампицилли-ну, но чувствительны к тетрациклину; по-этому их легко отобрать. Клетки, которыене смогли воспринять ДНК вектора, чув-ствительны к обоим антибиотикам, а клет-ки, содержащие pBR322 без вставки ДНК,к обоим антибиотикам устойчивы.

Другая группа векторов создана на осно-ве плазмиды ColE1, кодирующей колицинЕ - белковый токсин, убивающий некоторыештаммы Е. coli. Преимущество использова-ния этих колициногенных плазмид в качестве

Рис. 31.22. Генетическая карта плазмидыpBR322, несущей два генаустойчивости к антибиотикам.

Рис. 31.23. Электронная микрофотогра-фия плазмид ColE1. (Печатает-ся с любезного разрешенияд-ра Jack Griffith.)

векторов состоит в том , что их репликацияне находится под строгим контролем.В клетке, содержащей ColE1, обычно имеет-ся 25 копий плазмиды. Обработка клетокхлорамфениколом блокирует синтез белкаи репликацию клеточной хромосомы. Одна-ко репликация ColE1 в этих условиях про-должается. В результате в клетках, обрабо-танных хлорамфениколом, может накапли-ваться 1000 копий ColE1, так что количествоэтой плазмиды достигает примерно поло-вины всей клеточной ДНК1.

Фаг λ - другой удобный вектор. Большиеучастки его ДНК, имеющей в длину 48 kb,не являются необходимыми для литическойинфекции или интеграции и могут быть за-мещены чужеродной ДНК. Были сконструи-рованы мутантные фаги λ, предназначенныедля клонирования ДНК. Один из этих му-тантов, который называется λgt = λ, содер-жит два участка расщепления EcoR1 вместопяти, имеющихся в фаге дикого типа(рис. 31.24). После расщепления цен-тральный участок молекулы ДНК этого фа-га λ можно удалить. Два оставшихся кускаДНК составляют вместе 72% длины всегогенома. Это количество ДНК недостаточно

1 Плазмида pBR322 создана на основе ColE1,поэтому она обладает способностью точно также накапливаться в клетках в присутствии хлор-амфеникола.- Прим. перев.

для упаковки в головку фага λ. Длина ДНК,которая может быть легко упакована в го-ловку, достигает 75-105% длины генома ди-кого типа. Однако достаточно длинныйфрагмент ДНК (скажем, длиной 10 kb),вставленный между двумя концами ДНКфага λ, позволяет такой рекомбинантноймолекуле ДНК (93% генома) быть упако-ванной в головке (инкапсидироваться). По-чти все инфекционные частицы λ, образо-ванные таким способом, будут содержатьвставленный кусок чужеродной ДНК. Ещеодно преимущество использования этих ви-рионов в качестве векторов состоит в том,что они проникают в бактерии с гораздо бо-лее высокой эффективностью, чем плаз-миды. К настоящему времени разработаныметоды упаковки молекул ДНК in vitroс образованием инфекционных вирионов λ.Для использования в качестве векторов бы-ли сконструированы самые разнообразныемутанты фага λ. Некоторые из них могутслужить векторами для вставок фрагментовДНК, достигающих 40 kb.

31.11. Из суммарной геномной ДНК,расщепленной рестриктирующимиэндонуклеазами, можно выделитьс помощью клонирования определенныеэукариотические геныКак уже говорилось в предыдущей главе, ис-следование эукариотических геномов пред-ставляет огромные трудности. Ген длиной1 kb составляет 2,5•10-4 генома Е. coli и все-го лишь 3,4•10-7 генома млекопитающих.Методы рекомбинантных ДНК позволяютв настоящее время вводить эукариотическийген в Е. coli, что сильно упрощает задачу.Эксперимент начинается с частичного рас-щепления ДНК эукариотического генома,чтобы получить случайные фрагменты сосредней длиной примерно 20 kb (рис. 31.25).К концам этих фрагментов присоединяютсинтетические линкеры, образуют липкиеконцы и затем присоединяют к какому-ни-будь вектору, например к ДНК фага λ. Приупаковке ДНК в вирионы in vitro происхо-дит отбор рекомбинантных молекул ДНК,содержащих большие вставки. Затем этимирекомбинантными фагами заражают клеткиЕ. coli. Получается лизат, содержащий фраг-менты эукариотической ДНК, заключеннойв фаги и размноженной примерно в мил-лион раз. Этот лизат представляет собой би-


Рис. 31.24. В качестве вектора для клони-рования может быть использо-ван мутант фага λ. В ходе реак-ции упаковки фага происходитотбор молекул ДНК, содержа-щих вставку.

блиотеку клонированной эукариотическойДНК.

Затем в такой библиотеке можно прове-сти отбор для идентификации фаговых кло-нов, содержащих нужный эукариотическийген. Вычисление показывает, что лишь одиниз 180000 клонов будет содержать уни-кальный эукариотический ген. Поэтому не-обходима очень быстрая и эффективнаяпроцедура отбора. Она основана на гибри-дизации. Присутствие определенной после-довательности ДНК в одной бляшке фага

λ можно выявить с помощью радиоактивноймолекулы комплементарной ДНК или РНКв качестве гибридизационной пробы. Связы-вание этой пробы можно обнаружить мето-дом радиоавтографии. Таким образом, мож-но проверить 1 млн. клонов за один день.Итак, клон, соответствующий определенно-му эукариотическому гену, можно легкоидентифицировать и выделить при условии,что имеется транскрибированная с негоРНК в более или менее чистом виде.


31.12. Эукариотические гены могуттранскрибироваться в бактериальныхклеткахРекомбинантные молекулы ДНК, содержа-щие бактериальные гены, часто экспресси-руются в клетках Е. coli. Например, клони-рование триптофанового оперона Е. coliв составе плазмидного вектора ColE1 при-водит к образованию больших количествпяти биосинтетических ферментов, закоди-рованных в этом опероне. Количество этихферментов примерно в 20 раз выше, чемв обычной клетке Е. coli, так как рекомби-нантная плазмида представлена многимикопиями. ДНК дрожжей, простого эукарио-тического организма, также может экспрес-сироваться в бактериях. В одном исследова-нии в качестве клетки-хозяина использовалимутант Е. coli, нуждающийся в гистидине,так как он не содержал имидазолглицерол-фосфат-дегидрогеназы. При заражении это-го мутанта фагом λ, содержащим фрагментдрожжевой ДНК, появилось несколько бак-териальных клонов, которые уже не нужда-лись в экзогенном гистидине. Вставленныйкусок дрожжевой ДНК нес недостающийген, который экспрессировался с помощьюмеханизмов транскрипции и трансляциибактериальной клетки.

Могут ли гены млекопитающих экспрес-сироваться в бактериях? Для ответа на этотвопрос в клетки Е. coli ввели ген инсулинакрысы (рис. 31.26). Отправной точкой этого

кДНК -комплементарная ДНК, синтезированная обратной транскриптазой на РНК-матрице.

исследования послужила инсулинома - опу-холь поджелудочной железы, выделяющаябольшое количество инсулина. Эта опухольбогата мРНК препроинсулина, предше-ственника активного гормона (разд. 35.9).С помощью обратной транскрипции этоймРНК была получена двухцепочечная ком-плементарная ДНК (кДНК), а затем еевключили в плазмидный вектор. Почемуименно кДНК, а не геномную ДНК ввелив Е. соli? Как мы уже говорили, многие эука-риотические гены содержат вставочные по-следовательности, которые вырезаются изпервичных транскриптов (разд. 29.16). По-скольку бактерии, по всей вероятности, неспособны удалять эти последовательности,представляется желательным трансформи-ровать их участком ДНК, комплемен-тарным зрелой мРНК. Действительно, ока-залось, что несколько бактериальных кло-нов, трансформированных инсулиновойкДНК, синтезируют небольшое количествопредшественника инсулина (около 100 ко-пий на клетку). Недавно был получен ещеодин важный результат: последователь-ность ДНК, кодирующая овальбумин кури-ного яйца, экспрессируется в клетках Е. coli.Около 1,5% белка, синтезированного в та-ких трансформированных бактериях, пред-ставляет собой полные молекулы овальбум-ина (масса 43 кДа). Очевидно, гены эукарио-тических белков могут экспрессироватьсяв бактериях.

31.13. Химически синтезированный генпептидного гормона соматостатинаэкспрессируется в клетках Е. coliПоследние достижения в химическом синте-зе заданных последовательностей ДНК рас-ширили масштаб и возможности метода ре-комбинантных ДНК. Можно синтезироватьde novo гены с практически любой нуклео-тидной последовательностью и вставить ихв вектор для введения в Е. coli. Прекраснымпримером такого подхода служит синтез ге-на соматостатина - 14-членного пептида(рис. 31.27), который обнаруживается в эк-страктах гипоталамуса. Соматостатин по-давляет секрецию гормона роста, инсулинаи глюкагона. Молекулу ДНК, кодирующуюэтот пептид, синтезировали путем соедине-ния восьми олигонуклеотидных блоков.Этот ген соединили с геном β-галактози-

дазы, локализованном в плазмидном векто-ре. При трансформации E.coli начался син-тез гибридного белка, в котором сомато-статин был присоединен к β-галактозида-зе. Пептидную связь между этими двумякомпонентами расщепляли in vitro с по-мощью бромциана (разд. 2.7). Для этоговстроенный ген содержал кодон метиони-

Рис. 31.25. Стратегия клонирования опре-деленного эукариотическогогена, начиная с расщеплениясуммарной геномной ДНК.


на перед первым кодоном соматостатина.С-конец соматостатина был свободен, таккак после кодона последнего остатка пеп-тида были расположены два стоп-кодона(рис. 31.27). На долю химерного белка при-ходилась значительная часть клеточногобелка (около 3%). Более того, полученныйтаким способом соматостатин обладал био-логической активностью. Следовательно,клонированием химически синтезированногогена можно получать функционально ак-тивный полипептид.

31.14. Перспективы клонирования геновМетод рекомбинантных ДНК открылновые горизонты в молекулярной биологии.Увеличение числа генов путем клонирова-ния в бактериях дает неограниченные коли-чества ДНК для электронно-микроскопиче-ского анализа и определения последова-тельности нуклеотидов. Исследуются специ-фические участки ДНК, отвечающие заподвижность генов, репликацию ДНКи транскрипцию. Возникают совершенноновые направления; примером может слу-жить открытие вставочных последователь-

Рис. 31.26. Синтез предшественника ин-сулина - проинсулина в транс-формированных клетках Е. coli.


ностей во многих эукариотических генах.Появилась возможность быстро картиро-вать сложные хромосомы и разделять их наотдельные элементы, которые поддаютсяразличным манипуляциям. Темпы исследо-ваний постоянно нарастают. Кроме того,клонирование генов становится важнымспособом получения определенных белковв больших количествах. Например, с по-мощью рекомбинантных молекул можноувеличить в 500 раз количество ДНК-ли-газы, образующейся в клетках Е. coli. На-иболее многообещающим представляетсясинтез пептидов и белков эукариот транс-формированными бактериями. В недалекомбудущем такие гормоны, как инсулин, и та-кие противовирусные агенты, как интерфе-рон, будут продуцироваться бактериями1.В фармакологии начинается новая эра, ко-торая, по-видимому, окажет глубокое воз-действие на медицину. Исследуются такжевозможности клонирования генов для уве-личения сельскохозяйственного производ-ства. Эукариотические гены вводят в на-стоящее время не только в бактерии, но ив эукариотические клетки. Например, вирусSV-40 был использован в качестве векторадля переноса гена глобина кролика в клет-ки почек обезьяны. Такие зараженные клет-ки синтезировали значительные количестваβ-глобина кролика. Этот эксперимен-тальный подход является многообещаю-щим методом расшифровки регуляторныхмеханизмов экспрессии эукариотических ге-нов.

ЗаключениеПри генетической рекомбинации новая мо-лекула ДНК образуется путем разрываи воссоединения цепей ДНК. Взаимообмен

может произойти между любой парой гомо-логичных последовательностей родитель-ских молекул ДНК, и потому этот процесназывается общей генетической рекомбина-цией. У Е. coli общая рекомбинация осу-

1 В Англии и США уже продается инсулин, син-тезированный клетками бактерий.- Прим. перев.

Рис. 31.27. Синтез пептидного гормонасоматостатина клетками Е.со-li, трансформированными хи-мически синтезированным ге-ном.

ществляется под действием генов rec. БелокrecВС - нуклеаза; она образует одноцепо-чечную ДНК, которая может внедрятьсяв двухцепочечную молекулу ДНК. Эта реак-ция связывания одноцепочечной молекулыкатализируется белком recА, который одно-временно гидролизует АТР.

В генетических перестройках негомоло-гичных локусов участвуют подвижные гене-тические элементы, называемые транспозо-нами (элементы, способные к переносу -транспозиции). Плазмиды (небольшие коль-цевые двухцепочечные ДНК) - важный классподвижных генетических элементов. Эти до-полнительные хромосомы несут гены, отве-чающие за инактивацию антибиотиков, мета-болизм природных соединений и образова-ние токсинов. Плазмиды могут реплициро-ваться автономно или интегрироватьс хромосомой клетки-хозяина. ФакторF (фактор плодовитости) - плазмида, сооб-щающая бактериям способность передаватьгены другим бактериям путем коньюгации.Для коньюгации необходим непосред-ственный физический контакт между донор-ной (F + ) и реципиентной (F - - ) клетками.Плазмиды факторы R обеспечивают устой-

чивость к антибиотикам. Более крупные изэтих плазмид содержат фактор переносаустойчивости (RTF), обусловливающийпереход плазмиды в другую бактерию приконьюгации. Некоторые гены, обеспечиваю-щие устойчивость к антибиотикам, могутбыть сцеплены с областью RTF. Поэтомумножественная устойчивость к лекар-ственным средствам может быть трансмис-сивной. Транспозоны обладают высокойподвижностью, так как они обрамлены IS-элементами. Эти концевые последователь-ности направляют действие белков, уча-ствующих в их интеграции с ДНК. Транспо-зон не обязательно гомологичен реципиент-ной ДНК.

В лаборатории можно создать новые со-четания неродственных генов и клонироватьих в клетках-хозяевах. Прежде всего синте-зируется рекомбинантная молекула ДНКпутем соединения какого-либо фрагментаДНК с ДНК вектора, который может авто-номно реплицироваться в подходящем хо-зяине. Наиболее подходящие векторы - фаглямбда, вирус SV-40 и плазмиды. Ферментырестрикции и ДНК-лигаза - основные ин-струменты для получения новых молекулДНК. Липкие концы, гомополимерные кон-цевые фрагменты и химически синтезиро-ванные линкеры - три способа соединения


молекул ДНК. Рекомбинантные молекулыДНК можно ввести в клетки-хозяева, зара-жая их реконструированным вирусом илиинкубируя их в присутствии голых молекулДНК. Последний этап заключается в отбореклеток, несущих нужную молекулу реком-бинантной ДНК, с использованием какого-либо отличительного свойства введенногогена (например, устойчивости к антибиоти-ку). Имея рестриктазный гидролизат геном-ной ДНК, можно клонировать в клетках Е.

coli определенные эукариотические гены.Многие эукариотические гены могут тран-скрибироваться и транслироваться в бакте-риальных клетках. Клонирование генов —мощный метод исследования организациии выражения сложных генов. Кроме того,технология рекомбинантных ДНК - весьмамногообещающий метод для синтеза боль-ших количеств генов и белков, имеющихсяв обычных клетках в ничтожных количе-ствах.


С чего начатьGilbert W., Villa-Komaroff L., 1980. Us-eful proteins from recombinant bacteria,Sci. Amer., 242(4), 74-94.Cohen S.N., Shapiro J.A., 1980.Transposable genetic elements, Sci.Amer., 242(2), 40-49.Abelson J., Butz E. (eds.), 1980.Recombinant DNA, Science, 209,1317-1438. (Этот весьма содержа-тельный выпуск журнала Science со-держит много прекрасных статей, по-священных структуре и изменениямгенов эукариот и экспрессии клониро-ванных генов.)Clowes R.С., 1973. The molecule ofinfectious drug resistance, Sci. Amer.,228(4), 18-27.Cohen S.N., 1975. The manipulation ofgenes, Sci, Amer., 233(1), 24-33. (Этаи некоторые другие статьи, посвя-щенные той же проблеме, помещеныв книге Freifelder D. (ed.), RecombinantDNA, Freeman, 1978.)Stanier R.Y., Adelberg E.A., Ingra-ham J.L., 1976. The Microbial World(4 th ed.), Prentice-Hall. (Особенноудачна гл. 15, посвященная рекомби-нации, конъюгации и трансдукции.)

Генетическая рекомбинацияStahl F.W., 1979. Genetic Recom-bination, Freeman.Potter H., Dressler D., 1978. In vitrosystem from Escherichia coli thatcatalyzes generalized genetic recom-bination, Proc. Nat. Acad. Sci., 75,3698-3702.McEntee K., Weinstock G.M., Leh-man I.R., 1979. Initiation of generalrecombination catalyzed in vitro by therecA protein of E. coli, Proc. Nat. Acad.Sci., 76, 2615-2619.Cunningham R.P., Shibata Т., Gas-Gupta С., Radding C.M., 1979. Singlestrands induce recA protein to unwind

duplex DNA for homologous pairing,Nature, 281, 191-195.Radding C.M., 1978. Genetic recom-bination: strand transfer and mismatchrepair, Ann. Rev. Biochem., 47, 847-880.

Подвижные генетические элементыCalos M.P., Miller J.H., 1980. Trans-posable elements, Cell, 20, 579-595.Cohen S.N., 1976. Transposable geneticelements and plasmid evolution, Nature,263, 731-738.Kleckner N.. 1977. Translocatable ele-ments in procaryotes, Cell, 11, 11-23.Hicks J., Strathern J.N., Klar A.J.S.,1979. Transposable mating type genes inSaccharomyces cerevisiae, Nature, 282,478-483.Gill R.E., Heffron F.. Falkow S., 1979.Identification of the protein encoded bythe transposable element Tn3 which isrequired for its transposition, Nature,282, 797-801.Chou J., Lemaux P.G.,Casadaban M.J.,Cohen S.N.. 1979. Transposition proteinof Tn3: identification and characte-risation of an essential represser-con-trolled gene product, Nature, 282,801-806.Bukhari A.I., Shapiro J.A., Adhya S.L.(eds.), 1977. DNA Insertion Elementsand Episomes, Cold Spring HarborLaboratory.Broda P., 1979. Plasmids, Freeman.[Брода П. Плазмиды.- М.: Мир,1982.]Конструирование и клонированиерекомбинантных геновSetlow J.K., Hollaender A. (eds.), 1979.Genetic Engineering: Principles andMethods, Plenum.Scott W.A., Werner R., 1977. MolecularCloning of Recombinant DNA,Academic Press.Helinski D.R., 1978. Plasmids as vehiclesfor gene cloning: impact on basic andapplied research, Trends Biochem. Sci.,3, 10-14.Cameron J.R., Panesenko S.M., Leh-man I.R., Davis R.W., 1975. In vivo

construction of bacteriophage л carryingsegments of the Escherichia colichromosome: selection of hybridscontaining the gene for DNA ligase,Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 3416-3420.Collins J., Hohn B., 1978. Cosmids:a type of plasmid gene-cloning vectorthat is pack adeable in vitro inbacteriophage heads, Proc. Nat. Acad.Sci, 75, 4242-4246.Maniatis Т., Hardison R.C., Lacy E.,Lauer J., O'Connell C., Quon D.,Sim G.K., Efstratiadis A., 1978. Theisolation of structural genes fromlibraries of eucaryotic DNA, Cell, 15,687-701.

Экспрессия клонированных геновVilla-Komaroff L, Efstratiadis A.,Broome S., Lomedico P., Tizard R.,Naber S.P., Chick W.L., Gilbert W.,1978. A bacterial clone synthesizingproinsulin, Proc. Nat. Acad. Sci., 75,3727-3731.Burrell C.J., Mackory P., Greena-way P.J., Hofschneider P.H., MurrayK., 1979. Expression in Escherichia coliof hepatitis В virus DNA sequencescloned in plasmid pBR322, Nature, 279,43-47.Mulligan R.C., Howard B.H., Berg P.,1979. Synthesis of rabbit β-globin in cul-tured monkey kidney cells followinginfection with a SV40 β-globin re-combinant genome, Nature, 277,108-114.

Химический синтез геновKhorana H.G., 1979. Total synthesis ofa gene, Science, 203, 614-625.Itakura K., Hirose Т., Crea R.,Riggs A.D., Heyneker H.L, Bolivar F.,Boyer H.W., 1977. Expression inEscherichia coli of a chemicallysynthesized gene for the hormonesomatostatin, Science, 198, 1056-1063.Crea R., Kraszewski A., Hirose Т.,Itakura K., 1978. Chemical synthesis ofgenes for human insulin, Proc. Nat.Acad. Sci., 75, 5765-5769.

Часть

МолекулярнаяфизиологияВзаимосвязь между информацией,конформацией и метаболизмом вфизиологических условиях

Микрофотография палочексетчатки, полученная с по-мощью сканирующего микро-скопа. Для возбуждения палоч-ки достаточно одного фотона.(Печатается с любезного разре-шения д-ра Deric Bownds.)

ГЛАВА 32Оболочкибактериальных клетокБактериальные клетки в отличие от жи-вотных клеток окружены клеточной стен-кой, которая придает им определенную фор-му и служит механической опорой. Однаклеточная мембрана не способна выдержатьто высокое осмотическое давление, котороесоздается в бактериальной клетке вслед-ствие большой концентрации метаболитови которое может достигать 20 атм. Бакте-риальные клетки, лишенные клеточных сте-нок, в обычной среде лизируются.

Стенки бактериальных клеток предста-вляют значительный интерес для медицины.Дело в том, что именно клеточные стенкии связанные с ними вещества определяютвирулентность бактерий. Так, введениемэкспериментальным животным выделенныхбактериальных клеточных стенок удаетсявоспроизвести симптомы многих ми-кробных заболеваний. На клеточных стен-ках находятся специфические антигены бак-терий. Введением животному экстрактаклеточных стенок некоторых бактерий мож-но выработать у него иммунитет к этим бак-териям. Наконец, при подавлении синтезаклеточных стенок бактерии погибают.Именно на этом основан механизм действияпенициллина и некоторых других антибиоти-ков.

Уже более полувека бактерии классифи-цируют на грам-положительные и грам-отрицательные в зависимости от их реакциина окраску по Граму. Основа этого эмпири-чески найденного различия стала теперь по-нятной. Указанные классы бактерий разли-чаются по типу клеточной оболочки(рис. 32.2). Плазматическая мембрана грам-положителъных бактерий окружена массив-

218Часть V.Молекулярная физиология

ной клеточной стенкой толщиной, как пра-вило, 250 А, состоящей из пептидогликанаи тейхоевой кислоты. У грам-отрица-тельных бактерий клеточная оболочкаустроена более сложно: плазматическаямембрана окружена клеточной стенкой тол-щиной 30 А, состоящей из пептидогликана;далее располагается наружная мембранатолщиной 80 А, представляющая собой мо-заику белков, липидов и липополисахари-дов.

Рис. 32.1. Электронная микрофотогра-фия выделенной клеточнойстенки Bacillus licheniformis.(Печатается с любезного разре-шения д-ра Nathan Sharon.)

Рис. 32.2. Схематическое изображениеклеточных оболочек грам-по-ложительных (А) и грам-отри-цательных (Б) бактерий.

32.1. Клеточная стенка - это огромнаямешковидная макромолекулаРассмотрим структуру и биосинтез клеточ-ной стенки Staphylococcus aureus - грам-по-ложительной бактерии, вызывающейгнойные процессы в таких тканях, как кожа,кости и легкие. Макромолекула, образую-щая клеточную стенку этой бактерии, назы-вается пептидогликаном, поскольку она со-стоит из пептидных и углеводных единиц.В пептидогликане линейные полисахаридныецепи поперечно сшиты короткими пептида-ми. Благодаря обилию поперечных сшивоквозникает одна огромная мешковидная ма-кромолекула. В выделенном состоянии кле-точные стенки сохраняют свою исходнуюформу (т.е. форму той бактерии, которуюони окружали).

В состав пептидогликана входят три по-вторяющиеся единицы (рис. 32.3): 1) диса-харид N-ацетилглюкозамина (NAG) и N-ацетилмурамовой кислоты (NAM), соеди-ненных β-1,4-гликозидной связью; 2) тет-рапептид из L-аланина, D-глутамина, L-ли-зина, и D-аланина; 3) пентаглициновый пеп-тидный мостик. Тетрапептид представляетсобой совершенно необычное соединениев двух отношениях: в нем содержатсяD-аминокислоты, никогда не встречающие-ся в белках, и, кроме того, входящий

в его состав остаток D-глутамина образуетпептидную связь с γ-карбоксильной груп-пой своей же боковой цепи.

В интактном протеогликане NAG и NAMчередуются последовательно, образуя ли-нейную полисахаридную цепь. Пентаглици-новый пептид соединяет остатки NAM,принадлежащие разным полисахаридным

Рис. 32.3. Основное структурное звенопептидогликана из Staphylo-coccus aureus.

32. Оболочки бактериальныхклеток 219

цепям. Аминогруппа пептида (Gly)5 обра-зует пептидную вязь с карбоксильной груп-пой D-аланина, тогда как карбоксильнаягруппа (Сlу)5 дает пептидную связь с ε-ами-ногруппой боковой цепи L-лизина.

32.2. Стадии синтеза пептидогликанаСинтез пептидогликана происходит в пятьстадий.

1. На остатке NAM, присоединенномк уридиндифосфату, выстраивается пептид-ное звено.

2. Образовавшееся NAM-пептидное звенопереносится на липид-переносчик. Значениеэтой стадии для синтеза клеточной стенкисостоит в следующем. Конечный полимери-зованный продукт расположен вне клетки (снаружной стороны клеточного барьера про-ницаемости), тогда как его предшественниксинтезируется внутри клетки. UDP, будучисоединением полярным, не проникаетсквозь клеточную мембрану. Липидный жепереносчик как совершенно неполярное со-

Рис. 32.4. Схематическое изображениепептидогликана. Сахара пока-заны желтым цветом, тетра-пептиды - красным, пентагли-циновые мостики синим. Бла-годаря обилию перекрестныхсшивок клеточная стенка пред-ставляет собой одну огромнуюмешковидную макромолекулу.


единение способен совершать челночныедвижения через мембрану.

3. К NAM-пептидной единице, связаннойс липидным переносчиком, присоединяютсяNAG и пентаглициновый мостик.

4. Образовавшееся дисахарид-пептидноезвено переносится от липидного переносчикана растущую полисахаридную цень.

5. Отдельные полисахаридные цепи попе-речно связываются пентаглициновыми мо-стиками в ходе реакции транспептидации.

32.3. Синтез UDP-углевод-пептидногозвенаБиосинтез пептидогликанов начинается собразования активированных сахаров. Ури-диндифосфат-N-ацетилглюкозамин (UDP-NAG) синтезируется из N-ацетилглюкоз-амин-1-фосфата и UTP в реакции, проте-кающей за счет гидролиза пирофосфатнойсвязи (рис. 32.5). Уридиндифосфат-N-аце-тилмурамовая кислота (UDP-NAM) обра-зуется из UDP-NAG и фосфоенолпирувата(рис. 32.6).

Рост пептидной цепи начинается с образо-вания пептидной связи между аминогруп-пой L-аланина и карбоксильной группойостатка N-ацетилмурамовой кислотыв UDP-NAM. Далее последовательно при-соединяются D-глутамат, L-ЛИЗИН и дипеп-тид D-аланил-D-аланин (рис. 32.7). D-амино-кислоты образуются из соответствующихL-изомеров под действием рацемаз, содер-жащих в качестве простетической группыпиридоксальфосфат. Образование каждойиз этих пептидных связей протекает за счетэнергии АТР. Подчеркнем, что синтез в дан-ном случае осуществляется не по обычномумеханизму синтеза белков на рибосомах,а специальными ферментами. Следователь-но, информация относительно последова-тельности аминокислот определяется толь-ко специфичностью ферментов, а не нуклео-тидной последовательностью информа-ционной РНК. Пептид такого рода не могбы быть синтезирован обычным путем нарибосомах, поскольку он включает D-ами-нокислоты и γ-пептидную связь.

32.4. Перенос углевод-пептидного звенана липидный переносчик

На следующем этапе происходит переносактивированного углевод-пептидного звенаот UDP на липидный переносчик (рис. 32.8).Последний представляет собой длиннонепо-чечный спирт, содержащий 11 изопреновых

Рис. 32.5. Синтез UDP-NAG.

Рис. 32.6. Синтез UDP-NAM.

единиц и потому высокогидрофобный в от-личие от UDP. По-видимому, именно бла-годаря гидробофному характеру этогоС55-липида новообразованное углевод-пеп-тидное звено преодолевает барьер прони-цаемости, которым служит клеточная мем-брана.

Вспомним, что другой высокогидро-фобный переносчик - долихолфосфат - уча-ствует в синтезе олигосахаридов, соста-вляющих сердцевину (олигосахаридного«ядра») гликопротеинов у эукариот(разд. 29.31).

32.5. Синтез дисахарид-пептидного звена,прикрепленного к липидному переносчикуСледующий этап - присоединение NAGк остатку NAM в углевод-пептидном звене,прикрепленном к липидному переносчику.Донор активированного углевода UDP-NAG вступает в реакцию с С-4 остатка NAMи между этими сахарами образуется β-1,4-гликозидная связь (рис. 32.9). Далее в ходеАТР-зависимой реакции NH4

+ амидирует

свободную α-карбоксильную группу D-глу-таминовой кислоты в пептиде. Вслед за этимна ε-аминогруппе остатка лизина в пептидевыстраивается пентаглициновый мостик.


Рис. 32.7. Синтез пентапептида наUDP-NAM.

Рис. 32.8. Структура липидного перено-счика, участвующего в биосин-тезе клеточных стенок.

Рис. 32.9. Синтез дисахарид-пептидногозвена на липидном переносчи-ке.

Этот пентапептид синтезируется путем по-следовательного присоединения глициновыхостатков, доставляемых глицил-тРНК. Этоединственный случай, когда тРНК служитдонором аминокислот в ходе внерибосом-ного синтеза пептида. На этом завершаетсяобразование основной структурной еди-ницы клеточной стенки.

32.6. Перенос дисахарид-пептидного звенана растущую полисахаридную цепьДисахарид-пептидное звено переносится ли-пидным переносчиком на нередуцирующийконец растущей полисахаридной цепи. Реак-


ция протекает таким ооразом. Атом углеро-да С-1 остатка NAM находится в активиро-ванном состоянии, поскольку он связанс липидным переносчиком пирофосфатнойсвязью. Поэтому он вступает в реакциюс С-4 концевого остатка NAG растущей по-лисахаридной цепи, образуя в итоге β-1,4-гликозидную связь (рис. 32.10).

Липидный переносчик высвобождаетсяв форме пирофосфата и далее гидролизует-ся до монофосфата специфической фосфата-зой. Этот этап дефосфорилирования пред-ставляет собой, по существу, регенерирова-ние переносчика, способного акцептироватьуглевод-пептидное звено от UDP. Известенпептидный антибиотик бацитрацин, ингиби-рующий биосинтез клеточных стенок путемторможения этого этапа:

Рис. 32.10. Перенос дисахарид-пептидно-го звена на растущую полиса-харидную цепь.

32.7. Поперечные мостики междуполисахаридными цепями образуютсяв реакции транспептидированияВ результате реакции транспептидированиямежду полисахаридными цепями образуют-ся поперечные сшивки, что приводит к фор-мированию одной огромной молекулы, на-поминающей по виду мешок. В ходетранспептидирования концевая аминогруппаодного пентаглицинового мостика атакуетпептидную связь между остаткамиD-Ala-D-Ala другой пептидной единицы(рис. 32.11). При этом образуется пептиднаясвязь между глицином и одним из остатковD-аланина, а второй остаток D-аланина выс-вобождается. Фермент, катализирующийэту реакцию,- гликопептид-транспептидаза.Обратите внимание, что синтез этой попе-речной связи не требует расхода АТР: реак-ция идет за счет свободной энергии, уже со-держащейся в связи D-Аlа-D-Аlа. Формиро-вание пептидной связи таким необычнымспособом определяется, очевидно, тем, чтореакция протекает вне клетки, т.е. в остсут-ствие АТР. Вспомните, что путем трансами-нирования без использования АТР обра-зуются пептидные связи при поперечнойсшивке нитей фибрина (разд. 8.21).

32.8. У грам-положительных бактерийпептидогликан покрыт тейхоевой кислотойПоверхность грам-положительных бакте-рий состоит из тейхоевой кислоты, котораяпредставляет собой полимер остатков гли-

церола (или другого углевода, например ри-битола), соединенных фосфодиэфирнымимостиками (рис. 32.12). Свободные гидрок-сильные группы этерифицируются с алани-ном или сахарами, в частности с глюкозой.Тейхоевая кислота присоединяется к скелетупептидогликана - последовательностиостатков NAG-NAM - фосфодиэфирнойсвязью. Удлинение цепей тейхоевой кис-лоты происходит путем переноса глицерол-фосфата от CDP-глицерола на свободнуюконцевую ОН-группу цепи. Остатки глю-козы присоединяются к гидроксильнымгруппам скелета тейхоевой кислоты в ходереакции с UDP-глюкозой.

Рис. 32.11. Аминогруппа пентаглициново-го мостика атакует пептиднуюсвязь между двумя остаткамиD-Ala; в результате форми-руется поперечная связь (сшив-ка).


Рис. 32.12. Строение тейхоевой кислоты.

32.9. Пенициллин вызывает гибельрастущих бактерий, ингибируя синтезклеточных стенокПенициллин был открыт в 1928 г. Алексан-дером Флемингом (Alexcander Fleming) до-вольно случайно.

При работе с различными штаммами стафи-лококка часть чашек с культурами откладыва-ли в лабораторную коллекцию и время отвремени просматривали. Поскольку, когдачашки просматривали, их приходилось откры-вать, в чашки неизбежно попадали из воздухаразличные микроорганизмы. Обратили внима-ние на то, что вокруг большой колонии пророс-шей плесени колонии стафилококка стали про-зрачными и явно подвергались лизису.

Плесень пересеяли и далее стали проводитьпредварительное изучение того бактериологи-ческого вещества, которое, очевидно, синтези-ровалось плесенью и диффундировало в окру-жающую среду. Оказалось, что бульон,в котором на протяжении 1-2 недель при ком-натной температуре культивировали плесень,приобретал выраженные ннгибирующие, бак-терицидные и бактериолитические свойствав отношении многих распространенных пато-генных бактерий.

Далее было обнаружено, что экстракт изплесени Pinicillium при введении животнымне оказывал заметного токсического дей-ствия. Это послужило стимулом для даль-нейших исследований. Однако, когда Фле-минг попытался сконцентрировать и очи-


стить активный антибиотик, по его словам,оказалось, что «пенициллин легко разру-шается, и, несмотря на все усилия, мы потер-пели неудачу. Мы были бактериологи, а нехимики, и наши относительно простые при-емы не принесли успеха».

Прошло 10 лет, прежде чем к пеницилли-ну вернулись снова. Патолог Хоуард Флори(Howard Florey) и биохимик Эрнст Чейн(Ernst Chain) провели ряд глубоких исследо-ваний, итогом которых явилось выделение,химическая характеристика и клиническоеиспользование этого антибиотика. Пени-циллин состоит из тиазолидинового кольца,сочлененного с β-лактамным кольцом,в одном из положений которого находитсятот или иной заместитель (R), присоеди-ненный с помощью пептидной связи. В бен-зилпенициллине, например, R является бен-зильной группой (рис. 32.13 и 32.14). Этаструктура может подвергаться различнымтрансформациям, что служит причиной ла-бильности пенициллина, с которой впервыестолкнулся Флеминг. Особенно неустойчи-во β-лактамное кольцо. Как будет показанониже, это свойство имеет прямое отношениек антибиотической активности пеницил-лина.

В 1957 г. Джошуа Ледерберг (JoshuaLederberg) показал, что бактерии, в обычныхусловиях чувствительные к пенициллину,могут расти в присутствии этого антибиоти-ка, если используется гипертоническая сре-да. Выращенные таким образом микроорга-низмы, так называемые протопласты, ли-

Рис. 32.13. Высокореакционноспособныйучасток пенициллина - пептид-ная связь β-лактамного кольца.В положении R могут стоятьразличные заместители (вариа-бельная группа); в бензилпени-циллине R - бензильная группа.

шены клеточных стенок и потому припереносе в обычную среду подвергаются ли-зису. Отсюда был сделан вывод, что пени-циллин препятствует синтезу клеточных сте-нок бактерий. В 1965 г. Джеймс Парки Джек Стромингер (James Park, JackStrominger) независимо друг от друга при-шли к выводу, что пенициллин блокируетпоследний этап биосинтеза, а именно обра-зование поперечных сшивок.

32.10. Пенициллин блокирует синтезклеточных стенок путем ингибированияреакции транспептидированияПенициллин ингибирует транспептидазу,поперечно сшивающую цепи протеоглика-на:

При нормальном течении реакции транс-пептидаза образует в качестве промежуточ-ного продукта ацильное производное с остат-ком D-аланина в предпоследнем положениипептида (рис. 32.15). Этот промежуточныйпродукт взаимодействует далее с амино-группой концевого глицина другого пепти-да. Как показали недавно проведенные ис-следования, пенициллин ингибирует транс-пептидазу путем образования ковалентнойсвязи с остатком серина в активном центрефермента (рис. 32.16). Комплекс пеницилли-ноил-фермент не подвергается деацилирова-нию. В результате ингибирование транспеп-тидазы пенициллином оказывается необра-тимым.

Почему пенициллин является столь эф-фективным ингибитором транспептидазы?С помощью молекулярных моделей быловыявлено, что пенициллин сходен с одним из

субстратов фермента, а именно с ацил-D-Ala-D-Ala (рис. 32.17). Кроме того, четырех-членное β-лактамное кольцо пенициллина

имеет напряженную конформацию, вслед-ствие чего пептидная связь в нем становитсявысокореакционноспособной. В сущности,пенициллин имеет, по-видимому, структурупереходного состояния нормального суб-страта этого фермента. Другими словами.пенициллин - аналог переходного состояния.

Любопытно сравнить пенициллин с дру-гими необратимыми ингибиторами фермен-тов. Стабильный, неактивный пеницилли-ноил-ферментный комплекс совершенноаналогичен фосфорил-ферментному ком-плексу, образующемуся при взаимодействииорганических фторфосфатов с ацетилхолин-эстеразой или сериновыми протеиназами.Однако специфичность пенициллина намно-го выше, чем у фторфосфатных ингибито-

ров. Мишень действия пенициллина оченьстрого задана его структурным сходствомс концевым участком D-Аlа-D-Аlа новообра-зующейся цепи пептидогликана. След-ствием этой исключительной специфичнос-ти является низкая токсичность пеницилли-на, столь ценная при клиническом использо-вании. В организме человека нет ни одногофермента, распознающего D-Ala-D-Ala, а по-тому пенициллин не может помешать рабо-те наших ферментов.

32.11. Некоторые бактерии резистентнык пенициллину, так как синтезируютразрушающий его ферментРяд бактерий синтезирует пенициллиназу -фермент, способный расщеплять амиднуюсвязь в β-лактамном кольце пенициллинас образованием пенициллоиновой кислоты,лишенной антибиотической активности:


Рис. 32.14. Модель бензилпенициллина.

Был выделен целый ряд близких по струк-туре пенициллиназ, имеющих массу около30 кДа и высокое число оборотов (порядка103 с - 1 ) . Активность фермента в значитель-ной мере зависит от природы R-группы,присоединенной к β-лактамному кольцу пе-нициллина. Поэтому полусинтетические пе-нициллины с R-группами, защищающимиих от действия пенициллиназы, представ-ляют большую ценность для клиническихцелей.

Ген, кодирующий пенициллиназу, локали-зован в различных плазмидах (разд. 31.6).Эти внехромосомные генетические эле-менты у некоторых видов бактерий спо-собны быстро появляться и исчезать. В рядебактериальных штаммов пенициллиназаявляется индуцируемым ферментом. По-ви-димому, пенициллиназа возникла в ходе эво-люции как механизм детоксикации, посколь-ку она свойственна только микроорганиз-

Рис. 32.15. В ходе реакции транспептиди-рования в качестве промежу-точного продукта образуетсяацил—фермент.


мам, клеточная стенка которых образованапептидогликаном. Судя по тому, что утратагена пенициллиназы не вызывает поврежде-ния клетки в отсутствие антибиотика, у фер-мента, видимо, нет иной функции, кромеинактивации пенициллина. К тому жеимеется хорошая корреляция между сте-пенью устойчивости к действию пеницил-лина и общей пенициллиназной актив-ностью.

32.12. Грам-отрицательные бактерииокружены наружной мембраной,богатой липополисахаридамиКак уже упоминалось, клеточная оболочкаграм-отрицательных бактерий устроена бо-лее сложно, чем клеточная оболочка грам-положительных бактерий. У грам-отрица-тельных микроорганизмов (например,Escherichia coli или Salmonella typhimurium)слой пептидогликана окружен наружноймембраной, содержащей фосфолипиды, бел-ки и липополисахариды. Эта наружная мем-брана, подобно плазматической, имеетструктуру бислоя. Итак, грам-отрица-тельные бактерии имеют две мембраны,а грам-положительные - одну. Особенностьграм-отрицательных бактерий состоит так-же в наличии водной прослойки между плаз-матической мембраной и пептидогли-кановым слоем. В этом периплазматичес-ком пространстве содержится много бел-ков, участвующих в связывании и транспор-те сахаров и других питательных веществ(разд. 37.20).

Липополисахариды (ЛПС) наружной мем-браны представляют собой крайне необыч-ные соединения, молекулы которых состоятиз трех частей: липида А, олигосахаридовсердцевины («ядра») и О-боковой цепи

Рис. 32.16. Образование пенициллиномферментного комплекса, обла-дающего неограниченной ста-бильностью.

Рис. 32.17. Конформация пенициллинав области высокореакционно-способной пептидной связи (А)сходна с предполагаемой кон-формацией структуры R-D-Ala-D-Ala (Б) в переходномсостоянии при протеканииреакции транспептидирования.[Lee В., J.Mol.Biol., 61, 464(1971).]

(рис. 32.18). Липид А - это гидрофобнаячасть большой (10 кДа) амфипатическоймолекулы. Он включает шесть цепей насы-щенных жирных кислот, присоединенныхк двум остаткам глюкозамина. Этиацильные цепи составляют примерно поло-вину наружного слоя наружной мембраны.Внутренний слой вместо цепей жирных кис-лот содержит фосфолипиды (рис. 32.19). Да-лее в молекуле липополисахарида идет

Рис. 32.18. Молекула липополисахаридасостоит из трех частей: липи-да А, олигосахаридного «ядра»и О-боковой цепи. Здесь пока-зана последовательность саха-ров, характерная для Salmonellatyphimurium. Сокращения:Abe - абеквоза; EtN - этанол-амин; Gal-галактоза; Glc-глюкоза; GlcN - глюкоза-мин; GlcNAc - N-ацетил-глюкозамин; Hep - гептуле-за; KDO - 2-кето-3-дезокси-октонат; Man - манноза;Rha - L-рамноза.

область олигосахаридного «ядра». Здесь де-сять углеводных единиц вынесено кнаружиот липида А; еще более наружно распола-гается О-боковая цепь, состоящая из боль-шого числа повторяющихся тетрасаха-


Рис. 32.19. Молекулы липополисахаридовлокализованы в наружномслое, тогда как фосфолипиды -во внутреннем слое наружноймембраны.

Рис. 32.20. Формулы ряда редких сахаров,входящих в состав липополиса-харидов.

ридных единиц. В этих двух областяхсодержится несколько крайне редких в при-роде углеводов, а именно 8-углеродный са-хар 2-кето-3-дезоксиоктонат (КДО, KDO),7-углеродный сахар гептоза, а также 6-угле-родные сахара L-рамноза и абеквоза, в мо-лекуле которых в положении С-6 стоит—СН3 вместо —СН2ОН (рис. 32.20). В от-личие от ацильной части липида А олигоса-


хариды сердцевины и О-боковая цепьвысоко гидрофильны. Ряд сахаров в липо-полисахариде фосфорилирован, и потомумолекула полисахарида в целом имеет от-рицательный заряд.

Липополисахариды синтезируются в плаз-матической мембране и затем транспорти-руются в наружную мембрану. Сначала син-тезируется липид А, а затем путем последо-вательного присоединения сахаров (донора-ми активированных сахаров служат соеди-нения типа UDP-глюкозы или UDP-галак-тозы) образуется полисахаридное «ядро».О-боковая цепь собирается иным путем.Ее повторяющееся тетрасахаридное зве-но синтезируется на том же самомС55-изопреноидном липидном переносчике,который участвует в синтезе пептидоглика-на (разд. 32.4). Растущая цепь таких единицудлиняется путем переноса олигосахаридас одной молекулы переносчика на тетраса-харидное звено, связанное с другой молеку-лой переносчика (рис. 32.21). Аналогичныйспособ удлинения имеет место при синтезежирных кислот (разд. 17.18) и белков(разд. 27.16). Наконец, О-боковая цепь при-соединяется к концу олигосахаридного«ядра». По-видимому, повторяющийся те-трасахарид О-боковой цепи образуется вовнутреннем слое плазматической мем-браны, затем переносится в наружный слойи там присоединяется к растущей цепи. Пол-ностью сформированная молекула липопо-лисахарида транспортируется из плазмати-ческой мембраны в наружную, по-видимо-му, в тех участках, в которых эти структурысоприкасаются.

32.13. Благодаря разнообразиюО-боковых цепей грам-отрицательныебактерии противостоят защитным силаморганизма-хозяинаЛипополисахариды содержат в высшейстепени необычные сахара и своеобразныехимические связи. Что дает такая вычур-

Рис. 32.21. Способ удлинения О-боковыхцепей.

Рис. 32.22. Изменение структуры О-бо-ковых цепей бактерии Sal-monella при заражении уме-ренным фагом Р22.

ность? Ключ к решению этого вопроса былполучен при изучении мутантов, дефектныхпо синтезу липополисахаридов. Липид Аи прилегающие к нему КДО олигосахарид-ного «ядра», по-видимому, абсолютно необ-ходимы для выживания. Цепи насыщенныхжирных кислот вносят определенный вкладв барьерную функцию наружной мембраны,благодаря которой периплазматическиебелки не выходят наружу, а наиболее ядо-витые вещества не проникают в клетку. Так,пенициллин довольно плохо проходитсквозь клеточную мембрану грам-отрица-тельных бактерий. Кроме того, липидА придает наружной мембране жесткость.В отличие от липида А и олигосахаридного«ядра» О-боковые цепи не являются жиз-ненно важными. Например, любимый мно-гими биохимиками штамм К12 Е. coli вооб-ще лишен О-боковых цепей. Все жев естественных условиях грам-отрица-тельные бактерии почти всегда имеют О-бо-ковые цепи. Полисахаридная наружная обо-лочка придает поверхности бактериальныхклеток высокую степень гидрофильности,что повышает их устойчивость к фагоцитозуклетками хозяина. О-боковые цепи полиса-харидов крайне разнообразны; показаннаяна рис. 32.18 структура - это только одна измногих известных. Грам-отрицательныебактерии способны быстро мутировать, из-меняя таким путем состав своих О-боковыхцепей. В результате популяция клеток хозя-ина, встретившись с новой для себя поверх-ностной структурой, не имеет на первых по-рах достаточного количества антител про-

тив О-боковых цепей. Следовательно, ви-доизменяя О-боковые цепи, микроорганизмына один шаг опережают систему иммуноло-гической защиты организма-хозяина.

Источником генетической информации,необходимой для изменения О-боковых це-пей, может служить включение умеренногофага в грам-отрицательные бактерии. На-пример, фаг Р22 обеспечивает бактериаль-ную клетку геном фермента, добавляющегоглюкозу к повторяющемуся тетрасахарид-ному звену в О-боковых цепях (рис. 32.22).Такое изменение называют фаговой конвер-сией. Приведенный пример демонстрируетудивительное взаимодействие между бакте-риальными и вирусными генами и те пре-имущества в эволюции, которые возникаютв результате такого симбиоза.

32.14. Порин образует в наружной мембранеканалы для небольших полярных молекулВ наружной мембране бактериальной клет-ки содержится большое количество (~105)молекул порина - трансмембранного белкамассой 37 кДа. Тримеры порина форми-руют каналы, по которым небольшие по-лярные молекулы быстро диффундируют,проходя сквозь мембрану (рис. 32.23). По-скольку диаметр канала 10 А, он пропу-скает молекулы массой, не превышающей600 Да. Гидрофобные молекулы независимоот своего размера плохо проходят по кана-лу; из этого следует, что пориновый каналнаполнен водой и выстлан полярными груп-пами. Следовательно, канал приспособлендля пропускания небольших полярных ме-таболитов типа моносахара. Что касаетсяполярных соединений с большей молеку-лярной массой, то для некоторых из них су-ществуют специфические системы транс-порта через наружную мембрану; примеромможет служить система транспорта маль-тозы. Диффузия мальтозы (дисахарида)и мальтотриозы по пориновому каналу идеточень медленно; для их переноса через мем-брану существует специальная систематранспорта. Известны также специфическиесистемы транспорта витамина В12 и хелатовжелеза. Некоторые фаги проникают в бакте-риальные клетки путем связывания со спе-цифическими переносчиками. Так, фаг λ ис-пользует рецептор мальтозы.

Среди белков наружной мембраны коли-чественно преобладает (~ 7•105 молекул на


Рис. 32.23. А. Электронная микрофото-графия Е. coli. Видно располо-жение негативно окрашенныхпориновых каналов. Б. Изобра-жение пориновых каналов, по-лученное после обработкии фильтрации (обесцвечиванияфона) микрофотографии, при-веденной на рис. А. В. Разъ-ясняющая схема: показанапроекция каналов поринапри низком разрешении. [Ste-ven А, С., Heggeler В. Ten, Mu-ller R., Kistler J., Rosenbusch J.P., J. Cell Biol., 72, 292 (1977).]

клетку) небольшой липопротеин, содержа-щий всего лишь 58 остатков аминокислот.Этот белок характеризуется высокой сте-пенью α-спирализованности; к его N-конце-вому цистеину ковалентно присоединенытри жирные кислоты. Примерно 1/3 моле-кул липопротеина через ε-аминогруппысвоего С-концевого лизина связанас СООН-группами расположенного надним пептидогликана. Таким образом, рас-сматриваемый липопротеин прикрепляет на-ружную мембрану к подлежащему пептидо-гликанному слою и тем самым способствуетмеханической устойчивости клеточной обо-лочки.

32.15. Новообразованные белкинаружной мембраны содержат отщепляемуюсигнальную последовательностьБелки, синтезируемые грам-отрицательны-ми бактериями, могут локализоваться в ци-гозоле, плазматической мембране, пери-


плазматическом пространстве, наружноймембране или внеклеточной среде. Какимобразом новосинтезированная молекула по-падает в нужное место, выбирая из пяти воз-можных направлений правильное? Для вы-яснения этого вопроса очень важное значе-ние имеет следующий факт: как оказалось,липопротеин наружной мембраны синтези-руется в виде пролипопротеина, содержаще-го на N-конце 20 дополнительных остатков

Рис. 32.24. Последовательность амино-кислот N-концевой части про-липопротеина. Эта сигнальнаяпоследовательность содержитмного гидрофобных остатков(показаны желтым цветом).

Рис. 32.25. У прокариот синтез белковклеточной оболочки происхо-дит на рибосомах, прикре-пленных к плазматическоймембране. Сигнальная после-довательность (показанакрасным цветом) новообразо-ванного полипептида напра-вляет рибосомы к плазматиче-ской мембране, а также обеспе-чивает перенос белка через нее.

аминокислот (рис. 32.24). Аналогичнымобразом и другие белки, предназначенныедля плазматической мембраны или еще бо-лее наружно расположенных участков, несутсигнальные последовательности, отличаю-щие их от тех белков, которые остаютсяв цитозоле. Рибосомы, синтезирующие бел-ки, предназначенные для выхода из цитозо-ля, соединяются с плазматической мембра-ной посредством именно этих крайне гидро-фобных N-концевых последовательностей.Таким образом, начальные этапы процессасекреции у прокариот и эукариот оченьсходны (разд. 29.30). Однако есть и разли-чие: у прокариот рибосомы, синтезирующиебелки клеточной оболочки, прикрепляютсяк плазматической мембране (рис. 32.25),тогда как у эукариот рибосомы с аналогич-ной функцией связываются с эндоплазмати-ческим ретикулумом (разд. 29.29). Как иу эукариот, пептидазы прокариот отще-пляют сигнальные последовательности но-восинтезированных белков, как только этибелки минуют барьер мембраны.

Гипотеза сигнальных последовательно-стей подтверждается данными, полученны-ми при изучении бактериальных мутантов;проиллюстрируем это на примере белка,связывающего мальтозу: его масса 38 кДа,

он участвует в поглощении мальтозы клет-кой. Обычно этот белок локализован в пери-плазматическом пространстве. Однако примутации, затрагивающей N-конец его пред-шественника, локализация белка (в его зре-лой форме) меняется: замещение гидрофоб-ной аминокислоты в сигнальной последова-тельности на заряженный остаток приводитк накоплению связывающего мальтозу бел-ка в цитозоле. Таким образом, следствиемзамены всего лишь одного аминокислотногоостатка оказалось изменение локализациибелка: вместо периплазматического про-странства - цитозоль. Рассмотрим обрат-ную ситуацию: может ли белок цитозоляошибочно попасть в наружную мембрану?Часть гена, ответственного за синтез N-кон-цевой части белка-переносчика мальтозы(белок наружной мембраны, являющийсятакже рецептором фага λ), соединили с ге-ном β-галактозидазы. Кодируемый полу-ченным геном белок-химера накапливалсяне в цитозоле, как это свойственно β-галак-тозидазе, а в наружной мембране. Этотопыт показывает, что N-концевая последова-тельность новосинтезированной полипеп-тидной цепи - это своего рода форма записиадреса белков клеточной оболочки. Совер-шенно очевидно, что клетки прокариот, каки эукариот, способны транспортироватьбелки в соответствующие участки. Молеку-лярные основы этого процесса сортировкибелков - важная область современных ис-следований.

ЗаключениеБактериальные клетки окружены клеточны-ми стенками, которые защищают их от ос-


мотического лизиса. Клеточная стенкаграм-положительных бактерий имеет обыч-но толщину 250 А и состоит из пептидогли-кана и тейхоевой кислоты; клеточная по-верхность грам-отрицательных бактерийимеет более сложное строение. Клеточнаястенка - это одна огромная макромолекула,имеющая форму мешка. Пептидогликан изS. aureus содержит 3 повторяющихся звена;NAG-NAM, тетрапептид из D- и L-остаткови пентаглициновую цепь. Пентаглициновыезвенья поперечно связывают отдельные по-лисахаридные цепи. В биосинтезе пептидо-гликанов используются активированные са-хара в форме UDP-NAG и UDP-NAM.Биосинтез протекает в пять этапов: 1) наостатке NAM, присоединенном к UDP, на-ращивается пептидное звено; 2) NAM-пеп-тид переносится на липидный переносчик;3) к NAM-пептидной единице присоеди-няются NAG и пентаглициновый мостик;4) NAG-NAM-пептидное звено переноситсяот липидного переносчика на растущую по-лисахаридную цепь; 5) аминогруппа пента-глицинового мостика на одной полисаха-ридной цепи атакует концевую D-Ala-D-Ala-пептидную связь в тетрапептиде, принадле-жащем другой цепи, и таким образомобразуется поперечная сшивка между поли-сахаридными цепями.

Пенициллин убивает бактерии, подавляясинтез клеточных стенок. Пенициллин по-хож по структуре на ацил-D-Ala-D-Ala и со-держит высокореакционноспособную пеп-тидную связь. Он необратимо ингибируетгликопептид-транспептидазу и тем самымблокирует образование поперечных сшивокв пептидогликане. Некоторые бактерии ре-зистентны к действию пенициллина благо-даря наличию пенициллиназы, гидролизую-щей и тем самым инактивирующей пени-циллин.

Грам-отрицательные бактерии в отличиеот грам-положительных имеют наружнуюмембрану, расположенную над слоем пеп-тидогликана. Кроме того, между плазмати-ческой мембраной грам-отрицательныхбактериальных клеток и слоем пептидогли-кана имеется периплазматическое простран-ство. Наружная мембрана состоит из крайнесвоеобразных липополисахаридов. Эти ам-фипатические соединения содержат заяко-ренный в наружном слое наружной мем-браны липид А, а также еще более наружнорасположенные олигосахарид и О-боковыецепи.

О-боковые цепи, в состав которых входятнеобычные сахара, образуются путем поли-меризации тетрасахаридных звеньев на ли-пидном переносчике. Разнообразие струк-туры О-боковых цепей позволяет грам-отрицательным бактериям обойти иммуно-логическую защиту организма-хозяина. Посодержащим воду каналам в наружной мем-бране происходит диффузия небольших по-лярных (но не гидрофобных) молекул; этиканалы образованы трансмембранно распо-ложенным белком порином. Молекулыбольшей величины, например мальтоза иливитамин В1 2, проходят сквозь мембранублагодаря наличию специфических системих транспорта. К числу основных белковыхкомпонентов наружной мембраны относит-ся небольшой липопротеин, посредствомкоторого мембрана прикрепляется к подле-жащему слою пептидогликана. Белки кле-точной оболочки синтезируются на рибосо-мах, присоединенных к плазматическоймембране. Предшественники этих белковсодержат N-концевые сигнальные последо-вательности, которые отщепляются послепереноса белка-предшественника через мем-брану.


С чего начатьNikaido H., Nakae Т., 1979. The outermembrane of gram-negative bacteria,Advan. Microbiol. Physiol., 14, 163-250.DiRienzo J.M., Nakamura K., InouyeM., 1978. The outer membrane proteinsof gram-negative bacteria: biosynthesis,assembly, and functions, Ann. Rev.Biochem., 47, 481-532.

Sharon N., 1969. The bacterial cell wall,Sci. Amer., 220(5), 92-98.

Оболочки бактериальных клетокLeive L. (ed.), 1973. BacterialMembranes and Walls, Marcel Dekker.[Прекрасный сборник критическихобзоров. Статьи Гюйсена и Шокмана(Ghuysen, Shockman) по биосинтезупептидогликана и Накайдо (Nikaido)по биосинтезу клеточных оболочек

грам-отрицательных микроорганиз-мов имеют непосредственное отно-шение к теме данной главы.]Nikaido H., 1979. Permeability of theouter membrane of bacteria, Angew.Chem. (Int.Ed.), 18, 337-350.Hussey H., Baddiley J., 1976.Biosynthesis of bacterial cell walls. In:Martonosi A. (ed), The Enzymes ofBiological Membranes, vol. 2, pp.227-326, Plenum.Osborn M.J., 1971. The role ofmembranes in the synthesis ofmacromolecules. In: Rothfield L . L .(ed.), Structure and Function of232

Часть V.Молекулярная физиология

Biological Membranes, pp. 343-400,Academic Press.Steven A.C., ten Heggeler B., Muller R.,Kistler J., Rosenbusch J.P., 1977.Ultrastructure of a periodic protein layerin the outer membrane of Escherichiacoli, J. Cell Biol., 72, 292-301.

Пенициллин и бацитрацинFleming A., 1929. On the antibacterialaction of cultures of a penicillinium, withspecial reference to their use in theisolation of B. influenzae, Brit. J. Exp.Pathol., 10, 226-236.Chain E., 1971. Thirty years of penicillintherapy, Proc. Roy. Soc. London (B),179, 293-319.Strominger J.L., Blumberg P.M.,Suginaka H., Umbreit J., Wickus G.G.,1971. How penicillin kills bacteria:progress and problems, Proc. Roy. Soc.London (B), 179, 369-383.Yocum R.R., Waxman D.J., RasmussenJ.R., Strominger J.L., 1979.Mechanisms of penicillin action:penicillin and substrate bind covalentlyto the same active serine in two bacterial

D-alanine carboxypeptidases, Proc. Nat.Acad. Sci., 76, 2730-2734.Stone K.J., Strominger J.L., 1971.Mechanism of action of bacitracin:complexation with metal ion andC55-isoprenyl pyrophosphate, Proc.Nat. Acad. Sci., 68, 3223-3227.Boyd D.B.. 1977. Transition state struc-tures of a dipeptide related to the modeof action of b-lactam antibiotics, Proc.Nat. Acad. Sci., 74, 5239-5243.

Сигнальные последовательности и ло-кализация белковChang C.N., Model P., Blobel G., 1979.Membrane biogenesis: cotranslationalintegration of the bacteriophage f1 coatprotein into an Escherichia colimembrane fraction, Proc. Nat. Acad.Sci., 75, 4891-4895.Inouye S., Wang S., Sekizawa J., Halej-oua S., Inouye M., 1977. Amino acidsequence for the peptide extension on theprolipoprotein of the Escherichia coliouter membrane, Proc. Nat. Acad. Sci.,74, 1004-1008.Bedouelle H., Bassford P.J., Fowler A.

V., Zabin I., Beckwith J., Hofnung M.,1980. Mutations which alter the functionof the signal sequence of the maltosebinding protein of Escherichia coli,Nature, 285, 78-81.Emr S., Hedgpeth J., Clement J.-M.,Silhavy T.J., Hofnung M., 1980.Sequence analysis of mutations thatprevent export of λ receptor, anEscherichia coli outer membraneprotein, Nature, 285, 82-91.Bassford P., Beckwith J., 1979.Escherichia coli mutants accumulatingthe precursor of a secreted protein in thecytoplasm, Nature, 277, 538-541.Emr S.D., Schwartz M., Silhary T.J.,1978. Mutations altering the cellularlocalization of the phage λ receptor, anEscherichia coli outer membraneprotein, Proc. Nat. Acad. Sci., 75,5802-5806.Lin J.J.C., Kanazawa H., Ozols J.,Wu H.C., 1978. An Escherichia colimutant with an amino acid alterationwithin the signal sequence of outermembrane prolipoprotein, Proc. Nat.Acad. Sci., 75, 4891-4895.

ГЛАВА 33Иммуноглобулины

К началу этого столетия были выявленымногие важнейшие свойства иммунного от-вета. Однако представление о защитных ме-ханизмах возникло гораздо раньше, о чемсвидетельствуют записи Фукидида о чуме,поразившей Афины в 430 до н.э.:

«Пусть другие рассуждают о ее проис-хождении и причинах, вызвавших ее по-явление, если только для такого страшно-го бедствия могут быть найдены доста-точные причины... что до меня, я простоопишу ее природу и объясню, по какимсимптомам ее можно распознать, еслиона когда-нибудь разразится снова. Темлучше я смогу это сделать, что болел сами видел, как развивалась болезнь у дру-гих...

Именно у тех, кто выздоровел послеэтой болезни, больные и умирающие вы-зывали особенное сочувствие. Пережив-шие болезнь знали по своему опыту, чтоэто такое, и не боялись более за себя, ибоодин и тот же человек никогда не заболе-вал вторично или по крайней мере не уми-рал при этом. И таких людей не толькопоздравляли другие, но и сами они в радо-сти преисполнялись тщетной надеждой,что отныне они спасены от какой-бы тони было болезни».Называя надежду на спасение тщетной,

Фукидид явно имел в виду специфичностьзащиты, свойственную иммунной системе.

33.1. Основные определенияАнтитела (или иммуноглобулины) - это бел-ки, синтезируемые в организме животногов ответ на присутствие чужеродного веще-ства. Антитело обладает специфическим


сродством к стимулировавшему его синтезчужеродному веществу. Антиген (или имму-ноген) - чужеродная макромолекула, спо-собная вызвать образование антител. Эф-фективными антигенами обычно служатбелки, полисахариды и нуклеиновые кис-лоты. Антитела проявляют специфичностьв отношении определенного участка моле-кулы антигена; этот участок называют ан-тигенной детерминантой.

Чужеродные молекулы малого размеране вызывают образования антител. Однакоесли они присоединены к макромолекулам,то может иметь место синтез специфическихантител. В этом случае макромолекула вы-полняет функцию носителя присоединеннойхимической группы, называемой гаптеннойдетерминантой. Сама по себе чужероднаямолекула малого размера называется гап-теном.

Рис. 33.1. Электронная микрофотогра-фия кристалла молекул антите-ла. [Labaw L. W., Davies D. R.,J. Ultrastruct. Res., 40, 349(1972).]

Рис. 33.2. Электронная микрофотогра-фия В-лимфоцита. (Печатаетсяс любезного разрешенияL. Mercer.)

Молекулы антител секретируются плаз-матическими клетками, образовавшимисяиз В-лимфоцитов (рис. 33.2). Другой класслимфоцитов, а именно Т-лимфоциты, обус-ловливает клеточный иммунный ответ, ко-торый дополняет гуморальный ответ, выра-жающийся в появлении растворимых анти-тел. В этой главе мы рассмотрим толькогуморальный ответ, поскольку его молеку-лярные основы изучены значительно лучше.Однако нужно подчеркнуть, что молекулыантител - всего лишь один из компонентовбольшой, согласованно функционирующейсистемы молекул и клеток, распознающихи удаляющих чужеродные вещества.

33.2. Синтез специфических антителв ответ на антигенЖивотные способны синтезировать специ-фические антитела против практически лю-бой химической группы. Особенно эффек-тивно стимулирует образование антителдинитрофенол (ДНФ), и потому его широкоиспользуют в качестве гаптенной детер-минанты. Антитела против ДНФ получаютследующим образом.

1. ДНФ-группы присоединяют ковалент-но к белку-носителю, например к альбуминусыворотки быка (БСА), используя взаимо-действие фтординитробензола с боковымицепями лизина или других нуклеофильныхостатков белка (рис. 33.4).

2. ДНФ-БСА вводят кролику в качествеиммуногена (антигена). Спустя несколько

Рис. 33.3. Электронная микрофотогра-фия плазматической клетки.Виден очень хорошо развитыйшероховатый эндоплазматиче-ский ретикулум. (Печатаетсяс любезного разрешенияL. Mercer.)

Рис. 33.4. Динитрофенильное производ-ное бычьего сывороточногоальбумина (ДНФ-БСА) - эф-фективного антигена.

33. Иммуноглобулины 235

Рис. 33.5. Кинетика появления иммуно-глобулинов М и G (IgM и IgG)в сыворотке после иммуниза-ции.

дней содержание антител против ДНФ-аль-бумина начинает возрастать (рис. 33.5). Этипервыми появляющиеся антитела принадле-жат к классу иммуноглобулинов М (IgM)массой около 1000 кДа.

3. Спустя примерно 10 дней после введе-ния антигена количество иммуноглобулинаМ начинает уменьшаться, но одновременнорастет содержание антител другого класса,а именно иммуноглобулинов G (IgG) массойоколо 150 кДа.

4. Спустя примерно 3 недели после введе-ния антигена содержание анти-ДНФ-анти-тел класса иммуноглобулинов G достигаетплато. Введение в этот период новой порцииДНФ-БСА вызывает дальнейшее увеличе-ние содержания антител против ДНФ в сы-воротке кролика.

5. Собирают кровь иммунизированногокролика и получают сыворотку (называе-мую антисывороткой, поскольку она полу-чена после иммунизации). Содержание анти-тел против ДНФ в этой сыворотке можетдостигать 1 мг антител в расчете на 1 млсыворотки. ДНФ исключительно эффекти-вен как агент, стимулирующий образованиебольших количеств специфических антител.Почти все эти антитела принадлежат к клас-су иммуноглобулинов G - основному классуиммуноглобулинов сыворотки.

6. Следующий этап - отделение антителпротив ДНФ от антител с другой специфич-ностью и от прочих сывороточных белков.Антитела против ДНФ отличаются отостальных белков антисыворотки очень вы-


соким сродством к ДНФ. Следовательно, ихможно выделить методом аффинной хрома-тографии. Для этого готовят колонку, со-держащую динитрофенильные группы, ко-валентно связанные с нерастворимым угле-водным носителем. На колонку наносятантисыворотку и затем промывают бу-ферным раствором. Большая часть белковантисыворотки проходит сквозь колонку,поскольку их сродство как к ДНФ-группам,так и к углеводному носителю ничтожномало или вовсе отсутствует. В то же времяантитела против ДНФ прочно связываютсяна колонке. Далее эти антитела снимаютс колонки. Для этого на колонку наносятДНФ в высокой концентрации: доба-вленный ДНФ связывается с антителами,вытесняя их из связи с динитрофенильнымигруппами нерастворимого углеводного но-сителя. Растворимый комплекс, состоящийиз ДНФ и антител против ДНФ, выходитс колонки. Далее ДНФ удаляют путем диа-лиза или ионно-обменной хроматографии,и в результате остается препарат очи-щенных антител.

33.3. Участки антител, связывающиеантиген, подобны активным центрамферментовУчастки связывания антигена в молекулахантител во многих отношениях сходны с ак-тивными центрами ферментов.

1. Константы связывания для гаптеновбыли определены методами равновесногодиализа и спектроскопии. Например, при-соединение окрашенного гаптена типа дини-трофенильного производного тушит флуо-ресценцию остатков триптофана в белке-ан-тителе. Степень тушения служит меройнасыщения участков связывания в молекулебелка. Для большинства гаптенов кон-станты связывания лежат в пределах от10-4 до 10 - 1 0 М. Следовательно, стандарт-ная свободная энергия связывания соста-вляет от —6 до — 1 5 ккал/моль, т. е. лежитв границах, характерных для фермент-суб-стратных и фермент-коферментных ком-плексов. Кроме того, комплексы гаптен-ан-титело образуются под действием тех жесил, что и фермент-субстратные ком-плексы. Сочетание слабых нековалентныхсвязей типа электростатических, водо-родных и вандерваальсовых обеспечиваетпрочное и специфическое связывание.

2. Проверяли способность антител к дек-страну (полисахариду, состоящему из остат-ков глюкозы) связывать олигомеры. Обна-

ружили, что полное связывающее сродствопроявляется в отношении олигомера, со-стоящего из шести остатков глюкозы. Здесьнапрашивается сравнение с лизоцимом,у которого в щели активного центра разме-щается тоже шесть углеводных остатков. Изэтого сопоставления следует, что длинасвязывающего участка в молекулах антителпротив декстрана составляет 25 А.

3. На основе спектроскопических свойствряда гаптенов можно получить информа-цию о степени полярности участков связы-вания в молекулах антител. Так, некоторыенафталины, находясь в высокополярномокружении (например, в воде), дают слабуюжелтую флуоресценцию, а в выраженно не-полярном окружении (например, в гекса-не) - интенсивно голубую. Если такой на-фталиновый гаптен присоединяется к специ-фическому антителу, то появляется интен-сивно голубая флуоресценция, что указы-вает на изгнание воды из участка связыва-ния. Как правило, участки связыванияпредставляют собой неполярные ниши в мо-лекуле антитела; это увеличивает прочностьсвязывания антигена по причинам, которыеуже обсуждались применительно к фермент-субстратному взаимодействию (разд. 6.8).

4. Гаптен довольно точно соответствуетсвязывающему участку по структуре. Специ-фичность связывания, безусловно, очень вы-сока, но не абсолютна. Гаптен прочно удер-живается в участке связывания, имея, такимобразом, малую свободу вращения. Кон-станта скорости связывания для многих гап-тенов составляет около 108 М-1•с-1.Столь высокая константа свидетельствуето том, что скорость процесса контролирует-ся скоростью диффузии. Связывание гапте-на не сопровождается, по-видимому, суще-ственными структурными перестройками.

33.4. Препараты антител с определеннойспецифичностью обычно гетерогенныАнтитела имеют существенное отличие отферментов: большинство нормальных анти-тел с определенной специфичностью, напри-мер антитела против ДНФ, неоднородны помолекулярному составу. Анализ связываниядинитрофенильных гаптенов с препаратоманти-ДНФ-антител выявил целый набор ве-личин сродства. Некоторые молекулы анти-тел связывают ДНФ с К = 10-6 М, тогдакак другие - с К = 10 - 1 0 М. В отличие отэтого ферменты, как правило, характери-зуются только одной константой связыва-ния данного субстрата или кофермента. Да-

лее при электрофорезе препарата антителпротив ДНФ или других специфических ан-тител выявляется множество полос белка.Ферменты же при электрофорезе дают однуполосу или небольшое число отдельных по-лос (например, изоферменты лактат-деги-дрогеназы).

Гетерогенность антител с данной специ-фичностью определяется самой природойиммунного ответа. В чем причина гетеро-генности? Оказалось, что антитела, проду-цируемые одной клеткой, гомогенны. Одна-ко различные клетки образуют разные поструктуре антитела. Антитела против ДНФсинтезируются большим количеством раз-личных клеток, что и обусловливает ихгетерогенность.

33.5. При ферментативном расщеплениииммуноглобулина G образуются активныефрагментыИммуноглобулин G имеет массу 150 кДа.При изучении такого большого белка целе-сообразно предварительно расщепить егона активные фрагменты. В 1959 г. РодниПортер (Rodney Porter) показал, что приограниченном протеолизе папаином имму-

Рис. 33.6. Флуоресценция ε-дансилли-зина отчетливо меняется присвязывании этого гаптена соспецифическими антителами.Сдвиг максимума флуоресцен-ции в сторону более короткихволн и увеличение интенсивно-сти флуоресценции свидетель-ствуют о том, что связываниегаптена происходит в неполяр-ном участке.


Рис. 33.7. Протеолитическое расщепле-ние иммуноглобулина G (IgG).

Рис. 33.8. Схематическое изображениерешетки, формирующейся приобразовании перекрестных свя-зей между IgG (показано синимцветом) и антигеном (показаножелтым цветом).

ноглобулин G расщепляется на три ак-тивных фрагмента массой по 50 кДа. Двафрагмента связывают антиген. Их обозна-чили Fab (ab - от англ. antigen binding - свя-зывающий антиген, F - от англ. fra-gment - фрагмент), каждый из Fab содержитпо одному участку связывания гаптена илиантигена, причем по связывающему срод-ству этот участок не отличается от всей мо-


лекулы в целом. Однако, будучи однова-лентным (т.е. имея один участок связыва-ния), Fab не дает осадка с антигеном; этимFab отличается от интактной молекулыиммуноглобулина G, содержащей два иден-тичных участка связывания антигена. Им-муноглобулин G может дать осадок с анти-геном, содержащим не одну, а несколькоантигенных детерминант. При этом форми-руется структура в виде протяженной ре-шетки, где каждая молекула антитела обра-зует перекрестные связи с двумя и болееантигенами и наоборот (рис. 33.8). Осадокдостигает наибольшего размера, если анти-тело и антиген присутствуют в эквива-лентных количествах.

Третий фрагмент (также 50 кДа), обозна-чаемый Fc, не способен к связыванию анти-гена, но обладает другими биологическиважными функциями. В отличие от Fab этотфрагмент способен проникать через плацен-тарную мембрану. Следовательно, способ-ность иммуноглобулина G проходитьсквозь плаценту и попадать в систему кро-вообращения плода определяется наличиемна Fc специфического участка, обеспечиваю-щего перенос через плаценту. На Fc имеетсятакже участок связывания комплемента.Связывание антитела с антигенной детерми-нантой на поверхности чужеродной клеткичасто ведет к лизису последней. Такой ре-зультат взаимодействия антитела с антиге-ном опосредован группой белков, носящихобщее название комплемент. Присоедине-ние одного из этих белков к комплексу анти-ген—антитело и запускает последователь-ность реакций, приводящих к лизису чуже-родной клетки. В обозначении фрагмента Fc

индекс «с» (от англ. cristallizable - кристалли-зуемый) указывает на способность этогофрагмента кристаллизоваться, Обнаруже-ние этого свойства послужило первым ука-занием на гомогенность F c ; что касаетсяфрагментов F a b, то они гетерогенны и обы-чно не кристаллизуются.

33.6. Иммуноглобулин G состоитиз L- и Н-цепейСледующий важный шаг в развитии имму-нологии был сделан также в 1959 г., когдаДжералду Эделману (Gerald Edelman) уда-лось показать, что иммуноглобулин G со-стоит из полипептидных цепей двух видов.Белок обрабатывали следующим образом:дисульфидные мостики в молекуле восста-навливали меркаптоэтанолом; далее разру-шали нековалентные связи 6 М раствором

мочевины. При хроматографическом анали-зе смеси было обнаружено, что иммуногло-булин состоит из полипептидных цепей мас-сой 25 и 50 кДа, обозначенных соответ-ственно как легкие (L) и тяжелые (Н) цепи.

Впоследствии Портер подобрал болеемягкие условия обработки, позволившие ре-конструировать иммуноглобулин G из двухН- и двух L-пепей. На основе этих исследо-ваний он предложил модель (рис. 33.9)субъединичной структуры иммуноглобу-лина G, в соответствии с которой каждаяL-цепь соединена с Н-цепью дисульфиднойсвязью. Н-цепи, кроме того, связаны междусобой по крайней мере одной дисульфиднойсвязью. В целом субъединичная структураиммуноглобулина G L2H2.

Далее удалось определить, какие участкипредложенной структуры соответствуютфрагментам, образующимся при расщепле-нии папаином. Папаин отщепляет Н-цепи состороны С-конца от дисульфидного мости-ка, соединяющего L- и Н-цепи. В итоге Fab

состоит из целой L-цепи и аминоконцевойполовины Н-цепи, тогда как Fc состоит изС-концевых половин обеих Н-цепей, ЧастьН-цепи, содержащаяся в F a b, обозначаетсяFd.

33.7. Иммуноглобулин G - гибкаяY-образная молекулаЭлектронно-микроскопические исследова-ния, проведенные Робином Валентайноми Майклом Грином (Robin Valentine,Michael Green), показали, что иммуноглобу-лин G имеет форму буквы Y и что гаптенприсоединяется на концах Fab-единиц.Fс-единица и две Fab-единицы в интактномантителе соединены между собой своего ро-да шарниром, благодаря чему угол междуFab-единицами может меняться быстро ив большом диапазоне величин (рис. 33.10).Этот вид подвижности (гибкости) шарнир-ного типа усиливает комплексообразованиемежду антигеном и антителом, так как спо-собствует лучшему связыванию полива-лентных антигенов. В самом деле, таким пу-тем расстояние между антиген-связываю-щими участками на концах Fab-единиц мо-жет быть приведено в соответствиес расстоянием между специфическимидетерминантами на антигене (например, навирусе, имеющем много повторяющихсясубъединиц). Как правило, если связываниеполивалентного антигена происходит в двухучастках связывания антигена, то сродство

возрастает в 104 раз по сравнению со связы-ванием в одном участке. Не исключено, чтоподвижность шарнирного типа играет так-же определенную роль и в передаче инфор-мации от Fab-единиц на Fс-единицу.

Рис. 33.9. Субъединичная структураIgG — L2H2. Fab-фрагменты,высвобождающиеся при рас-щеплении папаином, показанысиним цветом, Fc-фрагмент -красным.

Рис. 33.10. Иммуноглобулин G имеетY-образную форму. Наличиев молекуле шарнирного соеди-нения обусловливает подвиж-ность отдельных участков.


33.8. Антитела образуются под действиемотбора или инструкции?Специфичность ферментов вырабатываласьна протяжении миллионов лет эволюции.Специфические антитела появляются в кро-ви животного всего лишь через нескольконедель после воздействия чужеродной де-терминанты. Каким же образом обеспечи-вается образование специфических антителв столь короткое время?

1. В 1940 г. Лайнус Полинг (Linus Pauling)предложил так называемую инструктивнуютеорию, согласно которой антиген дей-ствует как матрица, определяющая конфор-мацию новообразованной полипептидной це-пи антитела. При этом предполагалось, чтомолекулы антител с данной последователь-ностью аминокислот обладают потенциаль-ной способностью к образованию антиген-связывающих участков самой разнообраз-ной специфичности; возникновение же опре-деленной специфичности зависит от при-роды антигена, присутствующего во времясвертывания полипептидной цепи. Согласноинструктивной теории, специфическое анти-тело не может образоваться в отсутствие со-ответствующего антигена.

2. Селекционная теория (теория отбора),которую в 50-х годах выдвинули Макфер-лейн Вернет и Нильс Ерне (MacfarlaneBurnet, Niels Jerne), постулирует, что анти-ген регулирует только количество синтези-руемых специфических антител. Согласноэтой теории, антиген-связывающие участкиспецифических антител полностью детер-минированы еще до встречи с антигеном.

33.9. Конец инструктивной теорииИнструктивная теория предсказывала, чтоесли молекула антитела будет развернута(денатурирована), а затем вновь свернется(ренатурируется), то ее специфичность будетутрачена. Этому предсказанию противоре-чили экспериментальные данные по ренату-рации рибонуклеазы, полученные в лабора-тории Христиана Анфинсена (ChristianAnfinsen). Вспомним, что денатурированнаярибонуклеаза спонтанно восстанавливаетисходную трехмерную структуру, специфич-ность и каталитическую активность послеудаления денатурирующего агента(разд. 2.12). Для ренатурации присутствиесубстрата не требуется. Этот принципиаль-но важный факт относительно рибону-


клеазы послужил стимулом для постановкианалогичных опытов с антителами(рис. 33.11). Были взяты Fab-фрагменты ан-тител против ДНФ; использование фраг-ментов относительно небольшого размера,а не целых антител значительно упрощаетэксперимент. Fab-фрагмент обрабатываливысокоэффективным денатурирующимагентом - 7М солянокислым гуанидином.Денатурированный таким образомFab-фрагмент терял сродство к гаптену(ДНФ). Данные гидродинамического и оп-тического анализа свидетельствовали о том,что конформация денатурированного Fab

была близка к случайному клубку. Далеегуанидин-HCl удаляли путем диализа; приэтом денатурированный Fab восстанавливалисходную пространственную структурув отсутствие гаптена ДНФ. Самым пора-зительным было то, что ренатурированныйFab обладал высоким сродством к динитро-фенольным гаптенам. Поскольку ренатура-ция происходила в отсутствие гаптена, неоставалось сомнений, что специфичностьучастка связывания антигена определяетсятолько последовательностью аминокислотбелка-антитела. Результат этого экспери-мента свидетельствовал в пользу отбораи противоречил основному предсказаниюинструктивной теории. Более того, было об-наружено, что клетки, продуцирующие анти-тела, способны синтезировать их в большомколичестве в отсутствие антигена. Этоокончательно подтвердило основной тезисселекционной теории: антиген влияет на ко-личество продуцируемых специфических ан-тител, но не на их аминокислотную последо-вательность или трехмерную структуру.

33.10. Иммуноглобулины миеломыи гибридомы гомогенныКак же могут синтезироваться специфиче-ские антитела до появления антигенов? Ге-терогенность антител и трудности анализасмеси их молекул на протяжении многих летслужили препятствием к изучению этой про-блемы. Выйти из этого положения удалосьпутем использования такого объекта иссле-дования, как множественная миелома - зло-качественное перерождение клеток, проду-цирующих антитела. При этом виде ракапроисходит перерождение одного лимфоци-та или плазматической клетки, что ведетк неконтролируемому клеточному делению.Следовательно, в этом случае образуетсябольшое число клеток одного типа. Они со-ставляют клон, т.е. происходят от одной

Рис. 33.11. Fab-Фрагмент анти-ДНФ-анти-тел восстанавливает способ-ность к связыванию ДНФ по-сле денатурации (развертыва-ния структуры) и последующейренатурации (восстановленияисходной структуры) в отсут-ствие антигена. Этот опыт по-казывает, что специфичностьопределяется природой после-довательности аминокислот.

клетки и имеют одни и те же свойства. Такиеопухоли секретируют большие количествакакого-то одного иммуноглобулина. Имму-ноглобулины миеломы обладают нормальной

структурой и во всех отношениях соответ-ствуют норме, но каждый из них предста-вляет собой гомогенный образец одного измногочисленных антител, присутствующихв данном организме. Миеломы развиваютсяу мышей. Эти опухоли можно транспланти-ровать другим мышам; после пересадки отодной мыши другой опухоль пролифери-рует. Более того, в таких продуцирующихантитела опухолях из поколения в поколе-ние синтезируется одно и то же антитело.Именно это обстоятельство привело к тому,что основные достижения молекулярнойиммунологии связаны с изучением гомо-генных миеломных иммуноглобулинов.

Сезар Милстайн и Джордж Кёлер(Cesar Milstein, Georges Kohler) обнаружили,что можно получить в большом количествеантитела практически любой заданной спе-цифичности посредством слияния клетки,продуцирующей антитело, с клеткой мие-ломы. Для этого мышь иммунизируютопределенным антигеном и спустя несколь-ко недель удаляют у нее селезенку. Далее бе-рут смесь иммунокомпетентных клетокэтой селезенки и in vitro вызывают их слия-ние с клетками миеломы. Затем выделяютгибридные клетки путем культивированиясмеси всех клеток в среде, поддерживающейрост только гибридных (но не исходных)клеток. В некоторых из полученных ги-бридных клеток сохраняются неопластиче-ские свойства миеломных клеток, и приэтом они синтезируют антитела заданнойспецифичности. Такие клетки гибридомы какв первом, так и во всех последующих поко-лениях устойчиво продуцируют большиеколичества гомогенных антител со специ-фичностью, детерминированной исходнойклеткой селезенки. К настоящему временитаким путем получено много различных мо-ноклональных антител, которые исполь-зуются в аналитических целях как высоко-специфические реагенты. Например, моно-клональные антитела против определенноголекарственного средства или гормона по-зволяют определить его содержание в жид-костях тела даже при крайне низкой концен-трации.

33.11. Каждая L- и Н-цепь состоитиз вариабельного и константного участковПри множественной миеломе в мочебольных, как правило, появляются большие


Рис. 33.12. Легкая цепь иммуноглобулинасостоит из вариабельной и кон-стантной областей.

Рис. 33.13. Тяжелая цепь IgG также со-стоит из вариабельной и кон-стантной областей.


количества аномальных белков. На эти бел-ки обратил внимание еще в 1847 г. ГенриБенс-Джонс (Henry Bence-Jones) в связи с ихнеобычными свойствами: они выпадаютв осадок при нагревании до 50°С и вновьрастворяются при кипячении. Оказалось,что белок Бенс-Джонса - это димер L-цепейиммуноглобулина, продуцируемого миело-мой больного; этот белок послужилудобным исходным материалом для анали-за последовательности аминокислот в L-це-пях.

В 1965 г. было проведено первое полноеопределение последовательностей амино-кислот в миеломных L-цепях, содержащих214 аминокислотных остатков. Эти исследо-вания показали, что у разных больных белкиБенс-Джонса различаются по последова-тельности аминокислот. Самое удивитель-ное состояло в том, что различия касалисьтолько N-концевой половины полипеп-тидных цепей. Каждый из исследованныхбелков Бенс-Джонса характеризовался уни-кальной последовательностью аминокислотв положениях от 1 до 108, но начиная с поло-жения 109, последовательность ряда белковБенс-Джонса была идентичной. Следова-тельно, L-цenu состоят из вариабельногоучастка (остатки 1-108) и константного(постоянного) участка (остатки 109-214).Такое явление не имело прецедента в белко-вой химии.

Не все L-цепи имеют один и тот же кон-стантный участок. Существует два типаL-цепей, обозначаемых соответственно кап-па (χ) и лямбда (λ), которые во многомсходны между собой. Так, оба типа L-цепейсостоят из 214 остатков, содержат вариа-бельную N-концевую и константную С-кон-цевую половины. Каждая из половин χ- и λ-цепей образует петлю из-за наличия внутри-цепочечной дисульфидной связи. С-кон-цевым остатком цепей обоих типов являетсяцистеин, который участвует в образованиидисульфидного мостика с Н-цепью. Нако-нец, χ- и λ-цепи содержат идентичные ами-нокислотные остатки в 40% положений, т. е.проявляют примерно такую же степень го-мологии, как α- и β-цепи гемоглобиначеловека.

Константные участки всех χ-цепей иден-тичны, за исключением положения 191, гдеможет стоять либо лейцин, либо валин. Этоаллотипическое различие наследуется поклассическому правилу Менделя. λ-Цепитакже вариабельны по положению 191, гдеможет стоять лизин или аргинин.

Н-цепи содержат 446 аминокислотных

остатков. Сравнение последовательностейН-цепей иммуноглобулинов, продуци-руемых разными миеломами, выявило, чтои в этом случае вариабельными оказывают-ся первые 108 остатков (от N-конца). Следо-вательно, тяжелые цепи, подобно легким,состоят из вариабельной (V) и константной(С) области. Вариабельные области Н- и L-цепей но размеру одинаковы, а констант-ные - различны: в Н-цепях этот участок в3 раза длиннее, чем в L-цепях (рис. 33.13).

33.12. Участок связывания антигенаобразован гипервариабельнымифрагментами L- и Н-цепейКак уже упоминалось выше, в состав анти-ген-связывающего фрагмента Fab пол-ностью входит L-цепь и частично - Н-цепь.Каков относительный вклад каждой из этихцепей в связывающую активность? Первыесведения в этом отношении были полученыпри сравнении последовательностей амино-кислот в большом числе миеломных белков.Обнаружилось, что вариабельные областиL- и Н-цепей вовсе не равномерно вариа-бельны, а именно три участка L-цепи и четы-ре Н-цепи проявляют значительно большуюизменчивость, чем другие части вариа-бельных областей (рис. 33.14). В 1970 г. Эл-вин Кабат (Elwin Kabat) предположил, чтоэти гипервариабельные участки образуютобласть, связывающую антиген, и что имен-но от природы составляющих их аминокис-лот зависит специфичность антитела.

Для проверки этой гипотезы были прове-дены опыты с использованием аффиннойметки. Гаптены, содержащие реакционно-способные группы, синтезируются просто.Реакционноспособный гаптен специфическисвязывается с антиген-связывающим участ-ком антитела и далее образует ковалентнуюсвязь с ближайшим подходящим остаткомв молекуле данного белка. Например, анти-тела против ДНФ можно пометить по анти-ген-связывающему участку гаптеном нитро-фенилдиазонием:

Диазониевая группа высокореакционно-способна и образует диазосоединенияс остатками тирозина, гистидина и лизина.Модифицированные таким образом антите-ла содержат метку и в L-цепях и в Н-цепях.При этом меченые остатки оказались лока-

Рис. 33.14. Гипервариабельные участкилегких (А) и тяжелых (Б) цепей.Степень вариабельности в по-следовательности аминокис-лот отложена как функция по-ложения аминокислоты.(Capra J. D., Edmundson А. В.,The antibody combining site,Scientific American, Inc., 1976.)

лизованными в гипервариабельных участ-ках этих цепей. Следовательно, участкисвязывания антигена формируются гиперва-риабельными остатками аминокислот какL-цепей, так и Н-цепей. При последующемрентгеноструктурном анализе были полу-чены более прямые данные в пользу этогоположения; мы их обсудим ниже.

33.13. Вариабельная и константная областивыполняют разные функцииN-концевые части легких и тяжелых цепейсодержат вариабельные области, ответ-ственные за связывание антигена. Различия-ми в последовательности аминокислотобусловлено формирование участков,связывания антигена, различающихся поспецифичности. Остальная часть каждой изцепей - константная; она осуществляет та-кие эффекторные функции, как связываниекомплемента и перенос антител через пла-центарную мембрану. Одни и те же эффек-торные функции свойственны антителам


Рис. 33.15. Структура IgG. Показано рас-положение дисульфидных мо-стиков и участки г о м о л о -гичных последовательностей.(Edelman G. M., The structureand function of antibodies,Scientific American, Inc., 15,70.)

самой разной специфичности. Таким обра-зом, антитела состоят из участка с уни-кальной последовательностью аминокислот,определяющей специфичность связыванияантигена, и из участка с постоянной после-довательностью, осуществляющего общиеэффекторные функции. Поразительная осо-бенность структуры иммуноглобулинов со-стоит в том, что вариабельный и кон-стантный области в легких и тяжелых цепяхимеют четкую границу раздела.

33.14. Молекулы антител уложеныс образованием компактных доменов,имеющих гомологичные последовательностиПоследовательность аминокислот в моле-куле иммуноглобулина полностью раскрылв 1968 г. Джералд Эделман (GeraldEdelman). Самая интересная особенностьэтой последовательности состоит в перио-дичности расположения внутрицепочечныхдисульфидных связей и в легких, и в тя-желых цепях (рис. 33.15). Кроме того, имеет-ся сходство в последовательности амино-кислот разных частей молекулы иммуно-глобулина. Так, вариабельная область лег-кой цепи (VL) гомологична вариабельнойобласти тяжелой цепи ( V H ) ; константнаяобласть тяжелой цепи (С H ) состоит из трехравных частей (СH1 СH2 и СH3), обладаю-щих сходными последовательностями; на-


конец, константная область легкой цепи(СL) гомологична трем доменам констант-ной области тяжелой цепи.

Эта очевидная гомология последователь-ностей аминокислот свидетельствует о том,что молекулы иммуноглобулинов свернутыс образованием компактных доменов,каждый из которых содержит область, го-мологичную по крайней мере одному актив-ному участку, выполняющему определен-ную функцию, свойственную молекуле им-муноглобулина в целом (рис. 33.16). Пред-ставляется вероятным, что домены сходныпо четвертичной структуре, посколькусходны их последовательности аминокис-лот. Данные рентгеноструктурного анализаподтвердили гипотезу доменов. РобертоПоляк (Roberto Poljak) раскрыл простран-ственную структуру при разрешении 2,0 Афрагмента Fab' (практически идентичногофрагменту Fab) человеческого иммуногло-булина. Фрагмент Fab ' состоит из четырехрасположенных в виде тетраэдра глобу-лярных субъединиц - VL, VH, CL иСH1 - поразительно сходных по простран-ственной структуре (рис. 33.17). Общаяструктурная особенность четырех доменовсостоит в наличии двух широких антипарал-лельных β-складок (рис. 33.18). Между нимирасполагаются плотно упакованные бо-ковые цепи многих гидрофобных остатков.Указанный повторяющийся элемент струк-туры назван иммуноглобулиновой складкой.

Трехмерную структуру интактного имму-ноглобулина G раскрыл Дэвид Дэвис (DavidDavies). Анализ карты электронной плотно-сти с разрешением 6 А показал, что молеку-ла IgG имеет Т-образную форму(рис. 33.19). Домены в фрагменте Fc, такжекак и в фрагменте Fab, имеют характернуюиммуноглобулиновую складку. Углеводныйкомпонент, ковалентно связанный с остат-

Рис. 33.16. Схема, иллюстрирующая гипо-тезу доменов.

ком аспарагина в СH2-домене, расположенмежду доменами СH1 и СH2 (рис. 33.19)и составляет значительную часть областиконтакта между единицами Fab и Fc. Срав-нение взаимной ориентации прилегающихдруг к другу доменов в разных иммуногло-

Рис. 33.17. Структура Fab'-фрагмента; по-казаны только α-углеродныеатомы. L-цепи изображены си-ним цветом, Н-цепи - красным.[Poljak R. L., Amzel L. M, AveyН. P., Chen B.L., Phizacker-ley R. P., Saul F., Proc. Nat.Acad. Sci., 70, 3306 (1973).]

булинах и их фрагментах показало, что по-липептидные цепи между доменами обла-дают значительной гибкостью.

33.15. Рентгеноструктурный анализсвязывающих участков антител показал,как происходит связывание некоторыхгаптеновРентгеноструктурный анализ комплексовгаптенов с фрагментами Fab позволил опре-делить природу антиген-связывающих

участков антител и структурную основу ихспецифичности. Подтвердилось предсказа-ние, сделанное на основании сопоставленияпоследовательностей аминокислот, а такжеопытов с аффинной меткой, что антиген-


Таблица 33.1. Свойства иммуноглобулинов разных классов1.

Класс

IgGIgAIgMIgDIgE

Концен-трация всыворотке,мг/мл

1231

0,10,001

Масса,кДа

150180-500950175200

Коэффициентседиментации,S

77, 10, 1318-2078

Легкаяцепь

χ или λТо же»»»

Тяжелаяцепь

γαμδε

Субъединичныйсостав

χ2γ2 или λ2γ2

(χ2α2)n или (λ2α2)n

(χ2μ2)5 или (λ2μ2)5

χ2δ2 или λ2δ2

χ2ε2 или λ2ε2

1 n = 1,2 или 3. IgM и олигомеры IgA содержат также цепь J, которая соединяет между собой молекулы иммуно-глобулина. Секретируемый IgA имеет дополнительный секреторный компонент.

связывающий участок антитела сформиро-ван остатками гипервариабельных областейкак L-цenu, так и Н-цепи. Это хорошо виднона примере связывания производного ви-тамина К1 (рис. 33.20). Аналогично проис-ходит связывание фосфорилхолина в поло-сти, выстланной остатками, принадлежащи-ми пяти гипервариабельным сегментам:двум L-цепи и трем Н-цепи (рис. 33.21).Этот гаптен наиболее прочно связываетсяс остатками Н-цепи. Его положительно за-ряженная триметиламмониевая группа ухо-дит в глубь клинообразной полости, гдеэлектростатически взаимодействует с двумяотрицательно заряженными боковыми це-пями глутамата. Отрицательно заряженнаяфосфатная группа фосфорилхолина связы-вается с положительно заряженной гуаниди-ниевой группой аргининового остаткав устье щели. Кроме того, фосфатная группаобразует водородные связи с гидроксиломтирозинового остатка и с аминогруппой бо-ковой цепи аргинина. Многочисленные ван-дерваальсовы взаимодействия, в том числес боковой цепью триптофана (рис. 33.21),также вносят свой вклад в стабильность это-го комплекса.

33.16. Разные классы иммуноглобулиновразличаются по биологической активностиДо сих пор мы рассматривали иммуногло-булин G. Однако существует 5 классов им-муноглобулинов (табл. 33.1), и все они со-стоят из тяжелых и легких цепей. Кон-стантные области тяжелых цепей у иммуно-глобулинов разных классов неодинаковы,


тогда как легкие цепи одни и те же: либо λ,либо χ. Тяжелые цепи иммуноглобулинаG называются γ-цепями, а тяжелые цепи им-муноглобулинов А, М, D и Е - соответствен-но α-, μ-, δ- и ε-цепями. Различие тяжелыхцепей обусловливает и различие биологиче-ских свойств у пяти классов иммуноглобу-линов. Как уже упоминалось выше, иммуно-глобулин М (IgM) - это класс антител,которые первыми появляются в сыворотке

Рис. 33.18. Два слоя антипараллельныхβ-складок (показаны зелеными желтым цветом) составляютосновной структурный мотивдоменов в иммуноглобулинах.(Capra J. D.. Edmundson А. В.,The antibody combining site,Scientific American, Inc., 1976.)

Рис. 33.19. Схематическое изображениетрехмерной структуры моле-кулы IgG. Каждый аминокис-лотный остаток изображенв виде шарика. Одна из Н-це-пей показана красным цветом,другая синим. Одна из L-це-

пей показана розовым цветом,другая голубым. Углеводнаяцепь присоединена к доменуСН2 (показана желтым цве-том). [Silverton E. W., Na-via М.А., Davies D. R., Proc.Nat. Acad. Sci.. 74, 5142 (1977).]

Рис. 33.20. Способ связывания производ-ного витамина К1 (показаножелтым цветом) в участкесвязывания антигена. Остаткиаминокислот гипервариабель-ного участка Н-цепи изобра-жены розовым цветом, а остат-ки, принадлежащие L-цепи,—синим. [Amzel I. M., Poljak R.,Saul F., Varga J., Richards F.,Proc. Nat. Acad. Sci., 71, 1427(1974).]

после введения антигена, тогда как иммуно-глобулин G (IgG) - основной класс антителсыворотки. На протяжении многих лет IgGназывали γ-глобулином, исходя из его элек-трофоретических характеристик и раствори-мости. Иммуноглобулин А (IgA) - это основ-ной классе антител, секретируемых с раз-личного рода продуктами внешней секреции(слезная жидкость, слизь бронхиальногои кишечного эпителия). Таким образом, IgAслужит первой линией зашиты против бак-териальных и вирусных антигенов. Каковафункция иммуноглобулинов D (IgD) иЕ (IgE), пока не известно. Установлено, од-нако, что иммуноглобулин Е опосредует ал-лергические реакции и тем самым оказываетвредное действие.


33.17. Молекулы антител возниклив результате дупликации и последующейдивергенции геновСтруктурная гомология доменов иммуно-глобулинов указывает на характер их проис-хождения в эволюции. Выше уже рассматри-вался вопрос о том, что сходство последова-тельностей аминокислот в молекулах химо-трипсина, трипсина, эластазы и тромбинасвидетельствует о происхождении этихферментов от общего предшественника(разд. 8.11). Аналогичным образом вну-тренняя гомология в молекуле иммуногло-булина свидетельствует о появлении анти-тел в процессе дупликации генов и ихпоследующей дивергенции (видоизменения).Ген-предшественник кодировал, вероятно,примитивную молекулу антитела, состоя-щую примерно из 108 аминокислотныхостатков. Далее, по всей вероятности, про-исходила дупликация гена-предшественни-ка; в результате дивергенции образовав-шихся новых генов возникли разные типывариабельных и константных областей. Ал-лен Эдмундсон (Allen Edmundson) высказалпредположение, что димер L-цепи выполнялфункцию примитивного антитела(рис. 33.22).

Рис. 33.21. Способ связывания фосфорил-холина (показан синим цветом)с антителом в участке, связы-вающем антиген. [Padlan E.A.,Davies D. R., Rudikoff S., Pot-ter M., Immunochemistry, 13,945 (1976).]

Рис. 33.22. Вероятные этапы эволюциипримитивных антител. Ген, ко-дирующий одну полипептид-ную цепь (А) из 108 аминокис-лотных остатков, удваиваетсяи дает два идентичных домена(Б), соединенных короткой ли-нейной полипептидной цепью.В результате дивергентнойэволюции образовавшихся приудвоении генов аминокис-лотный состав двух доменовстановится различным и возни-кают (В) вариабельная (V)и константная (С) области,перевернутые одна по отноше-нию к другой. При соединенииэтих молекул формируется (Г)примитивный Fab-фрагмент,обладающий участком связы-вания антигена. (Capra J. D.,Edmundson А. В., The antibodycombining site, ScientificAmerican, Inc., 1976.)

33.18. Вариабельные и константные областикодируются разными, но соединившимисягенамиКак организованы и как функционируютгены иммуноглобулина? Обнаружение чет-кого различия между вариабельными и кон-

стантными областями в L- и Н-цепях далооснование думать, что гены иммуноглобу-линов, так же как и кодируемые ими поли-пептиды, имеют необычную архитектуру.Ранее уже упоминалось, что константныеобласти χ-цепей идентичны по всем положе-ниям, кроме 191, где можег стоять либо лей-цин, либо валин. Как показал анализ родос-ловной, указанные два варианта (аллотипа)наследуются в соответствии с классическимправилом Менделя, а это служит веским до-водом в пользу того, что константнаяобласть χ-цепей кодируется только однимгеном. Что касается вариабельных обла-стей, то по данным генетического анализаони кодируются множеством генов.В 1965 г. Уильям Дрейер и Клод Беннетт(William Dreyer, Claude Bennett) выдвинулипредположение, что в половых клетках мно-жественные гены V пространственно отде-лены от одиночного гена С. Согласно этойгипотезе, в процессе дифференцировки клет-ки, продуцирующей антитело, один из геновV соединяется с геном С. Позднее стало из-вестно, что действительно возможно сращи-вание ДНК (сплайсинг), аналогичное тому,которое имеет место, например, при вклю-чении ДНК фага в геном.

Окончательная проверка этой гипотезытранслокации сможет быть произведенатолько после того, как будет выделена чи-стая мРНК иммуноглобулина и будут раз-работаны методы анализа сложных гено-мов млекопитающих. Особенно интереснов этом отношении использование рестрик-таз, расщепляющих большие хромосомы наспецифические фрагменты ДНК, которыенетрудно далее подвергнуть анализу. Рас-пределение генов V и С в этих фрагментахДНК можно определить путем гибридиза-ции их с фрагментами мРНК, специфичны-ми в отношении либо вариабельной, либоконстантной области. В 1976 г. Сусуму То-негава (Susumu Tonegawa), используя этотподход, определил, что в ДНК половых кле-ток гены V и С расположены далеко друг отдруга, а в клетках, продуцирующих антите-ла, они тесно связаны. Следовательно, в ходедифференцировки лимфоцитов происходитперемещение генов иммуноглобулина(рис. 33.23).


Рис. 33.23. При дифференцировке клеток,продуцирующих антитела, генV транслоцируется, соединяясь

с геном С.

33.19. Как возникает разнообразиеспецифичности антител?Организм животного обладает способ-ностью к синтезу больших количеств специ-фических антител спустя несколько недельпосле введения практически любой чуже-родной детерминанты. Число различных ви-дов антител, которые могут синтезировать-ся в организме животного, огромно - ве-роятно, оно превышает миллион. Как мыуже видели, структурной основой специфич-ности антител служат последовательностиаминокислот в вариабельных областях лег-ких и тяжелых цепей. Это подводит наск ключевому вопросу: каким образом возни-кают различные последовательности амино-кислот вариабельных областей? Можносформулировать в связи с этим и более кон-кретные вопросы.

1. Когда возникает разнообразие? Напротяжении жизни животного (соматически)или на протяжении эволюции (генетически)?

2. Как возникает разнообразие? В резуль-тате случайных мутаций в ходе эволюции,путем соматической рекомбинации или пу-тем соматической гипермутации?

Обилие данных относительно последова-тельностей аминокислот миеломных имму-ноглобулинов позволило иммунологам раз-работать несколько гипотез относительнотого, как возникло разнообразие антител.Были предложены три возможных механиз-ма.

1. Гипотеза клеток зародышевых линий.Согласно этой модели, разнообразие свой-ственно уже клеткам зародышевых линий (иэмбриональным клеткам), содержащим


очень большое число (>104) генов, коди-рующих вариабельные области антител. Ка-ждой уникальной последовательности ва-риабельных областей соответствует участокДНК в клетках зародышевого пути. Такимобразом, эта гипотеза предполагает, чторазнообразие возникло на протяжении эво-люции в результате случайных мутацийи отбора.

2. Гипотеза соматических рекомбинаций.Согласно этой гипотезе, существует тольконебольшое число (порядка 100) генов, коди-рующих вариабельные области антител.Эти гены, сходные между собой, но не иден-тичные, на протяжении жизни индивидуумапретерпевают многократные рекомбинациив клетках, продуцирующих антитела. Пред-полагается, что кроссинговер идет внутри-хромосомно. Расчеты показали, что реком-бинация 10 генов может привести к появле-нию 106 разных последовательностей ами-нокислот.

3. Гипотеза соматических гипермутаций.Согласно этой модели, разнообразие возни-кает в результате точковых мутаций одно-го-единственного гена вариабельной обла-сти данного подкласса. Однако тольконеобычайно высокая частота мутаций мо-гла бы создать на протяжении жизни инди-видуума все разнообразие специфичностиантител. Было высказано предположение,что в клетках, продуцирующих антитела(или в соответствующих клетках-предше-ственниках), увеличение скорости мутацийобеспечивается механизмом репарацииДНК, действие которого в данном случаенаправлено на производство ошибок.

33.20. Вариабельные участки L- и Н-цепейкодируются несколькими сотнями геновРеволюция в методах изучения ДНК, про-изошедшая в последние годы, сделала во-прос о происхождении разнообразия анти-тел доступным для экспериментальногоанализа. Особенно ценными в данном слу-чае оказались методы клонирования генови быстрого определения последовательно-сти протяженных участков ДНК. Благодаряиспользованию этих методов за короткийсрок была получена информация, необходи-мая для ответа на два узловых вопроса:сколько генов вариабельных областей со-держится в клетках зародышевого пути?Меняется ли последовательность основанийв процессе дифференцировки клеток, проду-цирующих антитела?

Ответ на первый вопрос сводится к тому,

что существует несколько сотен генов ва-риабельных областей х-легких ( V χ ) и тя-желых цепей ( V H ) . 300 генов Vχ и 300 геновVH, соединяясь в различных комбинациях(300 х 300), способны были бы кодировать9•104 вариантов молекул антител, разли-чающихся по специфичности. Этот рас-четный максимум (9•104) намного нижереального числа антител различной специ-фичности, синтезирующихся в организмеживотного; считается, что число таких анти-тел значительно превышает 106. Расхожде-ние между расчетом и реальной величинойеще выше в отношении легких цепей λ, ко-торые, как было показано, кодируются ме-нее, чем 10 генами Vλ. В целом число геноввариабельных областей в клетках зародыше-вого пути оказалось слишком малым, чтобыполностью обеспечить все разнообразие ан-тител. Очевидно, в ходе дифференцировкилимфоцитов на протяжении жизни живот-ного появляются какие-то дополнительныефакторы, повышающие степень разнообра-зия.

33.21. Открытие генов J (соединяющих) -дополнительного источника разнообразияантителСледующий шаг в изучении механизма,обеспечивающего разнообразие антител,был сделан при определении последователь-

Рис. 33.24. Ген V, выделенный из эмбрио-нальных клеток, укорочен. Онне кодирует последние 13 ами-нокислотных остатков вариа-бельной (V) области полипеп-тидной цепи.

Рис. 33.25. Расположение тандемомгруппы генов J, кодирующихчасть последнего гипервариа-бельного участка вариабель-ной области; гены J локализо-ваны вблизи гена С.

ностей оснований клонированных генов, ко-дирующих иммуноглобулины в эмбрио-нальных и миеломных клетках. Эти исклю-чительно продуктивные исследования былипроведены Тонегавой, Филиппом Ледероми Лероем Худом (Tonegawa, Philip Leder.Leroy Hood). Прежде всего, совершенно не-ожиданно выяснилось, чем в эмбриональныхклетках гены V кодируют вариабельные обла-сти L- и Н-цепей вовсе не целиком. Ген V эм-бриональных клеток (и клеток зародышево-го пути) заканчивается кодом для аминокис-лотного остатка 95, а не 108, которыйсоставляет конец вариабельной областиполипептидной цепи иммуноглобулина(рис. 33.24). Где же находится ДНК, котораякодирует последние 13 остатков вариабель-ной области? В эмбриональных клеткахэтот отрезок ДНК локализован в неожидан-ном месте: вблизи гена С. Указанный отре-зок ДНК назвали геном J (от англ. join - сое-динять), потому что в дифференцированныхклетках он соединяет гены V и С. В сущно-сти, в эмбриональных клетках вблизи генаС локализована целая группа располо-женных тандемом генов J (рис. 33.25). Придифференцировке клеток, продуцирующихантитела, происходит транслокация гена Vв участок, расположенный рядом с геном С;эта транслокация осуществляется путемвнутрихромосомной рекомбинации. Приэтом ген V сращивается (сплайсинг) с геномJ и формируется общий ген, полностью ко-дирующий вариабельный участок. Каждыйиз указанных генов содержит короткую па-линдромную (разд. 24.27) последователь-ность, расположенную рядом с участком ре-комбинации. Эти палиндромы служат, ве-роятно, элементами узнавания в процессерекомбинации.

Гены J вносят большой вклад в разно-образие антител, так как они кодируют


Рис. 33.26. Неточность места соединениягенов V и J служит еще однимисточником разнообразия ан-тител.

часть последнего гипервариабельногоучастка L- и Н-целей. При формированииполного гена Vχ любой из нескольких сотенгенов V может присоединиться к любому изпяти генов J. Например, в результате ком-бинации 300 неполных генов V с пятью ге-нами J может образоваться 1500 вариантовполного (непрерывного) гена V. Следова-тельно, соматическая рекомбинация этихгенных сегментов усиливает разнообразие,заложенное уже в клетках зародышевогопути.

33.22. Соединение генов V и Jв различных рамках также способствуетразнообразию антителВторое удивительное открытие состоялов том, что набор из пяти генов J обеспечи-вал синтез не пяти, а большего числа после-довательностей аминокислот для соответ-ствующих областей легкой цепи. Анализпоследовательностей аминокислот и осно-ваний показал, что рекомбинация генов Vи J происходит не абсолютно точно. Какоказалось, рекомбинация этих генов можетиметь место по тому или иному из основа-ний вблизи кодона, детерминирующегоостаток 95 (рис. 33.26). Следовательно, раз-личие рамок, в которых происходит сращива-


ние генов V и J, вносит дополнительныйвклад в разнообразие антител в организме.Похоже, что иммунная система получаетудовольствие от мелких погрешностей!

В каждом данном лимфоците экспресси-рован только один из двух аллельных генов.Следовательно, все участки, связывающиеантиген, продуцируемые отдельной клет-кой, одинаковы. Обнаружена структурнаяоснова такого избирательного выражениягена (называемого аллельным исключением).Как показал анализ фрагментов, полу-ченных после рестрикции, неполный ген Vправильно соединяется с геном J тольков одной из двух гомологичных хромосом;экспрессируется же только правильно ре-комбинированный ген иммуноглобулина.

33.23. мРНК для L- и Н-цепей образуютсяпутем сращивания (сплайсинга) первичныхпродуктов транскрипциимРНК легких χ-цепей содержит около 1250оснований (рис. 33.27). Как и в другихмРНК эукариот, в ней содержатся poly(A)-последовательность, присоединенная к3'-концу, и нетранслируемые последователь-ности на 3'- и 5'-концах. Лидерная последова-тельность вблизи 5'-конца мРНК χ-цепикодирует гидрофобную N-концевуюобласть синтезируемой χ-цепи. Образую-щаяся сигнальная последовательность(рис. 33.28) направляет рибосому к эндо-плазматическому ретикулуму и определяетспособность новосинтезированной полипеп-тидной цепи иммуноглобулина проходитьчерез мембрану ЭР в просвет его трубочек(разд. 29.30). Далее на внутренней сторонемембраны ЭР происходит отщепление сиг-нальной последовательности под действиемпептидазы. Вариабельная и константнаяобласти легкой цепи кодируются смежнойобластью мРНК, которая следует непосред-ственно за лидерной последовательностью.

Первичный продукт транскрипции, из ко-торого образуется эта мРНК, содержит двевставочные последовательности (рис. 33.29).Одна из них отделяет лидерную последова-тельность от начала мРНК, кодирующейвариабельную область, а вторая расположе-на между дистальным концом последова-тельности, комплементарным гену J, и нача-лом последовательности, комплементарнойгену С (т.е. кодирующей константный уча-сток). При превращении первичного продуктав мРНК (процессинг) происходит удалениеэтих вставочных последовательностей. Лю-бопытно, что ген J несет информацию для

Рис. 33.27. Структура мРНК, кодирую-щей L-цепь.

Рис. 33.28. Сигнальная последователь-ность новосинтезированнойL-цепи. Желтым цветом отме-чены гидрофобные остатки.

сплайсинга (сращивания) двух типов:одно - на уровне ДНК (слияние генов V и J)и другую - на уровне РНК (соединение J-и С-участков).

Какова структура гена, кодирующего тя-желую цепь? Вспомним, что Н-цепь состоитиз четырех доменов: VH, СH1, СH2 и CH3.Недавно было осуществлено клонированиефрагмента ДНК, определяющего констант-ную область тяжелой цепи IgG. Электрон-но-микроскопические исследования показа-ли, что С H 1, СH2 и СH3 кодируютсяразными участками ДНК (рис. 33.30). Ещеодин участок ДНК кодирует шарнирное со-единение между СH1 и СH2. В целом до-менная структура иммуноглобулинов(разд. 33.14) является отражением архи-тектуры соответствующих генов. Благода-ря сплайсингу организмы оказались спо-

Рис. 33.29. Первичный транскрипт - пред-шественник мРНК L-цепи.

собными создавать в ходе эволюции новыебелки путем объединения участков ДНК, ко-дирующих разные домены.

33.24. Разные классы антител образуютсяв результате перескока генов VH

Как уже упоминалось, существует пятьклассов иммуноглобулинов. Клетки, проду-цирующие антитела, сначала продуцируютIgM, а затем IgG, IgA, IgD или IgE той жесамой специфичности. При этом переключе-нии от IgM на другой класс иммуноглобу-линов легкая цепь остается неизменной. Бо-лее того, неизменной остается и вариабель-ная область тяжелой цепи. Меняетсятолько константная область тяжелой це-пи, и потому этот этап дифференцировкиклетки, продуцирующей антитела, назы-вают СH-переключением (рис. 33.31).

В эмбриональных клетках мыши гены, ко-дирующие константные области μ-, γ- и α-тяжелых цепей (и обозначаемых соответ-ственно Сμ, Сγ и Cα), расположены в ряд,один за другим (рис. 33.32). Как оказалось,существует четыре гена константных участ-ков γ-цепей, что полностью соответствуетданным генетического анализа, выявившегочетыре подкласса IgG. Рядом с геном Сμ ло-кализуется набор расположенных тандемногенов J, кодирующих последний гиперва-риабельный участок вариабельной области.Полный ген тяжелой цепи IgM образутсяпутем транслокации гена VH к гену JH

(рис. 33.33). В результате этой транслокациигены VH, JH и Cμ соединяются в функцио-нально единый ген. Вставочные последова-тельности между лидерным отрезком и на-


Рис. 33.30. Три домена константной (С)области тяжелой цепи и шар-нирный участок кодируютсяразными участками гена.

чалом гена вариабельной области, междуконцом гена JH и началом гена Сμ, а такжев пределах гена Сμ выстригаются в ходе пре-вращения первичного траскрипта в мРНКдля μ-цепи.

Рис. 33.31. Синтез различных классов им-муноглобулинов. В результатетого, что ген VH-области снача-ла соединяется с геномСμ-области, а затем с каким-ли-бо другим из генов С-области,формируются Н-цепи разныхклассов иммуноглобулинов.


Как показал анализ продуктов рестрик-тазного расщепления ДНК из эмбрио-нальных и миеломных клеток, СH-пере-ключение происходит на уровне ДНК,а не РНК. Так, при переключении отIgМ к IgA ген V H J H , расположенный рядомс геном Сμ, перемещается в участок, распо-ложенный рядом с геном Cα (рис. 33.34).При этой рекомбинации гены между Сμ и Cα

образуют петлю и выстригаются. Не исклю-чено, что участки ДНК, претерпевающие ре-комбинацию, несут палиндромную последо-вательность. Именно транслокация всегогена VHJH лежит в основе того факта, чтоIgA, продуцируемый определенной клеткой,идентичен по антигенной специфичностиIgM, синтезированному той же клеткой наболее ранней стадии развития. Каким обра-зом клетка выбирает для транслокацииодин из нескольких генов СH, остается не-известным. Биологическое значениеСH-переключения состоит в том, что весьдомен, ответственный за узнавание (вариа-бельный домен), перемещается от первона-чальной константной области (Сμ) к дру-гим константным областям, кодирующимполипептидные цепи с иными эффекторнымифункциями.

33.25. Разнообразие антител обусловленосоматической рекомбинацией многих геновклеток зародышевого путии соматической мутациейПодытожим теперь те механизмы, которыеобеспечивают разнообразие антител. Клет-ки зародышевого пути содержат довольнобольшой набор генов вариабельных обла-стей. Легкая цепь х кодируется несколькимисотнями (скажем, 300) генов V и пятью гена-ми J. Существует по крайней мере три рам-ки, в которых происходит соединение геновV и J. Отсюда следует, что общее число пол-ных генов Vχ, образующихся при всех воз-можных сочетаниях генов V и J, составляет300•5•3 = 4500. Подобным же путем можетвозникнуть аналогичное число вариантов

Рис. 33.32. Гены константных областей μ-,γ- и α-цепей расположены в ряд,один за другим. Положение ге-нов Cδ и Cε еще не установлено.

тяжелых цепей. Соединение 4500 L-цепейс 4500 Н-цепями дает 4500•4500 = 2•107 раз-личных по антигенной специфичности анти-тел. Это число достаточно велико, чтобыобеспечить то большое разнообразие анти-тел, которое образуется в организме живот-ного.

Как упоминалось выше, генов Vλ гораздоменьше, чем генов Vχ. Так, у мышей имеет-ся, по-видимому, только 2 гена Vλ. Однакосоответствующих этому гену последова-тельностей аминокислот обнаружено на-много больше. Представляется вероятным,что разнообразие легких цепей λ возникаетв результате соматических мутаций. В це-лом, как мы видим, природа используеткаждый из трех обсуждавшихся выше(разд. 33.19) источников разнообразия -большой набор генов клеток зародышевогопути, соматические рекомбинации и сомати-ческие мутации: в итоге возникает тот бо-гатейший набор антител, который необхо-дим для защиты организма от вторжениячужеродных веществ.

33.26. Клонально-селекционная теорияобразования антителВ 50-х годах Нилс Ерне, Макферлейн Бёр-нет, Дэвид Тэлмедж и Джошуа Ледерберг(Niels Jerne, Macfarlane Burnet, DavidTalmage, Joshua Lederberg) разработали кло-нально-селекционную теорию, дающуюобобщенное описание иммунного ответа.

Рис. 33.33. В результате соединения геновVH и JH образуется ген, коди-рующий μ-цепь.

Основные положения этой ныне общепри-нятой теории следующие.

1. Клетка, продуцирующая антитела, со-держит ДНК с уникальной последователь-ностью оснований, определяющей последо-вательность аминокислот, характерную длясинтезируемых ею цепей иммуноглобулина.Специфичность антитела целиком опреде-ляется последовательностью аминокислот.

2. Каждая отдельная клетка продуцируетантитела только одной специфичности. Сле-довательно, способность к синтезу опреде-ленного антитела заложена в клетке еще доконтакта с антигеном.

3. Начинающая созревать клетка проду-цирует небольшие количества антителодной специфичности. Часть из них прикре-пляется к поверхности клетки. Если такаянезрелая клетка встречается с антигеном,против которого оказались направлены ееантитела, то она погибает. Вследствие этогоживотное обычно не производит антителпротив собственных макромолекул, т. е. онообладает толерантностью к своему. Дей-ствительно, клетки, продуцирующие антите-ла против собственных антигенов, элимини-руются на протяжении эмбриональногоразвития. На зрелые клетки в отличие от не-зрелых встреча с антигеном действует сти-мулирующим образом: усиливается синтезантител и запускается клеточное деление.Потомки одной клетки составляют клон,обладающий всеми генетическими особен-ностями исходной клетки. Следовательно,деление клетки, инициированное контактомс антигеном, приводит к появлению клонаклеток, синтезирующих антитела той жеспецифичности.


Рис. 33.34. Структурная основа СH-пере-ключения. В результате вну-трихромосомной рекомбина-ции ген VHJH, находивший-ся возле гена Сμ, оказываетсярядом с геном Cα.

4. Клон проявляет тенденцию к сохране-нию и после исчезновения антигена. В слу-чае нового появления того же антигена про-исходит стимуляция этих клеток, чтои обусловливает иммунологическую память.

33.27. На поверхности клеток, продуцирую-щих антитела, имеются рецепторыантигеновМолекулы специфических антител располо-жены на поверхности продуцирующих ихклеток. Клетками-предшественникамиявляются лимфоциты. В обычных условияхони делятся медленно. Однако в результатестимуляции антигеном лимфоцит превра-щается в плазматическую клетку, очень ак-тивно синтезирующую и продуцирующуюантитела. Если популяцию лимфоцитовпропустить через колонку, содержащую ко-валентно присоединенные динитрофе-нильные (ДНФ) группы, то на колонке свя-жется только очень небольшая часть клеток,


а именно те, которые синтезируют антителапротив ДНФ и несут молекулы таких анти-тел на своей поверхности. Не задержавшие-ся на колонке лимфоциты таких антителпротив ДНФ не вырабатывают.

Как происходит стимуляция лимфоцитовпод действием специфических антител?В отсутствие антигена молекулы антител наповерхности лимфоцита распределены слу-чайным образом. Добавление антигенаоказывает поразительный эффект: располо-женные на поверхности лимфоцита антите-ла вместе с присоединенными антигенамисобираются вместе на одном конце клетки.образуя так называемый «колпачок» («кэп»).По завершении перераспределения моле-кулы антител оказываются внутри клетки.Образование «колпачка» идет с потребле-нием энергии и при участии сократительныхэлементов клетки. Итак, формирование наповерхности клетки решетки из комплексовантиген—антитело ведет к образованию«колпачка», а это стимулирует клеточноеделение. Антиген должен быть полива-лентным (т. е. содержать более одной специ-фической детерминанты) для того, чтобысоздать перекрестные связи между молеку-лами антител на поверхности лимфоцита.Вопрос о зависимости митотической актив-ности клеточного ядра от этих событий,

Рис. 33.35. Полученное в сканирующемэлектронном микроскопе изо-бражение бараньих эритроци-тов, связавшихся с челове-ческим Т-лимфоцитом (в цен-тре). Поверхность этого лим-фоцита имеет рецепторы, спе-цифичные в отношении компо-нентов бараньих эритроцитов.(Печатается с любезного разре-шения д-ра J. Thornthwaite,д-ра R. Life и д-ра М. Сауег.)

Рис. 33.36. Полученное методом радиоав-тографии изображение имму-ноглобулинов, образовавших«колпачок» на поверхностиВ-лимфоцита. Темные включе-ния - меченные 125I антителапротив иммуноглобулинов, до-бавленные к В-лимфоцитам изселезенки мыши. А - при 4°Смолекулы иммуноглобулиновравномерно распределяютсяна поверхности клетки; Б - пос-ле инкубации при 37°С меткаконцентрируется в виде «кол-пачка» на одном полюсе клеткии затем попадает внутрь по-средством эндоцитоза. (Печа-тается с любезного разрешенияд-ра Е. Unanue.)

разыгрывающихся на поверхности клетки,составляет интересную и важную областьисследований.

33.28. Биологическое значение клональнойселекцииСущность теории селекции клонов в форму-лировке Бёрнета состоит в следующем:

Ни один участок связывания антигенане адаптирован в эволюционном смыслев какой-либо определенной антигеннойдетерминанте. Структура участка, связы-вающего антиген, существует как таковая,и если она оказывается подходящей в томсмысле, что сродство к данной антиген-ной детерминанте превышает какой-тоопределенный уровень, то инициируетсяиммунологически значимая реакция.Отбор предсуществующих вариантов,

возникающих случайным образом,- это не

новая тема в биологии. В самом деле, в этомсуть теории Дарвина. Любопытно отме-тить, что инструктивные теории предше-ствуют селекционным теориям: теория Ла-марка предшествовала теории Дарвина,инструктивная теория в иммунологии быласформулирована раньше, чем клонально-се-лекционная теория.

Ерне высказал предположение, что меха-низмы отбора могут играть роль в функцио-нировании нервной системы, например в ме-ханизмах памяти. По существу, инструктив-ная и селекционная теории обучения былисформулированы очень давно. Локк (Lock)считал, что мозг человека подобен чистомулисту бумаги, на котором опыт выписываетпочти бесконечные узоры. Сократ, напро-тив, утверждал, что «все обучение - это на-поминание о том, что уже существует в моз-гу». Будем надеяться, что эта глава вамкажется чем-то давно знакомым!

ЗаключениеАнтитело - это белок, который синтезирует-ся в организме животного в ответ на про-никновение чужеродного макромолекуляр-ного соединения (называемого антигеномили иммуногеном) и который обладает вы-соким сродством к нему. Небольшие чуже-родные молекулы (гаптены) вызываютобразование специфических антител тольков том случае, если такие гаптены присоеди-нены к макромолекулам. Синтез антителопределяется действием отбора, а не ин-струкции. Антиген связывается на поверхно-сти тех лимфоцитов, которые исходно син-тезируют антитела, специфичные к данномуантигену. Присоединение антигена к рецеп-


тору на поверхности клетки запускает про-цесс клеточного деления и синтез большихколичеств специфического антитела. Анти-тела против специфической детерминантыобычно гетерогенны, поскольку они проду-цируются разными клетками. Антитела, вы-рабатываемые одной клеткой или однимклоном клеток, гомогенны. В сывороткеимеется пять классов антител, причем ос-новной класс - это иммуноглобулины D.После введения антигена первыми появ-ляются в сыворотке антитела, принадлежа-щие к классу иммуноглобулинов М. Имму-ноглобулины А - это класс антител, сек-ретируемых с продуктами внешней секре-ции. Роль иммуноглобулинов D и Е покаеще не установлена.

Антитела состоят из легких (L) и тяжелых(Н) цепей. Иммуноглобулин G, имеющийсубъединичную структуру L2H2, содержитдва участка связывания антигена. При фер-ментативном расщеплении иммуноглобу-лина G образуются два Fab-фрагмента, ко-торые связывают антиген, но не дают с нимосадка, а также один Fс-фрагмент, обладаю-щий функцией эффектора (в частности,связывает комплемент). Сравнение последо-вательностей аминокислот в миеломныхиммуноглобулинах показало, что L- и Н-це-пи состоят из вариабельной (V) области (N-концевая последовательность, обычно из108 остатков) и константной (С) области.Участки связывания антигена сформиро-ваны из остатков аминокислот, принадле-жащих гипервариабельным участкам вариа-бельных областей как L-, так и Н-цепей.Молекулы антител свертываются в ком-пактные домены, содержащие примерно по108 аминокислотных остатков в виде гомо-логичных последовательностей. Полагают,что домены константной области, выпол-няющие эффекторные функции, возниклив процессе эволюции путем удвоения и по-следующего расхождения гена, кодирующе-

го антиген-связывающий (вариабельный)домен.

Вариабельная и константная области ко-дируются разными генами, соединяющими-ся в процессе дифференцировки клеток.Имеется несколько сотен генов вариа-бельных участков L- и Н-цепей. Полный генвариабельного участка легкой цепи обра-зуется путем рекомбинации неполного генаV и одного из нескольких генов J, кодирую-щих последний гипервариабельный участок.Расположенная тандемно группа генов J ло-кализована рядом с геном С. Первичныйпродукт транскрипции содержит вста-вочные последовательности. Эти вста-вочные последовательности удаляются, ив результате образуется мРНК, кодирую-щая вариабельные и константные областииммуноглобулина, а также N-концевую ги-дрофобную сигнальную последователь-ность, которая в последующем отщепляетсяот новосинтезированной полипептидной це-пи. Синтез тяжелой μ-цепи IgM кодируетсяполным геном, также образовавшимся в ре-зультате сращивания генов V и J. Тяжелыецепи иммуноглобулинов других классов (вчастности IgG) синтезируются после транс-локации полного гена VH к другому гену С(Сγ). Этот перескок генов называетсяСH-переключением. Разнообразие легких х-цепей, а также тяжелых цепей обусловленосоматической рекомбинацией довольнобольшого числа гаметных генов (т.е. геновклеток зародышевого пути) вариабельныхобластей и участков соединения. Степеньразнообразия возрастает также в результатесоединения генов в различных рамках. Раз-нообразие легких цепей обусловлено, по-ви-димому, соматическими мутациями. Соче-тание нескольких тысяч видов L-цепейс таким же количеством видов Н-цепейобеспечивает то огромное число различныхантител, которое синтезируется в организмеживотного.


С чего начатьCapra J.D., Edmundson А.В., 1977. Theantibody combining site, Sci. Amer.,236(1), 50-59.Milstein C., 1980. Monoclonal

antibodies, Sci. Amer., 243(4), 66-74.Porter R.R., 1973. Structural studies ofimmunoglobulins, Science, 180,713-716.Edelman G.M., 1973. Antibody struc-ture and molecular immunology,Science, 180, 830-840.

КнигиHood L.E., Weissman I.L., WoodW.B., 1978. Immunology, Benjamin.(Ясное, легко читаемое изложение ос-нов иммунологии.)Kabat E.A., 1976. Structural Conceptsin Immunology and Immunochemistry,(2nd ed.), Holt, Rinehart, and Winston.(Прекрасное описание структуры им-муноглобулинов и ее связи со специ-фичностью связывания антигенов.)258


Mishell B.B., Shiigi S.M. (eds.), 1980.Selected Methods in Cellular Immuno-logy, Freeman. (Очень хорошее руко-водство по экспериментальным ме-тодам в иммунологии.)

Структура иммуноглобулиновAmzel L.M., Poljak R.J., 1979. Three-dimensional structure of immunogl-obulins, Ann. Rev. Biochem., 48,961-967.Silverton E.W., Navia M.A., Davi-es D.R., 1977. Three-dimensional struc-ture of an intact human immunogl-obulin, Proc. Nat. Acad. Sci., 74,5140-5144.Valentine R.C, Green N.M., 1967.Electron microscopy of an antibody-hapten complex, J. Mol. Biol., 27,615-617.

Архитектура геновTonegawa S., Maxam A.M., Tizard R.,Bernard O., Gilbert W., 1978. Sequenceof a mouse germ-line gene for a variableregion of an immunoglobulin lightchain, Proc. Nat. Acad. Sci., 75,1485-1489.Sakano H., Rogers J.H., Huppi K.,Brack C., Traunecker A., Maki R.,Wall R., Tonegawa S., 1979. Domainsand the hinge region of an immunogl-obulin heavy chain are encoded in

separate DNA segments, Nature, 277,627-633.

Механизмы, создающие разнообразиеантителSeidman J.G., Leder A., Nau M,Norman B., Leder P., 1978. Antibodydiversity, Science, 202, 11-17.Sakano H., Huppi K., Heinrich G.,Tonegawa S., 1979. Sequences at thesomatic recombination sites of immun-oglobulin light-chain genes, Nature,280, 288-294.Seidman J.G., Max E.E., Leder P.,1979. A χ-immunoglobulins gene isformed by site-specific recombinationwithout further somatic mutation,Nature, 280, 370-375.Schilling J., Clevinger В., Davie J.M.,Hood L., 1980. Amino acid sequence ofhomogeneous antibodies to dextran andDNA rearrangements in heavy chainV-region gene segments, Nature, 283,35-40.Kataoka Т., Kawakami Т., Takahashi-N., Honjo Т., 1980. Rearrangement of

immunoglobulin γ1-chain gene andmechanism for heavy-chain class switch,Proc. Nat. Acad. Sci, 77, 919-923.Davis M.M., Calame K., Early P.W.,Livant D.L., Joho R., Weissman I.L.,Hood L., 1980. An immunoglobulinheavy-chain gene is formed by at least

two recombinational events, Nature,283, 733-739.

Эффекторные функции иммуноглобу-линовPorter R.R., Reid K.B.M., 1978. Thebiochemistry of complement, Nature,275, 699-704.Metzger H., 1978. The IgE-mast cellsystem as a paradigm for the study ofantibody mechanisms, Immunol. Rev.,41, 186-199.

Селекция клонов и клеточная иммуно-логияBurnet F.M., 1959. The ClonalSelection Theory of AcquiredImmunity, Cambridge University Press.Jerne N.K., 1967. Antibodies andlearning: selection versus instruction.In: Quarton G.C, Melnechuk T. andSchmitt F.O. (eds.), The Neurosciences:A Study Program, RockefellerUniversity Press.Cunningham B.A., 1977. The structureand function of histocompatabilityantigens, Sci. Amer., 237(4), 96-107.Raff M.C., 1976. Cell-surface immunol-ogy, Sci. Amer., 234(5), 30-39.Jerne N.K., 1973. The immune system,Sci. Amer., 229(1), 52-60.

ГЛАВА 34

Мышечное сокращениеи подвижность клетокКаким образом энергия химических связейтрансформируется в координированноедвижение? Это один из самых острых воп-росов современной молекулярной биоло-гии. Направленное движение имеет местопри расхождении хромосом в процессе кле-точного деления, при внедрении ДНК бакте-риофага в бактериальную клетку, при бие-нии ресничек и жгутиков, при активномтранспорте молекул, при перемещении РНКв ходе белкового синтеза и - в наиболее оче-видной форме - при мышечном сокращении.В данной главе мы будем рассматриватьглавным образом структурную основу про-цесса сокращения поперечнополосатыхмышц позвоночных, поскольку этот процессизучен наиболее полно. Сократительная си-стема поперечнополосатой мышцы состоитиз перекрывающихся белковых нитей, ко-торые скользят относительно друг друга.Сокращение происходит за счет энергии,высвобождающейся при гидролизе АТР.В поперечнополосатой мышце оно зависитот концентрации Са2+, которая в свою оче-редь регулируется саркоплазматическим ре-тикулумом - специализированной системоймембран, накапливающей Са2+ в состояниипокоя и высвобождающей его при воздей-ствии на мышечное волокно нервного им-пульса.

34.1. Мышца состоит из взаимодействующихдруг с другом толстых и тонкихбелковых нитейПроизвольные мышцы позвоночных в све-товом микроскопе выглядят поперечно ис-черченными (рис. 34.1). Они состоят из кле-


ток, окруженных электровозбудимой мем-браной - сарколеммой. Мышечная клеткасодержит большое число параллельныхмиофибрилл диаметром около 1 мкм каж-дая. Миофибриллы погружены во внутри-клеточную жидкость, называемую сарко-плазмой. В саркоплазме имеются гликоген,АТР, фосфокреатин и гликолитические фер-менты. В активно функционирующих мыш-цах обнаруживается также много митохон-дрий, регулярно расположенных вдоль мио-фибрилл.

Рис. 34.1. Волокно скелетной мышцыв фазово-контрастном свето-вом микроскопе. Диаметр во-локна около 50 мкм. А-диски —темные, I-диски - светлые. (Пе-чатается с любезного разреше-ния д-ра Hugh Huxley.)

Электронная микрофотография продоль-ного среза миофибрилл выявляет множе-ство деталей структуры (рис. 34.2 и 34.3).Функциональной единицей является сарко-мер, который повторяется каждые 2,3 мкм(23 000 А) по длинной оси фибриллы. Регу-лярно чередуются темная полоса - А-диски светлая полоса - I-диск. Середина А-диска,называемая зоной Н, отличается меньшейэлектронной плотностью. По центру зоныН проходит темная М-линия. I-диск пересе-кается узкой Z-пластинкой высокой элек-тронной плотности.

О молекулярном устройстве саркомерав толщину можно судить по электронныммикрофотографиям поперечного среза че-рез миофибриллу. На них видны два типавзаимодействующих друг с другом белковыхнитей (миофиламентов). Диаметр толстыхнитей равен примерно 150 А, а диаметртонких - около 70 А. Толстые нити содер-жат главным образом миозин, тонкие - ак-тин, тропомиозин и тропонин. В Z-пластин-ке имеется α-актинин, а в М-линиях - М-бе-лок.

I-диск состоит только из тонких нитей,тогда как в зоне Н А-диска присутствуюттолько толстые нити. В других частях А-ди-ска присутствуют нити обоих типов. На по-перечном срезе четко видно гексагональноеустройство миофибриллы, при которомкаждая тонкая нить соседствует с тремятолстыми, а каждая толстая нить окруженашестью тонкими (рис. 34.3). Взаимодей-ствие толстых и тонких нитей осуществляет-ся с помощью поперечных мостиков, ко-торые представляют собой домены молекулмиозина. Поперечные мостики, с регу-лярными интервалами выступающие натолстых нитях, перекрывают промежутокшириной 130 А между поверхностьютолстых и тонких нитей (рис. 34.4 и 34.5). Посуществу, именно взаимодействие миози-новых поперечных мостиков с единицамиактина в тонких нитях генерирует силусокращения.

34.2. При мышечном сокращении происходитскольжение толстых и тонких нитейотносительно друг другаКогда мышца сокращается, степень ее уко-рочения может достигнуть 1/3 первоначаль-ной длины. С чем это связано? В 50-х годахдве группы исследователей независимо другот друга постулировали, исходя из данныхдифракции рентгеновских лучей, световойи электронной микроскопии, модель мы-

Рис. 34.2. Электронная микрофотогра-фия продольного среза волок-на скелетной мышцы. (Печа-тается с любезного разрешенияд-ра Hugh Huxley.)

шечного сокращения, получившую названиемодель скользящих нитей. Основные чертыэтой модели (рис. 34.6), выдвинутойЭндрью Хаксли и Р. Нидергерке (AndrewHuxley, R. Niedergerke), а также Хью Хакслии Джейн Хенсон (Hugh Huxley, Jean Hanson),заключаются в следующем.

1. Длина как толстых, так и тонких нитейв ходе мышечного сокращения не меняется.

2. В то же время длина саркомера при со-кращении уменьшается вследствие того, чтонити двух типов перекрываются в большейстепени, а именно в ходе сокращениятолстые и тонкие нити скользят относи-тельно друг друга.

3. Сила сокращения генерируется в ре-зультате активного движения нитей одноготипа вдоль прилегающих нитей другоготипа.

В пользу этой модели свидетельствуютданные, полученные при измерении длиныА- и I-дисков, а также зоны Н в растянутой,покоящейся и сократившейся мышце(рис. 34.6). А-диск характеризуется постоян-

34. Мышечное сокращениеи подвижность клеток 261

Рис. 34.3. Электронограмма продольно-го среза миофибриллы скелет-ной мышцы. Под микрофото-графией приведено схематиче-ское изображение соответ-ствующих поперечных срезов.(Печатается с любезного разре-шения д-ра Hugh Huxley.)

ной длиной, т. е. размер толстых нитей присокращении не меняется. Расстояние междуZ-пластинкой и началом ближайшей к нейзоны Н также постоянно; следовательно,и размер тонких нитей не меняется при со-кращении. Однако зона Н и I-диск при со-кращении становятся уже, поскольку в со-кратившемся волокне толстые и тонкиенити перекрываются в большей мере, чемв покоящейся мышце.

34.3. Миозин образует толстые нити;он гидролизует АТР и связывает актинМиозин обладает тремя биологическиважными функциями. Во-первых, при фи-зиологических значениях ионной силы и рНмолекулы миозина в растворе спонтаннообразуют волокна. По существу, толстые


Рис. 34.4. Вид поперечных мостиков ме-жду толстыми и тонкими нитя-ми под электронным микро-скопом. (Печатается с любез-ного разрешения д-ра JohnHeuser.)

Рис. 34.5. Схематическое изображениеструктуры поперечнополоса-той мышцы, показывающеевзаимное перекрываниетолстых и тонких нитей, и со-ответствующая электроннаямикрофотография сверхтонко-го продольного среза. (Печа-тается с любезного разрешенияд-ра Hugh Huxley.)

нити миофибрилл состоят в основном измолекул миозина. Во-вторых, миозин - этофермент. В 1939г. В. А. Энгельгардти М. Н. Любимова обнаружили, что миозинобладает АТР-азной активностью:

АТР + Н2О ADP + Pi + Н+

Эта реакция является непосредственнымисточником свободной энергии, необходи-мой для мышечного сокращения. В-третьих,

Рис. 34.6. Модель скользящих нитей.(Huxley Н. Е., The mechanism ofmuscular contraction, ScientificAmerican, Inc., 1965.)

Рис. 34.7. Электронная микрофотогра-фия молекулы миозина. (Печа-тается с любезного разрешенияд-ра Susan Lowey.)

миозин связывает полимеризованную фор-му актина - основного компонента тонкихнитей. Именно это взаимодействие играетключевую роль в генерировании силы, обес-печивающей смещение толстых и тонких ни-тей относительно друг друга.

Молекула миозина очень большая(500 кДа). Она состоит из двух идентичныхосновных цепей (по 200 кДа) и четырех лег-ких цепей (примерно по 20 кДа). На элек-тронных микрофотографиях видно, чтомиозин состоит из глобулярной, образую-щей две головки части, присоединеннойк очень длинному стержню (рис. 34.7 и 34.8).Стержень представляет собой двухцепочеч-ную α-спирализованную суперспираль.


Рис. 34.8. Схематическое изображениемолекулы миозина.

34.4. Миозин можно расщепитьна активные фрагментыЕсли миозин подвергнуть ферментативномурасщеплению, то образуются фрагменты,сохраняющие некоторые функции интакт-ной молекулы. Выше на примере иммуно-глобулинов (разд. 33.5) уже было показано,насколько плодотворен такой эксперимен-тальный подход при изучении макромоле-кул. На самом же деле этот подход был раз-работан для миозина раньше, чем дляиммуноглобулинов. В 1953 г. Эндрью Сент-Дьёрдьи (Andrew Szent Gyorgyi) показал, чтопри обработке трипсином миозин расщеп-ляется на два фрагмента, названные им лег-ким меромиозином и тяжелым меромиози-ном (рис. 34.9).

Легкий меромиозин (ЛММ), подобномиозину, образует нити. Однако он не обла-дает АТР-азной активностью и не связываетактина. На электронных микрофотографияхвидно, что ЛММ имеет форму стержня; уд-линенность структуры обусловливает высо-кую вязкость растворов ЛММ. Данныеопределения оптического вращения показа-ли, что 90% молекулы ЛММ имеет структу-ру α-спирали. Это подтверждалось и прианализе дифракции рентгеновских лучей;волокна ЛММ дают сильный рефлекс при5,1 А, характерный для α-спирализованныхсуперспиралей. В целом, как было уста-новлено, ЛММ представляет собой двухце-почечный α-спирализованный стержень дли-ной 850 А.

Тяжелый меромиозин (ТММ) обладаетсовершенно иными свойствами. ТММ ката-лизирует гидролиз АТР и связывает актин,


но не способен к образованию волокон.ТММ состоит из вытянутой стержневиднойчасти и глобулярной (в виде двух головок)области (рис. 34.9). При дальнейшем фер-ментативном расщеплении ТММ распа-дается на два глобулярных субфрагмента(обозначаемых S1) и один фибриллярныйсубфрагмент (S2). Каждый S1-фрагментимеет участок с АТР-азной активностьюи участок связывания актина. Кроме того,к S1-фрагменту присоединены легкие цепимиозина. Легкие цепи способны модулиро-вать АТР-азную активность миозина. Так,например, в гладких мышцах ими опосредо-вано регулирующее действие Са2+ на сокра-щение.

Рис. 34.9. Ферментативное расщеплениемиозина. На схеме не показаны4 легкие цепи.

Рис. 34.10. Электронная микрофотогра-фия нити из очищенного F-ак-тина. (Печатается с любезногоразрешения д-ра JamesSpudich.)

34.5. Актин образует нити, которыесоединяются с миозиномАктин - основной компонент тонких нитей.В растворах с низкой ионной силой актинсуществует в виде мономера массой 42 кДа,обозначаемого как G-актин (G от англ.globular - глобулярный). При повышенииионной силы до физиологического уровняG-актин полимеризуется в F-актин - фи-бриллярную форму, очень похожую на тон-кие нити. На электронных микрофотогра-

этих белков актомиозин. Формированиеэтого комплекса сопровождается большимувеличением вязкости раствора. В 40-х го-дах Альберт Сент-Дьёрдьи показал, что воз-растание вязкости обращается добавлениемАТР. Так было выявлено, что АТР вызываетдиссоциацию актомиозина на актин и мио-зин. Сент-Дьёрдьи получил также нити ак-томиозина, молекулы которого были ориен-тированы определенным образом токомжидкости. Когда эти нити поместили в рас-твор, содержащий АТР, К+ и Mg2+, полу-чился поразительный результат: актомио-зиновые нити сократились. В тех же усло-виях нити, образованные из одного миози-на, не сокращались. Эти замечательныеопыты дали основание думать, что мышеч-ное сокращение возникает в результатевзаимодействия миозина, актина и АТР.

34.6. Актин повышает АТР-азнуюактивность миозинаАТР-азная активность миозина значительновозрастает в присутствии стехиометриче-ских количеств F-актина. Так, число оборо-тов увеличивается в 200 раз: от 0,05 до10 с-1. Собственно гидролиз АТР чистыммиозином идет очень быстро, но продуктыреакции-ADP и Рi - высвобождаются мед-ленно. Актин увеличивает число оборотовмиозина, присоединяясь к комплексумиозин—ADP—Pi и ускоряя высвобожде-ние ADP и Рi (рис. 34.12). После акта гидро-лиза актомиозин связывается с АТР, что

Рис. 34.11. Схематическое изображениеF-актина, состоящего из спи-рально расположенных моно-меров актина. (По схеме, лю-безно предоставленной д-ромJames Spudich.)

фиях волокна F-актина выглядят как двенити бус, закрученные одна вокруг другой(рис. 34.10). Рентгеноструктурный анализпоказал, что F-актин представляет собойспираль из мономеров актина. Диаметр спи-рали - около 70 А. Структура состоит из по-вторяющихся участков длиной 360 А по осиспирали (рис. 34.11).

При добавлении раствора актинак раствору миозина образуется комплекс

приводит к его диссоциации на актин и мио-зин. В результате вновь образуется ком-плекс миозин—АТР, входящий в новый ка-талитический цикл. Эти реакции идутс участием Mg2+. Важнейшая особенностьрассматриваемого цикла, который былпредложен Эдвином Тейлором (EdwinTaylor) на основе изучения быстрой кинети-ки процесса, состоит в том, что актин обла-дает высоким сродством к миозину и ком-плексу миозин—ADP—Pi, но низким срод-ством к комплексу миозин—АТР. Вслед-ствие этого актин то присоединяетсяк миозину, то высвобождается из комплекса


Рис. 34.12. Гидролиз ATP приводит к цик-лическому образованию и рас-паду комплекса актина и мио-зина.

с ним - в зависимости от гидролиза ATР.Как будет показано ниже, это АТР-зависи-мое изменение во взаимодействии миозинаи актина лежит в основе генерированиясилы при мышечном сокращении.

34.7. Толстые и тонкие нитимышечного волокна определенным образомориентированыЦиклический процесс образования и диссо-циации комплекса миозина и актина создаеткоординированное движение потому, чтоэти белки входят в состав высокоорганизо-ванной системы. Путем изучения интактных

миофиламентов, отделенных от мышцы,а также искусственных волокон, образо-ванных из очищенного миозина, Хью Хакс-ли показал, как расположены молекулымиозина в толстых нитях. Выделенная измышечного волокна толстая нить имеетдиаметр 160 А и длину примерно 1,5 мкм(15 000 А). Вдоль нити периодически по спи-рали выступают поперечные мостики,и только в середине остается свободная отмостиков область протяженностью 1500 А(рис. 34.13).

Аналогичную структуру имеют и искус-ственные толстые нити, образующиеся приснижении ионной силы раствора миозина.Длина наиболее короткой искусственнойнити составляет около 3000 А, а располо-женная в середине свободная от мостиковзона - 1500 А. Поскольку такая же протя-женность свободной зоны свойственна и бо-лее длинным искусственным нитям, очевид-но, что рост толстых нитей происходитпутем добавления молекул параллельнок уже собранному ряду. Молекулы миозина,расположенные по одну сторону от свобод-ной от мостиков зоны, ориентированыв одном направлении, тогда как молекулы подругую сторону ориентированы в противопо-ложном направлении. Следовательно,толстые нити по самой своей природебиполярны.

ЛММ, подобно миозину, агрегируетв растворах с низкой ионной силой, образуянити с периодической структурой, где длина

Рис. 34.13. Электронная микрофотогра-фия реконструированной тол-стой нити.По обе стороны от свободнойзоны видны выступающие по-перечные мостики. (Печатаетсяс любезного разрешения д-раHugh Huxley.)


повторяющегося участка составляет по оси430 А, т. е. столько же, сколько составляетрасстояние между поперечными мостикамив интактной толстой нити. Однако нити изЛММ гладкие, без выступающих мостиков.Это показывает, что поперечные мостикиобразуются в ТММ-части миозина, тогдакак ЛММ-единицы миозина образуют ске-лет толстых нитей.

Тонкие нити также имеют определенноенаправление. Если миозин (или ТММ, или

Рис. 34.14. Электронная микрофотогра-фия нити F-актина, декориро-ванной S1-головками ТММ.Все стрелки ориентированыв одну сторону. (Печатаетсяс любезного разрешения д-раJames Spudich.)

S1) добавить к тонким нитям или F-актину,то формируется структура, которая подэлектронным микроскопом выглядит какряд последовательно расположенных стре-лок (рис. 34.14). Такие структуры получилиобразное название декорированные нити. Повсей длине декорированных нитей стрелкина обоих тяжах направлены в одну сторону.Таким образом, тонким нитям изначально

присуща направленность, одинаковая на обо-их тяжах, составляющих тонкую нить.В некоторых препаратах тонких нитей, по-лученных из гомогенизированных мышц,часть нитей сохраняет связь с Z-пластинкой.При декорировании таких препаратов тя-желым меромиозином стрелки на всех ни-тях оказались направлены в сторону отZ-пластинки. Отсюда следует, что все тон-кие нити по одну сторону от Z-пластинкиориентированы в одном направлении, тогдакак нити, расположенные по другую сторо-ну,- в противоположном.

34.8. Полярность толстых и тонких нитейв середине саркомера меняетсяна противоположнуюПолярность структуры толстых и тонкихнитей играет решающую роль в координи-рованном движении. Благодаря тому чтоучастки взаимодействия на нитях актинаи миозина ориентированы одинаково поотношению друг к другу, в ходе скольже-ния нитей происходит сложение сил, разви-вающихся в каждом участке взаимодейст-вия. Кроме того, посередине между двумяZ-пластинками направление нитей меняет-ся на противоположное (рис. 34.15). В итогедве тонкие нити при взаимодействии с од-ной толстой скользят навстречу друг другу,что приводит к уменьшению расстояниямежду Z-пластинками (рис. 34.16).

34.9. «Рабочим ходом» является поворотсвязанной с актином S1-головки миозинаГенерирование силы сокращения связанос циклическим образованием и диссоциа-цией комплекса между S1-головкой миозинаи актином. Циклически повторяющиесяпроцессы присоединения, подтягивания

Рис. 34.15. Перемена полярности толстыхи тонких нитей посередине ме-жду двумя Z-пластинками.


Рис. 34.16. Схема взаимодействия толс-тых и тонких нитей при сокра-щении скелетной мышцы. (Посхеме, любезно предоставлен-ной д-ром James Spudich.)

и отсоединения сопровождают даже оди-ночное сокращение. Механизм генерирова-ния силы сокращения изучается в настоящеевремя методами биохимии, электронноймикроскопии, дифракции рентгеновских лу-чей. Полученные данные показывают, чтов покоящейся мышце головки S1 не связаныс тонкими нитями (рис. 34.17, А). В этом фи-зиологическом состоянии головки S1 распо-лагаются вокруг толстой нити по спирали.При стимуляции мышцы S1-головки ото-двигаются от толстых нитей и прикре-пляются к актиновым единицам на тонкихнитях (рис. 34.17, Б). На следующем этапеголовки S1 меняют свое направление так,что их длинная ось образует угол примерно45° с осью тонких нитей (рис. 34.17, В).Этот постулированный поворот головокмиозина является, по-видимому, рабочим хо-дом мышечного сокращения. Через S2-еди-ницу миозина поворот S1-домена передает-ся на толстую нить. В итоге толстая нитьпродвигается относительно тонкой пример-но на 75 А. Завершающий этап процес-са - отсоединение S1-головки от тонких ни-тей (рис. 34.17, Г).

Сопоставим эти предполагаемые струк-турные переходы, обеспечивающие возник-новение силы сокращения, с промежуточны-ми этапами гидролиза АТР. В состояниипокоя миозин содержит прочно связанныеADP и Рi (рис. 34.17, А). При стимуляциимышечного волокна головка S1 присоеди-няется к тонкой нити в перпендикулярномей направлении (рис. 34.17, Б). Далее ADP иРi, связанные с S1, высвобождаются, а го-


ловка S1 совершает поворот, принимая на-клонное положение по отношению к тонкойнити (рис. 34.17, В). Таким образом, «рабо-чий ход» обеспечивается высвобождениемпрочно связанных ADP и Pi. На следующемэтапе происходит отделение головки S1 оттонкой нити вследствие связывания АТР(рис. 34.17, Г). Далее отсоединенная от акти-на головка S1 вновь становится около тон-кой нити перпендикулярно ей. Завершаю-щий этап цикла - гидролиз АТР головкойS1, не связанной с актином.

В молекуле миозина имеется два типашарнирных соединений, благодаря ко-торым головка S1 обратимо присоединяет-ся к актину или отсоединяется от него, а так-же, находясь в связанном с актиномсостоянии, меняет свое направление. Шар-нир одного типа локализован между каждойиз головок S1 и стержнем S2, а шарнир вто-рого типа - между S2 и ЛММ-единицеймиозина (рис. 34.18). Шарниры предста-вляют собой гибкие участки полипептиднойцепи, легко расщепляемые гидролитически-ми ферментами. Собственно сам факт фер-ментативного расшепления миозина нафрагменты ЛММ, S1 и S2 указывает на то,что миозин образован из доменов, соеди-ненных между собой шарнирными участка-ми. Функция домена S2 состоит в передаченапряжения от связанной с тонкой нитьюголовки S1 на домен ЛММ, составляющийчасть толстой нити. Благодаря шарнирномуучастку между S1 и S2 головка S1 может по-разному взаимодействовать с актином в за-висимости от того, имеются ли на ней про-чно связанные ADP и Рi или нет. Другойшарнирный участок, соединяющий S2и ЛММ, допускает довольно большие изме-нения в положении S1 относительно тол-стой нити и тем самым обеспечивает точ-ность взаимодействия S1 с актином. В итогенапряжение может генерироваться на боль-шом протяжении латеральных поверхно-стей толстых и тонких нитей. В целом сег-

ментарная подвижность (гибкость) шар-нирного типа играет критическую рольв мышечном сокращении, так же как и в ме-ханизме действия антител (разд. 33.7).

34.10. Тропонин и тропомиозин опосредуютрегуляторное действие ионов кальцияна мышечное сокращениеФизиологическим регулятором мышечногосокращения служит Са2+. Сетсуро Эбаши(Setsuro Ebashi) открыл, что влияние Са2+

на взаимодействие актина и миозина опос-редовано тропомиозином и тропониновымкомплексом, которые локализованы в тон-ких нитях и составляют около трети ихмассы. Тропомиозин представляет собойдвухцепочечный α-спирализованный тяж.Этот очень сильно вытянутый белок массой70 кДа располагается почти параллельнодлинной оси тонкой нити (рис. 34.19). Тро-понин - комплекс трех полипептидных це-пей: ТнС (18 кДа), ТнI (24 кДа) и ТнТ (37кДа). ТнС связывает ионы кальция, ТнIсвязывается с актином, а ТнТ - с тропомио-зином. Тропониновые комплексы располо-жены на тонких нитях на расстоянии 385 Адруг от друга, причем этот интервал задает-ся длиной тропомиозина. Тропониновыйкомплекс, связанный с одной молекулойтропомиозина, регулирует активность при-мерно 7 мономеров актина.

В отсутствие Са2+ тропонин и тропомио-зин ингибируют взаимодействие актинаи миозина. При этом тропомиозин стериче-ски блокирует участки связывания S1 на ак-тине. Нервный импульс, как будет показанониже, запускает высвобождение Са2+ изсаркоплазматического ретикулума.Высвобожденный Са2+ связывается с ТнС-компонентом тропонина, что вызывает кон-формационные сдвиги, передающиеся натропомиозин и затем на актин. В частности,тропомиозин передвигается к центру длин-ной впадины, идущей спирально вдоль тон-кой нити. Это разрешает взаимодействиеS1-головок миозина с актиновыми единица-ми тонких нитей. Возникает сила сокраще-ния и одновременно гидролизуется АТР; да-лее происходит удаление Са2+ , и тропомио-зин вновь блокирует доступ актинак S1-головкам миозина. Таким образом,Са2+ регулирует мышечное сокращение поаллостерическому механизму со следующейпоследовательностью передачи информации:

Са2 + —> Тропонин —> Тропомиозин —>—> Актин —> Миозин.

Рис. 34.17. Предполагаемый механизм ге-нерирования силы при взаимо-действии S1-головок нитеймиозина с нитями актина. По-ворот головки S1, связаннойс актином, вызывает движениетолстых нитей относительнотонких (на схеме - переход отБ к В).

Рис. 34.18. Два типа шарнирных соедине-ний в миозине - один между S1и S2, второй между S2и ЛММ - позволяют изменятьположение головки S1 по отно-шению к актину во время «ра-бочего хода».


34.11. Поток ионов Са2+ регулируетсясаркоплазматическим ретикулумомНервный импульс, достигший концевойпластинки, т.е. области нервно-мышечногоконтакта, вызывает деполяризацию наруж-ной мембраны мышечного волокна. По Т-трубочкам (Т от англ. transverseorientation - поперечная ориентация) депо-ляризация наружной мембраны распростра-няется внутрь мышечного волокна. Т-тру-бочки тесно соприкасаются с сетью тончай-ших каналов, называемой саркоплазматиче-ским ретикулумом и служащей хранилищемСа2 + (рис. 34.20).

В состоянии покоя система активноготранспорта Са2+ накапливает его в сарко-плазматическом ретикулуме (разд. 36.9).Кальциевый насос, приводимый в действиеАТР, снижает концентрацию Са2+ в цито-плазме покоящихся мышц до уровня ниже10-6 М, а в саркоплазматическом ретикулу-ме повышает ее более чем до 10-3 М. Вто-рой белок, названный кальсеквестрином,связывает Са2+ внутри ретикулума. Каль-секвестрин, характеризующийся высокойкислотностью и массой 44 кДа, содержитболее 40 участков связывания Са2+. Деполя-ризация мембран Т-трубочек вызывает вы-брос Са2+ из цистерн саркоплазматическогоретикулума. Высвобожденный Са2+ связы-вается с ТнС-компонентом тропониновогокомплекса и стимулирует мышечное сокра-щение, как это было описано выше.

34.12. Фосфокреатин - форма запасания ~PТо количество АТР, которое имеется в мы-шце, может поддержать сократительную ак-тивность всего лишь на протяжении долисекунды. Однако в мышцах позвоночныхбогатые энергией фосфатные связи запа-саются в виде фосфокреатина (креатинфос-фата). Это соединение характеризуется бо-лее высоким потенциалом переноса высо-коэнергетических фосфатных групп, чемАТР (разд. 11.6). Креатинкиназа катализи-рует перенос фосфорильной группы от фос-фокреатина на ADP с образованием АТР:

Фосфокрсатин + ADP АТР +

+ Креатин.

Некоторые беспозвоночные для накопле-ния высокоэнергетических фосфорильныхгрупп используют фосфоаргинин. Фосфо-


Рис. 34.19. Предполагаемая структуратонкой нити в состоянии покоя.Двойная спираль тропомио-зина (показано красным цве-том) блокирует участки актина(синий цвет), в которых при со-кращении происходит связыва-ние S1-головок миозина. При-соединение Са2+ к ТнС-компо-ненту тропонинового комплек-са (показано желтым цветом)вызывает смещение спиралитропомиозина, при этом от-крываются участки связыванияголовок S1 на актине, и витоге происходит сокращение.(Cohen С., Protein switch ofmuscle contraction, ScientificAmerican, Inc., 1975.)

Рис. 34.20. Схематическое изображениесаркоплазматического ретику-лума. [Peachey L. D., J. CellBiol., 25, 222 (1965).]

креатин и фосфоаргинин называют фосфа-генами.

В работающей мышце запас фосфо-креатина быстро истощается, а следо-вательно, снижается и содержание АТР. Приэтом возрастает концентрация ADP и Pi,а также - под действием аденилаткиназы(миокиназы) - содержание AMP:

2ADP АТР + AMP.

Понижение энергетического заряда при-водит к стимуляции гликолиза, цикла три-карбоновых кислот и окислительного фос-форилирования (разд. 14.13) в работающеймышце. Относительный вклад каждого из

этих процессов в генерирование АТР зави-сит от типа мышц. Так, в красных мышцах,цвет которых обусловлен высоким содержа-нием миоглобина и цитохромов дыхатель-ной цепи, уровень аэробного обмена намно-го выше, чем в белых мышцах.

34.13. Актин и миозин служатсократительными элементами почти во всехэукариотических клеткахДавно уже установлено, что многие немы-шечные клетки способны передвигатьсяи менять свою форму. Миграция клетокв процессе развития эмбриона, передвиже-ние макрофагов к поврежденным тканям,ретракция сгустка тромбоцитами, биениемикроворсинок кишечного эпителия - всеэто примеры, иллюстрирующие универсаль-ность клеточной подвижности. Некоторыеаспекты подвижности клеток можно иссле-довать на культурах ткани. Так, культиви-руемые клетки различных типов имеют пло-ские складчатые выросты, так называемыеламеллиподии, форма которых медленно ме-няется. Они напоминают легкие складкиплатья на ветерке, и потому их называюттакже складчатыми краями или активнымикраями (рис. 34.21). Складчатые края высту-пают наружу на несколько микрометров, ис их помощью клетка может прикрепляться


Рис. 34.21. Слизистый плесневой грибDictyostelium discoideum в скани-рующем электронном микро-скопе. Этот организм можетсуществовать либо в виде сво-бодных клеток, либо как частьорганизованной колонии. Наповерхности Dictyostelium хо-рошо видны активные краяи филоподии, богатые акти-ном. (Печатается с любезногоразрешения д-ра JamesSpudich.)

к поверхности. Если прикрепившаяся клеткавтягивает складки на одном конце и вытяги-вает на другом, то при этом она постепенноперемещается.

Каковы молекулярные основы движенияклеток? Первые сведения по этому вопросубыли получены Ариелем Лёви (Ariel Loewy)при изучении слизистого плесневого грибаPhysarum polycephalum. Этот слизевик обра-зует плазмодий и содержит перетекающиемассы цитоплазмы. Полученные при высо-кой ионной силе экстракты гриба былисходны по свойствам с актомиозином попе-речнополосатых мышц. Так, добавлениеАТР вызывало быстрое падение вязкости,которая затем вновь медленно возрасталапо мере гидролиза АТР. Спустя нескольколет Садаси Гатано и Фумио Осава (SadashiHatano, Fumio Osawa) обнаружили в грибевысокое содержание актина, очень сходногос мышечным. Он образовывал тонкие нитии взаимодействовал с миозином. Самое ин-


тересное, что актин плесневого гриба взаи-модействовал с S1-головками миозина ске-летных мышц позвоночных, причем возни-кали декорированные нити, подобные тем,которые образуются из актина и миозинапозвоночных. Оказалось, что плесневой ак-тин отличается от актина мышц кроликатолько по 17 из 375 аминокислотных остат-ков. Следовательно, актин - это высококон-сервативный, древний белок эукариот. Ана-логично актину из рассматриваемого плес-невого гриба, а также из многих другихэукариотических клеток был выделен и мио-зин. Однако свойства миозинов из разныхисточников варьировали в большей степени,чем свойства актинов, выделенных из техже источников. Например, миозины из мно-гих немышечных клеток не способны к бы-строму формированию таких толстых ни-тей, какие образуются из миозина ске-летных мышц. Немышечные миозины обра-зуют короткие биполярные нити.

34.14. Распределение микрофиламентовв клетке выявляется методомиммунофлуоресцентной микроскопииКак правило, клетки эукариот богаты акти-ном, содержание которого составляет обыч-но 10% общего количества белка. По суще-ству, актин - количественно превалирующийбелок во многих типах клеток. Содержаниемиозина в немышечных клетках обычно в 10раз ниже, чем актина. Следовательно, коли-чественное отношение актина к миозинув немышечных клетках выше, чем в мыш-цах.

Часть актина в немышечных клетках по-лимеризуется с образованием микрофила-ментов (рис. 34.22), напоминающих тонкиенити мышечного волокна. Микрофила-

Рис. 34.22. Электронная микрофотогра-фия, демонстрирующая боль-шое количество микрофила-ментов в цитоскелете фибро-бластов эмбриона цыпленка.(Печатается с любезного разре-шения д-ра Susan Brown.)

менты диаметром 70А выявляются на элек-тронных микрофотографиях почти всехклеток эукариот. Декорирование микрофи-ламентов головками S1 приводит к возник-новению характерной структуры регулярнорасположенных стрелок; из этого следует,что микрофиламенты состоят из актинаи могут взаимодействовать с миозином(рис. 34.23).

Распределение микрофиламентов в клет-ке выявляется с помощью иммунофлуорес-центной микроскопии. Метод состоит в том,что получают специфические к актину анти-тела, ковалентно связывают их с флуорес-

центной меткой, например с флуоресцеи-ном, и добавляют к культивируемым клет-кам. В результате проявляется сеть микро-филаментов, видимая под флуоресцентныммикроскопом (рис. 34.24). Некоторые пучкифлуоресцирующих нитей тянутся через всюклетку. В покоящейся клетке, прикреплен-ной к твердому субстрату, многие акти-новые нити идут параллельно длинной осиклетки. В складчатых краях, напротив, флуо-ресценция имеет диффузный характер, чтосвязано с наличием мономеров актина или

Рис. 34.23. Электронная микрофотогра-фия F-актина из Dictyostelium,декорированного S1-головка-ми миозина также изDictyostelium. Видно, что обра-зуются такие же «наконечникистрел», как и в случае декориро-вания F-актина скелетныхмышц S1-головками мышечно-го миозина. (Печатается с лю-безного разрешения д-ра JamesSpudich.)


Рис. 34.24. Иммунофлуоресцентная ми-крофотография прикреплен-ной к поверхности покоящейсякультивируемой клетки. Клет-ка окрашена флуоресцирую-щими антителами против акти-на. Видны длинные пучки ми-крофиламентов. (С любезногоразрешения Elias Lazarides.)

коротких нитей актина (рис. 34.25). Мето-дом иммунофлуоресцентной микроскопиибыло также исследовано внутриклеточноераспределение других сократительных бел-ков. В микрофиламентах был обнаружентропомиозин (рис. 34.26), тогда как тропо-нина в них, по-видимому, нет. Ионы кальцияиграют важную роль в регуляции не толькомышечной, но и немышечной подвижности,хотя в целом эти два процесса регулируютсяпо-разному. Относительно внутриклеточно-го распределения миозина известно оченьмало. В немышечных клетках обнаружентакже α-актинин, который в мышцах связы-вает актин с Z-пластинками миофибрилл.Этот белок присутствует в наибольшем ко-личестве в складчатых краях и других участ-ках клетки, где происходит быстрое форми-рование и распад нитей актина. Возможно,что α-актинин создает мостики между нитя-ми актина в цитоскелете и другими образо-ваниями, связанными с подвижностью.


34.15. Прикрепленные к мембраненити актина опосредуют сокращениемикроворсинок кишечникаМикроворсинки эпителиальных клеток ки-шечника (рис. 34.27) - это одна из наиболееизученных немышечных сократительных си-стем. Микроворсинки представляют собойвыпячивания цитоплазмы на апикальной

Рис. 34.25. Более диффузное распределе-ние нитей актина в движущейсяклетке, особенно в ее активныхкраях. (Печатается с любезногоразрешения д-ра Elias Laza-rides.)

Рис. 34.26. В клетках, окрашенных флуо-ресцирующими антителамипротив актина, видны похожиена геодезические вышки купо-лообразные структуры. (Печа-тается с любезного разрешенияд-ра Elias Lazarides.)

поверхности эпителиальных клеток кишеч-ника, и в своей массе они образуют так на-зываемую щеточную каемку, видимуюв световом микроскопе. Каждая из микро-ворсинок содержит пучок актиновых нитей,которые на выступающем конце прикре-пляются к плазматической мембране. Кро-ме того, во многих точках вдоль микровор-синки актиновые нити связаны с плазмати-ческой мембраной тонкими нитевиднымисоединениями. Остов актиновых филамен-тов проникает под поверхность клетки, до-стигая так называемой терминальной сети.Плазматическую мембрану изолированныхщеточных каемок можно удалить, обрабо-тав их детергентом; остальная часть струк-туры при этом сохраняется интактной. Былобнаружен поразительный факт: лишеннаямембраны щеточная каемка сокращаетсяпри добавлении АТР и Са2+ и актиновыенити быстро погружаются в терминальнуюсеть.

Какова структурная основа этой подвиж-

ности? Путем декорирования актиновых ни-тей микроворсинок S1-головками миозинабыло выявлено, что все нити имеют одина-ковую полярность (рис. 34.28). Образовав-шиеся стрелки оказались направленнымик основанию микроворсинок (подобно томукак на декорированных тонких нитях мы-шечных волокон стрелки направлены в сто-рону Z-пластинок). Другими словами, по-лярность актиновых нитей такова, чтомикроворсинки при сокращении втягивают-ся в клетку. Было также обнаружено, чтов терминальной сети имеются толстые нити,содержащие миозин. По всей вероятности,биполярные миозиновые нити терминаль-ной сети взаимодействуют с нитями актинаприлежащих ворсинок (рис. 34.28). Соглас-но этой гипотезе, нити актина скользят от-

Рис. 34.27. Электронная микрофотогра-фия щеточной каемки кишеч-ного эпителия. Микроворсинкисодержат нити актина.[Mooseker M. S., Tilney L. G.,J. Cell Biol., 67, 725 (1975).]

34. Мышечне сокращениеи подвижность клеток 275

носительно нитей миозина, так что в целомдвижение направлено к центру клетки.В итоге микроворсинки укорачиваются, чтоспособствует всасыванию питательных ве-ществ клеткой.

34.16. Цитохалазин и фаллоидин тормозятподвижность, сопряженную с процессамисборки и дезагрегации нитей актинаЦитохалазин В (алкалоид из грибов) при до-бавлении к эукариотическим клеткам изме-няет их форму и подавляет многие формыподвижности. Так, этот алкалоид ингиби-рует образование складчатых краев у фи-бробластов, отрастание аксонов от ган-глиев, ретракцию кровяного сгустка тром-боцитами, деление оплодотворенной яйце-клетки морского ежа. Судя по данным

электронной микроскопии, цитохалазиноказывает влияние на микрофиламенты, таккак они исчезают в клетках, обработанныхэтим алкалоидом. Оказалось, что цитохала-зин препятствует сборке актиновых нитей,специфически взаимодействуя с одним изконцов нити. Этот ингибиторный эффектцитохалазина свидетельствует о динамич-ности структуры микрофиламентов.

Значение постоянно идущих процессовсборки и дезагрегации микрофиламентовдля клеточного движения было выявленотакже при изучении механизма действияфаллоидина. Этот токсический агент присут-ствует в ядовитом грибе Amanita phalloides,содержащем также α-аманитин - ингибитор


РНК-полимеразы (разд. 29.18). Подобно ци-тохалазину, фаллоидин блокирует те формыподвижности, в которых участвуют микро-филаменты. Фаллоидин присоединяетсяк единицам актина в микрофиламентахи тем самым препятствует его деполяриза-ции. Таким образом, фаллоидин как бы за-пирает микрофиламенты.

34.17. Микротрубочки участвуютв различных видах клеточной подвижностии частично формируют цитоскелетДо сих пор мы рассматривали роль микро-филаментов в различных видах клеточнойподвижности. Обратимся теперь к другомуклассу волокнистых элементов, а именнок микротрубочкам, которые имеются прак-тически во всех эукариотических клеткахи участвуют как в поддержании архитек-туры клетки, так и в сократительной актив-ности (рис. 34.29). Микротрубочкипредставляют собой полые цилиндрическиеструктуры, образованные из двух сходных(массой по 55 кДа) типов субъединиц - α-и β-тубулина. Наружный диаметр микро-трубочек составляет около 240 А, и этим оничетко отличаются от микрофиламентов(диаметром 70 А) и от промежуточных фи-ламентов (структур диаметром 100 А, вы-полняющих роль связывающих элементов).Жесткая стенка микротрубочек образованаиз спирально уложенных, чередующихся

Рис. 34.28. Предполагаемое расположе-ние миозина и актина в ми-кроворсинках щеточной каем-ки кишок. [Mooseker M. S., Til-ney L.G., J. CellBiol., 67, 725(1975).]

Рис. 34.29. Иммунофлуоресцентная ми-крофотография, демонстри-рующая распределение микро-трубочек в фибробласте. (Печа-тается с любезного разрешенияд-ра Klaus Weber.)

α- и β-тубулиновых субъединиц (рис. 34.30).Повторяющейся единицей структурыявляется αβ-димер, и в целом структураобразована из 13 протофиламентов, идущихпараллельно длинной оси микротрубочки.

Сборка и дезагрегация микротрубочекпроисходят с противоположных концов. Ал-калоид из осенних крокусов колхицин бло-кирует сборку и тем самым тормозит кле-точные процессы, протекающие с участиеммикротрубочек. Например, колхицин оста-навливает клеточное деление на стадии ме-тафазы, так как микротрубочки имеют су-

щественное значение для расхождения хро-мосом. Колхицин ингибирует также направ-ленное движение разного рода частицв клетках, что лежит в основе торможенияпроцессов их секреции. На протяжении не-скольких веков колхицин используют длялечения острых приступов подагры.

34.18. Биение ресничек и движение жгутиковобусловлено скольжением микротрубочек,индуцированным динеиномМикротрубочки являются основными ком-понентами ресничек и жгутиков у эукариот.Эти органеллы имеются во многих клетках.Подвижные реснички, подобно веслам, вы-зывают ток жидкости параллельно поверх-ности клетки. Так, координированное дви-жение ресничек, выстилающих дыхательныепути, способствует удалению чужеродныхчастиц. Жгутики необходимы для продви-жения свободных клеток, таких, как спермииили простейшие. Как показали электронно-микроскопические исследования, структураресничек и жгутиков практически у всех эу-кариот в основе своей одинакова. Это пучокволокон, называемый аксонемой, которыйокружен мембраной, составляющей продол-жение плазматической мембраны. Волокнав аксонеме - это микротрубочки. По перифе-


Рис. 34.30. Спиральное расположение ту-булиновых субъединиц в ми-кротрубочке. А - схематиче-ское изображение поперечногосреза; видно, что микротрубоч-ка образована 13 протофила-ментами. Б - поверхностная ре-шетка из α- и β-субъединиц.[Snyder J. A., McIntosh J. R.,Ann. Rev. Biochem., 45, 706(1976).]

Рис. 34.31. Электронная микрофотогра-фия поперечного среза аксо-немы жгутика. Девять на-ружных двойных микротрубо-чек окружают две одинарные.(Печатается с любезного разре-шения д-ра Joel Rosenbaum.)


рии расположены девять двойных микро-трубочек, в центре - две одинарные микро-трубочки (рис. 34.31). Такой часто встре-чающийся структурный мотив известен какрасположение 9 + 2. Диаметр двух цен-тральных микротрубочек равен 240 А. Каж-дая из девяти периферических пар на попе-речном срезе имеет вид цифры 8 и размер370 х 250 А (рис. 34.32). Одна из микротру-бочек в паре - субфибрилла А - меньше поразмеру и присоединяется к центральнойкапсуле реснички с помощью радиальногомостика. От каждой субфибриллы А отхо-дят две ручки. В отдельной ресничке все руч-ки направлены в одну сторону. Обработкаресничек детергентом и далее раствором со-лей высокой концентрации приводит к уда-лению наружной мембраны и солюбилиза-ции АТРазы, называемой динеином.В результате этой обработки располо-женные на периферии волокна сохраняютсвою цилиндрическую попарную организа-цию, но утрачивают ручки. При добавлениидинеина в соответствующей ионной средеручки восстанавливаются. Следовательно,состоящие из динеина ручки субфибриллыА обладают АТРазной активностью.

Каким образом расщепление АТР динеи-ном вызывает движение ресничек и жгути-ков? Как показали Питер Сатир и Ян Гиб-бонс (Peter Satir, Jan Gibbons), перифериче-ские двойные микротрубочки аксонемыскользят относительно друг друга и темсамым вызывают изгиб реснички. Самоскольжение обусловлено образованием ди-неиновых поперечных мостиков. По-видимо-му, динеиновые ручки одной пары микро-трубочек по мере гидролиза АТР продви-гаются вдоль прилегающей пары совершен-но аналогично тому, как в скелетной мышцемиозиновые поперечные мостики движутсявдоль актиновой нити. В интактной реснич-ке радиальные мостики противодействуютскольжению, и благодаря им происходит несокращение реснички, а локальный изгиб.

При обследовании группы больных хро-ническими легочными заболеваниями былиобнаружены аксонемы, лишенные динеина.В этом случае, как показал Бьёрн Афзелиус(Bjorn Afzelius), реснички эпителия дыха-тельных путей оказались неподвижными.Более того, мужчины с этим генетическимдефектом были стерильны вследствие непо-движности их сперматозоидов. В другом,недавно обнаруженном случае неподвиж-ность ресничек и жгутиков оказалась обус-ловленной дефектом радиальных мостиков.

Рис. 34.32. Схематическое изображениеструктуры аксонемы.

Эти клинические наблюдения подтвер-ждают существующие представления о ме-ханизме движения рассматриваемых орга-нелл.

ЗаключениеПоперечнополосатая мышца позвоночныхсостоит из белковых нитей двух типов, ко-торые взаимодействуют друг с другом.Толстые нити содержат миозин, а тон-кие - актин, тропомиозин и тропонин. Ги-дролиз АТР актомиозином вызывает сколь-жение указанных нитей относительно другдруга. Миозин представляет собой оченьбольшой по массе белок (500 кДа), состоя-щий из двух основных цепей и четырех лег-ких цепей. Конформация основных цепейтакова, что они содержат две глобулярныеобласти (головки S1) и присоединенныйк ним длинный α-спирализованный стер-жень. Головки S1 и часть стержня образуютпоперечные мостики, которые взаимодей-ствуют с актином, генерируя силу сокраще-ния. Остальная часть молекулы миозинасоздает скелет толстой нити. Актин - основ-ной компонент тонких нитей - представляетсобой глобулярный белок (42 кДа), которыйполимеризуется с образованием нитей диа-метром 70 А. Толстые и тонкие нити опреде-ленным образом направлены, причем посе-

редине между двумя Z-пластинками этонаправление меняется на противоположное.Циклическое образование и диссоциациякомплексов между миозиновыми попе-речными мостиками, выступающими изтолстых нитей, и единицами актина тонкихнитей происходят за счет энергии АТР;

Рис. 34.33. Динеиновые ручки располо-жены вдоль микротрубочекс правильной периодичностью.Электронные микрофотогра-фии интактной аксонемы (А)и микротрубочки, реконструи-рованной из тубулина и дине-ина (Б). [Haimo L. Т.,Telzer В. R., Rosenbaum J. L.,Ргос Nat. Acad. Sci., 76, 5760(1979).]


Рис. 34.34. Внутренняя поверхность плаз-матической мембраны фибро-бласта под электронным ми-кроскопом. Ясно видны нитиактина (декорированные S1-го-ловками миозина) и окай-мленные ямки на мембране.(Печатается с любезного разре-шения д-ра John Heuser.)

образование комплексов ведет к уменьше-нию расстояния между Z-пластинками. «Ра-бочим ходом» является поворот S1-головкимиозина, находящейся в комплексе с акти-ном. В генерировании силы сокращенияважную роль играют шарнирные соедине-ния между доменами миозина. Мышечноесокращение регулируется Са2+ , причем эф-фект Са2+ опосредован тропонином и тро-помиозином. При низкой концентрацииСа2+ эти белки ингибируют взаимодействиеактина и миозина. Нервный импульс запу-скает высвобождение Са2+ из саркоплазма-тического ретикулума. Далее ионы кальциясвязываются с тропонином, что инициируетсерию конформационных сдвигов, разре-шающих в итоге взаимодействие актинаи миозина.

Актин и миозин - эволюционно древние


белки, о чем свидетельствует тот факт, чтоони содержатся уже в слизистых грибах.В сущности, эти белки участвуют в сократи-тельной активности практически всех эука-риотических клеток. Особенно распростра-нен актин, образующий микрофиламентыдиаметром около 70 А. Микрофиламентыучаствуют в разных видах клеточной под-вижности, например в миграции клетокв ходе развития, ретракции кровяного сгуст-ка тромбоцитами, передвижении макрофа-гов к поврежденным тканям. Сокращениеворсинок щеточной каемки кишечного эпи-телия опосредовано взаимодействием нитейактина с биполярными нитями миозина; по-следние в эпителиальных клетках кишечни-ка меньше по размеру и содержатся в мень-шем относительном количестве по сравне-нию с мышцами. Цитохалазин и фаллоидинтормозят те виды клеточной подвижности,которые связаны с агрегацией и диссоциа-цией нитей актина. Цитохалазин ингибируетсборку, а фаллоидин - распад микрофила-ментов.

В клетках эукариот имеются микротру-бочки, которые поддерживают архитектуруклетки, а также участвуют в сократительнойактивности. Микротрубочки представляютсобой полые фибриллы диаметром 240 А;они построены из тубулина. Реснички и жгу-тики клеток эукариот содержат девятьдвойных микротрубочек, окружающих две

одинарные. Между внешними парами ми-кротрубочек имеются поперечные мостикииз динеина - белка, обладающего АТРазнойактивностью. Индуцированное динеиномскольжение прилегающих пар микротрубо-чек относительно друг друга вызывает из-

гиб реснички или жгутика; этот механизмлежит в основе биения ресничек и движенияжгутиков. Ингибитором подвижности,опосредованной микротрубочками, служитколхицин, который блокирует их полимери-зацию.


С чего начатьHuxley H.Е., 1965. The mechanism ofmuscular comtraction, Sci. Amer.,213(6), 18-27.Cohen C., 1975. The protein switch ofmuscle contraction, Sci. Amer., 233(5),36-45.Murray J.M., Weber A., 1974. Thecooperative action of muscle proteins,Sci. Amer., 230(2), 59-69.Lazarides E., Revel J.P., 1979. Themolecular basis of cell movement, Sci.Amer., 240(5), 100-113.Satir P., 1974. How cilia move, Sci.Amer., 231(4), 44-52.Dustin P., 1980. Microtubules, Sci.Amer., 243(2), 66-76.

КнигиCold Spring Harbor Laboratory, 1972.The Mechanism of Muscle Con-traction, Cold Spring HarborSymposia on Quantitative Biology,vol. 37. (Выдающийся сборник ста-тей, посвященных структуре мы-шечных белков, механизму возник-новения силы сокращения, системамрегуляции, саркоплазматическомуретикулуму, миогенезу, а также со-кратительным белкам немышечныхтканей.)Goldman R., Pollard Т., Rosenbaum J.(eds.), 1976. Cell Motility, Cold SpringHarbor Laboratory. (Содержит многопрекрасных статей, посвященныхмикрофиламентам и микротрубоч-кам и их роли в клеточной подвиж-ности.)Inoue S., Stephens R.E. (eds.), 1975.Molecules and Cell Movement, RavenPress.Hatano S., Ishikawa H., Sato H. (eds.),1979. Cell Motility: Molekulas andOrganization, University Park Press.Sugi H., Pollack G.H. (eds.), 1979.Cross-bridge Mechanism in MuscleContraction, University Park Press.

Мышечное сокращениеHuxley H.E., 1971. The structuralbasis of muscle contraction, Proc. Roy.Soc. London (B), 178, 131-149.Haxley A.F., 1975. The origin of forcein skeletal muscle, Ciba Found. Symp.,31, 271-290.Harrington W.F., 1979. Contractileproteins of muscle. In: Neurath H. andHill R. L. (eds.), The Proteins (3rd ed.),vol. 4, pp. 245-409, Academic Press.Adelstein R.S., Eisenberg E., 1980. Re-gulation and kinetics of theactin-myosin-ATP interaction, Ann.Rev. Biochem., 49, 921-956.Hill T.L, 1977. Free EnergyTransduction in Biology, AcademicPress. (В гл. 5 дано ясное описаниетермодинамики мышечного сокра-щения.)Huxley H.E., Farugi A.R., Bordas J.,Koch M.H.J., Milch J.R., 1980. Theuse of synchrotron radiation intime-resolved x-ray diffraction studiesof myosin layer-line reflections duringmuscle contraction, Nature, 284,140-143.Adelstein R.S. (ed.), 1980. Symposiumon phosphorylation of musclecontractile proteins, Fed. Proc., 39,1544-1573. McCubbin W.D., Kay C.M., 1980. Calciuminducedconformational changes in thetroponin-tropomyosin complexes ofskeletal and cardiac muscle and theirroles in the regulation ofcontraction-relaxation, Ace. Chem.Res., 13, 185-192.

Роль актина и миозина в клеточнойподвижностиКоrn E.D., 1978. Biochemistry ofactomyosin-dependent cell motility (areview), Proc. Nat. Acad. Sci., 75,588-599.Clarke M., Spudich J.A., 1977. Non-muscle contractile proteins: the role ofaction and myosin in cell motility andshape determination, Ann. Rev.Biochem., 46, 797-822.

Tilney L.G., 1979. Actin, motility, andmembranes. In: Cone R.A. andDowling J.E. (eds.), MembraneTransduction Mechanisms,pp. 163-186, Raven Press.Lin S., Lin D.C., Flanagan M.D., 1978.Specificity of the effects of cytochalasinВ on transport and motile processes,Proc. Nat. Acad. Sci., 75, 329-333.Brown S.S., Spudich J.A., 1979. Cyto-chalasin inhibits the rate of elongationof actin filament fragments, J. CellBiol., 83, 657-662.

МикротрубочкиKirschner M.W., 1978. Microtubules:assembly and nucleation, Int. Rev.Cytol., 54, 1-71.Margolis R.L, Wilson L., 1978.Opposite end assembly anddisassembly of microtubules atsteadystate in vitro, Cell, 13,1-8.Amos L.A., Baker T.S., 1979. Thethree-dimensional structure of tubulinprotofilaments, Nature, 279, 607-612.Summers K.E., Gibbons I.R., 1971.ATP-induced sliding of tubules intrypsin-treated flagella of seaurchinsperm, Proc. Nat. Sci., 68, 3092-3096.(Описаны остроумные опыты, пока-завшие, что волнообразное движе-ние обычного жгутика возникает какрезультат индуцированного АТРвзаимодействия между прилегающи-ми парными трубочками.)Haimo L.Т., Telzer В.R., RosenbaumJ.L., 1979. Dynein binds to andcrossbridges cytoplasmic microtubules,Proc. Nat. Acad. Sci., 76, 5759-5763.Sturgess J.M., Chao J., Wong J.,Aspin N., Turner J.A.P., 1979. Ciliawith defective radial spokes: a cause ofhuman respiratory disease, New Engl.J. Med., 300, 53-56.

Промежуточные нитиLazarides E., 1980, Intermediate fi-laments as mechanical integrators ofcellular space, Nature, 283, 249-256.

ГЛАВА 35Действие гормонов

Гормоны - это химические посредники,координирующие активность различныхклеток многоклеточного организма. Тер-мин «гормон» был впервые использованв 1904 г. Уильямом Бэйлиссом и ЭрнстомСтарлингом (William Bayliss, ErnestStarling) при описании действия секре-тина - вещества, секретируемого двенадца-типерстной кишкой и стимулирующего вы-деление сока поджелудочной железы. Изэтой работы вытекала очень плодотворнаяконцепция, а именно, что 1) гормоны - этомолекулы, синтезируемые специфическимитканями (железами); 2) гормоны секрети-руются непосредственно в кровь, котораяи доставляет их к месту действия; 3) гор-моны специфическим образом меняют ак-тивность определенных чувствительных тка-ней (органов-мишеней или клеток-мишеней).По своей химической природе гормоныочень разнообразны. Некоторые, напримерадреналин и тироксин, представляют собойнебольшие молекулы, производные амино-кислот. Другие, в частности окситоцин, ин-сулин и тиреотропин (тиреотропный гор-мон),- полипептиды или белки. Третья груп-па гормонов - стероиды, производные холе-стерола. В настоящее время выяснен моле-кулярный механизм действия ряда гормо-нов. Установлено, что гормоны оказываютспецифическое действие тремя путями:1) воздействуя на скорость синтеза фер-ментов и других белков; 2) изменяя ско-рость ферментативного катализа; 3) изме-няя проницаемость клеточных мембран.Любопытно отметить, что ни один гормонне является ферментом или коферментом.Напротив, действие гормонов сводитсяк регуляции уже существующих процессов.


35.1. Открытие циклического АМР -посредника в действии многих гормоновВажнейшее достижение в изучении меха-низма действия гормонов связано с име-нем Эрла Сазерленда (Earl Sutherland).Первоначальная цель его работ, начатыхв 50-х годах, состояла в том, чтобы выяс-нить механизм действия адреналинаи глюкагона на распад гликогена и образо-вание глюкозы в печени. Сазерленд избралэту систему, во-первых, потому, что ука-занные гормоны оказывают очень значи-тельное и воспроизводимое действие нараспад гликогена. Во-вторых, этот эффектразвивается в течение нескольких минут. В-третьих, срезы печени нетрудно получитьв большом количестве. В-четвертых, био-химия распада гликогена уже была доста-точно хорошо изучена (гл. 16). ФактическиСазерленд начал свои исследования меха-низма действия адреналина и глюкагонав лаборатории Карла и Герти Кори (CarlCori, Gerty Cori).

На начальном этапе работы он стремил-ся выявить ту ферментативную реакциюв процессе превращения гликогена в глю-козу, которую усиливали эти гормоны.Для этого срезы печени инкубировалив присутствии 3 2P i и определяли, в какиепромежуточные соединения включаласьметка. Оказалось, что ферментом, лимити-рующим скорость процесса расщеплениягликогена, была фосфорилаза, а не фосфо-глюкомутаза или глюкозо-6-фосфатаза.Более того, адреналин и глюкагон увели-чивали активность фосфорилазы. Однакомеханизм активации был неясен. ДалееСазерленд обнаружил фермент, катализи-ровавший инактивацию активной фосфори-лазы. Этот инактивирующий фермент ока-зался фосфатазой; напрашивалось предпо-ложение, что активация фосфорилазы обус-ловлена ее фосфорилированием. Действи-тельно, при инкубации срезов печени с 3 2 Р i

обнаружилось, что скорость включения

Рис. 35.1. Электронная микрофотогра-фия соматотропной клетки ги-пофиза. Гормон роста (сомато-тропин) накапливается в элек-тронноплотных гранулах, чет-ко видных на микрофотогра-фии. (С любезного разрешенияLynne Mercer.)

метки в фосфорилазу возрастала в присут-ствии адреналина и глюкагона, причем этовозрастание было прямо пропорциональнодействию гормонов на распад гликогена.Таким образом, в результате этих исследо-

ваний и было установлено, что фосфорила-за активируется при фосфорилированиии инактивируется при дефосфорилировании.Это был первый пример регуляцииактивности фермента с помощью механиз-ма ковалентной модификации.

Далее приступили к анализу активациифосфорилазы гормонами в препарате раз-рушенных клеток печени. Поразительнымобразом добавление адреналина и глюка-гона приводило, как и в опытах со срезами

35. Действие гормонов 283

Рис. 35.2. Примеры трех химически раз-личных классов гормонов:А - адреналин, производноеаминокислоты; Б - глюкагон,полипептид; В - кортизол, сте-роид.

печени, к активации фосфорилазы. Обнару-жение того факта, что гормональный эф-фект проявляется и в бесклеточном гомо-генате, явилось новой вехой в развитиибиохимии. Дело в том, что ранее не удава-лось наблюдать специфического действиягормонов в бесклеточных системах, и мно-гие биологи полагали, что гормоны спо-собны воздействовать только на интакт-ную клетку-мишень. Любопытно вспом-нить, как за полвека до этого Бухнеры(Buchner) опровергли совершенно анало-гичные воззрения, доказав, что процессброжения может идти и в бесклеточном эк-стракте дрожжей. Однако в отличие отгликолитических ферментов не все компо-ненты системы, обеспечивающей ответ наадреналин и глюкагон, оказались раство-римыми. Так, после центрифугирования го-могената клеток печени ответная реакцияна добавление гормонов исчезала. Следо-вательно, какая-то существенная часть сис-темы гормонального ответа была локали-зована во фракции мембран. Действитель-но, гормональный ответ можно быловосстановить, добавив к надосадочнойжидкости фракцию субклеточных частиц.

Роль субклеточных частиц была выявле-на следующим образом. При инкубацииэтой фракции с адреналином и глюкаго-ном образовывался некий термостабиль-ный фактор. Добавление этого факторак надосадочной фракции приводило к ак-


тивации фосфорилазы. Другими словами,гормональный ответ удалось разделить надва этапа: взаимодействие гормона с мем-бранной фракцией, приводящее к образова-нию термостабильного фактора, и дей-ствие этого фактора на надосадочнуюфракцию, выражающееся в активации фос-форилазы. Следующая задача состоялав том, чтобы идентифицировать термоста-бильный фактор, полученный в оченьмалом количестве. По данным химическо-го анализа это был аденинрибонуклеотид,но с необычными свойствами. Сазерлендописал его в письме Леону Хеппелю (LeonHeppel), к которому обратился в надеждена помощь в изучении структуры этого ве-щества. В это же время Хеппель получилписьмо от Дэвида Липкина (David Lipkin)с описанием нового нуклеотида, получен-ного путем обработки АТР гидрооксидомбария. Хеппель пришел к выводу, что Лип-кин и Сазерленд изучают одно и то же ве-щество, и помог им связаться друг с дру-гом. Действительно, оба ученых исследова-ли одно и то же соединение, оказавшеесяаденозин-3',5'-монофосфатом, или, как егообычно называют теперь, циклическим

AMP (cAMP). Эта случайная встреча двухученых принесла еще одну пользу: сразувозникла возможность получения большихколичеств сАМР для биохимических иссле-

Рис. 35.3. Ферментативный синтез и рас-пад сАМР.

дований. Более того, в результате лабора-торного синтеза сАМР из АТР и гидроок-сида, бария появилась возможность выдви-нуть предположение о вероятном путибиосинтеза этого соединения.

35.2. Циклический AMP синтезируетсяаденилатциклазой и расщепляетсяфосфодиэстеразойсАМР образуется из АТР под действиеммембранного фермента аденилатциклазы:

Эта реакция в небольшой степени эндерго-нична; ее ΔG°' составляет около 1,6 ккал/моль. Источником энергии для синтезасАМР служит последующий гидролиз пиро-фосфата. Специфическая фосфодиэстеразаразрушает сАМР путем гидролиза до AMP:

Это высокоэкзергоническая реакция с ΔG°'около — 1 2 ккал/моль. В отсутствие фосфо-диэстеразы сАМР - очень стабильное соеди-нение.

35.3. сАМР служит вторым посредникомпри действии многих гормоновРабота Сазерленда привела к созданию кон-цепции о роли сАМР как второго посредникав механизме действия некоторых гормонов.Первым посредником является сам гормон.Сущность этой концепции заключаетсяв следующем.

1. Плазматические мембраны клеток со-держат рецепторы гормонов.

2. Взаимодействие гормона с его специ-фическим рецептором на плазматическоймембране ведет к стимуляции аденилатци-клазы, также связанной с плазматическоймембраной.

3. В результате активации аденилатци-клазы в клетке увеличивается содержаниесАМР.

4. Действие сАМР проявляется внутриклетки и состоит в изменении скоростиодного или более процессов.

Важная особенность этой гипотезы вто-рого посредника состоит в том, что она непредполагает проникновения гормона в клет-ку. Действие самого гормона ограничивает-ся клеточной мембраной. Биологическийэффект гормона опосредован действиемсАМР внутри клетки; непосредственногодействия сам гормон не оказывает. Обосно-ванность этой концепции была проверенас использованием целого ряда эксперимен-тальных критериев, а именно:

1. Аденилатциклазу клетки должны сти-мулировать те гормоны, которые дей-ствуют на эту клетку как на мишень. Гор-моны, не вызывающие специфического био-логического ответа данной клетки, недолжны повышать в ней активности этогофермента.

2. Концентрация сАМР в клетках-мише-нях должна изменяться пропорциональнобиологическому ответу этих клеток на гор-мональную стимуляцию, т.е. она должнапроявлять временную и количественную за-висимость от концентрации гормона.

3. Ингибиторы фосфодиэстеразы, напри-мер теофиллин или кофеин, должны дей-ствовать синергично с теми гормонами, эф-


фект которых опосредован сАМР каквторым посредником.

4. Добавление сАМР или родственногоему соединения к клеткам-мишеням должноимитировать биологическое действие гор-мона. (На практике сАМР в таких опытах неиспользуется, так как он плохо проникаетв клетки; однако менее полярные про-изводные сАМР, в частности дибутирил-сАМР, проникают в клетки и оказываютсвое действие.)

Проведенные опыты показали, что цикли-ческий AMP является вторым посредникомпри действии не только адреналина и глюка-гона, но и многих других гормонов(табл. 35.1). сАМР оказывает влияние на ис-ключительно большое число клеточныхпроцессов. Так, под действием этого соеди-нения увеличивается распад накопленныхзапасов топливных веществ, повышаетсявыделение соляной кислоты слизистой же-лудка, происходит дисперсия пигментныхгранул меланина, уменьшается агрегациятромбоцитов.

Рис. 35.4. Разделение аденилатциклазыи β-адренергического рецепто-ра центрифугированием солю-билизированной (в растворедетергента) плазматическоймембраны в градиенте плотно-сти сахарозы. [Haga Т., HagaК., Gilman A.G., J. Biol. Chem.,252, 5776 (1977).]


Таблица 35.1. Гормоны, действие которых опосредованосАМР

КальцитонинХорионический гонадо-тропин

КортикотропинАдреналинФолликулостимулирую-щий гормонГлюкагонЛютеинизирующий гор-мон

Липотропин

Меланоцитстимулирую-щий гормонНорадреналииПаратгормон

Тиреотропный гормонВазопрессин

35.4. Сопряжение рецепторов гормоновс аденилатциклазой осуществляетсябелком, связывающим гуаниннуклеотидыКаким образом связывание гормона типаадреналина или глюкагона со специфиче-ским рецептором приводит к активации мо-лекулы аденилатциклазы? Участки связыва-ния этих гормонов локализованы на наруж-ной поверхности плазматической мем-браны, тогда как каталитические участкиаденилатциклазы обращены к цитозолю.В сущности, участки связывания гормонаи каталитические участки принадлежатразным белкам, которые можно разделитьпри центрифугировании плазматическоймембраны в растворе детергента (рис. 35.4).Аденилатциклаза (185 кДа) и рецептор адре-налина (75 кДа) представляют собой боль-шие интегральные белки мембраны. Рецеп-тор адреналина называют также β-адренер-гическим рецептором, поскольку он связы-вает целый ряд фармакологически активныхсоединений.

Связывание гормона со специфическимрецептором оказывает активирующее дей-ствие на аденилатциклазу не прямо, а опос-редованно - через третий белок, называе-мый G-белком1 (от англ. guanyl, посколь-ку этот белок связывает гуаниннуклеотиды).Этот регуляторный белок (42 кДа) суще-ствует в двух формах. Комплекс G-белкас GTP активирует аденилатциклазу, тогдакак комплекс G-белка с GDP такого дей-ствия не оказывает. G-белок превращаетсяиз неактивной GDP-формы в активнуюGTP-форму в результате обмена связанногоGDP на GTP. Этот GTP—GDP-обмен ка-тализируется гормон-рецепторным ком-плексом, но не свободным рецептором. Та-

1 В отечественной литературе чаще использует-ся обозначение N-белок.- Прим. перев.

ким образом, путь передачи информацииидет от рецептора гормона на G-белок и да-лее на аденилатциклазу (рис. 35.5).

Как происходит выключение аденилатци-клазы? G-белок обладает еще одним свой-ством, благодаря которому он может пере-давать информацию от рецепторов гормонана аденилатциклазу. Дело в том, что свя-занный с G-белком GTP медленно гидроли-зуется до ADP. Другими словами, G-белокявляется GТРазой. Следовательно, этот ре-гуляторный белок содержит встроенноев него устройство для инактивации аденил-атциклазы. Доля G-белка, находящегосяв комплексе с GTP, а соответственно и сте-пень активации аденилатциклазы зависят ототношения скорости обмена GDP на GTPк скорости гидролиза GTP. Скорость GTP-GDP-обмена значительно возрастает присвязывании G-белка с комплексом гор-мон—рецептор. Следовательно, при низкомсодержании гормона почти весь G-белок на-ходится в GDP-форме и соответственно по-чти вся аденилатциклаза неактивна. В неко-торых клетках активация аденилатциклазызависит также от концентрации Са2+. Дляактивации аденилатциклазы в этих клеткахнеобходим не только G-белок в GTP-форме,но и комплекс Са2+ с кальмодулином (белокмассой 17 кДа). Таким образом, в настоящеевремя начал проясняться вопрос о том, ка-кие регуляторные циклы определяют актив-ность аденилатциклазы.

35.5. Циклический AMP активируетпротеинкиназыКаким образом сАМР воздействует настоль большое число различных клеточныхпроцессов? Есть ли в этих воздействиях что-либо общее? Действительно, такая общ-ность имеется, и обнаружена она былаопять-таки при изучении регуляции обменагликогена - участка метаболизма, где «ро-дился» сАМР. Эдвин Кребс и Донал Уолш(Edwin Krebs, Donal Walsh) установили, чтосAMP активирует протеинкиназу в ске-летных мышцах. Протеинкиназа фосфори-лирует как гликоген-синтазу (переводя еев неактивное состояние), так и киназу фос-форилазы (переводя ее в активное состоя-ние). Таким путем сАМР стимулирует рас-пад гликогена и ингибирует его синтезв мышцах (разд. 16.15). Аналогичный меха-низм действует в печени. По существу, всеизвестные эффекты сАМР обусловлены ак-тивацией протеинкиназ. Все исследованные

Рис. 35.5. Путь передачи информациипри активации аденилатци-клазы, вызванной связываниемгормона со специфическим ре-цептором. G-белок играет ре-шающую роль как в активации,так и в инактивации аденилат-циклазы.

до сих пор клетки содержат протеинкиназы,которые активируются под действиемсАМР в концентрации порядка 10-8 М. Этикиназы модулируют активность различныхбелков путем их фосфорилирования.

Интересен механизм активации протеин-киназы мышц циклическим AMP. Этот фер-мент состоит из субъединиц двух типов: ре-гуляторной (R) субъединицы (49 кДа),связывающей сАМР, и каталитической (С)субъединицы (38 кДа). В отсутствие сАМРрегуляторная и каталитическая субъеди-ницы образуют комплекс R2C2, лишенныйферментативной активности. Присоедине-ние сАМР к каждой из регуляторных субъе-диниц приводит к диссоциации комплексаR2C2 на одну R2-субъединицу и две С-субъе-диницы. Свободные каталитические субъе-диницы обладают ферментативной актив-ностью. Следовательно, присоединениесAMP к регуляторной субъединице снимаетингибирование каталитической субъединицы.сАМР при этом функционирует как алло-стерический эффектор. Своей субъединич-ной структурой (наличием отдельных регу-ляторных и каталитических субъединиц)протеинкиназа напоминает аспартат-транс-карбамоилазу (разд. 22.14).


Рис. 35.6. сАМР активирует протеин-киназу, вызывая диссоциациюкомплекса регуляторных и ка-талитических субъединиц фер-мента.

35.6. Циклический AMP - эволюционнодревний сигнал голоданияКак было описано выше (разд. 28.6), сАМРоказывает регуляторное действие на клеткибактерий, у которых он стимулирует тран-скрипцию определенных генов. Очевидно,что сАМР как вещество-регулятор имеетдлинную эволюционную историю. У бакте-рий сАМР служит сигналом голодания. По-явление сАМР свидетельствует об отстут-ствии глюкозы и ведет к синтезу ферментов,необходимых для использования других ис-точников энергии. В некоторых клетках мле-копитающих, таких, как клетки печении мышц, сАМР сохраняет свою древнююфункцию сигнала голодания, но при этомдействие сАМР направлено на стимуляциюпротеинкиназы, а не на усиление транскрип-ции определенных генов. Еще одно важноеразличие состоит в том, что у высших орга-низмов сАМР стал вторым посредником,участвуя во внутриклеточных, а не внекле-точных коммуникативных связях.

Почему в ходе эволюции сАМР превра-


тился во второго посредника? Представ-ляется, что здесь сыграли роль три фактора.

1. сАМР образуется из повсеместно при-сутствующего АТР в ходе несложнойреакции, протекающей за счет энергии по-следующего гидролиза пирофосфата.

2. Будучи производным вещества, зани-мающего центральное положение в метабо-лических превращениях, сам сАМР стоитв стороне от основных путей метаболизма.сАМР используется только как интеграторобмена веществ и не является ни предше-ственником в процессах биосинтеза, ни про-межуточным продуктом в энергетическомобмене. Вследствие этого концентрациясАМР может регулироваться однозначно.Более того, сАМР стабилен, если не подвер-гается действию специфической фосфоди-эстеразы.

3. сАМР обладает достаточным количе-ством функциональных групп, которыеобеспечивают прочное и специфическоесвязывание с рецепторными белками (на-пример, с регуляторной субъединицей про-теинкиназы мышц) и развитие соответ-ствующих аллостерических эффектов.

Важно отметить, что использование сАМРкак второго посредника приводит к значи-тельному усилению гормонального сигнала.Так, многие гормоны в крови присутствуютв концентрациях порядка 10 - 1 0 М. В стиму-лированных клетках-мишенях концентра-ция сАМР намного выше, так как каждая ак-тивированная молекула аденилатциклазысинтезирует много молекул сАМР. Фосфо-рилирование множества молекул белка мо-лекулой протеинкиназы, активированнойсАМР, представляет собой еще один этапусиления гормонального сигнала. Каскад

Рис. 35.7. Пространственная модельсАМР.

ферментативных реакций, регулирующихобмен гликогена, служит примером того,как малые стимулы могут вызвать значи-тельные изменения метаболизма клетки.

35.7. Холерный токсин стимулируетаденилаткиназу, ингибируя GTP-азнуюактивность G-белкаНепосредственное участие сАМР в патоло-гических процессах было четко установленопри холере. Возбудителем этого потен-циально смертельного заболевания являет-ся Vibrio cholerae - грам-отрицательная бак-терия с одним жгутиком, с помощьюкоторого она движется. Основное клиниче-ское проявление холеры - сильнейший понос(диарея). В течение нескольких часов орга-низм может потерять несколько литровжидкости, и если потерю жидкости не воз-местить, то развивается шок и наступаетсмерть. Диарея обусловлена не прямым дей-ствием бактерии, а бактериальным токси-ном. Холерный токсин (называемый такжехолерагеном) повышает активность адени-латциклазы в слизистой тонких кишок, ко-торая в свою очередь повышает содержаниесАМР в клетках, причем до исключительновысокого уровня. Последнее стимулирует ак-тивный транспорт ионов в кишечном эпите-лии, вследствие чего резко возрастает выходNa+ и воды в полость кишечника.

Холерный токсин - белок массой 87 кДа;он состоит из A1 и А2-пептидов, соеди-ненных дисульфидным мостиком, и пяти В-пептидов. Токсин проникает в клетку путемвзаимодействия с ганглиозидом GM1 (разд.20.7) на ее поверхности. Этот богатый угле-водами сфинголипид узнают В-цепи ток-сина. Попав в клетку, А1-субъединица (23кДа) ковалентно модифицирует G-белок, ре-гулирующий активность аденилатциклазы.В частности, А1-субъединица токсина ката-лизирует перенос ADP-рибозы от NAD набоковую цепь аргинина G-белка (рис. 35.8).Это ADP-рибозилирование блокируетGTP-азную активность G-белка. Другимисловами, модифицированный G-белок ли-шается встроенного в него устройства дляинактивации аденилатциклазы (см.рис. 35.5). По существу, G-белок оказывает-ся стабилизированным в GTP-форме, а аде-нилатциклаза - в непрерывно активирован-ном состоянии, несмотря на отсутствиегормона. Аналогичный эффект можно полу-чить in vitro путем добавления к немодифи-цированному G-белку гуанилилимидоди-фосфата - негидролизуемого аналога GTP.

Рис. 35.8. Холерный токсин катализи-рует ADP-рибозилированиеG-белка - регулятора активно-сти аденилатциклазы.

Этот аналог, подобно GTP, активирует G-белок, но не способен превращаться в GDP.Связывание гуанилилимидодифосфата с не-модифицированным G-белком так же акти-вирует аденилатциклазу, как связываниеGTP G-белком, утратившим GТРазную ак-

тивность. Действие холерного токсина ещераз доказывает значение GТРазной актив-ности G-белка. Вспомним, что вредоносноедействие дифтерийного токсина также обус-ловлено ADP-рибозилированием белкас GТРазной активностью (разд. 29.28).


35.8. Инсулин стимулирует анаболическиепроцессы и ингибирует катаболическиепроцессыОбратимся теперь к инсулину - полипептид-ному гормону, играющему ключевую рольв интеграции процессов использования то-пливных веществ, что уже обсуждалось вы-ше (разд. 23.6). Общая характеристика функ-ции инсулина состоит в том, что в мышцахпечени и жировой ткани он усиливает анабо-лические и ингибирует катаболические про-цессы. В частности, инсулин повышает ско-рость синтеза гликогена, жирных кислот,белков, а также стимулирует гликолиз. Важ-ное значение имеет такой аспект действиягормона, как стимуляция проникновенияглюкозы, ряда других сахаров, а также ами-нокислот в клетки мышц и жировой ткани.Способствуя входу глюкозы в указанныеклетки, гормон снижает ее содержаниев крови (так называемый гипогликемическийэффект). Инсулин ингибирует такие катабо-лические процессы, как распад гликогенаи нейтрального жира. Он тормозит такжегликонеогенез путем снижения уровня фер-ментативной активности пируват-карбокси-лазы и фруктозо-1,6-бисфосфатазы. Дей-ствие инсулина во многом противоположнодействию адреналина и глюкагона. По су-ществу, адреналин и глюкагон служат сигна-лами недостаточности глюкозы, тогда какинсулин - сигнал избытка глюкозы.

35.9. Препроинсулин и проинсулин -предшественники активного гормонаКак показал Фредерик Сангер (FrederikSanger), бычий инсулин состоит из двух це-пей: А-цепи из 21 аминокислотного остатка

Рис. 35.9. Полипептидные цепи и дисуль-фидные мостики в инсулине.


Рис. 35.10. Изучение белка с высокой ра-диоактивностью, выявляемойпосле импульсного введенияметки в аденому островковойткани поджелудочной железы,привело к открытию проинсу-лина (непрерывной линией по-казана радиоактивность, пре-рывистой - оптическая плот-ность при 280 нм).

и В-цепи из 30 остатков; цепи инсулина ко-валентно связаны между собой двумя ди-сульфидными мостиками (рис. 35.9). Анало-гичное строение имеют инсулины другихвидов животных, в том числе человека. Каксинтезируется этот двухцепочечный белок?A priori можно предположить, что А- и В-це-пи синтезируются по отдельности, затемони специфически связываются в результатенековалентных взаимодействий и далеемежду ними формируются правильно рас-положенные дисульфидные мостики. Такоепредположение было проверено экспери-ментально; для этого определяли, можно лииз восстановленных А- и В-цепей получитьin vitro активный гормон с правильным рас-положением дисульфидных мостиков. Сти-мулом для этого исследования послужилиданные Анфинсена (Anfinsen), посвященныерибонуклеазе - одноцепочечному белку, спо-собному к полной ренатурации после хими-ческого восстановления и развертыванияструктуры (разд. 2.12). Однако в случае ин-сулина был получен совершенно иной ре-зультат: менее 4% образованных in vitro мо-лекул содержали правильные дисульфидныепары. Такой же низкий выход ренатуриро-ванного белка имел место и в случае с химо-трипсином - трехцепочечным ферментом,имеющем две межцепочечные дисуль-фидные связи (разд. 8.2). С другой стороны,химотринсиноген - одноцепочечный пред-

Рис. 35.11. Последовательность амино-кислот в проинсулине свиньи;А-цепь инсулина показанакрасным цветом, В-цепь - си-ним, связующий пептид (С-пеп-тид) - желтым. [Chance R.E.,Ellis R.M., Bromer W.W..Science, 161, 165 (1968).]

шественник химотрипсина - восстанавливалсвою структуру в значительно большей ме-ре. Различие в поведении химотрипсинаи химотрипсиногена наводило на мысльо том, что и инсулин не восстанавливалструктуры должным образом из-за частич-ного отсутствия необходимой для этого ин-формации. Возник вопрос, не является лиинсулин, подобно химотрипсину, про-изводным одной полипептидной цепи?

Решающую роль в изучении этой про-блемы сыграла работа Доналда Стайнера(Donald Steiner), проведенная на аденомеостровковой ткани поджелудочной железы.Эта редко встречающаяся опухоль человекапродуцирует большие количества инсулина.Стайнер инкубировал срезы опухоли с ме-ченным тритием лейцином и далее прово-дил анализ. Таким путем был обнаруженновый включавший большое количествометки белок (рис. 35.10). Последующие ис-следования показали, что этот белок, на-званный проинсулином, служит предше-ственником инсулина.

Проинсулин представляет собой единуюполипептидную цепь, в которой есть после-довательность примерно из 30 аминоки-слот, отсутствующая в инсулине (рис. 35.11).Это связующий пептид (С-пептид от англ.connecting - связующий); он расположен ме-жду карбоксильным концом В-цепи и ами-ноконцом А-цепи будущего инсулина. Каки предполагалось, проинсулин обладает спо-собностью к формированию правильно распо-ложенных дисульфидных связей после обра-ботки восстанавливающими агентамии последующего повторного окисления.

Недавно проведенные исследования био-синтеза инсулина выявили, что проинсу-лин - это еще не исходная форма синтезиро-ванного гормона. Новообразованная поли-пептидная цепь, попадающая в просветшероховатого эндоплазматичсского ретику-лума, представляет собой так называемыйпрепроинсулин, который содержит N-конце-вую последовательность из 16 остатков, от-сутствующую в проинсулине. По-видимому,этот N-концевой гидрофобный участок слу-жит сигнальной последовательностью, на-правляющей новообразованную цепь в эн-доплазматический ретикулум (разд. 29.30).Превращение препроинсулина в проинсулинпроисходит в просвете трубочек эндоплаз-матического ретикулума вскоре после про-хождения препроинсулина через мембрану.


Рис. 35.12. Ферментативное превращениепрепроинсулина в проинсулини далее в инсулин.


Далее образовавшийся проинсулин транс-портируется в аппарат Гольджи, где на-чинается протеолиз соединительного пепти-да. Формирование инсулина из проинсулина(неактивного гормона) продолжается в се-креторных гранулах. В проинсулинах жи-вотных разных видов С-пептиды имеют об-щие структурные особенности. Так, вовсех изученных к настоящему времени про-инсулинах связующий пептид содержитArg-Arg на N-конце и Lys-Arg на С-конце.Гидролиз полипептидной цепи по этим по-ложительно заряженным остаткам осущест-вляется протеолитическим ферментом, сход-ным с трипсином. Секреция инсулина, на-копленного в созревших секреторных грану-лах, осуществляется при слиянии мембрангранул с плазматической мембраной клетки.

35.10. Трехмерная структура инсулинаВ лаборатории Дороти Ходжкин (DorothyHodgkin) было проведено рентгенострук-турное исследование инсулина свиньи и рас-крыта его трехмерная пространственнаяструктура при разрешении 1,9 А. Эта работабыла завершена почти через 36 лет после то-го, как Ходжкин получила первые рентгено-граммы кристалла белка (пепсина), будучистуденткой-дипломницей в лабораторииДжона Бернала (John Bernal). За прошедшиегоды Ходжкин расшифровала структуры та-

Рис. 35.13. Электрононграмма содержа-щих инсулин секреторных гра-нул в β-клетках поджелудочнойжелезы. Инсулин образуетв гранулах мелкие кристаллы,что обусловлено его высокойконцентрацией в этих структу-рах. (Печатается с любезногоразрешения д-ра Arthur Like.)

ких биологически важных веществ, как холе-стерол, пенициллин и витамин В12. Инсулиноказался компактным трехмерным образо-ванием (рис. 35.14), из которого «торчат»только N- и С-концы В-цепи. Между этимидвумя вытянутыми ветвями В-цепи распо-лагается А-цепь. Структура имеет неполяр-ную сердцевину, образованную обращенны-ми внутрь алифатическими боковыми цепя-ми остатков аминокислот, принадлежащихА- и В-цепям. Помимо дисульфидных мо-стиков, инсулин стабилизирован нескольки-ми солевыми связями, а также водородны-ми связями между определенными группа-ми А- и В-цепей. Конформация проинсулинаеще не исследована, но, судя по даннымспектроскопии, она очень сходна с конфор-мацией инсулина. Об этом же свидетель-ствует способность проинсулина кристалли-зоваться вместе с инсулином.

35.11. Рецепторы инсулина локализованыв плазматической мембранеклеток-мишенейИнсулин прочно связывается со специфиче-скими рецепторами на плазматическоймембране клеток-мишеней. Это выявляетсяв опытах с использованием радиоактивно-го инсулина, содержащего ковалентно свя-занный 125I. Константа диссоциации инсу-лин-рецепторного комплекса составляетоколо 10 - 1 0 М. Необходимость в стольпрочном связывании объясняется низкойконцентрацией инсулина в крови (порядка10 - 1 0 М). Константа скорости образованиякомплекса очень велика (около107 М-1•с-1) и приближается к величине,характеризующей реакции, скорость ко-торых регулируется только скоростьюдиффузии. Клетка жировой ткани содер-жит всего лишь 1•104 рецепторов инсули-на, что соответствует плотности один ре-цептор на квадратный микрометр плазма-тической мембраны. Иными словами, одинрецептор инсулина приходится на 1•10б

фосфолипидов мембраны.Параметры связывания инсулина с со-

любилизированным рецептором и с рецеп-тором в интактной плазматической мем-бране одинаковы. Солюбилизированныерецепторы были очищены методом аффин-ной хроматографии, т. е. методом, осно-ванным на использовании специфическихсвязывающих свойств рецептора. Дляочистки препарат солюбилизированныхмембран пропускали через колонку ага-розы с ковалентно присоединенным инсу-

Рис. 35.14. Схематическое изображениеструктуры инсулина; показанытолько α-углеродные атомы.Красным обозначена А-цепь.синим - В-цепь.

лином; рецепторы инсулина прочно связы-вались с колонкой, тогда как остальныекомпоненты смеси проходили сквозь ко-лонку. Далее рецепторы инсулина элюиро-вали подкисленным раствором мочевины,который вызывал денатурацию рецепторови их отделение от связанного с агарозойинсулина. По счастью, очищенные рецеп-торы удавалось затем ренатурировать пу-тем удаления мочевины и повышения рНраствора. Используя этот метод, ПедроКватрсказас (Pedro Cuatrecasas) очистилрецепторы инсулина в 250000 раз. Субъе-диница рецептора, связывающего инсулин,представляет собой гликопротеин массой135 кДа (рис. 35.15).

На долю рецепторов инсулина прихо-дится всего лишь 4•10-3% общего количе-ства мембранных белков в гомогенатепечени. Следовательно, чтобы получитьв чистом виде 1 мг белка-рецептора, необ-ходимо подвергнуть обработке количествогомогената, эквивалентное 500 г белка,а для этого нужно взять печень от 200крыс. Этот расчет показывает, что выделе-ние рецепторов в количестве, достаточномдля определения последовательности ами-нокислот, рентгеноструктурного анализа


Диабет -название указывает на повышенное мочеиспускание. Аретей, каппадокийскийврач второго столетия н.э., писал: «Эпитет «диабет» относится к состоянию,похожему на прохождение воды по сифону». Он с тонкой наблюдатель-ностью охарактеризовал диабет как «растворение плоти и конечностей и пре-вращение их в мочу».

Сахарный -(по латыни mellitus, т.е. «подслащенный медом») указывает на присутствиесахара в моче больных диабетом.

и опытов по реконструированию, предста-вляет собой трудоемкую, но все же выпол-нимую задачу.

По всей вероятности, взаимодействиеинсулина с рецепторами на плазматиче-ской мембране запускает многие быстроразвивающиеся эффекты инсулина, напри-мер активацию транспорта аминокислот

Рис. 35.15. Гель-электрофорез экстрактаплазматических мембран кле-ток печени (А) и очищенного ре-цептора инсулина (Б). Электро-форез проводился в денатури-рующих условиях. [Jacobs S.,Hazum E., Schechter Y.,Cuatrecasas P., Proc. Nat. Acad.Sci., 76, 4919 (1979).]


и глюкозы через мембрану. К числу бы-стро развивающихся эффектов инсулинаотносится также фосфорилирование белка,принадлежащего рибосомной 40S-субча-стице. Все эти эффекты гормона не свя-заны с изменением содержания сАМР. Ка-кие вещества опосредуют действие инсули-на в клетке, пока еще не установлено.

35.12. Недостаточность инсулина вызываетдиабетСахарный диабет - это сложное заболева-ние, которым страдают несколько сот мил-лионов людей. Диабет характеризуется по-вышенным уровнем глюкозы в крови ив моче. Выделение глюкозы с мочой насту-пает в условиях, когда содержание глю-козы в крови превышает способность по-чечных канальцев к реабсорбции. Вместес глюкозой выделяется много воды, такчто нелеченый больной в острой стадии за-болевания испытывает голод и жажду. По-теря глюкозы приводит к израсходованиюзапасов углеводов, а затем и к расщепле-нию жиров и белков. В результате мобили-зации жиров образуется большое количе-ство ацетил-СоА. Если ацетил-СоА неможет полностью использоваться в циклетрикарбоновых кислот из-за недостаточно-го количества оксалоацетата, то образуют-ся кетоновые тела (ацетоацетат, ацетони гидроксимасляная кислота). Вспомним,что в организме животных синтеза окса-лоацетата из ацетил-СоА не происходит;у животных оксалоацетат образуется изглюкозы и некоторых аминокислот(разд. 23.4). Выделение кетоновых тел на-рушает кислотно-щелочное равновесиеи усиливает обезвоживание организма.В итоге в острой стадии диабета у нелече-ного больного может развиваться комаи наступить смерть.

Сахарный диабет обусловлен недоста-точностью инсулина. Причины же недоста-точности инсулина в большинстве случаевнеизвестны. Диабет удается воспроизвести

у экспериментальных животных путем хи-рургического удаления значительной частиподжелудочной железы либо путем хими-ческого разрушения β-клеток. Эти проду-цирующие инсулин клетки избирательноразрушаются при введении аллоксана.Диабет можно также вызвать введениемантител против инсулина. Еще одно дока-

зательство той важной роли, которуюиграет инсулиновая недостаточность в раз-витии диабета, состоит в том, что введениеинсулина быстро снимает острые симп-томы диабета.

Почему у больного диабетом количествоинсулина оказывается ниже потребностейв нем тканей? В настоящее время устано-влено, что в основе клинического состоя-ния, называемого сахарным диабетом, мо-жет лежать множество различных моле-кулярных дефектов. Рассмотрим неко-торые из причин диабета.

1. Нарушение превращения проинсулинав инсулин. В результате мутаций, затраги-вающих остатки аминокислот в участке со-единения А-цепи (или В-цепи) с С-пепти-дом в проинсулине, может нарушиться егопревращение в инсулин. У таких больныхв плазме крови обнаруживается высокийуровень содержания проинсулина (не обла-дающего гормональной активностью).

2. Нарушение молекулярной структурыинсулина. Еще один тип мутаций приводитк замене аминокислотного остатка в кри-тически важном участке молекулы инсу-лина. Так, если произошла замена фенил-аланина на лейцин вблизи карбоксильногоконца В-цепи, то гормональная активностьтакого инсулина оказывается сниженнойв 10 раз. Любопытно, что этот участок мо-лекулы инсулина сохраняется неизменнымв эволюции, начиная с примитивных мик-син и до человека.

3. Дефект рецепторов инсулина. У неко-торых больных секретируется нормальныйинсулин, но нарушается его связываниес клетками-мишенями. Следовательно,

в этом случае имеет место дефект рецепто-ров инсулина в плазматических мембранах.

4. Нарушение сопряжения рецепторовинсулина. Бывают случаи, когда у больныхсекретируется нормальный инсулин, клет-ки-мишени содержат обычное число рецеп-торов инсулина и параметры связываниягормона рецептором также соответствуютнорме. По-видимому, у этих больных нару-шения локализованы внутри клетки. Воз-можно, в частности, что отсутствует сопря-жение между инсулин-рецепторным ком-плексом и следующим компонентомв цепи передачи гормонального сигнала.

35.13. Эндорфины - пептиды мозга,действующие подобно опиатамНа протяжении веков опиаты, в частностиморфин, использовались как болеутоляю-щие средства. В 1680 г. Томас Сиденхем(Thomas Sydenham) писал: «Среди всех ле-карств, которые всевышний даровал чело-веку, дабы облегчить его страдания, нетболее универсального и более действенно-го, чем опий». Но почему в мозгу позво-ночных содержатся рецепторы к алкалои-дам из семян мака? Нейрофармакологипредположили, что опиатные рецепторыпредназначены не для взаимодействияс растительными алкалоидами, а для во-сприятия эндогенных регуляторов ощуще-ния боли. Согласно этой точке зрения,морфин оказывает фармакологический эф-фект только потому, что он имитирует ве-щества, существующие в организме живот-ного. Вопрос этот был окончательно раз-решен в 1975 г., когда Джон Хьюз (JohnHughes) выделил из мозга свиньи два пеп-тида с опиатоподобной активностью. Этисходные между собой пентапептиды, на-званные метионин-энкефалином и лейцин-энкефалином, присутствуют в большом ко-личестве в некоторых нервных окончаниях.По-видимому, они участвуют в интеграциисенсорной информации, имеющей отноше-ние к боли.

Спустя год Роджер Гилемин (RogerGuillemin) выделил из промежуточнойдоли гипофиза более длинные пептиды —эндорфины. Эндорфины обладают почтитакой же способностью снимать ощущениеболи, как морфин (при той же концентра-ции). Введение эндорфинов в желудочкимозга лабораторным животным оказывает


Рис. 35.16. Последовательности амино-кислот метионин-энкефалина(А), лейцин-энкефалина (Б)и β-эндорфина (В). Синим цве-том показана общая для них те-трапептидная последователь-ность.

примечательное действие. Так, β-эндорфинна несколько часов индуцирует глубокуюанальгезию всего тела, причем в этот пе-риод понижается температура тела. Болеетого, у животных возникает ступор, и онилежат распластавшись. Спустя несколькочасов действие эндорфинов исчезает, и жи-вотные вновь ведут себя нормально. Выяс-нился также удивительный факт, что дей-ствие эндорфинов исчезает через несколькосекунд после введения налоксона(рис. 35.17), известного антагонистаморфина. Судя по поведенческим реак-циям, индуцированным эндорфинами, этипептиды в нормальных условиях уча-ствуют в регуляции эмоциональных отве-тов. Многие методы, необходимые дляпроверки этой гипотезы, уже разработаны.Так, для определения крайне малых коли-честв пептидов, например эндорфинов, ис-пользуется радиоиммунологический анализ,который сочетает чувствительность ра-диоизотопных методов со специфичностьюиммунной реакции. Здесь мы сталкиваемся


с зарождением новой и многообещающейобласти нейробиологии и нейропсихиа-трии.

35.14. При расщеплении проопиокортинаобразуется несколько пептидных гормоновХотя β-эндорфин был открыт недавно, од-нако последовательность аминокислотв нем оказалась знакомой. В самом деле,β-эндорфин имеет такую же последова-тельность, как С-концевая область β-липо-тропина - гормона, который Чо Ли (ChouLi) выделил из гипофиза. In vivo β-эндор-фин образуется путем протеолитическогорасщепления β-липотропина, накопленногов секреторных гранулах. В последующембыл обнаружен еще более крупный белок,включающий последовательности β-липо-тропина и кортикотропина. Этот прогор-мон (массой 29 кДа) был назван про-опио-кортином, так как он служит предшествен-ником опиатного гормона и кортикотропи-на (рис. 35.18). Кортикотропин (назы-ваемый также адренокортикотропным гор-моном или АКТГ) способствует разраста-нию коры надпочечников и стимулируетсинтез целого набора стероидных гормо-нов в этой ткани. Из про-опиокортинаобразуется два меланоцитстимулирующихгормона (МСГ). Один из них - α-МСГ -является фрагментом кортикотропина,а второй - β-МСГ - формируется из β-липо-тропина (рис. 35.18). Не исключено, что N-концевая половина про-опиокортина слу-жит источником и других гормонов. Изизложенного ясно, что пептидные гормоныобразуются из про-опиокортина, как из рогаизобилия. Этот прогормон состоит изчетырех гомологичных областей, которые,

Рис. 35.17. Структура морфина - опиата(А) и налоксона - антагонистаморфина (Б).

Рис. 35.18. Про-опиокортин - биосинтети-ческий предшественник не-скольких пептидных гормонов.

видимо, возникли путем последовательныхудвоений гена.

Участки соединения между будущимиактивными гормонами в про-опиокортинесодержат пары основных остатков(Lys-Arg, Arg-Arg или Lys-Lys). Следуетподчеркнуть, что границы С-пептидав проинсулине (см. рис. 35.11) и в пропа-ратгормоне также представлены парамиосновных остатков. Видимо, именно парыосновных остатков в различных прогормо-нах служат теми отметинами, которыеуказывают, в каких участках должно про-изойти последующее расщепление.

35.15. Простагландины - модуляторыдействия гормоновОбратимся теперь к простагландинам -группе жирных кислот, оказывающихвлияние на разнообразнейшие физиологи-ческие процессы. Эти соединения были от-крыты в 30-х годах, но внимание привле-кли только недавно, главным образомблагодаря работам Суне Бергстрома (SuneBergstrom). Простагландины - это 20-угле-родные жирные кислоты, содержащие5-углеродное кольцо. Основные классы про-стагландинов обозначаются как ПГ-А,ПГ-В, ПГ-Е и ПГ-F, причем внизу допол-нительно ставится цифра, указывающая начисло углерод-углеродных двойных связейв углеводородной цепи (вне кольца). Про-стагландины, по-видимому, не являютсягормонами, но модулируют действие гор-монов. Обычно они изменяют активностьтех клеток, в которых синтезировались. Ха-рактер действия простагландинов зависитот типа клетки, и этим они отличаются отгормонов с их однозначно определеннымэффектом.

Подробно исследован механизм дей-ствия ПГ-Е1 на расщепление жиров в жи-ровой ткани. Такие гормоны, как адрена-лин, глюкагон, кортикотропин и тиреотро-пин, стимулируют липолиз в клетках.ПГ-Е, в концентрации 10-8 М являетсясильным ингибитором их липолитическогоэффекта. Непосредственное отношениек этому имеет тот факт, что ПГ-Е1 предот-

Рис. 35.19. Структура ряда простагланди-нов.


Рис. 35.20. Синтез ПГ-Е1 из цис-Δ8, Δ11,Δ14-эйкозотриеноата.

вращает увеличение концентрации сАМР,которое индуцируют эти гормоны. ОднакоПГ-Е1 не тормозит липолиза, вызванногодобавлением дибутирил-сАМР. Следова-тельно, ПГ-Е1 ингибирует аденилатциклазуклеток жировой ткани. В других клеткахвлияние простагландинов на содержаниесАМР может быть противоположным.

Молекулярные основы многих эффектовпростагландинов еще не изучены. Физио-логическое действие простагландинов вы-ражается в том, что они усиливают воспа-лительные процессы, регулируют притоккрови к определенному органу, контроли-руют транспорт ионов через некоторыемембраны, модулируют синаптическуюпередачу. Простагландины представляютбольшой интерес для клиники. Так, пред-полагается, что они играют роль при ро-дах. Вливание ПГ-Е2 вызывает роды черезнесколько часов. Простагландины в прин-ципе могут быть использованы как контра-цептивы; показано, что ПГ-F2α снижает се-


крецию прогестерона - гормона, необходи-мого для имплантации в матке оплодотво-ренной яйцеклетки.

35.16. Простагландины образуютсяиз ненасыщенных жирных кислотПростагландины синтезируются в мембра-нах из С20-жирных кислот, содержащих неменее трех двойных связей. В организммлекопитающих эти ненасыщенныежирные кислоты поступают с пищей(разд. 17.23). Предшественники простаглан-динов высвобождаются из фосфолипидовмембран под действием фосфолипаз. Био-синтез ПГ-E1, например, начинаетсяс цис-Δ 8,Δ 1 1,Δ 1 4-эйкозотриеноата. Обра-зование циклопентанового кольца и вклю-чение трех атомов кислорода осущест-вляются простагландин-синтазой (называе-мой также простагландин-циклооксигена-зой). Как и предполагалось a priori, источ-ником всех трех атомов кислорода служитмолекулярный кислород (рис. 35.20). Гем-содержащий фермент диоксигеназа, ката-лизирующий эти реакции, связан с гладкимэндоплазматическим ретикулумом.

Как показал Джон Вейн (John Vane), аспи-рин тормозит биосинтез простагландиновпутем инактивирования простагландин-син-таз. Причина угнетения активности этогофермента аспирином (ацетилсалицилатом)заключается в том, что он ацетилирует кон-цевую аминогруппу одной из субъединицпростагландин-синтазы (рис. 35.21). Про-стагландины усиливают воспалительныепроцессы, тогда как аспирин подавляет их.По-видимому, такое фармакологическоедействие аспирина обусловлено тем, что онингибирует биосинтез простагландинов.

35.17. Стероидные гормоны активируютспецифические геныПервичный эффект стероидных гормонов,в частности эстрадиола, прогестерона и кор-тизона, состоит в воздействии на выражениегенов, а не непосредственно на активностьфементов или процессы транспорта. В отли-чие от адреналина эти стероидные гормоныоказывают свое действие, только проникнувв клетку-мишень. Кроме того, местом ихпервичного действия служит не плазматиче-ская мембрана, а клеточное ядро. Для пол-ного проявления биологического эффектастероидных гормонов требуются часы, а неминуты, поскольку он зависит от синтезановых белков. Актиномицин D тормозит

Рис. 35.21. Инактивация простагладин-синтазы аспирином.

действие указанных стероидов, из чего сле-дует, что оно связано с синтезом новоймРНК.

17β-эстрадиол стимулирует увеличениематки. Первый этап этого воздействия со-стоит в том, что гормон связывается со спе-цифическим рецептором в цитоплазме кле-ток матки. Связывание характеризуетсявысокой прочностью (К 10-9 M). Образо-вавшийся гормон-рецепторный комплексмигрирует далее в клеточное ядро. В резуль-

тате связывания рецептора с эстрадиоломсродство рецептора к ДНК значительно по-вышается. Кроме того, у рецептора, связав-шего зстрадиол, появляется вторая субъеди-ница. Последнее находит отражение в увели-чении коэффициента седиментации с 4S до5S. Остается неизвестным, чем определяетсяспецифичность участков ДНК, связываю-щих эстрадиольный рецептор: последова-тельностью ли оснований или белками хро-мосом. Взаимодействие гормон-рецептор-ного комплекса с ДНК высокоспецифично.Кроме того, строго специфична и активациярецептора путем связывания гормона. К ре-цептору эстрадиола может присоединитьсяэстрон, но этот комплекс не взаимодей-ствует с ДНК. Неспособность эстрон-рецеп-торного комплекса к связыванию с ДНКвполне согласуется с тем, что эстрон не сти-мулирует увеличения матки.

По-видимому, описанный механизм раз-вития гормонального эффекта характеренне только для эстрадиола, но и в целом длявсех стероидных гормонов. Так, в опытахс культурой ткани гепатомы было показано,что глюкокортикоидный стероидный гор-мон дексаметазон тоже связывается со спе-цифическим цитоплазматическим рецепто-ром; рецептор, связавший гормон, претер-певает конформационные изменения и за-тем мигрирует в клеточное ядро, гдеобразует комплекс со специфическими

Рис. 35.22. Пространственные модели17β-эстрадиола (А) и тестосте-рона (Б).


Рис. 35.23. Фактор роста нервов (ФРН) ин-дуцирует отрастание аксоновот культивируемых нервныхклеток. А -без ФРН; Б - в при-сутствии ФРН. (Печатается слюбезного разрешения BruceYankner, Christiana Richter-Landsberg и д-ра Erick Shooter.)

участками в ДНК. Число участков ДНК,связывающих этот рецептор, определеноравным 1 на 106 пар оснований. Полученноечисло согласуется с данными о том, что дек-саметазон влияет на транскрипцию лишьнебольшого числа генов. Каков механизмэтой высокой избирательности в регуляциитранскрипции со стороны стероидных гор-монов, остается интригующей загадкой.

35.18. Белковые факторы роста типа ФРНи ЭФР стимулируют пролиферациюклеток-мишенейКак регулируется рост эукариотических кле-ток? Проведенное в последние годы выделе-ние белковых факторов роста, способныхспецифическим образом стимулироватьклетки-мишени, внесло существенный вкладв решение этого интересного и важного во-проса. Рита Леви-Монтальчини (RitaLevi-Montalcini) открыла, что фактор ростанервов (ФРН) играет решающую роль в раз-витии симпатических нейронов и опреде-ленных сенсорных нейронов у позвоночных.Под влиянием ФРН начинается деление


и дифференцировка этих клеток. Чувстви-тельным тестом на присутствие фактора ро-ста нервов служит отрастание аксонов откультивируемых ганглиев (рис. 35.23). Био-логически активная молекула ФРН состоитиз двух идентичных полипептидных цепеймассой по 13 кДа. Этот димер (называемыйβ-субъединицей) накапливается в местесвоего синтеза - поджелудочной железе - ввиде комплекса, имеющего субъединичнуюструктуру α2γ2β и массу 130 кДа. γ-Субъеди-ница является протеолитическим фермен-том, а α-субъединица - ингибитором этойпротеиназы. ФРН синтезируется в виде со-стоящего из α- и β-субъединиц прогормона,который в последующем расщепляется γ-протеиназой. По последовательности ами-нокислот ФРН напоминает инсулин. Сле-дует отметить, что инсулин не толькосильно активирует анаболические процессыв мышцах, печени и жировой ткани, нои оказывает стимулирующий эффект нарост большинства клеток. Можно предпо-ложить, что гены ФРН и инсулина произош-ли от общего предшественника.

Был выделен и изучен также эпидер-малъный фактор роста (ЭФР). Это полипеп-тид массой 6 кДа (рис. 35.24), способныйстимулировать рост эпидермальных и эпи-телиальных клеток. ЭФР прочно связывает-ся на плазматической мембране клеток-мишеней. Константа диссоциации комплек-са ЭФР—рецептор составляет около10 - 1 0 М. Спустя несколько минут послесвязывания ЭФР на мембране кластерыЭФР-рецепторных комплексов попадаютвнутрь клетки путем эндоцитоза. Участкамиэндоцитоза являются так называемые окай-мленные ямки (вдавления мембраны), со-

держащие клатрин (разд. 29.32). Далеепузырьки с ЭФР сливаются с лизосомами.Аналогичным образом попадают внутрьклеток и ФРН-рецепторные комплексы(рис. 35.25). Остается неизвестным, насколь-ко необходим собственно процесс проник-новения этих комплексов в клетку для пере-дачи стимулирующего сигнала клеточномуядру.

,ЗаключениеГормоны - это группа химически разно-родных соединений, которые интегрируютактивность различных клеток в многокле-точном организме. Решающую роль в дей-ствии многих гормонов (например, адре-налина или глюкагона) играет сАМР,который служит вторым посредником вну-три клетки-мишени. Гормоны, действие ко-торых опосредовано сАМР, связываются соспецифическими рецепторами на плазмати-ческой мембране клетки-мишени и активи-руют аденилатциклазу. Последняя предста-вляет собой связанный с мембраной фер-мент, катализирующий синтез сАМР и АТР.Сопряжение между рецепторами гормонови аденилатциклазой осуществляет белок,связывающий гуаниннуклеотиды (G-белок).Активация аденилатциклазы приводитк увеличению содержания сАМР в клетке.Образовавшийся сАМР активирует в своюочередь протеинкиназу, которая фосфори-лирует один или несколько белков. Так, фос-форилирование гликоген-синтазы и киназыфосфорилазы в мышцах и печени ведет к ин-гибированию синтеза и активации распадагликогена. Этот каскад реакций многократ-но усиливает первоначальный гормо-нальный стимул. сАМР появился на раннихэтапах эволюции, первоначально как сигналголодания. Холерный токсин катализируетADP-рибозилирование G-белка, что приво-дит к стойкой активации аденилатциклазыв клетках кишечного эпителия. В результатепри холере происходит массивный выходNa+ и воды в полость кишечника.

Инсулин активирует анаболические про-цессы (синтез гликогена, жирных кислоти белков) и тормозит катаболизм (в частно-сти распад гликогена и жиров). Инсулиноказывает сильнейшее воздействие на про-цессы мембранного транспорта; в частно-сти, он стимулирует вход глюкозы и амино-кислот в клетки мышечной и жировойткани. Биосинтетическими предшественни-ками активного гормона служат препроин-

Рис. 35.24. Последовательность амино-кислот в эпидермальном фак-торе роста (ЭФР). [Savage С. R.,Hash J.H., Cohen S., J. Biol.Chem., 248, 7669 (1973).]

Рис. 35.25. Проникновение в клетку ком-плекса ФРН-рецептор. (По ри-сунку, любезно предоставлен-ному д-ром Erick Shooter.)


сулин и проинсулин, состоящие из одной по-липептидной цепи. Препроинсулин содер-жит сигнальную последовательность, кото-рая отщепляется в просвете трубочек шеро-ховатого эндоплазматического ретикулума.Далее из проинсулина образуется инсулин;это происходит путем протеолитическогоотщепления пептида, соединяющего А-и В-цепи будущего активного гормона. Ука-занное превращение прогормона в гормонпротекает в аппарате Гольджи и в секре-торных гранулах. Инсулин распознаетсяспецифическими рецепторами, локализо-ванными в плазматической мембране кле-ток-мишеней. Недостаточность инсулина посравнению с потребностью в нем клеток ле-жит в основе сахарного диабета. Это забо-левание, возникающее в силу многих раз-личных причин, характеризуется повы-шенным содержанием глюкозы в кровии моче. У небольшой части больных диабе-том обнаружены такие явления, как наруше-ние превращения проинсулина в инсулин,изменение молекулярной структуры инсу-лина, а также дефект инсулиновых рецепто-ров клеточных мембран.

Эндорфины и энкефалины - это пептидымозга, оказывающие такой же эффект, какопиаты, в частности морфин. β-Эндорфинобразуется из про-опиокортина - прогормо-на, являющегося источником и других био-логически активных пептидов: кортико-тропина (АКТГ), β-липотропина и ме-

ланоцитстимулирующего гормонов (α-и β-МСГ). Участки соединения между буду-щими гормонами в про-опиокортине, каки в проинсулине, содержат пары основныхаминокислотных остатков. Небольшие помолекулярной массе белки служат такжегормонами роста, что видно на примерефактора роста нервов или эпидермальногофактора роста. Эти белки стимулируют де-ление и дифференцировку клеток-мишеней,Время проявления их действия - часы и дни.Аналогично и эффект стероидных гормонов(например, эстрадиола, прогестерона и кор-тизона) развертывается на протяжении не-скольких часов или дней. Действие стерои-дов направлено главным образом на регу-ляцию выражения генов. Показано, чтоэстрадиол проникает в клетку-мишеньи связывается со специфическим рецепто-ром в цитозоле. К образовавшемуся ком-плексу присоединяется вторая субъединицабелка, после чего весь комплекс попадаетв ядро, где происходит его связывание соспецифическими участками ДНК. Проста-гландины, которые синтезируются из полие-новых С20-жирных кислот, модулируютдействие различных гормонов, но сами неявляются гормонами. Аспирин подавляетсинтез простагландинов путем ковалентноймодификации фермента, катализирующеговключение атомов кислорода в ходе биосин-теза простагландинов.


С чего начатьPastan I., 1972. Cyclic AMP, Sci. Amer.,227(2), 97-105.Rubenstein E., 1980. Diseases caused byimpaired communication among cells,Sci. Amer., 242(3), 102-121.Sutherland E.W., 1972. Studies on themechanism of hormone action, Science,177, 401-408.Synder S.H., 1977. Opiate receptors andinternal opiates, Sci. Amer., 236(3),44-56.Guillemin R., 1978. Peptides in thebrain: the new endocrinology of theneuron, Science, 202, 390-402.

Рецепторы гормоновBaxter J.D., MacLeod К.M., 1980.

Molecular basis for hormone action. In:Bondy P. K. and Rosenberg L. E. (eds.),Metabolic Control and Disease,pp. 104-160, Saunders.Bradshaw R.A., Frazier W.A., 1977.Hormone receptors as regulators ofhormone action, Curr. Top. Cell Regul.,12, 1-35.Kahn C.R., 1976, Membrane receptorsfor hormones and neurotransmitters, J.Cell Biol., 70, 261-286.Goldstein J.L., Anderson R.G.W.,Brown M.S., 1979. Coated pits, coatedvesicles, and receptor-mediatedendocytosis, Nature, 279, 679-685.

cAMP и аденилатциклaзaRoss E.M., Oilman A.G., 1980. Bio-chemical properties of hormone-sen-sitive adenylate cyclase, Ann. Rev.Biochem., 49, 533-564.

Rodbell M., 1980. The role of hormonereceptors and GTP-regulatory proteinsin membrane transduction, Nature, 284,17-22.Helmreich E.J.M., Zenner H.Р.,Pfeuffer T., Cori C.F., 1976. Signaltransfer from hormone receptor to ade-nylate cyclase, Curr. Top. CellRegul., 10, 41-87.Greengard P., 1978. Phosphorylatedproteins as physiological effectors,Science, 199, 146-152.Means A.R., Dedham J.R., 1980.Calmodulin: an intracellular calciumreceptor, Nature, 285, 73-77.

Холерный токсинMoss J., Vaughan M., 1979. Activationof adenylate cyclase by choleragen, Ann.Rev. Biochem., 48, 581-600.Hirschorn N., Greenough W.B., III,1971. Cholera, Sci. Amer, 225(2), 15-21.

Инсулин и диабетCzech M.P., 1977. Molecular basis of302


insulin action, Ann. Rev. Biochem., 46,359-384.Steiner D.F., 1977. Insulin today,Diabetes, 26, 322-340.Renold A.E., Mintz D.H., Muller W.A.,Cahill G.F., Jr., 1978. Diabetes mellitus.In: Stanbury J.B., Wyngaarden J.B.and Fredrickson D.S. (eds.), TheMetabolic Basis of Inherited Disease(4th ed.), McGraw-Hill.Tager H., Given В., Baldwin D.,Mako M., Markese J., Rubenstein A.,Olefsky J., Kobayashi M., Kol-terman O., Poucher R., 1979. A struc-turally abnormal insulin causing humandiabetes, Nature, 281, 122-125.

Эндорфины и опиатыGuillemin R., 1977. Endorphins: brainpeptides that act like opiates, New Engl.J. Med., 296, 226-228.Nakanishi S., Inoue A., Kita T.,Nakamura M., Chang А.С.Y., CohenS.N., Numa S., 1979. Nucleotidesequence of cloned cDNA for bovinecorticotropin-b-lipotropin precursor,Nature, 278, 423-427.

Synder S.H., 1977. Opiate receptors inthe brain, New Engl. J. Med., 296,266-271.

Факторы ростаHaigler H.T., Cohen S., 1979.Epidermal growth factor: interactionswith cellular receptors. Trends Biochem.Sci, 4, 132-134.Greene L.A., Shooter E.M., 1980. Thenerve growth factor: biochemistry,synthesis, and mechanism of action,Ann. Rev. Neurosci., 3, 353-402.Levi-Montalcini R., Calissano P., 1979.The nerve-growth factor, Sci. Amer.,240(6), 68-77.

Стероидные гормоны и витамин DYamamoto К.R., Alberts В.М., 1976.Steroid receptors: elements formodulation of eukaryotic transcription,Ann. Rev, Biochem., 45, 721-746.DeLuca H.F., 1974. Vitamin D: thevitamin and the hormone, Fed. Proc.,33, 2211-2219.Haussler M.R., McCain T.A., 1977.Basic and clinical concepts related to

vitamin D metabolism and action, NewEngl. J. Med., 297, 974-984, 1041-1049.

ПростагландиныSamuelsson B., Granstrom E., Green K.,Hamberg M., Hammarstrom S., 1975.Prostaglandins, Ann. Rev. Biochem., 44,669-695.Roth G.J., Siok C.J., 1978. Acetylationof the NH2-terminal serine of prostagla-ndin synthetase by aspirin, J. Biol.Chem., 253, 3782-3784.Vane J.R., 1971. Inhibition ofprostaglandin synthesis as a mechanismof action for aspirin-like drugs, Nat.New Biol., 231, 232-235.

Радиоиммунологический метод опре-деления гормоновYalow R.S., 1978. Radioimmunoassay:a probe for the fine structure of biologicsystems, Science, 200, 1236-1246.

Общее представление о проблемеHood L.E., Wilson J.H., Wood W.В.,1975. Molecular Biology of EucaryoticCells, ch. 6, Benjamin.

ГЛАВА 36Мембранный транспорт

Биологические мембраны представляют со-бой высокоизбирательные барьеры прони-цаемости. Поток молекул и ионов междуклеткой и окружающей средой строго регу-лируется специфическими системами транс-порта. Транспортные процессы выполняютнесколько важных функций.

1. Регулируют объем клетки и поддержи-вают внутриклеточное значение рНи ионный состав в узких пределах колебаний,что создает благоприятные условия дляпроявления активности ферментов.

2. Экстрагируют из среды и концентри-руют субстраты энергетического и пласти-ческого обмена (топливо и строительныеблоки), а также выведение токсических ве-ществ.

3. Создают ионные градиенты, что необ-ходимо для поддержания возбудимости не-рвов и мышц.

В настоящее время начинают выяснятьсямолекулярные механизмы, лежащие в осно-ве многих процессов транспорта. В этой гла-ве мы рассмотрим ряд транспортных си-стем, обеспечивающих перенос ионов, саха-ров и аминокислот через биологическиемембраны бактериальных и животных кле-ток. Мы обсудим также продуцируемые ми-кроорганизмами транспортные антибиоти-ки, поскольку именно анализ их структурыпозволил выяснить, каким образом системытранспорта различают такие ионы, как, на-пример, Na+ и К+. Последняя часть этойглавы содержит описание каналов, соеди-няющих содержимое прилежащих другк другу клеток. Эти протоки (рис. 36.1)играют важную роль в межклеточной ком-муникации.


36.1. Различие между пассивным и активнымтранспортомЯвляется ли процесс транспорта активнымили пассивным, зависит от изменения сво-бодной энергии транспортируемых компо-нентов. Рассмотрим случай, когда транс-портируется незаряженное растворенное ве-щество (рис. 36.2). Свободная энергия егопереноса из отсека 1, где оно находитсяв концентрации с1, в отсек 2, где его концен-трация равна с2, составляет

Для заряженного компонента следуетучитывать также электрический потенциалмембраны. Сумма концентрационнойи электрической составляющих дает элек-трохимический потенциал. Изменение сво-бодной энергии в этом случае составит

где Z - электрический заряд транспортируе-мого компонента, ΔV - мембранная раз-ность потенциалов в вольтах и F - число Фа-радея (23,062 ккал • В-1 • моль - 1 ) .

Если ΔG положительно, то процесс транс-порта должен быть активным; если же ΔGотрицательно, то транспорт может осущест-вляться пассивно. Активный транспорттребует сопряжения с притоком свободнойэнергии, тогда как пассивный транспорт мо-жет идти спонтанно. Рассмотрим для при-мера транспорт незаряженного вещества изс1 = 10-3 мМ в с2 = 10-1 мМ: ΔG == 2,3RТlg(10-1/10-3) = 2,3•1,98•298•2 == + 2,7 ккал/моль. При 25°С (298 К) ΔG == + 2,7 ккал/моль, что указывает на ак-

тивный транспорт, нуждающийся в притокесвободной энергии. Такой транспортныйпроцесс может протекать за счет, например,гидролиза АТР, энергия которого соста-вляет —7,3 ккал/моль в стандартных усло-виях.

Рис. 36.1. Электронная микрофотогра-фия негативно окрашенныхмежклеточных соединений, вы-деленных из клеток печени. Потаким каналам диаметром 15 Аионы и небольшие молекулымогут перетекать из однойклетки в другую. [Hertzberg E.L, Gilula N. В., J. Biol. Chem.,254, 2143 (1979).]

36.2. Открытие системы активноготранспорта ионов натрия и калияБольшинство животных клеток имеет высо-кую концентрацию К+ и низкую концентра-цию Na+ по сравнению с окружающей клет-ку средой. Градиенты этих ионов создаютсяспецифической транспортной системой, на-зываемой (Na+ + К+)-насосом, посколькудвижение этих ионов взаимосвязано. Ак-тивный транспорт Na+ и К+ имеет огром-

36. Мембранный транспорт 305

Рис. 36.2. Изменение свободной энергиипереноса незаряженного рас-творенного вещества из отсекас концентрацией с1 в отсекс концентрацией с2 (А) и одно-валентных ионов через мем-брану на сторону, имеющуюодноименный с ионом заряд(Б). Обратите внимание, чтомембранный потенциал 59 мВтребует для транспорта одно-валентного иона при 25°С тако-го же изменения свободнойэнергии, как и градиент концен-трации, равный 10.

ное физиологическое значение. В самом де-ле, в организме животного на этот процессзатрачивается более трети АТР, расходуе-мой в состоянии покоя. Градиенты концен-трации Na+ и К+ регулируют объем клетки,обеспечивают электрическую возбудимостьнервных и мышечных клеток и служат дви-жущей силой для активного транспортаСахаров и аминокислот (разд. 36.10).

В 1957 г. Йенс Скоу (Jens Skou) открылфермент, гидролизующий АТР только приусловии добавления Na+ и К+ в содержа-


щую Mg2+ среду. Этот фермент был назван(Na+ + K+)-АТРазой:

Скоу предположил, что (Na+ ++ К+)-АТРаза является интегральной

частью (Na+ + К+)-насоса и расщеплениеАТР обеспечивает энергией активный транс-порт Na+ и К+. С тех пор был полученцелый ряд доказательств того, что (Na + ++ К+)-ATРаза - действительно составнаячасть (Na + + К+)-насоса.

1. (Na+ + К+)-АТРаза обнаруживаетсяво всех случаях, когда происходит активныйтранспорт Na+ и К+. Уровень фермента-тивной активности коррелирует с количе-ством транспортируемых ионов. Так, не-рвным клеткам свойственна высокая актив-ность и (Na+ + K+)-АТРазы, и (Na+ ++ К+)-насоса, тогда как в эритроцитах

оба этих показателя находятся на низкомуровне.

2. И (Na+ + К+)-АТРаза, и насос про-чно связаны с плазматической мембраной.

3. (Na+ + К+)-АТРаза и насос одинако-во ориентированы в плазматической мем-бране.

4. Изменения концентраций Na+ и К+

оказывают одинаковое действие на АТРаз-ную активность и скорость транспорта этихионов.

5. Кардиотонические стероиды являютсяспецифическими ингибиторами и (Na+ ++ К+)-АТРазы, и (Na+ + К+)-насоса.

Концентрация ингибитора, оказывающая

Рис. 36.3. (Na++К+)-АТРаза [компо-нент (Na+ + К+)-насоса] ги-дролизует АТР только в томслучае, если в среде, содержа-щей Mg2+, одновременно при-сутствуют Na+ и К+.

Рис. 36.4. (Na+ + К+)-насос строгоориентирован в плазматиче-ской мембране.

полумаксимальный эффект, для обоих про-цессов одинакова.

6. При обращении работы насоса в опре-деленной ионной среде происходит синтезАТР из ADP и Рi;.

36.3. И фермент, и насос ориентированыв мембранеИсследование (Na+ + К+)-насоса в теняхэритроцитов позволило установить, какориентированы (Na+ + К+)-АТРаза и(Na+ + К+)-насос. В гипотонической соле-вой среде эритроцит набухает, и в его мем-бране появляются дырки. Из него выходитгемоглобин и остается светлая мембрана(тень). Содержимое набухшего эритроцитаможно уравновесить с наружной средой. Ес-ли наружный раствор сделать изотоничным.то мембрана вновь становится барьеромпроницаемости. Следовательно, молеку-лярный и ионный состав среды внутри тенейможно отрегулировать путем запечатыва-ния их в соответствующей среде. Исследова-ния процессов транспорта и ферментатив-ной активности в тенях эритроцитов показа-ло, что (Na+ + K+)-насос ориентированследующим образом (рис. 36.4).

1. Для активации АТРазы и переноса че-рез мембрану ионы Na+ должны быть вну-три, а ионы К+ - снаружи.

2. Только находящийся внутри клеткиАТР служит эффективным субстратомАТРазы и используется для работы насоса.

3. Кардиотонические стероиды ингиби-руют насос и АТРазу только в том случае,если они находятся вне клетки (снаружи).

4. Ванадат-ионы ингибируют насоси АТРазу только при условии, что они нахо-дятся внутри клетки.

36.4. АТР транзиторно фосфорилируетнатрий-калиевый насосКаким образом АТР обеспечивает ак-тивный транспорт Na+ и К + ? Ключом к ре-шению этого вопроса оказалось наблю-дение, что в присутствии Na+ и Mg2+

АТР фосфорилирует (Na+ + К+)-АТРазу.Участком фосфорилирования служит боко-вая цепь специфического остатка аспартата.Далее в присутствии К+ происходит гидро-лиз фосфорилированного промежуточногопродукта (Е—Р). Для реакции фосфорили-

рования не требуется К+, а для реакции де-фосфорилирования не требуются ни Na+, ниMg 2 + :

Na+-зависимое фосфорилирование и К+-зависимое дефосфорилирование - не един-ственные реакции, имеющие критическоезначение. В процессе функционированиянасос принимает по крайней мере дверазные конформации, обозначаемые как Е1

и Е2. Всего же в транспорте Na+ и К+ и со-пряженном с ним гидролизе АТР участвуетне менее четырех конформационных формфермента: E1, Е1—Р, Е2—Р и Е2 (рис. 36.5).При гидролизе одной молекулы А ТР происхо-дит перенос трех ионов Nа+ и двух ионовК+. Следовательно, работа насоса генери-рует электрический ток через мембрану.Другими словами, (Na+ + K+)-АТРазный


Рис. 36.5. Циклическое изменение кон-формации (Nа+ + К+)-АТРазыв ходе катализа.

насос электрогенен. Максимальное числооборотов АТРазы составляет около 100 с-1.

Ионы ванадата (V5 +) в наномолярныхконцентрациях ингибируют (Na+ + К+)-АТРазу. Этот пятивалентный ион фик-сирует белок в форме Е2 . Ванадат являетсяаналогом переходного состояния, образую-щегося при гидролитическом отщеплениифосфорильной группы, так как он способенпринять бипирамидальную структуру, по-добную той. какую дает фосфат (рис. 36.6).

36.5. Транспорт ионов и гидролиз АТРтесно сопряженыВажная характеристика насоса состоитв том, что в отсутствие транспорта Na+ иК+ не происходит гидролиза АТР. Другимисловами, система так сопряжена, что энер-гия АТР не растрачивается впустую. Про-чное сопряжение - общая особенность био-логических систем, опосредующих превра-щение энергии. Вспомним, что и в митохон-дриях условием нормального потока элек-тронов в дыхательной цепи служит одновре-менное генерирование АТР (разд. 14.13).Другой пример сформулированного прин-ципа - обязательное сопряжение гидролизаАТР и мышечного сокращения.

Действие (Na + + K+)-насоса можнообратить так, чтобы он приводил к синтезуАТР. Суммарный синтез АТР из ADP и Рi


происходит в условиях резко увеличенныхионных градиентов. Это достигается инку-бацией эритроцитов в среде с очень высокой(по сравнению с нормой) концентрациейNa+ и очень низкой концентрацией К+.

36.6. Натрий-калиевый насос - олигомерныйтрансмембранный белок(Na+ + K+)-АТРаза представляет собойтетрамер α2β2 массой 270 кДа. Большаяα-субъединица (95 кДа) содержит участок,осуществляющий гидролиз АТР, и участоксвязывания кардиотонических стероидныхингибиторов. Меньшая β-субъединица(40 кДа) содержит углеводные группы. Ме-жду двумя α-субъединицами или между α-и β-субъединицами (но не между двумяβ-субъединицами) легко образуются попе-речные мостики. Исходя из этого факта,можно было предположить, что α-субъеди-ницы контактируют друг с другом, тогдакак β-субъединицы пространственно разде-лены. Как уже упоминалось, гидролиз АТРпротекает на той стороне мембраны, кото-рая обращена к цитозолю, а участок связы-вания стероидных ингибиторов находитсяна наружной стороне мембраны. Следова-тельно, каждая α-субъединица пронизываетмембрану насквозь (рис. 36.7). Углеводныецепи β-субъединиц расположены на наруж-ной стороне плазматической мембраны, какэто вообще свойственно мембранным гли-копротеинам (разд. 10.12).

Любопытно отметить, что рассматри-ваемый ферментный комплекс обладает од-ним участком связывания стероидных инги-биторов, одним участком фосфорилирова-ния и тремя участками связывания Na+ . Как

Рис. 36.6. Строение ванадат-иона (V5 +).Лиганды вокруг этого ионарасполагаются в виде двойнойпирамиды, т.е. так же, как во-круг атома фосфора при гидро-литическом отщеплении фос-форильной группы.

Рис. 36.7. Схематическое изображениесубъединичной структурыи расположения в мембране(Na+ + К+)-насоса.

же получается, что тетрамер с субъединич-ной структурой α2β2 содержит нечетноечисло связывающих участков? Одна из воз-можностей состоит в том, что участкисвязывания расположены между субъедини-цами, в месте их контактов. Вспомним, чтоα2β2-тетрамер гемоглобина содержит един-ственный участок связывания бисфосфогли-церата, находящийся в полости, располо-женной в центре молекулы (разд. 4.14).Однако существует и иная возможность,а именно такое взаимодействие двух αβ-по-ловин фермента, при котором связываниев одном из двух участков препятствуетсвязыванию в другом. В самом деле, целыйряд олигомерных ферментов проявляет та-кую половинную реакционноспособность.

36.7. Модель механизма действиянатрий-калиевого насосаПочему фосфорилирование и дефосфорили-рование АТРазы приводят к переносу Na+ иК+ через мембрану? Структура этого насо-са еще не настолько изучена, чтобы можнобыло детально описать механизм его дей-ствия. Все же полезно рассмотреть простуюмодель работы насоса, предложенную Оле-гом Ярдецким (Oleg Jardetzky). Согласноэтой модели, структура белка, функциони-рующего в качестве насоса, должна отве-чать трем условиям.

1. В белке должна быть полость такой ве-личины, чтобы в ней умещались небольшаямолекула или ион.

2. Белок должен существовать в двух кон-формациях, причем при одной из них по-

лость должна быть открыта со стороны,обращенной внутрь, а при другой - со сто-роны, обращенной наружу.

3. Указанные конформации должныиметь разное сродство к транспортируемымкомпонентам.

Рассмотрим эту модель применительнок транспорту Na+ и К+ (рис. 36.8). Две кон-формации белка - это формы Е1 и Е2,уже описанные ранее. Постулировано, что1) связывающая ионы полость на Е1 обра-щена внутрь клетки, а на Е2 - наружу и 2) Е1

обладает высоким сродством к Na+, а Е2 - кК+. Модель исходит также из двух ус-тановленных фактов, а именно 1) Na+ за-пускает фосфорилирование, а К+ - дефос-форилирование, 2) фосфорилирование ста-билизирует форму Е2, а дефосфорилиро-вание - форму Е1. На рис. 36.8 E1 и Е2

изображены совершенно разными по кон-формации. Нужно, однако, подчеркнуть,что структурные различия между этими дву-мя формами вовсе необязательно должныбыть большими. Сдвига нескольких атомовна расстояние 2 А может оказаться доста-точно, чтобы изменить ориентацию полостии сродство к Na+ или К+. Существует мно-жество прецедентов, позволяющих считать,что фосфорилирование способно вызватьизменения такого масштаба. Вспомнимвлияние фосфорилирования на свойствагликоген-фосфорилазы и гликоген-синтазыили на изменение сродства гемоглобинак кислороду при нековалентном связываниибисфосфоглицерата.

36.8. Кардиотонические стероиды -специфические ингибиторы (Na+ ++ К+)-АТРазы и (Na+ + К+)-насосаНекоторые стероиды растительного проис-хождения являются мощными ингибитора-ми (Na+ + К+)-АТРазы и насоса. Полу-максимальное ингибирование обоих про-цессов наблюдается при концентрации ин-гибитора порядка 10-8 М. Представителиэтого класса ингибиторов, в частности диги-токсигенин и уабаин, называются кардиото-ническими стероидами в связи с их выра-женным действием на сердечную деятель-ность (рис. 36.9). Активность кардиотониче-ских стероидов определяется наличием в ихструктуре 5- или 6-членного ненасыщенноголактонного кольца с β-конфигурацией при


Рис. 36.8. Схематическое изображениепредполагаемого механизмадействия (Na+ + К+)-насоса.На верхней половине рисун-ка последовательность реак-ций, направленных на выведе-ние трех ионов Na+; ниже —последовательность реакций,обеспечивающих вход двух ио-нов К + . Формы Е1 (желтыйцвет) и Е2 (синий цвет) на рисун-ке сильно различаются по кон-формации. На самом деле кон-формационные различия могутбыть очень небольшими.

С-17. Существенное значение имеют такжегидроксильная группа при С-14 и цис-кон-фигурация сочленения колец С и D. В моле-куле уабаина и ряда других кардиотониче-ских стероидов при С-3 находится остатоксахара, однако этот сахар не имеет значениядля ингибирования АТРазы.

Как уже упоминалось, кардиотоническиестероиды ингибируют реакцию дефосфори-лирования (Na+ + К+)-АТРазы. Ингиби-рование присходит только в том случае, ес-ли кардиотонические стероиды локализо-

310Часть V.

Молекулярная физиология

ваны на наружной стороне мембраны.Таким образом, подавление дефосфорили-рования этими стероидами пространствен-но так же асимметрично, как и активация де-фосфорилирования ионами калия.

Кардиотонические стероиды, напримердигиталис, имеют огромное значение в ме-дицине. Дигиталис повышает силу сокраще-ния сердечной мышцы и потому служит ос-новным средством лечения острой сердеч-ной, недостаточности. Ингибирование диги-талисом (Na+ + К+)-насоса приводитк повышению содержания Na+ в клеткахсердечной мышцы. Это сопровождается уве-личением внутриклеточной концентрацииСа2+ , что в свою очередь повышает сокра-тительную активность миокарда. Любопыт-но отметить, что дигиталис (алкалоид на-перстянки) успешно использовался задол-го до открытия (Na+ + К+)-АТРазы. В1785 г. врач и ботаник Уильям Уитеринг(William Withering) опубликовал «Описаниенаперстянки и некоторые способы ее приме-нения в медицине», где рассказывает, какимобразом он впервые узнал об использова-нии дигиталиса для лечения острой сердеч-ной недостаточности.

«В 1775 г. меня спросили, каково моемнение о домашнем способе лечения во-дянки. При этом сообщили, что этот спо-соб был известен одной старухе в Шроп-шире и она долго держала его в секрете.Старуха иногда вылечивала больных, ко-торым не могли помочь врачи... Ее сна-добье состояло из 20 или более различныхтрав, однако разбирающемуся в этомпредмете нетрудно было заметить, что ак-тивным началом могла быть только на-

перстянка... Наперстянка влияет на бие-ние сердца в большей степени, чемкакое-либо из других лекарств, и это дей-ствие можно с успехом использовать дляисцеления больного».

36.9. Транспорт кальция осуществляетсядругой АТРазойИоны кальция играют важную роль в регу-ляции мышечного сокращения (разд. 34.10),а также во многих других физиологическихпроцессах. В скелетной мышце содержитсясложная сеть связанных с мембраной трубо-чек и везикул. Эта мембранная система, на-зываемая саркоплазматическим ретикулу-мом, регулирует концентрацию Са2+

в среде, окружающей сократительные мы-шечные волокна. В состоянии покоя Са2+

насасывается в саркоплазматический рети-кулум, так что непосредственно вокруг мио-фибрил концентрация Са2+ бывает очень

Рис. 36.9. Кардиотонические стероиды,например дигитоксигенин и уа-баин, ингибируют (Na+ ++ К+)-насос.

Рис. 36.10. Наперстянка. (Krochmal A.,Krochmal С., A Guide to theMedicinal Plants of the UnitedStates, Quadrangle Books, 1973,p. 243.)

низкой. Возбуждение мембраны саркоплаз-матического ретикулума под влиянием не-рвного импульса ведет к мгновенному выс-вобождению больших количеств Са2+, и этозапускает мышечное сокращение. Другимисловами, Са2+ служит промежуточнымзвеном между нервным импульсом и сокра-щением мышечного волокна.

Транспорт Са2+ через мембрану сарко-плазматического ретикулума происходит засчет энергии АТР. В саркоплазматическомретикулуме имеется АТРаза, которую акти-вирует Са2+. Эта Са2+-АТРаза является со-ставной частью Са2+-насоса подобно тому,как (Na+ + К+)-АТРаза - часть (Na+ ++ К+)-насоса. Са2+-АТРаза также подвер-гается фосфорилированию в ходе гидролизаАТР:


Рис. 36.11. Мембранные везикулы, обра-зованные из очищеннойСа2+-АТРазы. Глобулярныечастицы на поверхности мем-браны - участки молекулыАТРазы, пронизывающей мем-брану. [Stewart P. S., Мас-Lennan D. H., J. Bioi.Chem., 249,987 (1974).]

Цикл конформационных изменений, обус-ловленных фосфорилированием и дефосфо-рилированием, обеспечивает перенос двухионов Са2+ при расщеплении одной моле-кулы АТР. Благодаря очень высокому срод-ству этой АТРазы к Са2+ (К 10-7 М) фер-мент эффективно транспортирует Са2+ изцитозоля (где [Са2+] < 10-5 М) в сарко-плазматический рстикулум (где [Са2+]

10-2 М).Плотность молекул Са2+-насоса в мем-

бране саркоплазматического ретикулумаочень велика, а именно около 20 000 в расче-те на 1 мкм2. В сущности, Са2+-АТРаза со-ставляет более 80% общего количества ин-тегральных белков мембраны и занимаеттреть ее поверхности. Большая субъединица(100 кДа) Са-насоса пронизывет мембрануи содержит участок фосфорилирования; каки в (Na+ + K+)-насосе, таким участкомявляется специфическая боковая цепь, пред-ставленная остатком аспартата. Еще однаобщая черта обоих насосов - это наличиегликопротеина: в Са2+-насосе гликопро-теин массой 55 кДа связан с большойсубъединицей.

Из очищенной Са2+-АТРазы и фосфоли-пидов удалось реконструировать функцио-нально активный Са2+-насос. В этом экспе-


рименте Са2+-АТРазу выделяли из мем-бран саркоплазматического ретикулума по-сле их солюбилизации детергентом хола-том. Очищенный солюбилизированныйфермент добавляли к фосфолипидам из со-евых бобов. После удаления детергента пу-тем диализа образовывались мембранныевезикулы. Эти реконструированные вези-кулы с высокой скоростью накапливали Са2+

в присутствии АТР и Мg 2 + .

36.10. Поток Na+ обеспечивает энергиейактивный транспорт сахаров и аминокислотв животных клеткахМногие транспортные процессы не зависятнепосредственно от гидролиза АТР, а со-пряжены с потоком ионов по электрохими-ческому градиенту. Так, во многих жи-вотных клетках насасывание глюкозы обес-печивается одновременным входом Na+.При этом ионы натрия и глюкоза связы-ваются со специфическим транспортнымбелком и проникают в клетку одновремен-но. Согласованный перенос двух компонен-тов называют котранспортом; при симпор-те имеет место перенос обоих компонентовв одном направлении, а при антипорте - в

Рис. 36.12. Источником энергии для ак-тивного транспорта глюкозыслужит градиент концентрацииNa+. Эта система симпортасвойственна плазматическиммембранам клеток кишечникаи почек.

противоположных направлениях. Ионы на-трия, которые входят в клетку вместе с мо-лекулами глюкозы посредством симпорта,выводятся из клетки (Na+ + К+)-АТРазой(рис. 36.12). Количество транспортируемойглюкозы и скорость ее транспорта зависятот трансмембранного градиента концентра-ции Na+.

Зависящий от Na+ симпорт широко ис-пользуется в животных клетках для нако-пления аминокислот. В некоторых клетках,например в микроворсинках щеточнойкаемки кишечника (рис. 36.13), посредствомсимпорта осуществляется активный транс-порт сахаров. Кроме того, в тонком кишеч-нике существует специализированныйNa+-зависимый симпорт, обеспечивающийперенос ионов Cl- против градиента кон-центрации. Во многих клетках ионы натрияслужат также движущей силой в процес-сах антипорта, направленных на выведениеионов кальция. Таким образом, градиентконцентрации ионов натрия, создаваемый(Na+ + K+)-АТРазой, обеспечивает энер-гией большинство симпортов и антипортовв животных клетках.

36.11. Поток протонов служит движущейсилой во многих процессах транспортау бактерийСимпорты и антипорты - эволюционноочень древние механизмы молекулярноготранспорта. Так, движущей силой многихтранспортных систем у бактерий служит по-ток протонов через плазматическую мем-брану. Наиболее изученная бактериальнаясистема симпорта - перенос лактозы у E.coli(рис. 36.14). У этой обитательницы нижнихотделов кишечника млекопитающих выра-ботался высокоэффективный механизм кон-центрирования лактозы. Насос для этогодисахарида, выделенный Юджином Кенне-ди (Eugene Kennedy), представляет собойодиночную полипептидную цепь массой30 кДа и называется пермеазой для лактозы(или М-белком). Это интегральный мем-бранный белок, который кодируется геному, входящим в lac-оперон (разд. 28.3). В ин-дуцированных клетках на его долю прихо-дится около 4% белков мембраны.

Раскрытию механиза функционированиялактозного насоса способствовало изучениемутантов по гену у, а также исследованиявезикул (пузырьков), полученных из бакте-риальных мембран. Везикулы очень удобныдля изучения процессов транспорта, по-скольку они значительно проще устроены,

Рис. 36.13. Электронная микрофотогра-фия поперечного среза микро-ворсинок кишечника. Наличиемикроворсинок во много разувеличивает площадь поверх-ности, через которую происхо-дит транспорт питательных ве-ществ. (Печатается с любезно-го разрешения д-ра G. Pallade.)

чем целая бактерия. В везикулах есть систе-ма окислительного фосфорилирования идругие связанные с мембраной белки, но от-сутствуют цитоплазматические компонентыинтактной клетки. Сами по себе везикулы ненакапливают лактозы, но если добавитьсубстрат окисления, обеспечивающий потокобладающих высоким потенциалом элек-тронов по дыхательной цепи, то накоплениелактозы имеет место. Этот же эффект мож-но получить и иным способом, а именно со-зданием градиента рН с помощью образуе-мой вне клеток кислоты. Создание мем-бранного потенциала градиентом концен-трации К+ также приводит к насасываниюлактозы. Все эти данные показывают, чтоактивный транспорт лактозы обеспечивает-ся протонодвижущей силой в плазматиче-ской мембране. Транспорт молекул лактозысопряжен с движением протона в клетку.При физиологических условиях протонный


Рис. 36.14. Пермеаза для лактозы транс-портирует β-галактозиды. вчастности лактозу (А) и изо-пропилтиогалактозид (Б). Тио-галактозиды оказались оченьудобными для изучения этойсистемы, так как они транс-портируются пермеазой длялактозы, но не подвергают-ся гидролизу β-галактозида-зой.

градиент, необходимый для этого активно-го транспорта, возникает за счет потокаэлектронов от донора, обладающего высо-ким потенциалом (например, NADH), подыхательной цепи. Симпорт протонов и лак-тозы иллюстрирует обобщающую концеп-цию Питера Митчелла (Peter Mitchell)о «преобразовании энергии посредствомпротонного градиента» (разд. 14.18).

36,12. Активный транспорт ряда сахаровсопряжен с их фосфорилированиемСимпорт - не единственный тип насосов,осуществляющих транспорт сахаров. У не-которых бактерий накопление углеводовпроисходит путем сопряжения их входав клетку с фосфорилированием. Например,у многих бактерий поступающая в клеткиглюкоза превращается в глюкозо-6-фосфат.Особенность транспорта этого типа, назы-ваемого транслокацией группы, состоитв том, что в ходе транспорта происходитмодификация растворенного вещества. Кле-точная мембрана непроницаема по отноше-

Таблица 36.1. Углеводы, транспортируемые фосфо-трансферазной системой Е. coli

ГлюкозаФруктозаМаннозаN-ацетилглюкозамин

МаннитолСорбитолГалактитолЛактоза


нию к фосфорилированным сахарам, и по-тому они накапливаются внутри бакте-риальной клетки.

Наиболее хорошо изучен процесс транс-локации групп, осуществляемый фосфо-трансферазной системой ( Ф Т С ) которуюоткрыл Сол Роузман (Saul Roseman). Осо-бенность этой системы состоит в том, чтодонором фосфорильной группы служит фос-фоенолпируват, а не АТР или какой-либоиной нуклеозидтрифосфат. Суммарная ре-акция, катализируемая фосфотрансфераз-ной системой, следующая:

Сахарвне клетки +

+ Фосфоенолпируват

—> Фосфорилированный сахарв клетке +

+ Пируват.

Рис. 36.15. Протонный градиент служитисточником энергии для транс-порта ряда сахаров и амино-кислот в бактериальные клет-ки. Протонный градиент гене-рируется током электроновв дыхательной цепи.

В этой транслокации участвуют 4 белка:HPr, фермент I, фермент II и фермент III.Фермент II, будучи интегральным белкоммембраны, образует трансмембранный ка-нал и катализирует фосфорилирование саха-ра. При этом фосфорильная группа фосфое-нолпирувата переносится на сахар не прямо,а сначала на фермент I и после на специфи-ческий остаток гистидина небольшоготермостабильного белка HPr (рис. 36.16).Образующийся в качестве промежуточногосоединения фосфогистидин имеет высокийпотенциал переноса фосфатной группы.промежуточный по величине между со-ответствующими значениями для АТРи фосфоенолпирувата. Далее происходитперенос фосфорильной группы от фосфори-лированного HPr на фермент III - перифе-рический мембранный белок, который ужевзаимодействует с собственно каналом, т. е.ферментом II:

Конечный этап - перенос фосфорильнойгруппы от фермента III на транспорти-руемый сахар (рис. 36.17). Из указанныхчетырех очищенных белков удалось рекон-струировать функционально активный фер-ментный комплекс.

Некоторые белки, входящие в состав фос-фотрансферазной системы, обладают специ-фичностью, другие - нет. Так, HPr и фер-мент I, которые являются растворимымибелками цитозоля, участвуют в транспортевсех сахаров, переносимых этой системой.С другой стороны, ферменты II и III про-являют специфичность в отношении опреде-ленных сахаров. Например, в транспортеглюкозы, лактозы и фруктозы участвуютразные ферменты II и III. Такой же резуль-тат был получен и при генетических иссле-дованиях. У мутантов, дефектных по HPrили ферменту I, не происходит транспортабольшого числа разных сахаров, тогда какмутанты, дефектные по синтезу ферментовII и III, не способны транспортироватьтолько какой-либо определенный сахар.Фермент III не участвует в транслокациигекситолов, в частности галактитола; в этом

Рис. 36.16. Поток фосфорильных групп отфосфоенолпирувата на сахар,транспортируемый через мем-брану фосфотрансферазной си-стемой.

случае фосфорильная группа переноситсянепосредственно от HPr на углевод.

Чем объяснить, что фосфотрансферазнаясистема устроена значительно сложнее дру-гих переносчиков, например пермеазы длялактозы? Представляется вероятным, чтофосфотрансферазная система не только осу-ществляет транспорт сахаров, но и выпол-няет регуляторные функции. Избыточноепоступление какого-то одного углевода поддействием фосфотрансферазной системысильно подавляет активный транспорт саха-ров другими переносчиками. Это ингибиро-вание опосредуется, по-видимому, измене-нием содержания сАМР, а именно повыше-


Рис. 36.17. Предполагаемый механизмтранслокации групп, осущест-вляемой фосфотрансферазнойсистемой.

Рис. 36.18. Транспортируемый фосфо-трансферазной системой сахарα-метилглюкозид ингибируетобразование сАМР.


ние концентрации сахара, накопленногофосфотрансферазной системой, ведет к сни-жению выработки сАМР (рис. 36.18). В ре-зультате прекращается транскрипция рядаиндуцируемых оперонов. Вспомним, чтоэкспрессия таких индуцируемых оперонов,как lac и gal, значительно возрастает присвязывании комплекса сАМР с белком БАКв соответствующих участках промотора(разд. 28.6). Следовательно, фосфотрансфе-разная система регулирует использованиеисточников углерода.

36.13. Транспортные антибиотики повышаютионную проницаемость мембранРяд микроорганизмов синтезирует низко-молекулярные соединения, в присутствиикоторых мембраны становятся прони-цаемыми для определенных ионов. Эти не-большие молекулы, называемые транс-портными антибиотиками, оказалисьценным инструментом для эксперимен-тальных исследований, в частности дляизучения механизма связывания ионов. На-пример, валиномицин препятствует окисли-тельному фосфорилированию в митохон-дриях путем повышения их проницаемостидля К + : в присутствии валиномицина мито-хондрии используют энергию, генерируе-мую при транспорте электронов, не на син-тез АТР, а на накопление К + . Валиномицинимеет циклическую структуру, образован-ную из повторяющейся три раза последова-тельности четырех разных остатков (А, Б,В и Г) (рис. 36.19). Эти остатки четырех ти-пов соединены чередующимися эфирнымии пептидными связями.

Еше один хорошо изученный транспорт-ный антибиотик - грамицидин А (рис. 36.20).Это полипептид с открытой цепью, сос-тоящий из 15 аминокислотных остатков.Примечательна структура грамицидина А:в нем чередуются D- и L-аминокисло-ты. Кроме того, N- и С-концы поли-пептида модифицированы. Как будет пока-зано несколько ниже, транспорт ионовграмицидином А и валиномицином осу-ществляется совершенно по-разному.

Механизм переноса ионов этими анти-биотиками удобно исследовать на таких хо-рошо охарактеризованных модельных си-стемах, как двуслойные липидные пузырьки(разд. 10.6) и плоские двуслойные мем-браны (разд. 10.6). В опытах используютпузырьки, содержащие радиоактивный ион,например 4 2 К + ; их получают путем обра-ботки мембран ультразвуком в присутствии

Рис. 36.19. Валиномицин имеет периоди-ческую циклическую структу-ру, состоящую из остатковL-лактата (А), L-валина (Б),D-гидроксиизовалерианата (В)и D-валина (Г).

этого иона и последующего удаления 4 2К+,не попавшего внутрь пузырьков, методомгель-фильтрации. Далее сравнивают ско-рость выхода радиоактивного иона из пузы-рьков в присутствии и в отсутствие антибио-тика. Другой способ получения информацииотносительно ионной проницаемости дву-слойных мембран состоит в измерении та-ких электрических параметров, как сопроти-вление мембраны и мембранный потенциал.Например, сопротивление двуслойной мем-браны по отношению к К+ в присутствии10-7 М валиномицина или 10-9 М грами-цидина падает более чем в 10000 раз приградиенте концентраций КСl на мембране0,02 М.

Рис. 36.20. Структура грамицидина А.

36.14. Транспортные антибиотикифункционируют либо как подвижныепереносчики, либо как каналообразователиСуществует два совершенно разных меха-низма действия транспортных антибиоти-ков на проницаемость мембран для ионов(рис. 36.21). Некоторые антибиотики (на-пример, грамицидин А) формируют канал,пронизывающий мембрану. Ионы входятв такой канал на одной стороне мембраны,диффундируют по нему и выходят на дру-гой стороне мембраны. Стимуляция транс-порта ионов по этому механизму не сопря-жена с движением самого антибиотика-ка-налообразователя. Антибиотики другойгруппы (например, валиномицин) функцио-нируют как переносчики ионов через углево-дородную область мембраны. Активностьэтих транспортных антибиотиков сопряже-на с их собственной диффузией.

В эксперименте подвижные переносчикии каналообразователи можно различить сле-дующим образом. Измеряют температур-ную зависимость ионной проводимости ис-кусственной липидной двуслойной мем-

Рис. 36.21. Схематическое изображениеразличий между транспортны-ми антибиотиками-канало-образователями и подвижны-ми переносчиками. Все из-вестные транспортные белкипринадлежат к категории кана-лообразователей.


Рис. 36.22. Влияние температуры на про-водимость липидных дву-слойных мембран, одна из ко-торых содержит транспортныйантибиотик-каналообразова-тель, другая - транспортныйантибиотик, являющийся под-вижным переносчиком.

браны, содержащей транспортный антибио-тик. При этом берут температурный интер-вал, включающий температуру фазовогоперехода липида; в этом интервале углево-дородная середина мембраны переходит отпрактически затвердевшего состояния досовершенно жидкого. Каналообразователь,опосредуя транспорт ионов через мембрану,сам по себе не диффундирует. Следователь-но, застывание углеводородного слоя неокажет существенного влияния на его спо-собность транспортировать ионы. Иная си-туация складывается с подвижным перено-счиком ионов, который для проявленияактивности должен диффундировать сквозьуглеводородный слой мембраны: его эффек-тивность при затвердении углеводородногослоя должна значительно уменьшиться.Данные экспериментов с валиномициноми грамицидином А действительно выяв-ляют различие между двумя рассматри-ваемыми механизмами (рис. 36.22). Прони-цаемость содержащей валииомицин дву-слойной мембраны возрастает при ееразжижении более чем в 1000 раз. В то жевремя на транспортную активность грами-цидина А переход мембраны в жидкое со-стояние почти не оказывает влияния.

Важно подчеркнуть, что все известныев настоящее время природные системытранспорта представляют собой каналы.


Как уже обсуждалось выше (разд. 10.14),перемещение интегральных мембранныхбелков с одной поверхности мембраны надругую (поперечная диффузия) идет крайнемедленно либо вовсе отсутствует. Следова-тельно, они не могут служить подвижнымипереносчиками.

36.15. Антибиотики-переносчики имеютформу скорлупы ореха и связывают ионыв своей центральной полостиПо данным рентгеноструктурного анализаи спектроскопических исследований, анти-биотики - подвижные переносчики ионов -характеризуются определенной общностьюструктуры. Все исследованные к настояще-му времени переносчики по форме напо-минают скорлупу ореха. Единственныйсвязываемый ион металла образует коор-динационные связи с несколькими атомамикислорода, окружающими центральную по-лость. Число таких атомов кислорода(связывающих ион металла) обычно равно6 или 8. Периферическая часть структурыподвижного переносчика состоит из углево-дородных групп (рис. 36.23).

Функция центрально расположенных ато-мов кислорода, окруженных углеводо-родным наружным слоем, вполне очевидна.В самом деле, в водной среде ион металла,например К+, связывает через кислород не-сколько молекул воды. Антибиотик-перено-счик конкурирует с молекулой воды засвязывание иона, образуя с ним хелатное со-единение через несколько соответствующимобразом расположенных атомов кислородав центральной полости. Благодаря углево-дородной периферической части переносчи-

Рис. 36.23. Схематическое изображениехелатирования К+ атомамикислорода в транспортномантибиотике - подвижном пе-реносчике.

Рис. 36.24. Модели валиномицина (А)и его комплекса с К+ (Б). Присвязывании К+ происходит из-менение конформации анти-биотика. [Изображено в со-ответствии с атомнымикоординатами, любезно пред-оставленными д-ром W. Duax(для валиномицина) и д-ромL. Steinrauf (для комплексавалиномицин—К+).]

ка его комплекс с ионом растворим в липи-дах мембран. По существу, каталитическоедействие рассматриваемых антибиотиковна транспорт ионов через мембраны и со-стоит в том, что они переводят ионы в рас-творимую в липидах форму.

На рис. 36.24 показаны структуры вали-номицина и его комплекса с К+. Ион К+

координирован с шестью атомами кислоро-да, описывающими октаэдр вокруг цен-тральной полости молекулы. Эти атомыкислорода принадлежат карбонильнымгруппам шести остатков валина в антибио-тике. Метильные и изопропильные боковыецепи формируют углеводородную наруж-ную часть молекулы валиномицина.

Интересна также структура комплекса сК+ другого переносящего ионы антибиоти-ка, а именно нонактина (рис. 36.25). В этомкомплексе К+ связан с восемью атомамикислорода в центре молекулы. Четыре ато-ма кислорода из восьми принадлежат кар-боксильным группам, а остальные четы-ре - эфирным связям.

36.16. Валиномицин связывает К+ в 1000 разпрочнее, чем Na+

Каким образом соединения, транспорти-рующие ионы, различают такие сходныеионы, как Na+ и К + ? Валиномицин связы-вает К+ в 1000 раз прочнее, чем Na+, т.е. из-бирательность этого переносчика выше, чему (Na+ + К+)-АТРазы. Рассмотрим основустоль высокой избирательности. Как пока-зали спектроскопические исследования,комплексы валиномицина с Na+ и К+ оченьсходны по структуре. В частности, в обоихкомплексах одинаковы длины координа-ционных связей между катионом в центремолекулы и атомами кислорода. Почему жетогда К+ связывается намного прочнее, чемNa+? Причина этой избирательности в том,что К+ слабее, чем Na+, притягивает воду.Свободная энергия образования гидратнойоболочки для Na+ на 17 ккал/моль ниже,чем для К+ (табл. 36.2). Следовательно, ва-линомицин связывает К+ прочнее потому,что отделение воды от К+ требует менъ-

Таблица 36.2. Свойства щелочных катионов

Ион

Li+

Na+

К +

Rb+

Cs+

Порядковыйномерэлемента

311193755

Радиус иона,А

0,600,951,331,481,69

Свободнаяэнергиягидрата-ции,ккал/моль

-98-72-55-51-47


Рис. 36.25. Вид с двух сторон модели ком-плекса нонактина с К+.

шей затраты энергии, чем отделение Na+.Пока еще не проводилось исследования

атомарной структуры какого-либо ион-транспортирующего соединения, предпоч-тительно связывающего Na+, однако мож-но представить себе, каким должна бытьключевая особенность такой структуры. По-видимому, в ней должно отражаться ис-пользование того факта, что Na+ имеетменьший ионный радиус (r = 0,95 А), чемК+ (r = 1,33 А), благодаря чему отрицатель-но заряженные атомы кислорода могутв большей степени приблизиться к Na+, чемк К + ; таким путем может быть преодоленболее высокий энергетический барьер деги-дратирования Na+ но сравнению с К+. Сле-довательно, можно предсказать, что участ-ки специфического связывания Na+ должныобладать высокой плотностью отрицатель-ного заряда и такой геометрией, котораяпозволяла бы Na+ плотно входить в них. Вотличие от этого участки специфическогосвязывания К+ должны, по-видимому, обла-дать отрицательным зарядом меньшейплотности и их геометрия должна меньшеподходить для образования очень короткихсвязей между катионом и координирующи-ми группами.

Примечательна также гибкость молекулывалиномицина (рис. 36.24). Хелатирование


К+ представляет собой ступенчатый про-цесс, в ходе которого молекулы воды ги-дратной оболочки иона последовательновытесняются кислородными атомами анти-биотика. Новые связи формируются по мереразрыва старых, и потому активационныйбарьер для связывания иона оказываетсянизким. Аналогичным образом и энергияактивации противоположного процес-са - высвобождения иона - также низка.В итоге валиномицин присоединяет и выс-вобождает К+ множество раз на протяже-нии секунды. Важная роль гибкости струк-туры в этом случае так же очевидна, каки при действии ферментов.

36.17. Можно выявить поток ионовчерез единичный канал в мембранеПроводимость планарной двуслойной мем-браны, содержащей небольшое количествограмицидина А, не является постоянной.Как показал Денис Хейдон (Denis Haydon),проводимость этой мембраны для Na+ из-меняется во времени ступенчато (рис. 36.26).Эти ступени проведения иона определяютсяспонтанным открыванием и закрываниемобразованных грамицидином А каналов.Единичный канал остается открытым в те-чение примерно секунды. По такому каналулегко проходят одновалентные катионы, ноне анионы или двухвалентные катионы. Ока-залось, что по одному каналу в течение се-кунды мажет, пройти более 107 ионов. Такаяскорость транспорта только на один поря-док величины ниже скорости диффузии в чи-стой воде. В отличие от этого максимальнаяскорость транспорта, осуществляемого под-вижным переносчиком, составляет менее

Рис. 36.26. Ступенчатое изменение прово-димости липидной двуслойноймембраны, содержащей не-сколько молекул грамицидинаА. Минимальное увеличениепроводимости обусловлено по-явлением одного открытогоканала. (Печатается с любезно-го разрешения д-ра О. Ander-sen.)

103 ионов в 1 с, так как повороты и переме-щение подвижного переносчика в мембранезанимают не менее 1 мс.

Методами спектроскопии и дифракциирентгеновских лучей было показано, чтотрансмембранный канал образуется из двухмолекул грамицидина А (рис. 36.27). Внутримембраны обладающий свойством провод-ника спирализованный димер находитсяв равновесии с непроводящими мономера-ми. По существу, ступенчатое изменениепроводимости на рис. 36.26 соответствуетпроцессу образования и диссоциации диме-ров. Димер формирует обводненный каналдиаметром 4 А, окруженный полярнымигруппами пептидов. Гидрофобные боковыецепи располагаются на периферии каналаи контактируют с углеводородными цепямифосфолипидов мембраны. Окружающие во-дную пору карбоксильные группы в каналеобразуют кратковременные координа-ционные связи с катионом в момент егопрохождения по каналу. Как показал рент-геноструктурный анализ, связавший ка-тионы канал становится короче и шире; этоеще раз подчеркивает динамическую приро-ду молекул, обладающих транспортнойфункцией.

Рис. 36.27. Схематическое изображениеканала из грамицидина А. Ка-нал образуется путем связыва-ния N-формильных концовдвух полипептидов. Каждаяцепь скручивается в β-спираль,похожую на свернутый в рулонβ-складчатый слой. Изобра-женная модель была предложе-на Деном Ури (Dan Urry).[Weinstein S., Wallace В. А.,Blout E. R., Morrow J. S.,Veatch W., Proc. Nat. Acad. Sci.,76, 4230 (1979).]


Рис. 36.28. Электронная микрофотогра-фия изолированных листковмежклеточных щелевых соеди-нений. Цилиндрические кон-нексоны образуют гексаго-нальную решетку с ребромячейки 85 А. Диаметр интенсив-но окрашенной полости в цен-тре - около 20 А. (Печатаетсяс любезного разрешения д-раN. Unwin и д-ра G. Zampighi.)

36.18. Через щелевые соединения ионыи небольшие молекулы перетекаютиз клетки в клеткуБольшие водные каналы, через которыепроисходит пассивный транспорт, свой-ственны многим биологическим мембранампрокариот и эукариот. Так, в наружной мем-бране грам-отрицательных бактерийимеются каналы, образованные порином —трансмембранным белком массой 37 кДа(разд. 32.14). По этим каналам диаметром10 А легко проникают в периплазматиче-ское пространство полярные молекулы мас-сой, не превышающей примерно 600 Да. Да-лее эти молекулы транспортируютсяв цитозоль посредством симпорта, трансло-кации групп или иных пермеаз. Подобнымже образом в наружных мембранах мито-хондрий и хлоропластов имеются большиеводные каналы, образованные из анало-гичных порину молекул.

Наиболее хорошо изученным типом во-дного канала у эукариот является щелевоесоединение (щелевой контакт), называемое


также межклеточным каналом, посколькуон служит протоком между внутренним со-держимым многих смежных клеток. Ще-левые соединения, открытые Жан-ПолемРевелем и Морисом Карновским (Jean-Paul,Revel, Morris Karnovsky), располагаютсяскопом (кластерами) в определенных участ-ках плазматических мембран прилежащихдруг к другу клеток. На электронных микро-фотографиях листков щелевых соединений(рис. 36.28) можно видеть, что каждое со-единение образовано шестью субъединица-ми, окружающими пору диаметром15-20 А. На тангенциальном срезе(рис. 36.29) видно, что эти гексамеры про-низывают промежуток (щель) между сопри-касающимися клетками (отсюда и назва-ние - щелевое соединение). Для определениявнутреннего размера щелевых соединенийпроизводили микроинъекцию ряда флуорес-цирующих веществ в одни клетки и затемнаблюдали, как распространяется флуорес-ценция по соседним клеткам. По даннымВернера Лёвенштейна (Werner Loewenstein),все полярные вещества массой до 1 кДа лег-ко проходят по межклеточным каналам.Другими словами, по щелевым соединениямиз одной клетки в другую могут поступатьнеорганические ионы и большинство метабо-литов (сахара, аминокислоты, нуклеотиды).Что касается белков, нуклеиновых кислоти полисахаридов, то из-за своих большихразмеров они не проходят по этим каналам.

Щелевые соединения играют важную рольв межклеточной коммуникации. В ряде воз-будимых тканей, например в сердечной мы-шце, клетки объединены в единую системубыстрым потоком ионов через эти соедине-ния; таким путем достигается быстрыйи синхронный ответ на стимуляцию. Через

Рис. 36.29. Электронная микрофотогра-фия тангенциального среза ще-левых соединений между при-лежащими клеточными мем-бранами. [Hertzberg E. L., Gi-lula N. В., J. Biol. Chem., 254.2143 (1979).]

щелевые контакты происходит также пита-ние клеток, удаленных от кровеносных сосу-дов, например в костях или хрусталике гла-за. Представляется вероятным, что рассма-триваемые каналы коммуникации имеютважное значение в регуляции процессов раз-вития и дифференцировки.

Проницаемость щелевых контактов регу-лируется ионами кальция. Повышение вну-триклеточного содержания Са2+ приводитк тому, что щелевой контакт в той илииной мере закрывается. Межклеточные ка-налы полностью открыты при концентра-ции Са2+ ниже 10-7 М и полностью закры-ваются при концентрации Са2+ , превышаю-щей 5•10-5 М. Увеличение содержанияСа2+ в указанном диапазоне приводитк сужению просвета межклеточных каналов,причем в первую очередь снижается прони-цаемость для более крупных молекул.Структурная основа таких изменений про-света каналов была выявлена при анализереконструированных трехмерных изображе-ний полей щелевых контактов, взятыхв двух различающихся по четвертичнойструктуре состояниях. Эти структурные ис-следования показали, что щелевой контактсостоит из двух смыкающихся цилиндриче-ских единиц, названных коннексонами.Каждый коннексон образован шестьюсубъединицами, имеет длину 75 А и на-сквозь пронизывает плазматическую мем-брану. Сегмент коннексока длиной 20 А вы-

ступает во внеклеточное пространствои соединяется с коннексоном прилежащейклетки. Длинная ось каждой из субъединицконнексона имеет наклон по отношениюк поперечной оси мембраны. Путем сколь-жения субъединиц относительно друг другапроисходит уменьшение их наклона к попе-речной оси мембраны, и канал при этом за-крывается (рис. 36.31). Самые большие кон-формационные изменения имеют местов середине канала, где субъединицы двухстыкующихся коннексонов скользят относи-тельно друг друга на расстояние примерно11 А, что соответствует повороту на 28o.Анализ высокой степени разрешения позво-лит в дальнейшем выявить, каким образомСа2+ индуцирует скольжение и поворот.

Рис. 36.30. Схематическое изображениещелевого контакта.


Рис. 36.31. Модель регуляции ионамиСа2+ степени закрывания ще-левого соединения. (По рисун-ку, любезно предоставленномуд-ром N. Unwin и д-ромG. Zampighi.)

ЗаключениеТранспорт молекул и ионов через биологи-ческие мембраны осуществляется транс-мембранно ориентированными белками, ко-торые формируют каналы. Транспортявляется пассивным, если ΔG для транспор-тируемого компонента отрицательно; в слу-чае активного транспорта величина ΔG по-ложительна. Изменения свободной энергиизависят от соотношения концентрацийтранспортируемого компонента по двумсторонам мембраны и от мембранного по-тенциала, если мембрана заряжена. Ак-тивный транспорт требует вклада свобод-ной энергии. Наиболее распространеннаясистема транспорта в животныхклетках - (Na+ + K+)-насос, который выво-дит из клетки три иона Na+ и насасываетв клетку два иона К+ за счет энергии гидро-лиза одной молекулы АТР. В присутствииNa+ ATP фосфорилирует аспартатную бо-ковую цепь в α-субъединице этого фермен-тативного комплекса с субъединичнымсоставом α2β2. Образовавшееся фосфори-лированное промежуточное соединение ги-дролизуется в присутствии К+. Эту послед-нюю реакцию подавляют кардиотоническиестероиды (например, дигиталис), являющие-ся высокоспецифичными ингибиторами(Na+ + К+)-насоса. В результате цикла кон-формационных изменений, обусловленныхфосфорилированием и дефосфорилирова-нием, происходит перенос ионов Na+ и К+.Транспорт ионов кальция, играющих важ-ную роль в регуляции мышечного сокраще-


ния, осуществляется иной АТРазной систе-мой, локализованной в мембране сарко-плазматического ретикулума. Однако ив этом случае процесс транспорта сопряженс фосфорилированием остатка аспартата.Обе системы транспорта - как Са2+, так и(Na+ + К + ) - удалось реконструировать изсоответствующих очищенных АТРаз и фос-фолипидов.

Для ряда транспортных систем непосред-ственным источником энергии служит не ги-дролиз АТР, а градиент концентрации ио-нов. Так, активный транспорт глюкозыи аминокислот в ряде животных клеток со-пряжен с одновременным входом Na + ; та-кой процесс называется котранспортом.Одновременный вход Na+ и глюкозы обес-печивается специфическим симпортом.(Na+ + К+)-насос создает тот градиент кон-центрации ионов Na+ , который необходимдля сопряженного входа Na+ и глюкозы.У бактерий, как правило, непосредственнымисточником энергии для симпортов и анти-портов служит градиент концентрации Н+,а не Na+. Например, активный транспортлактозы, осуществляемый пермеазой длялактозы, сопряжен с входом протона в бак-териальную клетку. Этот транспортныйпроцесс протекает за счет протонодвижу-щей силы, генерируемой переносом элек-тронов по дыхательной цепи. Бактериямсвойствен и иной тип транспорта, а именнотак называемая транслокация групп; в этомслучае происходит модификация растворен-ного вещества в процессе переноса. Так,фосфотрансферазная система, переносящаясахара, фосфорилирует их (например, глю-козу в глюкозо-6-фосфат) по мере поступле-ния в клетку. Донором фосфорильнойгруппы в этом процессе служит фосфоенол-пируват. Фосфорилирование опосредованотремя разными ферментами и небольшимбелком (HPr) - переносчиком фосфорильнойгруппы.

Клетки прокариот и эукариот содержаттакже наполненные водой каналы, по ко-торым ионы и небольшие полярные моле-кулы могут пассивно диффундироватьсквозь мембраны. Например, в наружныхмембранах грам-отрицательных бактерийимеются пориновые каналы диаметромоколо 10 А. Между соприкасающимисяклетками высших организмов во многихслучаях имеются щелевые соединения. Поэтим каналам диаметром 20 А ионы и боль-шинство метаболитов (например, моносаха-риды, аминокислоты и нуклеотиды) могут

перетекать из одной клетки в другую. Ще-левые соединения закрываются под дей-ствием Са2+. Эти протоки между соприка-сающимися клетками играют важную рольв межклеточной коммуникации.

Транспортные антибиотики повышаютпроницаемость мембран для определенныхионов, функционируя в качестве подвижныхпереносчиков (например, валиномицин) ли-бо каналообразователей (например, грами-

цидин А). Молекула антибиотика подвижно-го переносчика, имеющая форму скорлупыореха, связывает в центральной полостиодин ион металла. Благодаря углеводород-ной периферической части весь комплексспособен проходить сквозь внутреннийуглеводородный слой мембраны. Кана-лообразующие антибиотики формируютпронизывающие мембрану водные по-ры.


С чего начатьHobbs A.S., Alberts R.W., 1980. Thestructure of proteins involved in activemembrane transport, Ann. Rev. Biop-hys. Bioeng., 9, 259-291.

Wilson D.В., 1978. Cellular transportmechanisms, Ann. Rev. Biochem., 47,933-965.Harold F.M., 1978. Vectorial meta-bolism. In: Ornston L.N. and So-katch J.R. (eds.), The Bacteria, vol. 6,pp. 463-521, Academic Press.Saier M.H., Jr., 1979. The role of thecell surface in regulating the internalenvironment. In: Sokatch J.R. Orn-ston L.N. (eds.), The Bacteria, vol. 7, pp.167-227, Academic Press.Estes J.W., White P.D., 1965. WilliamWithering and the purple foxglove, Sci.Amer., 212(6), 110-117. (Любопытноеописание истории открытия и ис-пользования дигиталиса.)

КнигиAndreoli Т.E., Hoffman J.F., Fane-stil D.D. (eds.), 1978. Physiology ofMembrane Disorders, Plenum. (Содер-жит прекрасные статьи, касающиесямногих аспектов мембранного транс-порта.)Rosen В.P. (ed.), 1978. BacterialTransport, Dekker.

Транспорт ионов Na+ и К+

Skou J.C., Norby J.G., (eds.), 1979. Na,K-ATPase: Structure and Kinetics,Academic Press,Fishman M.C., 1979. Endogenousdigitalis-like activity in mammalianbrain, Proc. Nat. Acad. Sci., 76,4661-4663.Sweadner K.J., Goldin S.M., 1980.Active transport of sodium andpotassium ions: mechanism, function,and regulation, New Engl. J. Med., 302,777-783.

Cantley L.C., Jr., Resh M.D., Guidot-ti G., 1978. Vanadate inhibits the redcell (Na+, K+)-ATPase from thecytoplasmic side, Nature, 272, 552-554.Akera Т., 1977. Membrane adenosi-netriphosphatase: a digitalis receptor?Science, 198, 569-574. (Обзор данных,показывающих, что (Na+ ++ К+)-АТРаза является мишенью

фармакологического действия диги-талиса.)Jardetzky О., 1966. Simple allostericmodel for membrane pumps, Nature,211, 969.

Транспорт ионов кальцияDeMeis L., Vianna A.L., 1979. Energyinterconversion by the Ca2+-dependentATPase of the sarcoplasmic reticulum,Ann. Rev. Biochem., 48, 275-292.MacLennan D.H., Campbell K.P., 1979.Structure, function, and biosynthesis ofsarcoplasmic reticulum proteins, TrendsBiochem. Sci., 4, 148-151.Tada M., Yamamoto Т., Tonomura Y.,1978. Molecular mechanism of activecalcium transport by sarcoplasmicreticulum, Physiol. Rev., 58, 1-79.Racker E., 1972. Reconstitution ofa calcium pump with phospholipids anda purified Ca2+-adenosine triphos-phatase from sarcoplasmic reticulum, J.Biol. Chem., 247, 8198-8200.Wasserman R.H., Fullmer C.S., Tay-lor A.N., 1978. The vitamin D-depen-dent calcium binding proteins. In:Lawson D. E. M. (ed.), Vitamin D,Academic Press.Kretsinger R.H., 1976. Calcium-bindingproteins, Ann. Rev. Biochem., 45,239-266.

Система транспорта у бактерийKaback H.R., Ramos S., Robert-son D.E., Stroobant P., Tokuda H.,1977. Energetics and molecular biologyof active transport in bacterial mem-brane vesicles, J. Supramol. Struc., 7,443-461.

Saier M.H., Jr., 1977. Bacterial phos-phoenolpyruvate sugar phosphotran-sferase systems: structural, functional,and evolutionary interrelationships,Bacteriol. Rev, 41, 856-871.Simoni R.D., Postma P.W., 1975. Theenergetics of bacterial active transport,Ann. Rev. Biochem., 44, 523-554.

Каналы между клеткамиLoewenstein W.R., Kanno Y.,Socolar S.J., 1978. The cell-to-cell chan-nel, Fed. Proc., 37, 2645-2650.Unwin P.N.T., Zampighi G., 1980.Structure of the junction betweencommunicating cells, Nature, 283,545-549.Hertzberg E.L., Gilula N.B., 1979.Isolation and characterization of gapjunctions from rat liver, J. Biol. Chem,254, 2138-2147.Staehelin L.A., Hull B.E., 1978. Junc-tions between living cells, Sci. Amer,238(5), 140-152.

Транспортные антибиотикиUrban В.W., Hladky S.B., HaydonD.A., 1978. The kinetics of ionmovements in the gramicidin channel,Fed. Proc., 37, 2628-2632.Ovchinnikov Y.A., 1979. Physico-che-mical basis of ion transport throughbiological membranes: ionophores andion channels, Eur. J. Biochem., 94,321-336.Lauger P., 1972. Carrier-mediated iontransport, Science, 178, 24-30.Krasne S., Eisenman G., Szabo G., 1971.Freezing and melting of lipid bilayersand the mode of action of nonactin,valinomycin, and gramicidin, Science,174, 412-415.Koeppe R.E., Berg J.M., Hodg-son K.O., Stryer L., 1979. GramicidinA crystals contain two cation bind-ing sites per channel, Nature, 279,723-725.

ГЛАВА 37

Возбудимые мембраны исенсорные системы

Мембраны многих клеток способны возбу-ждаться под действием специфических хи-мических или физических стимулов. Ответымембраны аксона нервной клетки на элек-трический стимул, синапса на выделение ме-диатора, палочек сетчатки на свет, под-вижных клеток на молекулы аттрактан-тов - все это реакции, опосредованные воз-будимыми комплексами, присутствующимив мембранах. Эти и другие процессы, опо-средованные возбудимыми комплексами,имеют следующие общие особенности.

1. Стимул воспринимается высокоспеци-фичным белком-рецептором, которыйявляется интегральным компонентом возбу-димой мембраны.

2. Специфический стимул вызывает изме-нение конформации рецептора, что в своюочередь приводит к изменению проницае-мости мембраны или активности связанно-го с мембраной фермента. При этом во мно-гих случаях происходит многократное уси-ление ответа на специфические стимулы.

3. Как конформационный сдвиг, таки возникающие в результате функцио-нальные изменения рецептора обратимы.Существуют специальные механизмы, воз-вращающие рецептор в состояние покояи восстанавливающие его возбудимость.

В этой главе мы рассмотрим четыре типавозбудимых комплексов, начав с натриевогоканала в мембранах аксонов нервных кле-ток; этот зависимый от потенциала каналучаствует в возникновении потенциала дей-ствия в нервах. Далее мы обратимся к хими-чески регулируемому каналу и рассмотрим,


как рецепторы ацетилхолина обеспечиваютпроведение нервного импульса в опреде-ленных синапсах. Затем перейдем к палоч-кам сетчатки глаза - исключительно чув-ствительному детектору света. При этом мыпознакомимся с ролью фоторецепторногобелка родопсина в преобразовании светав нервный сигнал. Последняя тема даннойглавы - хемотаксис, т. е. движение клеток понаправлению к веществам-аттрактантами от веществ-репеллентов. В последние годыполучено много новых сведений относи-тельно сопряжения хеморецепторов с двига-тельным аппаратом у бактерий.

37.1. Потенциалы действия опосредованыкратковременными изменениямипроницаемости для Na+ и К+

Нервные импульсы представляют собойэлектрические сигналы, создаваемые токомионов через плазматическую мембрану ней-ронов. В нейроне, как и в большинстве кле-ток, К+ содержится в высокой концентра-ции, a Na+ - в низкой. Градиенты концен-трации этих ионов генерируются (Na+ +

Рис. 37.1. Электронная микрофотогра-фия синапса. (Печатается с лю-безного разрешения д-раU. Jack McMahan.)

+ К+)-насосом (разд. 36.2). В состояниипокоя проницаемость мембраны нервнойклетки для К+ гораздо выше, чем проницае-мость для Na+, и поэтому мембранный по-тенциал определяется главным образом от-ношением внутриклеточной концентрацииК+ к внеклеточной (рис. 37.2, А). В нестиму-лированных аксонах мембранный потен-циал составляет -60 мВ; это близко квеличине -75 мВ (равновесный К+-потен-циал), которая соответствует проницае-мости мембраны для одних только ионовК+. Нервный импульс, или потенциал дей-ствия, возникает при деполяризации мем-браны, выходящей за пределы выше порого-вого уровня (а именно с —60 до —40 мВ).За несколько миллисекунд мембранный по-тенциал становится положительным и до-стигает примерно +30 мВ, после чеговновь делается отрицательным. Эта усилен-ная в несколько раз деполяризация распро-страняется по нерву, достигая нервногоокончания. В раскрытии природы потенциа-ла действия важную роль сыграло изучениегигантского аксона кальмара. Посколькув этот необычайно крупный аксон (диаме-тром около миллиметра) нетрудно ввестиэлектроды, он стал излюбленным объектомисследователей.

Каков механизм возникновения потен-циала действия? Ален Ходжкин и ЭндрьюХаксли (Alan Hodgkin, Andrew Huxley) про-вели остроумные исследования, показав-шие, что потенциал действия возникает в ре-зультате сильных кратковременных измене-ний проницаемости мембраны аксона дляионов Na+ и К+ (рис. 37.2, Б). Сначала ме-няется проницаемость мембраны для Na+.Деполяризация мембраны выше порогово-го уровня приводит к открытиюNa+-каналов. В силу существования высо-кого трансмембранного электрохимическо-го градиента концентрации Na+ ионынатрия начинают входить в клетку. ВходNa+ усиливает деполяризацию мембраныи способствует тому, что открывается ещебольшее число Na+-каналов. Эта положи-тельная обратная связь между деполяриза-цией и входом Na+ приводит к очень бы-стрым и очень большим по величинеизменениям мембранного потенциала: от—60 до +30 мВ за одну миллисекунду.Вход прекращается при достижении при-мерно +30 мВ, так как это значение со-ответствует равновесному Na+-потенциалу.Другими словами, по достижении этого по-тенциала исчезает та термодинамическая

Рис. 37.2. Потенциал действия возникаетв результате деполяризациимембраны аксона нервнойклетки. Показано изменение вовремени мембранного потен-циала (А) и проводимости ио-нов натрия и калия (Б).

движущая сила, за счет которой происходилвход Na+. Na+-каналы спонтанно закры-ваются, и к этому времени начинают откры-ваться К+-каналы (рис. 37.2, Б). В результа-те ионы калия входят в клетку, и мем-бранный потенциал вновь становится отри-цательным. Примерно через две миллисе-кунды мембранный потенциал становитсяравным —75 мВ, т. е. равновесному К+-по-тенциалу. Уровень покоя —60 мВ вос-станавливается еще через несколько милли-секунд, когда проводимость К+ снижаетсядо величины, характеризующей нестимули-рованное состояние. Необходимо подчерк-нуть, что во время потенциала действия че-рез плазматическую мембрану проходиточень малое количество ионов Na+ иК+ - примерно одна миллионная часть отсодержания этих ионов в нервной клетке.Другими словами, при одном нервном им-пульсе расходуется лишь ничтожно малаячасть (Na+-K+)-градиента. Из этого яв-ствует, насколько эффективен потенциал

37. Возбудимые мембраныи сенсорные системы 327

Рис. 37.3. Избирательность натриевогоканала в отношении ионов ча-стично определяется стериче-скими факторами. Ионы Na+ иLi+ вместе с присоединеннойк ним молекулой воды, так жекак гидроксиламин и гидразин,соответствуют размерам кана-ла. В отличие от этого К+

с присоединенной молекулойводы оказывается слишкомбольшим для канала.(Keynes R. D., Ion-channels inthe nerve-cell membrane,Scientific American, Inc., 1979.)

действия как средство сигнализации набольшие расстояния.

Na+-канал проводит Na+ в 11 раз лучше,чем К + . Как достигается такая избиратель-ность? Окончательный ответ на этот вопросбудет получен только после анализа струк-туры канала при высоком разрешении. Од-нако электрофизиологические исследованияотносительной проницаемости канала дляразличных щелочных катионов и органиче-ских катионов все же дают определенныйключ к решению данного вопроса. Зависи-мость проницаемости от размера иона(табл. 37.1) указывает на то, что канал узок:через него не проходят ионы, диаметр ко-торых превышает 5 А. Однако проводи-мость определяется не только размерами.Так, метиламин (H3CNH3

+) имеет почти та-кие же размеры, как гидразин (H 2NNH 3

+)и гидроксиламин (HONH3

+), но при этом не-сравненно хуже проходит через канал. При-чина, по всей вероятности, кроется в том,что метильная группа метиламина в отли-чие от аминогруппы гидразина или гидрок-


сильной группы гидроксиламина не обра-зует водородной связи с кислородныматомом канала. В результате метиламин непроходит по каналу. Обнаружен еше одинважный факт: проводимость Na+-каналав отношении всех проникающих катионовзначительно уменьшается при снижении рН.По существу, относительная проницаемостьсоответствует кривой титрования кислотыс рK 5,2, что указывает на присутствие отри-цательно заряженного карбоксилат-ионав активной форме канала. Таким образом,избирательность Nа+-канала в отношенииNa+ обусловлена наличием отрицательнозаряженного участка с малым радиусом.Ион К+ , будучи крупнее, чем Na + , практи-чески не может пройти через эту область(рис. 37.3).

37.2. Тетродотоксин и сакситоксинблокируют натриевые каналы в мембранахаксонов нервных клетокТетродотоксин - сильнодействующий ядрыбы иглобрюха - блокирует проведениенервных импульсов вдоль аксона и в возбу-димых мембранах нервных волокон, что вы-зывает паралич дыхания. Летальная дозадля мыши составляет около 0,01 мкг. В свя-

Таблица 37.1. Относительная проницаемость натриевогои калиевого каналов в мембранах аксонов

Ион

Li+

Na+

К+

Rb+

Cs+

NH4

+

HONH3

+

H 2 NNH 3

+

H 3CNH 3

+

Na+-канал

0,931,000,09

<0,01<0,01

0,160,940,59

<0,01

K+ -канал

<0,01<0,01

1,000,91

<0,080,13

<0,03<0,03<0,02

Рис. 37.4. Блокаторы Na+-канала.

зи с высокой специфичностью действия те-тродотоксин с успехом используется приэкспериментальных исследованиях. Он

Иглобрюх, считающийся в Япо-нии деликатесом.

очень прочно (К 10-9 М) связывается сNa+-каналом и блокирует поток ионов на-трия, не влияя при этом на К+-канал. Та-ким же действием обладает и сакситоксин,вырабатываемый одним из морских дино-флагеллят. Моллюски, питающиеся дино-флагеллятами, в особенности съедобныедвустворчатые моллюски и мидии, тожестановятся ядовитыми. Так, одна мелкаямидия может содержать сакситоксин в дозе,достаточной чтобы убить 50 человек! Об-щая структурная особенность тетродотокс-ина и сакситоксина - наличие гуанидиновойгруппы (рис. 37.4). Эта положительно заря-женная группа токсина взаимодействуетс отрицательно заряженным карбоксилат-ионом в устье канала на внеклеточной сто-роне мембраны. В сущности, эти токсиныявляются конкурентными ингибиторамиNa+.

Тетродотоксин и сакситоксины в силусвоей специфичности и высокого сродства кNa+-каналу оказались ценнейшими сред-ствами анализа. Так, измерением связыва-

ния меченого тетродотоксина с высокойудельной радиоактивностью определялиплотность Nа + -каналов в различных возбу-димых мембранах. Немиелинизированныенервные волокна, которые лишены изоля-ционного слоя миелина, обычно характери-зуются низкой плотностью Na+-ка-налов - порядка 20 на 1 мкм2. В мембранахтаких аксонов Na+-каналы отделены другот друга расстоянием 2000 А. Что касаетсямиелинизированных нервных волокон, тов специфических участках, называемых пере-хватами Ранвье, плотность Na+-каналов, на-против, достигает очень высоких значе-ний - порядка 104 на 1 мкм2. ПерехватыРанвье, расположенные на аксоне с интерва-лом 2 мм,- это единственные участки, в ко-торых мембрана аксона миелинизированно-го нерва соприкасается с внеклеточнойжидкостью. Участки мембраны между пере-хватами Ранвье содержат очень мало кана-лов и не участвуют в проведении. Потен-циал действия перескакивает от перехватак перехвату, вследствие чего импульс прово-дится быстрее и эффективнее, чем в немие-линизированном волокне. Наличие 104 ка-налов на 1 мкм2 в перехвате Ранвье озна-чает, что значительная часть поверхностимембраны в этой области занятаNа+-каналами.

Специфичность связывания тетродоток-сина с Na+-каналами была использованатакже при их выделении и очистке. Для это-го интегральные мембранные белки возбу-димых мембран солюбилизировали с по-мощью детергента, после чего разделяли наионообмсннике. Связывание тетродоток-сина с солюбилизированным Na+-каналомпозволило количественно определять каналв процессе очистки. Выделенный таким пу-тем Na+-канал оказался белком массой230 кДа, состоящим из субъединиц раз-личных типов. Сложность устройства


Рис. 37.5. Электронная микрофотогра-фия миелинизированного аксо-на из спинного мозга. Миели-новая оболочка аксона («оберт-ка», образованная многочис-ленными слоями мембран) вы-полняет роль изолятора. Ско-рость проведения в миелинизи-рованных нервах намного вы-ше, чем в лишенных миелино-вой оболочки нервах того жедиаметра. (Печатается с любез-ного разрешения д-ра CedricRaine.)

Na+-канала частично обусловлена, видимо,тем, что он является не только высокоизби-рательной порой в мембране, но и содержитструктуру, воспринимающую напряжение(сенсор напряжения). Заряженные группыэтой структуры реагируют на изменениемембранного потенциала во время потен-циала действия и передают информацию нату часть канала, которая составляет порув мембране. Действительно, до начала пото-ка натрия через мембрану выявляется потокчерез канал (так называемый воротный ток),обусловленный движением заряженныхгрупп в белке.

37.3. Ацетилхолин является нейро-медиаторомВзаимодействие между нервными клеткамиосуществляется в местах их соединения, на-


зываемых синапсами (рис. 37.6). Нервныеимпульсы передаются через большинствосинапсов с помощью химических нейроме-диаторов - небольших легко диффундирую-щих веществ, например ацетилхолина илинорадреналина. Ацетилхолин служит такжемедиатором в двигательных концевых пла-стинках (нервно-мышечных соединениях),являющихся участками контактов междунервом и поперечнополосатой мышцей.Пресинаптическая мембрана холинергиче-ского синапса (т. е. синапса, в котором в каче-стве нейромедиатора используется ацетил-холин) отделена от постсинаптической мем-браны так называемой синаптическойщелью шириной около 500 А. Окончаниепресинаптического аксона наполнено синап-тическими пузырьками (везикулами), содер-жащими ацетилхолин. Пришедший к синап-су нервный импульс вызывает высвобожде-ние ацетилхолина в синаптическую шель.Далее молекулы ацетилхолина диффунди-руют через щель и достигают постси-наптической мембраны, где связываются соспецифическими рецепторными молекула-ми. Это приводит к деполяризации постси-наптической мембраны, и далее волна депо-ляризации распространяется вдоль электри-чески возбудимой мембраны второй нерв-ной клетки. Ацетилхолин гидролизуетсяацетилхолинэстеразой, и постсинаптическаямембрана поляризуется вновь.Ацетилхолин синтезируется вблизи пре-синаптического окончания аксона путемпереноса ацетильной группы от ацетил-СоА

Рис. 37.6. Схематическое изображениехолинергического синапса.

на холин. Фермент, катализирующий эту ре-акцию,- холин-ацетилтрансфераза (холин-ацетилаза). Далее часть образовавшегосяацетилхолина попадает в синаптическиепузырьки, а часть остается в цитозоле.В одном холинергическом синаптическомпузырьке (обычно 400 А диаметром) содер-жится около 10000 молекул ацетилхолина.

Изучению синаптической функции значи-тельно способствовало выделение синапто-сом из гомогената нервной ткани. Синапто-сомы представляют собой пресинаптиче-ские окончания, образующие в процессевыделения замкнутые структуры. Они пред-ставляют собой мешочки из пресинаптиче-ской мембраны, содержащей митохондрии,цитозоль и синаптические пузырьки.

37.4. Ацетилхолин открываетв постсинаптической мембране каналыдля катионовПотенциал покоя постсинаптической мем-браны или мембраны двигательной конце-вой пластинки составляет примерно ——75 мВ. При взаимодействии ацетилхо-

лина со специфическими рецепторами про-исходит резкое изменение проницаемостиэтих мембран (рис. 37.7). В течение 0,1 мсзначительно возрастает проводимость какNa+, так и К+, и возникает сильный токNa+ внутрь клетки и более слабый ток К+

из клетки. Ток Na+ в клетку приводит к де-поляризации постсинаптической мембраныи инициирует возникновение потенциаладействия в соседнем (постсинаптическом)нейроне или мышечном волокне. Ацетилхо-лин раскрывает катионные каналы толькоодного типа, характеризующиеся почти оди-наковой проницаемостью для Na+ и К+. Ес-ли поток Na+ при действии ацетилхолинаоказывается большим, чем поток К+, то этообусловлено лишь большей крутизной элек-

трохимического градиента концентрацииNa+ по сравнению с К+.

Две молекулы ацетилхолина связываютсяс молекулой рецептора, вызывая при этомтакие изменения конформации, которые от-крывают канал. Схематически кинетикупроцесса, согласующуюся с эксперимен-тальными данными, можно описать уравне-нием

где А - молекула ацетилхолина, R - закры-тый канал, R* - открытый канал. За полупе-риод жизни открытого канала, равный всеголишь 1 мс, по нему проходит примерно 104

ионов. Продолжительное воздействие аце-тилхолина на рецептор приводит к его де-сенсибилизации: канал закрывается и реак-ция на ацетилхолин исчезает на длительныйпромежуток времени.

37.5. Ацетилхолин высвобождаетсяквантамиПроведенное Бернардом Катцем (BernardKatz) изучение передачи нервного импульса

Рис. 37.7. Ацетилхолин деполяризуетпостсинаптическую мембранупутем увеличения Na+ и К+

проводимости.


Рис. 37.8. Генерирование напряженияв электрической пластинкеэлектрического угря.

в участках нервно-мышечного соединенияпоказало, что ацетилхолин высвобождаетсяиз пресинаптической мембраны порциямипо 104 молекул. Доказательство квантовоговысвобождения ацетилхолина было получе-но при анализе мембранного потенциаладвигательных концевых пластинок, ко-торым свойственна спонтанная электриче-ская активность даже в отсутствие стимуля-ции нерва. Деполяризующие импульсыс амплитудой 0,5 мВ и длительность около20 мс возникают залпами. Это так назы-ваемые миниатюрные потенциалы концевыхпластинок; они возникают случайно с ве-роятностью, сохраняющейся постоянной напротяжении длительного времени. Миниа-тюрный потенциал концевой пластинки вы-зывается спонтанным высвобождением оди-ночного синаптического пузырька. Полнаядеполяризация концевой пластинки, созда-ваемая потенциалом действия, обусловленасинхронным высвобождением примерно 100«квантов» («пакетов») ацетилхолина за бо-лее короткое время чем 1 мс. Числовысвобождающихся квантов ацетилхолиназависит от потенциала действия пресинап-тической мембраны. Другими словами, выс-вобождение ацетилхолина представляет со-бой электрически регулируемую форму се-креции. Высвобождение ацетилхолина зави-сит от присутствия Са2+ во внеклеточнойжидкости. При деполяризации пресинапти-ческой мембраны происходит вход Са2+,


что способствует слиянию на короткий срокмембраны синаптических пузырьков с пре-синаптической мембраной.

37.6. При добавлении ацетилхолинареконструированные мембранные пузырькистановятся проницаемыми для катионовВ последние годы сделаны большие успехив очистке ацетилхолиновых рецепторови реконструировании функционально ак-тивных мембранных пузырьков. Наиболееподходящий исходный материал для такихисследований - электрический орган элек-трической рыбы, например Torpedo (элек-трический скат), который очень богат холи-нергическими постсинаптическими мембра-нами. Электрический орган образован изколонок клеток, называемых электрически-ми пластинками. Одна сторона клеток (ин-нервируемая поверхность) снабжена нерв-ными окончаниями и электрически возбуди-ма. Другая сторона (неиннервируемая по-верхность) образует многочисленные склад-

Electrophorus electricus, амери-канский электрический угорь.

ки и электрически невозбудима. Разностьпотенциалов, возникающая при стимуляцииэлектрических пластинок, обусловленаасимметрией ответа двух поверхностей.У такой электрической рыбы, как Electropho-rus, мембранный потенциал иннервируемойповерхности при возбуждении сдвигается с—90 до +60 мВ, тогда как на неиннерви-

руемой поверхности сохраняется —90 мВ.Следовательно, в пик потенциала действияразность потенциалов между наружными

Рис. 37.9. Трехмерная структура нейро-токсина, блокирующего рецеп-тор ацетилхолина. Этот нейро-токсин вырабатывается у мор-ских змей. (Печатается с любез-ного разрешения д-раDemetrius Tsernoglou и д-раGregory Petsko.)

поверхностями двух сторон составляет150 мВ (рис. 37.8). Электрические пластинкиэлектрического органа соединены парал-лельно, и, следовательно, их разность потен-циалов складывается. Орган, состоящий из5000 рядов электрических пластинок, может,таким образом, генерировать разрядв 750 В. Интересно отметить, что электриче-ские пластинки электрического угря эволю-ционно возникли из мышечных клеток. Приэтом они сохранили электрически возбуди-мую наружную мембрану мышцы, но утра-тили аппарат сокращения. Электрическийорган Electrophorus - великолепный источ-ник Na+-каналов.

Еще один экзотический биологическийматериал оказался бесценным источникомацетилхолиновых рецепторов. Для того,чтобы идентифицировать рецептор в смесимакромолекул, его необходимо специфиче-ски пометить. Для этого используют нейро-токсины змей, в частности α-бунгароток-син из яда одной змеи с о. Тайваньи кобратоксин (из яда кобры). Указанныенейротоксины блокируют нейромышечноепроведение, связываясь с рецепторами аце-тилхолина на двигательных концевых пла-

стинках или на иннервируемой поверхностиэлектрических пластинок электрическогооргана. Нейротоксины представляют собойнебольшие основные белки (7 кДа). Их мож-но пометить радиоактивным изотопомс высокой удельной радиоактивностью. Дляэтого их либо иодируют иодом-125, либопревращают в шиффово основание с пири-доксальфосфатом с последующим восста-новлением образованного продукта3М-боргидридом. Меченый кобратоксинпрочно связывается с ацетилхолиновым ре-цептором (константа диссоциации - порядка10-9 М) и, что особенно важно, практическине связывается с другими макромолекуламипостсинаптической мембраны. Таким обра-зом, рецептор ацетилхолина можно специ-фически пометить радиоактивным атомом.

Путем обработки фрагментов мембранынеионным детергентом (таким, как про-изводное полиоксиэтилена твин-80) удалосьсолюбилизировать рецепторы ацетилхо-лина электрического органа. Полученныйраствор фракционировали методами гель-фильтрации и ионообменной хроматогра-фии. Последним этапом очистки была аф-финная хроматография на колонке, содер-жащей ковалентно связанный кобратоксин.В итоге был получен рецептор, очищенныйв 10000 раз. Ацетилхолиновый рецепторпредставляет собой комплекс массой270 кДа, состоящий из четырех типов субъе-диниц. Субъединица 40 кДа метится посродству радиоактивными соединениями,содержащими группу триметиламмония,что указывает на наличие в ней участкасвязывания ацетилхолина. Удалось полу-чить мембранные пузырьки, содержащиеочищенные рецепторы ацетилхолина; дляэтого к раствору рецепторов добавлялифосфолипиды и затем удаляли диализом де-тергент. Показано, что радиоактивные ионынатрия (2 2Na+), включенные в процессе ре-конструирования пузырьков в их внутреннееводное пространство, высвобождаются придобавлении ацетилхолина или его аналогов,например карбамоилхолина (рис. 37.10).Высвобождение ионов натрия блокируютбунгаротоксин и обычные антагонисты аце-тилхолина; следовательно, оно опосредова-но специфическим взаимодействием ацетил-холина со связанным с мембраной рецепто-ром.


37.7. Ацетилхолин быстро гидролизуется,и концевая пластинка реполяризуетсяДля восстановления возбудимости пост-синаптической мембраны необходимо вы-ключение деполяризующего сигнала. Этуфункцию выполняет ацетилхолинэстераза,открытая Дэвидом Нахманзоном (DavidNachmansohn) в 1938 г. Фермент гидроли-зует ацетилхолин до ацетата и холина. В ре-зультате проницаемость постсинаптическоймембраны возвращается к исходному уров-ню и мембрана реполяризуется. Ацетилхо-линэстераза локализована в синаптическойщели, где она связана с сетью из коллагенаи гликозамингликанов, поступающих изпостсинаптической клетки. Масса фермента260 кДа, субъединичная структура - α2β2.Ацетилхолинэстеразу можно легко отде-лить от ацетилхолиновых рецепторов. Фер-мент характеризуется поразительно высо-ким числом оборотов, а именно 25000 с-1.Это означает, что одна молекула ацетилхо-лина расщепляется за 40 мкс. Такое высокоечисло оборотов фермента имеет очень важ-ное значение для быстрого восстановленияполяризованного состояния постсинаптиче-ской мембраны. Синапсы способны переда-

Рис. 37.10. Ацетилхолин вызывает высво-бождение Na+ из реконструи-рованных мембранныхпузырьков, содержащих аце-тилхолиновый рецептор. Пооси ординат отложено содер-жание 22Na+ в синаптическихпузырьках.


вать тысячу импульсов в секунду только по-тому, что постсинаптическая мембранавосстанавливает свою поляризованность задоли миллисекунды.

По механизму действия ацетилхолинэсте-раза сходна с химотрипсином. Ацетилхолинвзаимодействует со специфическим остат-ком серина в активном центре ацетилхолин-эстеразы с образованием в качестве проме-жуточного продукта ковалентно связанногоацетил—фермента, а холин высвобождает-ся. Ацетил—фермент далее вступает вовзаимодействие с молекулой воды, что при-водит к образованию ацетата и регенериро-ванного свободного фермента (рис. 37.12).

37.8. Ингибиторы ацетилхолинэстеразыиспользуются как лекарственные средстваи как ядыТерапевтические и токсические свойства ин-гибиторов ацетилхолинэстеразы нашли ши-рокое практическое применение. Алкалоидиз калабарских бобов физостигмин (назы-ваемый также эзерин) когда-то использовал-ся при испытании ядом в судилище над кол-дунами и ведьмами. Физостигмин и род-ственные ему ингибиторы, например не-остигмин, являются карбамоильными эфира-ми (рис. 37.13). Они ингибируют ацетилхо-

линэстеразу путем образования ковалентно-го промежуточного соединения, котороеочень медленно гидролизуется. Неостигминсвязывается с ацетилхолинэстеразой такимобразом, что его положительно заряженнаятриметиламмониевая группа встаетв анионном участке фермента, а карба-моильная группа оказывается рядом с реак-ционноспособным остатком серина в участ-ке этерификации. Далее происходит карба-моилирование фермента и высвобождаетсяобразующийся спирт. Последующий гидро-

Рис. 37.11. Электронная микрофотогра-фия ацетилхолиновых рецепто-ров в постсинаптической мем-бране.(Печатается с любезногоразрешения д-ра John Heuserи д-ра Steven Salpeter.)

лиз карбамоильного производного ферментав отличие от гидролиза ацетил—ферментапроисходит с очень низкой скоростью. В ито-ге активный центр ацетилхолинэстеразыоказывается прочно заблокированным. Не-остигмин используется для лечения глау-комы - болезни глаз, характеризующейсяповышенным внутриглазным давлением.Механизм терапевтического эффекта сос-тоит в том, что неостигмин ингибирует аце-тилхолинэстеразу и тем самым усиливаетдействие ацетилхолина.

Еще более мощные ингибиторы ацетил-холинэстеразы - органические фторфос-фаты, в частности диизопропилфторфосфат(ДИФФ). Эти соединения реагируют с аце-тилхолинэстеразой, образуя высокоста-бильные ковалентные фосфорил-фермент-ные комплексы (рис. 37.14). Как и привзаимодействии с сериновыми протеиназа-ми, фосфорильная группа ДИФФ связы-вается с серином в активном центре фер-мента.

Множество различных органическихфторфосфатов было синтезировано для ис-пользования в качестве инсектицидов в сель-ском хозяйстве, а также в качестве отра-вляющих веществ - нервно-паралитическихядов в химической войне (рис. 37.15). Эти со-единения могут вызвать смерть путем оста-новки дыхания. Наиболее токсичны изних - табун и зарин. Паратион - инсектицид,нашедший широкое применение в сельскомхозяйстве.

Путем использования радиоактивногоДИФФ в качестве метки было определеночисло молекул ацетилхолинэстеразы в кон-цевой пластинке нерва в диафрагмальноймышце мыши. Плотность фермента соста-вила 12000 м к м - 2 , что почти равно числурецепторов ацетилхолина, определенномус помощью радиоактивных нейротоксинов.Таким образом, постсинаптическая мем-брана очень богата и ацетилхолинэстеразой,и ацетилхолиновыми рецепторами. Припередаче нервных импульсов, поступающихс малой частотой, используется только не-большая доля общего числа молекул фер-мента. Однако проведение при высокой ча-стоте импульсации требует участие множе-ства молекул ацетилхолинэстеразы.

Рис. 37.12. Механизм каталитическогодействия ацетилхолинэсте-разы.


Рис. 37.13. Физостигмин и неостигмин ин-гибируют ацетилхолинэстера-зу путем карбамоилированиясерина в активном центре фер-мента.

Рис. 37.14. Ингибированная диизопро-пилфторфосфатом ацетилхо-линэстераза.

Рис. 37.15. Структурные формулы не-скольких органических фосфа-тов - ингибиторов ацетилхоли-нэстеразы.


37.9. Разработка антидота для леченияотравлений органическими фосфатамиАцетилхолинэстеразу, ингибированную ор-ганическими фторфосфатами типа ДИФФ,можно реактивировать производными ги-дроксиламина (NH2OH). При разработкеантидота исходили из обнаруженного Ирви-ном Уилсоном (Irvin Wilson) факта, что ги-дроксиламин высвобождает фосфорильнуюгруппу, присоединенную к сериновомуостатку ингибированного фермента, и темсамым реактивирует его (рис. 37.16). Задачасостояла в том, чтобы приспособить эту ре-акцию для клинического использования.Однако гидроксиламин нельзя использо-вать in vivo, поскольку в тех высоких кон-центрациях, которые необходимы для реак-тивации ацетилхолинэстеразы, ингибиро-ванной ДИФФ, он токсичен. ВыбранныйУилсоном подход состоял в том, чтобы най-ти соединение, обладающее реакционнойспособностью гидроксиламина, но со специ-фичностью и очень высоким сродствомк ацетилхолинэстеразе. Относительно фер-мента было известно, что на нем естьанионный участок для связывания положи-тельно заряженного остатка холина в аце-тилхолине, и потому представлялось целе-сообразным синтезировать производное ги-дроксиламина, содержащее четвертичнуюаммониевую группу. Возникал, однако, во-прос, где должен стоять заместитель: приатоме кислорода или азота гидроксила-мина? Было обнаружено, что О-метилги-

дроксиламин лишен способности реактиви-ровать фермент, тогда как N-метилгидрок-силамин обладал такой активностью. Ги-дроксильная группа реактиватора не можетбыть замещена, поскольку именно анионнаяформа соединения атакует атом фосфорав ингибированном ферменте.

Следующий и основной этап состоялв том, чтобы поместить четвертичную ам-

мониевую группу на необходимом растоя-нии от нуклеофильного атома кислорода.Более того, требовалось, чтобы по своейориентации эти группы были комплемен-тарны анионному участку и атому фосфорав ингибированном ферменте.

В качестве реактиваторов были испробо-ваны многочисленные соединения, содержа-щие четвертичную аммониевую группу и ги-дроксиламинную функцию. Наиболее эф-

фективным среди них оказался 2-пири-динальдоксимметиодид (ПАМ). Это соедине-ние обладает устойчивой геометрией благо-даря двойной связи в оксиме, которая спо-собствует удержанию атома кислородав плоскости кольца.

ПАМ реактивирует ингибированнуюДИФФ ацетилхолинэстеразу в принципе потому же механизму, что и гидроксиламин.Однако по эффективности 10-6 М ПАМ со-ответствует 1 М гидроксиламина. Такое по-вышение эффективности в 1000000 раз по-зволяет использовать ПАМ для леченияотравлений органическими фосфатами.Удивительная эффективность ПАМ обусло-влена оптимальным расположением четвер-тичной аммониевой группы по отношениюк нуклеофильному атому кислорода. Разра-ботка этого препарата явилась вехой в раз-витии рационального подхода к синтезу ле-карственных препаратов.

37.10. Ингибиторы ацетилхолиновогорецептораБлокаторами нервно-мышечного проведе-ния служат также соединения, непосред-

ственно воздействующие на ацетилхоли-новый рецептор. К ним относится кураре,который на протяжении столетий использо-вали южноамериканские индейцы. Вскорепосле возвращения Колумба из Америкид'Ангера в своем сочинении «De Orbo novo»отмечал, что «местные жители отравлялистрелы соком смертельно-ядовитой травы».Одним из активных компонентов курареявляется d-тубокурарин (рис. 37.17). Тубоку-рарин ингибирует деполяризацию концевыхпластинок, конкурируя с ацетилхолином засвязывание с рецептором. Аналогичным пу-тем действуют α-бунгаротоксин и кобраток-син. В отличие от этого вещества типа дека-

метония соединяются с рецептором ацетил-холина, вызывая устойчивую деполяризациюконцевой пластинки.

В хирургии в качестве препарата, вызы-вающего расслабление мышц, используетсяаналог ацетилхолина - сукцинилхолин.

Рис. 37.16. Реактивация гидроксилами-ном ацетилхолинэстеразы, ин-гибированной диизопропил-фторфосфатом.


Рис. 37.17. Формула и модель d-тубоку-рарина.

Сукцинилхолин крайне медленно гидро-лизуется ацетилхолинэстеразой в пост-синаптической мембране. Вследствие этогоон вызывает устойчивую деполяризациюконцевой пластинки. В то же время сукци-нилхолин гидролизуется под действием ме-нее специфических холинэстераз в плазмеи в печени; эти ферменты назвали плаз-менными ацетилхолинэстеразами илипсевдохолинэстеразами для того, чтобы от-личить их от ацетилхолинэстеразы пост-синаптической мембраны. Сукцинилхолинудобен тем, что при его использовании не-рвно-мышечное проведение восстанавли-вается вскоре после того, как перестают вво-дить этот препарат. Однако в отдельныхслучаях мышечное расслабление и параличдыхательных мышц сохраняются на протя-жении многих часов. Дело в том, что в такихслучаях гидролиз сукцинилхолина у боль-ных идет крайне медленно из-за сильносниженного сродства плазменной холин-эстеразы к сукцинилхолину. Повышеннаячувствительность к сукцинилхолину [так жекак и памахину (разд. 15.11)] - пример гене-тически детермированной лекарственнойидиосинкразии.

Если кроликов иммунизировать очи-щенными ацетилхолиновыми рецепторами,то спустя несколько недель после иммуниза-ции у них наблюдается мышечная слабость


и быстрая утомляемость. Объясняется этотем, что в результате иммунизации у нихвырабатываются антитела, реагирующиес ацетилхолиновыми рецепторами их соб-ственных нервно-мышечных соединений.В итоге число функционально активных аце-тилхолиновых рецепторов уменьшается, чтоприводит к ухудшению нейромышечнойпередачи. Развивающееся у этих кроликовсостояние очень напоминает тяжелую бо-лезнь человека - миастению (myastheniagravis), и, действительно, в сывороткебольных миастенией содержатся антитела,направленные против собственных рецепто-ров ацетилхолина. Другими словами,myasthenia gravis является аутоиммуннымзаболеванием, т. е. таким заболеванием, прикотором организм оказывается мишеньюдействия собственной иммунной системы.

37.11. К числу нейромедиаторов относятсятакже катехоламины и γ-аминомаслянаякислота (ГАМК)Помимо ацетилхолина, известны и другиенейромедиаторы. Вещество считается ней-ромедиатором, если оно удовлетворяет сле-дующим критериям. Во-первых, ми-кроинъекции предполагаемого нейромедиа-тора в синаптическую щель должны вызы-вать такой же ответ, как возбуждениепресинаптического нерва. Во-вторых, это ве-щество должно в больших количествах при-сутствовать в пресинаптических нервныхокончаниях. В этом отношении наиболее ве-сомым критерием служит выделение синап-тических пузырьков, содержащих это веще-ство. В-третьих, постулированный медиатордолжен высвобождаться из пресинаптиче-

ского нерва в нужное время и в количестве,достаточном для воздействия на постсинап-тический нерв.

Этим критериям удовлетворяет ряд кате-холаминов. Так, норадреналин является ме-диатором в гладкомышечных соединениях,которые иннервируются симпатическиминервами (в отличие от парасимпатическихсоединений, в которых нейромедиаторомслужит ацетилхолин). Катехоламины адре-налин и дофамин - два других катехолами-новых нейромедиатора. Указанные катехол-амины синтезируются из тирозина в оконча-ниях симпатических нервов и в надпочечни-ках (рис. 37.18). Первый этап синтеза (реак-ция, лимитирующая скорость всего процес-са) - гидроксилирование тирозина с образо-ванием 3,4-дигидроксифенилаланина (ДО-ФА). Данная реакция катализируется тиро-зин-гидроксилазой - ферментом, аналогич-ным фенилаланин-гидроксилазе. Активато-ром молекулярного кислорода при этомслужит тетрагидробиоптерин - кофакторфермента. Второй этап синтеза - декар-боксилирование ДОФА, катализируемоеДОФА-декарбоксилазой (ферментом, со-держащим пиридоксальфосфат) с образова-нием 3,4-дигидроксифенилэтиламина (до-фамина). Далее дофамин гидроксилируетсяв норадреналин в присутствии медьсодержа-щей гидроксилазы. Наконец, из норадрена-лина в результате метилирования образует-ся адреналин; фермент, осуществляющийэту реакцию,- трансметилаза, использую-щая в качестве донора метильных группS-аденозилметионин.

Инактивация катехоламиновых нейроме-диаторов осуществляется путем метилиро-вания 3-ОН-группы катехолового кольца.Реакцию катализирует катехол-О-метил-трансфераза, использующая S-аденозилме-тионин в качестве донора метильнойгруппы. Другой путь инактивации этих ней-ромедиаторов - удаление аминогруппыв ходе окисления моноаминоксидазой(рис. 37.19).

Среди производных аминокислот выя-влен еще один нейромедиатор. Это γ-амино-бутират, называемый также γ-аминомасля-ной кислотой (ГАМК). ГАМК увеличиваетпроницаемость постсинаптических мембрандля К+ и тем самым отдаляет мембранныйпотенциал от порогового уровня, при кото-ром возникает потенциал действия; такимобразом, ГАМК - это тормозный нейроме-диатор. ГАМК образуется при декарбок-силировании глутамата в реакции, ката-

Рис. 37.18. Путь биосинтеза катехолами-новых нейромедиаторов.

лизируемой глутамат-декарбоксилазой(рис. 37.20). Нетрудно предугадать, что про-стетической группой этой декарбоксилазыслужит пиридоксальфосфат. γ-Аминобути-рат инактивируется путем трансаминирова-ния с образованием полуальдегида янтар-ной кислоты, который далее окисляетсяв сукцинат.


Рис. 37.19. Инактивация норадреналина.

37.12. Для возбуждения палочки сетчаткиглаза достаточно одного фотонаРассмотрим теперь возбудимые рецепторы,активируемые светом. У человека имеютсядва типа фоторецепторных клеток, назы-ваемых палочками и колбочками в соответ-ствии с их формой. Колбочки функциони-руют на ярком свету и ответственны зацветовое зрение, тогда как палочки воспри-нимают слабый свет, но не различают цвета.В сетчатке глаза человека содержится 3 млн.колбочек и 1 млрд. палочек. Эти фоторецеп-торные клетки преобразуют энергию светав движение атомов, а далее и в нервный им-пульс. Палочки и колбочки образуютсинапсы с биполярными клетками, которые

Рис. 37.20. Синтез и инактивация γ-амино-бутирата.


в свою очередь взаимодействуют с другиминервными клетками в сетчатке. Электриче-ские сигналы, генерированные фоторецеп-торными клетками, преобразуются, прохо-дя по сложной сети нервных клетокв сетчатке, и затем передаются в мозг по во-локнам зрительного нерва. Таким образом,сетчатка выполняет две функции, а именнотрансформирует свет в нервные импульсыи интегрирует зрительную информацию.

В 1938 г. Зелиг Хехт (Selig Hecht) открыл,что для возбуждения палочки (клетки) сет-чатки человека достаточно одного фотона.Рассмотрим молекулярную основу исклю-чительно высокой чувствительности этихклеток. Палочки представляют собой тон-кие удлиненные структуры диаметром обы-чно 1 мкм и длиной 40 мкм. Основныефункции этой клетки четко разделены про-странственно (рис. 37.22). Наружный сег-мент палочки специализирован для фоторе-цепции. В нем содержится примерно 1000дисков, сложенных стопкой (рис. 37.23). Ди-ски представляют собой закрытые упло-щенные мешочки толщиной около 160 А.Эти мембранные структуры насыщены фо-торецепторными молекулами. Мембраныдисков и плазматическая мембрана наруж-ного сегмента не соприкасаются. Тонкая ре-сничка соединяет наружный сегмент с вну-тренним сегментом, богатым митохон-дриями и рибосомами. Во внутреннемсегменте с очень высокой скоростью выра-батывается АТР и идет активный синтезбелков. Диски наружного сегмента имеютсрок жизни всего лишь 10 дней и постояннообновляются. Внутренний сегмент соприка-сается с ядром, расположенным рядомс синаптическим тельцем. Синаптическоетельце, в котором содержится много синап-тических пузырьков, образует синапс с би-полярными клетками.

37.13. Родопсин - фоторецепторный белокпалочекДля стимуляции фоторецепторных клетокнеобходимо поглощение света. Поглощениефотона света должно вызвать структурныеизменения светопоглошающей группировки

Рис. 37.21. Микрофотография клеток па-лочек сетчатки, полученнаяв сканирующем электронноммикроскопе. (Печатается с лю-безного разрешения д-ра DericBownds.)

(хромофора). Фоточувствительным веще-ством палочек является родопсин, состоя-щий из белка опсина и простетическойгруппы, представленной 11-цис-ретиналем(рис. 37.24). Родопсин представляет собойтрансмембранный белок массой 38 кДа. Его

Рис. 37.22. Схематическое изображениепалочки сетчатки.

N-конец расположен в водной фазе внутридиска, а С-конец - на другой стороне мем-браны диска, в цитозоле. N-концеваяобласть родопсина содержит две олигосаха-ридные единицы, ковалентно присоеди-ненные к аспарагиновой боковой цепи.

Рис. 37.23. Наружный сегмент палочкисетчатки под электронным ми-кроскопом. Видны уложенныестопкой диски. (Allen J. M., ed.,Molecular organization andbiological function, Harper andRow, 1967.)


Рис. 37.24. Структура 11-цис-ретиналя, по-лностью-транс-ретиналя и по-лностью-транс-ретинола (ви-тамина А).

Этим сахарам, по-видимому, принадлежитважная роль в направленном передвиженииродопсина из внутреннего сегмента к ди-

Рис. 37.25. Образование дисков путем ин-вагинации плазматическоймембраны. Стрелками показа-на полярность молекул ро-допсина.


скам. Дело в том, что родопсин, как и другиемембранные белки эукариот, синтезируетсяна рибосомах, прикрепленных к эндоплаз-матическому ретикулуму. Новосинтезиро-ванный родопсин попадает в аппаратГольджи и лишь после этого достигаетплазматической мембраны. Новые дискиобразуются в основании внутреннего сег-мента путем инвагинации плазматическоймембраны, и именно поэтому углеводныеединицы родопсина оказываются локализо-ванными внутри диска, хотя первоначально,входя в состав плазматической мембраны,они обращены во внеклеточное простран-ство (рис. 37.25).

Опсин, подобно другим белкам, ли-шенным простетических групп, не погло-щает видимого света. Цвет родопсина и егочувствительность к свету определяютсяприсутствием 11-цис-ретиналя, являющего-ся высокоэффективным хромофором. Бла-годаря 11-цис-ретиналю родопсин обладаетширокой полосой поглощения в видимойобласти спектра с максимумом при 500 нм,что прекрасно соответствует солнечному из-лучению. Примечательна также интенсив-ность поглощения видимого света родопси-ном. Коэффициент экстинкции родопсинапри 500 нм очень высок, а именно4•104 см-1•М-1 (рис. 37.26). Суммарнаясила поглощения видимого света родопси-ном приближается к максимальным значе-ниям для органических соединений. Высо-кие хромофорные качества 11-цис-ретиналяобусловлены тем, что он является полиеном.Чередование в нем шести одинарныхи двойных (ненасыщенных) связей создаетдлинную ненасыщенную систему для пере-носа электрона.

11-цис-ретиналь присоединен к родопсинучерез шиффово основание, которое образует-ся при связывании альдегидной группы

Рис. 37.26. Спектр поглощения родоп-сина.

Рис. 37.27. Первичный акт при возбужде-нии светом - это изомеризация11-цис-изомера шиффова осно-вания, образуемого ретиналем.в полностью-транс-форму.Двойная связь между С-11и С-12 показана зеленым цве-том.

11-цис-ретиналя с ε-аминогруппой специфи-ческого остатка лизина в опсине. Спек-тральные свойства родопсина свидетель-ствуют о том, что шиффово основание нахо-дится в протонированной форме.

Предшественником 11-цис-ретиналя слу-жит полностью-транс-ретинол (витамин А),который в организме млекопитающих неможет синтезироваться de novo. Пол-ностью-транс-ретинол (рис. 37.24) превра-щается в 11-цис-ретиналь в два этапа. Сна-чала происходит окисление спиртовойгруппы в альдегидную в присутствии рети-нол-дегидрогеназы и NADP+ в качестве ак-цептора электронов. Затем под действием

ретиналь-изомеразы двойная связь междуС-11 и С-12 изомеризуется из транс-формыв цис-форму. Недостаточность витаминаА приводит к ночной («куриной») слепотеи в конечном итоге к повреждению на-ружных сегментов палочек.

37.14. Свет вызывает изомеризацию11-цис-ретиналяПервичный акт в процессе зрительного воз-буждения известен. Как показал ДжорджУолд (George Wald), свет вызывает изомери-зацию 11-цис-ретиналъной группы родопсинав полностью-транс-ретиналь. В результате

изомеризации сильно меняется геометрияретиналя (рис. 37.27). Образованное ретина-лем шиффово основание передвигается поотношению к области кольца хромафорапримерно на 5 А. В сущности, поглощенныйфотон преобразуется в движение атомов.

Значительная изомеризация ретиналяпроисходит практически в первые несколько


Рис. 37.28. Промежуточные этапы фото-лиза родопсина. Приведеныдлины волн, соответствующиемаксимумам поглощения ка-ждого из соединений, а такжепостоянная времени каждогоиз превращений.

пикосекунд после поглощения фотона, о чемможно судить по появлению новой полосыпоглощения после сильного импульсногоосвещения лазером. Образующийся приэтом промежуточный продукт фотолиза, на-зываемый батородопсином (или прелюмиро-допсином), содержит напряженную пол-ностью-транс-форму хромофора. Далееи ретиналь, и белок продолжает изменятьсвою конформацию, что приводит к образо-ванию ряда промежуточных продуктов, раз-личающихся по спектральным свойствам(рис. 37.28). При переходе от метародопсинаI к метародопсину II, длящемуся около мил-лисекунды, происходит депротонированиешиффова основания. Лишенное протонашиффово основание в метародопсине II ги-дролизуется в течение примерно одной ми-нуты с образованием опсина и полностью-транс-ретиналя; последний путем диффузииотделяется от опсина, поскольку не соответ-ствует участку связывания 11-цис-изомера.Полностью-транс-ретиналь в темноте изо-меризуется снова в 11-цис-ретиналь, ко-торый связывается с опсином, и таким пу-тем регенерируется родопсин. В отличие от


реакций фотолиза родопсина гидролизшиффова основания протекает настолькомедленно, что не играет никакой роли в ге-нерировании нервного импульса.

37.15. Свет вызывает гиперполяризациюплазматической мембраны наружногосегмента палочекИзомеризация ретиналя из цис- в транс-форму и последующие конформационныеизменения родопсина - это первичные актыпроцесса зрительного возбуждения. Сле-дующий важный этап, необходимый для ге-нерирования нервного импульса, был вы-явлен при электрофизиологических исследо-ваниях интактной сетчатки. Квант светавызывает кратковременную гиперполяриза-цию плазматической мембраны наружныхсегментов (рис. 37.29). Кинетика процессагиперполяризации зависит от интенсивно-сти светового пучка и уровня устойчивогофонового освещения. Время реакции на еди-ничный фотон составляет около секунды,а на интенсивный падающий свет - несколь-ко миллисекунд. В палочках не возникаетпотенциала действия. Их реакция на светможет быть различной силы. Величина сиг-нала, идущего от наружного сегментак синапсу, зависит от числа поглощенныхфотонов. Если взять обладающие полнойчувствительностью адаптированные к тем-ноте палочки, то полумаксимальный уро-вень гиперполяризации наблюдается припоглощении всего лишь 30 фотонов на-ружным сегментом палочки, содержащим40•106 молекул родопсина (рис. 37.30). По-глощение единичного фотона адаптирован-ной к темноте палочкой вызывает гиперпо-ляризацию порядка 1 мВ, что улавливаетсясинапсом и передается на другие нейронысетчатки. Исключительная чувствитель-

Рис. 37.29. Под действием света происхо-дит гиперполяризация палочексетчатки.

ность - не единственное выдающееся свой-ство палочек. Их вторая поразительная осо-бенность состоит в том, что реакциясветовоспринимающего аппарата фотоде-тектора на импульсное освещение зависитот уровня фоновой освещенности. Для воз-буждения палочек, освещенных постояннымсветом, требуется значительно больше фо-тонов, чем для палочек, находящихся в тем-ноте (рис. 37.30). Благодаря этому свойству,называемому адаптацией, палочки сетчаткиспособны функционировать при уровняхфоновой освещенности, различающихся намного порядков величины.

Каков ионный механизм индуцированнойсветом гиперполяризации? Плазматическаямембрана наружного сегмента палочкив темноте высоко проницаема для Na+. Этообстоятельство наряду с наличием высоко-го трансмембранного градиента концентра-ций Na+ приводит к тому, что в темнотеионы натрия быстро входят внутрь наруж-ного сегмента. Этот градиент поддержи-вается (Na+ + К+)-АТРазой, локализован-ной в плазматической мембране внутренне-го сегмента. Таким образом, в темнотеионы натрия входят в наружный сегмент,диффундируют далее во внутренний сег-мент и затем выводятся с помощью насоса,работающего за счет энергии АТР. Свет ка-ким-то образом блокирует Na+-каналыв плазматической мембране наружного сег-мента. В результате ток Na+, направленныйвнутрь клетки, снижается и мембрана с вну-тренней стороны становится более элек-троотрицательной. Другими словами, мем-бранный потенциал палочек при освещениисдвигается в сторону равновесногоК+-потенциала. Далее индуцированная све-том гиперполяризация вблизи освещенныхдисков пассивно передается по плазматиче-ской мембране на синаптическое тельце.

37.16. Медиаторы передают сигналот фотолизированного родопсинана плазматическую мембрануИзменение проницаемости плазматическоймембраны для Na+ и последующая гипер-поляризация - это многократно усиленныереакции наружного сегмента на свет.В самом деле, поглощение всего лишь одно-го фотона адаптированной к темноте палоч-кой блокирует ток более чем миллиона ио-нов натрия. Как возникает усиление такогомасштаба? Прежде всего следует обратитьвнимание на то, что мембраны дисков, со-держащие основную массу молекул родоп-

Рис. 37.30. Чувствительность палочек сет-чатки к импульсному освеще-нию зависит от фонового уров-ня освещенности.

сина, не соприкасаются с плазматическоймембраной палочек и не сопряжены с нейэлектрически. Более того, молекула родоп-сина, поглотившая фотон, может быть уда-лена от натриевого канала плазматическоймембраны на несколько тысяч ангстрем. Всеэто исключает возможность прямого взаи-модействия между дисками и плазматиче-ской мембраной. Практически не можетбыть сомнений в том, что сигнал от фотоли-зированного родопсина (Рд*) в мембранахдисков передается на плазматическую мем-брану с помощью диффундирующих медиа-торов. При этом для обеспечения той высо-кой степени усиления, которая реальнонаблюдается, фотолиз одной молекулы ро-допсина должен сопровождаться образова-нием (или распадом) большого числа моле-кул медиатора.

Природа медиатора не установлена ещеокончательно; проведенные исследованияпозволили выдвинуть на эту роль двух до-статочно вероятных кандидатов: ионы Са2+

(рис. 37.31) и циклический GMP (рис. 37.32).В пользу Са2+ как медиатора свидетель-ствуют следующие экспериментальныеданные.

1. Натриевые каналы в плазматическоймембране закрываются при повышении со-держания Са2+ в цитозоле и открываютсяпри его понижении.

2. При введении в цитозоль хелатирую-


Рис. 37.31. Схематическое изображениегипотезы о роли ионов кальциякак медиаторов при зритель-ном возбуждении.

щих агентов, специфически связывающихСа2+, чувствительность палочек к светууменьшается. Такая десенсибилизацияуказывает на то, что фотолиз одной моле-кулы родопсина ведет к высвобождениюв цитозоль нескольких сотен ионов Са2+.

3. После импульсного воздействия све-том из наружных сегментов палочек выво-дится много Са2+.

Однако, судя по результатам других экс-периментов, медиатором может бытьcGMP. Решающее значение для этого за-ключения имеют следующие данные.

1. Натриевые каналы плазматическоймембраны открываются при повышении со-держания cGMP в цитозоле и закрываютсяпри снижении содержания этого нуклеоти-да.


2. Содержание cGMP регулируется све-том. В частности, под действием света про-исходит активация фосфодиэстеразы, ги-дролизующей cGMP, что будет описанонесколько ниже.

3. Фотолиз одной молекулы родопсинаведет к быстрому гидролизу 105 молекулcGMP.

37.17. Свет снижает содержаниециклического GMP путем активациифосфодиэстеразыКак показывают приведенные эксперимен-тальные данные, возбудимость палочек за-висит и от Са2+, и от cGMP. Взаимодей-ствие этих агентов может играть решаю-щую роль в зрительном возбуждении. Чтокасается молекулярного механизма индуци-рованного светом высвобождения Са2+

Рис. 37.32. Схематическое изображениегипотезы о роли cGMP какмедиатора при зрительномвозбуждении. Рд* - фотолизи-рованный родопсин.

в цитозоль, то в этом вопросе еще много не-ясного. Что же касается регуляции светомсодержания cGMP в наружных сегментахпалочек, то в изучении этого вопроса в по-следние годы был достигнут значительныйпрогресс. На гуанилат-циклазу - фермент,катализирующий синтез cGMP,- свет, по-видимому, не оказывает существенноговлияния:

Зато на фосфодиэстеразу, гидролизующуюcGMP, свет оказывает поразительное по си-ле действие:

В результате освещения активность фосфо-диэстеразы возрастает в несколько сотенраз. Стимуляция этого фермента фотолизи-рованным родопсином опосредована регу-ляторным белком, называемым трансдуци-ном. В темноте трансдуцин содержит про-чно связанную молекулу GDP. При освеще-нии фотолизированный родопсин образуеткомплекс с GDP-трансдуцином и катализи-рует обмен GDP на GTP (рис. 37.34). Возни-кающий комплекс GTP-трансдуцин активи-рует фосфодиэстеразу. Крайне важное зна-чение имеет то обстоятельство, что всеголишь одна фотолизированная молекула ро-допсина катализирует обмен GDP на GTPна нескольких сотнях молекул трансдуцина,что в свою очередь активирует сотни моле-кул фосфодиэстеразы. Следовательно, есличисло оборотов фосфодиэстеразы соста-вляет примерно 103 с-1, то на свету в тече-ние секунды гидролизуется уже более 105

молекул cGMP в расчете на одну молекулуфотолизированного родопсина. Системавозвращается в исходное темновое состоя-ние благодаря встроенной в нее GTP-азнойактивности. Присоединенный к трансдуцинуGTP подвергается медленному гидролизус образованием GDP-трансдуцина, неспо-собного активировать фосфодиэстеразу. Та-ким образом, весь этот цикл протекает засчет свободной энергии гидролиза GTP.Здесь мы видим пример того, как для усиле-ния сигнала используется ~Р. Описанныйкаскад реакций, регулирующих содержаниеcGMP (рис. 37.35), очень напоминает каскадреакций, опосредующих действие β-адре-нергических гормонов, в частности адрена-лина (разд. 35.4).

Рис. 37.33. Молекулярная модель цикли-ческого GMP.

Рис. 37.34. Фотолизированный родопсин(Рд*) катализирует образова-ние комплекса GTP с трансду-цином; этот комплекс в своюочередь активирует фосфодиэ-стеразу циклического GMP.[Fung В. К.-К., Stryer L., Ргос.Nat. Acad, Sci., 77, 2503 (1980).]

37.18. Цветовое зрение опосредуетсяфоторецепторами трех типовВ 1802 г. Томас Юнг (Thomas Young) выска-зал предположение, что цветовое восприя-тие опосредовано тремя основными рецеп-торами. Как показали спектрофотометриче-ские исследования интактной сетчатки, про-веденные более 150 лет назад, в глазусуществует три типа клеток-колбочек,а именно клетки, поглощающие синий, зе-леный и красный свет. Для получения спек-тра поглощения этих трех фоторецепторныхпигментов колбочки освещали лучом света


Рис. 37.35. Предполагаемый каскад реак-ций, регулирующих содержа-ние cGMP в сетчатке глаза. Со-кращения: Рд - родопсин,Рд* - фотолизированный ро-допсин, Т - трансдуцин,ФДЭн - неактивная фосфодиэ-стераза, ФДЭ - активная фос-фодиэстераза.

диаметром I мкм (рис. 37.36). Кроме того,во многие колбочки вводили микроэлек-троды. Спектры действия, основанные нагиперполяризации плазматических мем-бран, разделяются на три группы с макси-мумами соответственно в синей, зеленойи красной областях видимого света. У золо-той рыбки максимумы поглощения трехцветовых рецепторов приходятся на 455, 530и 625 нм, тогда как родопсин характери-зуется максимумом 500 нм.

Хромофором в колбочках всех трех типовслужит 11-цис-ретиналъ. В отсутствие бел-ка протонированное шиффово основаниеимеет максимум поглощения при 380 нм.Следовательно, различные группировки наопсине оказывают значительное действие нахромофорные свойства связанного 11-цис-ретиналя. Зависимость спектральныхсвойств этого хромофора от белковогоокружения - частное проявление общегопринципа, а именно взаимодействие с бел-ком оказывает модулирующее влияние насвойства простетической группы. Другойпример тому - функционирование гема в ка-


честве переносчика кислорода в гемоглоби-не, переносчика электронов в цитохроме си катализатора в пероксидазе.

Большинство форм дальтонизма (цвето-вой слепоты) обусловлено сцепленной с по-лом рецессивной мутацией. Около 1% му-жчин не видят красного цвета, около2% - зеленого. Как показали спектральныеисследования, проведенные на интактномглазе, у этих людей либо совсем отсут-ствуют фоторецепторные молекулы, вос-принимающие красный или зеленый цвет,либо имеется измененный пигмент со сдви-нутым спектром поглощения. Таким обра-зом, дальтонизм обусловлен отсутствиемили дефектом одного из типов опсинав колбочках.

37.19. 11-цис-ретиналь - хромофор всехизвестных органов зренияТолько у трех типов животных - моллю-сков, членистоногих и позвоночных - глазаспособны отображать образ предмета. Ана-томически глаза этих трех типов устроенысовершенно по-разному и, по-видимому,в ходе эволюции возникли независимо. Од-нако во всех трех случаях хромофором в фо-торецепторных молекулах служит 11-цис-ретиналь. Это поразительный пример кон-вергентной эволюции. Что же такого особен-ного в 11-цис-ретинале? Во-первых, этосоединение обладает интенсивной полосойпоглощения, которая легко сдвигается в ви-димую область спектра. Во-вторых, поддействием света 11-цис-ретиналь легко изо-меризуется. Более того, в темноте скоростьизомеризации очень низка. В-третьих, изо-меризация вызывает большие измененияв структуре. В итоге поглощенный свет пре-образуется в движение атомов такого масш-таба, которое способно инициироватьгенерирование нервного импульса. На-конец, исходными предшественниками

Рис. 37.36. Спектры поглощения трех цве-товых рецепторов.

Рис. 37.37. Вид клеток - палочек и колбо-чек - фоторецепторного слоясетчатки в сканирующем элек-тронном микроскопе. (Печа-тается с любезного разрешенияд-ра William Miller.)

11-цис-ретиналя являются каротины (разд.20.27), очень широко распространенныев живой природе.

37.20. Хеморецепторы бактерий восприни-мают специфические молекулыи передают сигналы на жгутикиВ конце XIX в. немецкий ботаник Виль-гельм Пфеффер (Wilhelm Pfeffer) продемон-стрировал, что подвижные бактерии скапли-ваются вокруг отверстия тонкого капилля-ра, содержащего какой-нибудь аттрактант,например сахар (рис. 37.38). В случае же,когда капилляр содержит репеллент (обыч-но это вещество, повреждающее бактерии,или продукт их выделения), бактерии дви-жутся прочь от капилляра. Такое направлен-ное движение бактерий в сторону одних ве-ществ и прочь от других называется

хемотаксисом. В 60-х годах Джулиус Адлер(Julius Adler) начал изучать молекулярнуюоснову хемотаксиса бактерий. Выполненныеим, а также большим числом других ученыхбиохимические, генетические и структурныеисследования раскрыли многие стороныэтого процесса. Хемотаксис начинается с об-наружения химических соединений специфи-ческими хеморецепторами на поверхностиклетки. Информация от этих сенсоров пере-дается в систему преобразования, где проис-ходит анализ и интеграция большого числастимулов. Далее сенсорная преобразующаясистема посылает сигналы к моторам, при-водящим в движение жгутики. В зависимо-сти от этих сигналов бактерия либо плавнопередвигается по прямой, либо резко меняетнаправление движения.

У Е. coli обнаружено около 20 различныххеморецепторов. Каждый из этих белков ло-кализован или в плазматической мембране,или в периплазматическом пространстве.Хеморецептор содержит узнающий и сигна-


Рис. 37.38. Хемотаксис у бактерий. Бакте-рии движутся к капилляру, со-держащему атрактант, напри-мер глюкозу.

Рис. 37.39. Электронная микрофотогра-фия S. typhimurium. Хорошовидно, что жгутики собраныв пучок. (Печатается с любезно-го разрешения д-ра DanielKoshland.)


лизирующий компоненты. В хеморецепто-рах, обеспечивающих положительный хемо-таксис (привлечение), узнающий компонентоказался связывающим белком, участвую-щим в транспорте данного соединенияв клетку. Так, например, связывающий га-лактозу белок (растворимый белок, локали-зованный в периплазматическом простран-стве) служит и узнающим компонентом приположительном хемотаксисе на галактозу,и частью насоса, осуществляющего ак-тивный транспорт галактозы в клетку. Хе-морецептор для глюкозы является такжекомпонентом фосфотрансферазной си-стемы, связанной с мембраной и обеспечи-вающей активное потребление этого сахара(разд. 36.12). На поверхности Е. coli имеютсяхеморецепторы и для таких аттрактантов,как серин, цистеин, аланин, глицин. Хотятранспорт и хемотаксис тесно связаны ме-жду собой, однако хемотаксис не зависит отпроцессов транспорта. Так, некоторые му-танты, неспособные транспортироватьопределенные сахара или аминокислоты, со-храняют способность направленно двигать-ся к ним. Имеются также различные хеморе-цепторы, связанные с отрицательным хемо-таксисом. Жирные кислоты, спирты, гидро-фобные аминокислоты, индол, Н+ (рН << 6,5), ОН- (рН > 7,5) и сульфиды отталки-

вают бактерии путем взаимодействия соспецифическими хемосенсорами.

37.21. В основании бактериального жгутиканаходится вращающий его реверсивный«мотор»Бактерии плывут благодаря вращению жгу-тиков, отходящих от поверхности клетки.Эти тонкие спиральные нити состоят изсубъединиц массой 53 кДа, называемыхфлагеллином. У бактерии Е. coli имеетсяоколо 6 жгутиков длиной 10 мкм и диаме-тром 150 А. Жгутики бактерий по сравне-нию со жгутиками и ресничками эукариот(разд. 34.18) имеют значительно меньшиеразмеры и проще устроены. Бактериальныйжгутик сам по себе не может совершать ак-тивных волнообразных движений, так какв нем нет сократительного аппарата. Еговращает «мотор», расположенный в участкесоединения жгутика с клеточной оболочкой.Выделение жгутиков, сохраняющих прикре-пленную к ним базальную структуру, позво-лило изучить эти образования; оказалось,что они состоят из нити, крючка и стерж-ня. У E.coli на стержень насажены 4 коль-ца. Наружное кольцо прикреплено к наруж-

ной мембране, а внутреннее - к плазматиче-ской мембране клеточной оболочки. Базаль-ное тельце (рис. 37.40) заякоривает жгутикк клеточной оболочке и приводит его в дви-жение. Этот «мотор» работает за счет про-тонодвижущей силы, возникающей на плаз-матической мембране, а не за счет энергиигидролиза АТР. Действительно, угловая ско-рость вращения прямо пропорциональнапротонодвижущей силе. Загадочное свой-ство «мотора» состоит в том, что он можетвращаться как по часовой стрелке, таки против нее.

Обычно отдельная бактерия Е. coli спо-койно плывет по прямой примерно одну се-кунду. За это время она проходит расстоя-ние около 30 мкм, что примерно в 15 разпревышает ее собственную длину. Затембактерия как бы кувыркается и резко меняетнаправление движения (рис. 37.41). Угол по-ворота в среднем обычно составляет 60°. Отчего зависит, движется ли бактерия плавноили кувыркаясь? Оказалось, что при враще-нии жгутиков против часовой стрелки ихспиральные нити организуются в стройныйпучок, который и обеспечивает плавноепередвижение клетки. Если же жгутики вра-щаются по часовой стрелке, то весь пучокрассыпается, каждая нить тянет в свою сто-рону и бактерия начинает кувыркаться.

37.22. Бактерии различают временнойградиент, а не одномоментныйпространственный градиент концентрацийРегуляция частоты кувыркания занимаетцентральное место в хемотаксисе. Когдабактерия движется в направлении увеличе-ния концентрации аттрактанта, кувырканиестановится реже. Наоборот, при движенииот аттрактанта бактерия кувыркается ча-ще. Репелленты оказывают противопо-ложный эффект на частоту кувырканиябактерий. В результате при движениив сторону аттрактанта или прочь от репел-лента бактерия плывет прямолинейно в те-чение большего промежутка времени, чемпри движении в противоположном направ-лении. Кувыркание способствует выборуправильного направления.

Сравнивает ли бактерия концентрацииаттрактанта на двух концах своей клетки,или же она сравнивает концентрации ат-трактанта в два отдельных момента вре-мени? Другими словами, является ли еесенсорный механизм пространственнымили временным? Дэниел Кошланд и Ро-берт Макнаб (Daniel Koshland, Robert

Рис. 37.40. Базальное тельце жгутика у Е.coli. (Adler J., The sensing ofchemicals by bacteria, 1976.)

Рис. 37.41. Проекция пути E. coli, получен-ная в электронном микроскопепутем автоматическою слеже-ния за перемещением бактериив трех измерениях. Точки отде-лены друг от друга промежут-ком 80 мс. [Berg H.C., Nature,254, 390 (1975).]


Рис. 37.42. Кувыркание бактерии обусло-влено резким изменением на180° направления вращения«мотора»; в результате пучокжгутиков оказывается разме-танным в разные стороны. (Порисунку, любезно предоста-вленному д-ром Daniel Kosh-land.)

Macnab) нашли ответ на этот важныйвопрос, поставив очень простойи остроумный опыт. Суспензию бактерийв среде, лишенной аттрактанта, быстросмешивали с раствором, содержащим ат-трактант, и подсчитывали частоту кувыр-каний бактерий. Поразительным образомуже через секунду после смешивания этачастота снижалась. Бактерии проплывалиотносительно большие расстояния по пря-мой, хотя в быстро перемешанном раство-ре пространственный градиент концентра-ции отсутствовал. Следовательно, бакте-рии воспринимают изменение концентра-ции во времени, т.е. обладают временнымсенсорным механизмом. Иными словами,бактерия определяет градиент аттрактантав пространстве не путем сопоставления егоконцентрации на переднем и заднем кон-цах своей клетки, а путем сопоставленияотдельных восприятий концентрации вовремени по мере движения. По существу,бактериальный хемотраксис - это частичноориентированное случайное движение. Це-ленаправленность возникает в результатеотбора случайных направлений движения.

37.23. При бактериальном хемотаксисепередача информации обеспечиваетсяметилированными белкамиРеакция бактерии на тот или иной гра-диент концентрации аттрактанта неявляется строго определенной. Торможе-ние кувыркания, обусловленное повыше-


нием концентрации аттрактанта, являетсявременным. После определенного лаг-пе-риода частота кувырканий возвращаетсяк исходному уровню. По существу, при по-стоянном наличии аттрактанта бактериятеряет чувствительность к нему. Благодарятакой десенсибилизации, называемой адап-тацией, бактерии способны восприниматьградиенты в широком диапазоне концен-траций аттрактанта. Как указывалось ра-нее, аналогичным свойством обладает ре-акция палочек сетчатки на свет (рис. 37.30).

Генетические исследования хемотаксисабактерий показали, что информация покрайней мере от 12 хеморецепторов пере-дается через 3 белка-продукта генов tsr,tar и trg (рис. 37.43). Например, сигналы отрецепторов рибозы и галактозы поступаютна белок trg. Указанные три белка подвер-гаются обратимому метилированию, и по-тому их называют метил-акцепторные хе-мотаксические белки (МХБ). Несколькоглутаматных боковых цепей в каждом изэтих белков подвергается метилированиюпод действием метилтрансферазы, исполь-зующей S-аденозилметионин в качестве ак-тивированного донора метильных групп(рис. 37.44). Эти ковалентные модификациимогут быть обращены специфической эсте-разой. Уровень метилирования МХБ воз-растает при воздействии аттрактантоми снижается при воздействии репеллентом.По-видимому, адаптация опосредована сте-пенью метилирования этих белков.

Информация от указанных трех метил-акцепторных белков попадает далее напродукты генов che. Каким образом этимолекулы определяют направление враще-ния жгутиков, остается неизвестным. Одна-ко теперь уже совершенно ясно, что у бак-терий имеется примитивная сенсорная си-стема, образованная продуктами примерно30 генов, в которой обрабатывается и ин-тегрируется информация относительно пи-тательных веществ и ядов в окружающейбактерию среде. В сущности, основной во-прос для бактерии: «кувыркаться или некувыркаться»?

Рис. 37.43. Путь передачи информациипри хемотаксисе бактерий.В нижней части схемы пока-заны выявленные типы мутан-тов. МХБ - акцептирующийметильную группу хемотакси-ческий белок. [Springer R. S.,Coy M.F., Adler J., Nature, 280,280 (1979).]

ЗаключениеПотенциалы действия в мембранах аксо-нов нервных клеток опосредованы кратко-временным изменением проницаемостидля Na+ и К+. И Na+-, и К+-каналы регу-лируются трансмембранной разностью по-тенциалов. Тетродотоксин и сакситоксин- специфические блокаторы Na+-каналов.Передача нервных импульсов черезсинапсы в большинстве случаев опосредо-вана химическими медиаторами. Ацетилхо-

Рнс. 37.44. Обратимое метилирование ме-тил-акцепторных хемотаксиче-ских белков.


лин, который служит нейромедиатором вомногих синапсах и двигательных концевыхпластинках, синтезируется из ацетил-СоАи холина. Ацетилхолин накапливаетсяв синаптических пузырьках, которые припоступлении нервного импульса сливаютсяс пресинаптической мембраной; высвобо-ждающийся при этом ацетилхолин диф-фундирует через синаптическую щель и со-единяется со специфическими белковымирецепторами на постсинаптической мем-бране. Вызванное этим увеличение прони-цаемости для Na+ и К+ приводит к депо-ляризации постсинаптической мембраны.Рецептор ацетилхолина имеет высокоесродство к α-бунгаротоксину и другимнейротоксинам; указанное свойство облег-чило выделение и очистку этого интеграль-ного мембранного белка. После гидролизаацетилхолина под действием ацетилхолин-эстеразы происходит реполяризация пост-синаптической мембраны. Ингибиторамиацетилхолинэстеразы служат органическиефосфаты, в частности ДИФФ, который мо-жет вызвать смерть вследствие параличадыхания. К числу нейромедиаторов отно-сятся также катехоламины (адреналин, нор-адреналин и дофамин) и γ-аминобутират(ГАМК).

Возбуждение палочек сетчаткой глазаможет быть вызвано одним фотоном.В наружном сегменте палочки имеетсяоколо тысячи уложенных пачкой дисков,которые представляют собой замкнутыедвуслойные мембраны, обильно нагру-женные молекулами трансмембранногобелка родопсина. Родопсин - фоторецеп-торный белок; его хромофором является11-цис-ретиналь, который образуется изполностью-транс-ретинола (витамина А).11-цис-ретиналъ присоединяется к специфи-ческому остатку лизина в опсине, образуяшиффово основание. Первичный актзрительного возбуждения - изомеризация

11-цис-ретинальной группировки в по-лностью-транс-ретиналь. Конечный этапзрительного возбуждения - гиперполяриза-ция плазматической мембраны наружногосегмента, обусловленная снижением прони-цаемости для Na+. Поглощение одногофотона адаптированной к темноте палоч-кой блокирует поток более миллиона ио-нов натрия. Медиаторы (вероятно, Са2+

или циклический GMP) передают сигналот фотолизированного родопсина на плаз-матическую мембрану. Цветовое зрениеопосредовано фоторецепторами трех ти-пов, каждый из которых содержит 11-цис-ретиналь. По существу, 11-цис-ретинальявляется хромофором во всех известныхзрительных органах, что служит удиви-тельным примером конвергентной эволю-ции.

Подвижные бактерии способны к напра-вленному движению в сторону аттрактанта(например, глюкозы) или от репеллента(например, жирных кислот). Сенсоры дляхемотаксиса локализованы в периплазма-тическом пространстве или на плазматиче-ской мембране. Бактериальные жгутикивращаются с помощью «моторов», исполь-зующих энергию протонного градиента наплазматической мембране. Бактерии спо-койно плывут в течение примерно секунды,затем кувыркаются вследствие переменынаправления вращения жгутиков от движе-ния против часовой стрелки к движениюпо часовой стрелке. Когда бактерия дви-жется к аттрактанту или от репеллента, еекувыркания становятся реже. Бактерииопределяют временной, а не простран-ственный градиент концентрации. В бакте-риальной клетке информация от хемосен-соров передается на три метил-акцеп-торных хемотаксических белка (МХБ)и далее на жгутики. Обратимое метилиро-вание МХБ регулирует чувствительностьдетекторной системы.


С чего начатьLester H.А., 1977. The response toacetylcholine, Sci. Amer, 236 (2),106-118.Keynes R.D., 1979. Ion channels in thenerve-cell membrane, Sci. Amer.,240(3), 126-135.

Rushton W.A.H., 1975. Visual pig-ments and color blindness, Sci. Amer.,232(3), 64-74.Adler J., 1976. The sensing of che-micals by bacteria, Sci. Amer., 234(4),40-47.Berg H., 1975. How bacteria swim, Sci.Amer., 233(2), 36-44.

КнигиKuffler S.W., Nicholls J.G., 1976.From Neuron to Brain, Sinauer.[Имеется перевод: Куффлер С., Ни-коле Дж. От нейрона к мозгу.- М.:Мир, 1979.] (Часть II этой замеча-тельной книги содержит прекрасноеописание механизмов передачи сиг-налов по нейронам.)Katz В., 1966. Nerve, Muscle, andSynapse, McGraw-Hill. [Имеетсяперевод: Катц Б. Нерв, мышцаи синапс.- М.: Мир, 1968.] (Велико-354


лепное краткое изложение общихпредставлений.)Cone R.A., Dowling J.E. (eds.), 1979.Membrane Transduction Mechanisms,Raven Press. (Сжатые и ясные описа-ния различных возбудимых мем-бранных систем.)Aidley D.J., 1977. The Physiology ofExcitable Cells (2nd ed.), LiverpoolUniversity Press.

Проведение по аксону нерваHille В., 1978. Ionic channels inexcitable membranes: current pro-blems and biophysical approaches,Biophys. J., 22, 283-294.Barchi R.L., Cohen S.A., Murphy L.E.,1980. Purification from rat sarcolemmaof the saxitoxin-binding component ofthe excitable membrane sodiumchannel, Proc. Nat. Acad. Sci., 77,1306-1310.Morell P., Norton W.T., 1980. Myelin.Sci. Amer., 242(5), 88-118.Ritchie J.M., Rogart R.B., 1977. Den-sity of sodium channels in mammalianmyelinated nerve fibers and nature ofthe axonal membrane under themyelin sheath, Proc. Nat. Acad. Sci.,74, 211-215.

Синаптическая передачаAxelrod J., 1974. Neurotransmitters,Sci. Amer. 230(6), 59-71.Heidmann Т., Changeux J.-P., 1978.Structural and functional properties ofthe acetylcholine receptor protein in itspurified and membrane-bound states,Ann. Rev. Biochem., 47, 317-357.Raftery M.A., Hunkapiller M.W., Stra-der C.D., Hood L.E., 1980.Acetylcholine receptor: complex ofhomologous subunits, Science, 208,1454-1457.Klymkowsky M.W., Stroud R.M., 1979.Immunospecific identification andthree-dimensional structure ofa membrane-bound acetylcholinereceptor from Torpedo California, J.Mol. Biol, 128, 319-334.Moore H.H., Hartig P.R., Raftery M.A., 1979, Correlation of polypeptidecomposition with functional events inacetylcholine receptor-enriched mem-branes from Torpedo California, Proc.Nat Acad. Sci., 76, 6265-6269.

Fulpius B.W., Miskin R., Reich E.,1980. Antibodies from myasthenicpatients that compete with cholinergicagents for binding to nicotinic re-ceptors, Proc. Nat. Acad. Sci., 77,4326-4330.Hess G.P., Lipkowitz S., Struve G.E.,1978. Acetylcholine-receptor mediatedion flux in electroplax membranemicrosacs (vesicles): change in me-chanism produced by asymmetricaldistribution of sodium and potassiumions, Proc. Nat. Acad. Sci., 75,1703-1707.Anglister L., Silman L., 1978. Molecularstructure of elongated forms of electriceel acetylcholinesterase, J. Mol. Biol125, 293-311.

ЗрениеMiller W.H., (ed.), 1981. MolecularMechanisms of Photoreceptor Trans-duction, Academic Press.Hagins W.A., 1979. Excitation invertebrate photo receptors. In: SchmittF.O. and Worden F.G. (eds.), TheNeurosciences: Fourth Study Program,pp. 183-191, MIT Press.Hubbell W.L., Bownds M.D., 1979.Vi-sual transduction in vertebratephotoreceptors, Ann. Rev. Neurosci., 2,17-34.Wald G., 1968. The molecular basis ofvisual excitation, Nature, 219, 800-807.(Нобелевская лекция; содержит ин-тересное описание того, как был от-крыт первичный акт зрительноговозбуждения.)Young R.W., 1970. Visual cells, Sci.Amer., 223(4), 80-91.Dawling J.E., 1966. Night blindness,Sci. Amer., 215(4), 78-84.MacNichol E.F., Jr., 1964. Three-pigment color vision, Sci. Amer.,211(6), 48-56.Yoshikami S., George J.S., Hagins W.-A., 1980. Light-induced calcium fluxesfrom outer segment layer of vertebrateretinas, Nature, 286, 395-398.Pober J.S., Bitensky M.W., 1979.Light-regulated enzymes of vertebrateretinal rods, Advan. Cyclic NucleotideRes., 11, 265-301.Liebman P.A., Pugh E.N., Jr., 1979.The control of phosphodiesterase inrod disk membranes: kinetics, possiblemechanisms, and significance forvision, Vision Res., 19, 375-380.

Fung B.K.-K., Stryer L., 1980.Photolyzed rhodopsin catalyzes theexchange of GTP for bound GDP inretinal rod outer segments, Proc. Nat.Acad. Sci., 77, 2500-2504.

ХемотаксисKoshland D.E., Jr., 1979. A modelregulatory system: bacterialchemotaxis, Physiol. Rev., 59, 811-862.Macnab R., Koshland D.E., Jr., 1972.The gradient-sensing mchanism inbacterial chemotaxis, Proc. Nat. Acad.Sci., 69, 2509-2512. (Эти опыты пока-зали, что бактерии определяют вре-менной, а не пространственный гра-диент.)Springer M.S., Goy M.F., Adler J.,1979. Protein methylation in behavi-oural control mechanisms and insignal transduction, Nature, 280,279-284.Silverman M.R., Simon M.I., 1974.Flagellar rotation and the mechanismof bacterial motility, Nature, 249,73-74.Manson M.D., Tedesco P., Berg C.,Harold F.M., van der Drift C., 1977.A protomotive force drives bacterialflagella, Proc. Nat. Acad. Sci., 74,3060-3064.Manson M.D., Tedesco P.M.,Berg H.C., 1980. Energetics of flagellarrotation in bacteria, J. Mol. Biol., 138,541-561.Khan S., Macnab R.M., 1980. Protonchemical potential, proton electricalpotential and bacterial motility, J.Mol. Biol, 138, 599-614.Stock J.B., Koshland D.E., Jr., 1978.A protein methylesterase involved inbacterial sensing, Proc. Nat. Acad. Sci.,75, 3659-3663.Kondoh H., Ball С.В., Adler J., 1979.Identification of a methyl-acceptingchemotaxis protein for the ribose andgalactose chemoreceptors ofEscherichia coli, Proc. Nat. Acad. Sci.,76, 260-264,Berg H.C, Purcell E.M., 1977. Physicsof chemoreception, Biophys. J., 20,193-219.

Ответы на вопросыи задачиГлава 24

1. a) TTGATC; б) GTTCGA; в) ACGCGT;г) ATGGTA.

2. а) [Т] + [С] = 0,46.б) [Т] = 0,30; [С] = 0,24; [А] + [G] = 0,46.

3. 5,88•103 пар оснований.4. Через 1,0 генерацию половина молекул будет

1 5 N— 1 5 N, а другая половина 1 4 N— 1 4 N. Через2,0 поколения четверть всех молекул будет1 5 N — 1 5 N , остальные три четверти 1 4 N— 1 4 N.Гибридные молекулы 1 4 N — 1 5 N при консерва-тивной репликации обнаруживаться не будут.

5. FAD, CoA, NADP+.6. ДНК-лигаза релаксирует сверхспирализован-

ную ДНК, катализируя расщепление фосфодиэ-фирной связи в одной из цепей ДНК. Атакую-щая группа - AMP; она присоединяетсяк 5'-фосфорильной группе в месте расщепления.AMP необходим потому, что эта реакция пред-ставляет собой обращение заключительнойстадии соединения различных кусков ДНК (см.рис. 24.32 в разд. 24.15).

7. 5'-GGCATAC-3'.

Глава 25

1. а) ДНК-полимераза I представляет собой од-ну-единственную полипептидную цепь, а РНК-полимераза имеет субъединичную структуруα2ββ'σ.б) Предшественниками служат дезоксинуклео-зидтрифосфаты, а не рибонуклеозидтрифос-фаты.в) Направление синтеза для обоих ферментов5'—>3'.г) ДНК-полимераза I обладает 5'—>3'- и 3'—>—>5'-экзонуклеазными активностями, а РНК-

полимераза - ни одной из них.д) ДНК-полимераза I осуществляет полукон-сервативный синтез, а РНК-полимераза - кон-сервативный.е) ДНК-полимеразе I необходима затравка,а РНК-полимеразе нет.

356 Ответы на вопросы и задачи

ж) Движущей силой обеих реакций являетсягидролиз пирофосфата.

2. 5'-UAACGGUACGAU-3'.3. 2'-ОН группа в составе РНК действует в каче-

стве внутримолекулярного катализатора. Прищелочном гидролизе РНК образуется 2'3'-ци-клический промежуточный продукт.

4. Кордицепин обрывает синтез РНК. В цепиРНК, содержащей кордицепин, нет 3'-ОН-группы.

5. a) pGCp, AGUp, ACp, Up, GUp и С.б) pGp, CAGp, UACUGp и UCв) pGp, САр, Gp, UAp, CUGp и UC.г) pGp, CAp, Gp, Up, Ap, CUp и С.

6. UAGCCUGAAUp.

Глава 26

1. Leu-Pro-Ser-Asp-Trp-Met-.2. Poly (Leu-Leu-Thr-Tyr).3. a) Pro (CCC), Ser (UCC), Leu (CUC) и Phe

(UUC). В другом случае последнее основаниекаждого из этих кодонов может быть U.б) Эти С —> U- мутации были вызваны азоти-стой кислотой.

4. а) Для этого понадобились бы две заменыоснований.б) Arg, Asn, Gln, Gln, Ile, Met или Thr.

5. а) Нет, эта последовательность возникла в ре-зультате делеции первого основания приведен-ной ниже последовательности и вставки друго-го основания в конце.б)—AGUCCAUCACUUAAU—.

6. Они имеют следующие последовательности:Lys-стоп; -Met-Arg-; -Asn-Gln-.

Глава 27

1. а) Нет; б) нет; в) да.2. В градиенте будет 4 полосы: легкая; тяжелая;

полоса, соответствующая гибриду легкой 30S-и тяжелой 50S-субчастиц; полоса, соответ-ствующая гибриду тяжелой 30S- и легкой 50S-субчастиц.

3. Расходуется примерно 799 богатых энергиейфосфатных связей: 400 для активирования 200аминокислот, 1 для инициации и 398 для обра-зования 199 пептидных связей.

4. б), в) и е) - механизм 1-го типа; а), г) и д) - меха-низм 2-го типа.

5. Простейшее предположение состоит в том, чтоантикодон ССА триптофановой тРНК мутиро-вал в UCA-кодон, комплементарный UGA.Однако изучение этой измененной тРНК при-вело к неожиданному результату. Ее антикодоностался неизменным. Вместо этого произошлозамещение А на G в положении 24. Такимобразом, остаток, расположенный на значи-тельном расстоянии от антикодона в линейнойпоследовательности, может влиять на точностьузнавания кодона.

6. Один из подходов состоит в том, чтобы синте-зировать тРНК, к которой присоединен реак-ционноспособный аналог аминокислоты. На-пример, бромацетилфенилаланил-тРНК служитреагентом для мечения по сродству Р-участкарибосом E.coli. См.статью: Oen H., PellegriniМ., Eilat D., Cantor С. R., Ргос. Nat. Acad. Sci.,

70, 2799 (1973).7. Последовательность GAGGU комплементарна

последовательности пяти оснований на 3'-конце16S-pPHK и расположена на расстоянии не-скольких оснований в 5'-сторону от кодонаAUG. Поэтому этот участок служит сигналомначала синтеза белка. Замещение G на А моглобы ослаблять взаимодействие этой мРНКс 16S-pPHK и снижать таким образом эффек-тивность этой последовательности в качествесигнала инициации. Действительно, эта мута-ция приводит к 10-кратному снижению скоро-сти синтеза белка, кодируемого мРНК. См.статью, в которой подробнее обсуждаютсясвойства этой интересной мутации: Dunn J. J.,Buzash-Pollert E., Studier F. W., Proc. Nat. Acad.Sci., 75, 2741 (1978).

8. В обоих случаях используются реакции гидро-лиза: 3'—>5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I и гидролиз ошибочного проме-жуточного продукта аминоацил—AMP поддействием аминоацил-тРНК—синтетазы.

Глава 28

1. а) у i--мутанта нет lac-репрессора. Поэтомутакой мутант конститутивен в отношении син-теза белков lac-оперона.б) Этот мутант конститутивен в отношении

синтеза белков trp-оперона, так как в нем нетtrp-репрессора.в) В этом мутанте арабинозный оперон не экс-прессируется, так как для активирования тран-скрипции необходима Р2-форма araC-белка.г) Этот мутант обладает литическим дей-ствием, но не лизогенизирующим, так как онне способен синтезировать λ-репрессор.д) Этот мутант обладает лизогенизирующимдействием, но не способен к литическому дей-ствию, так как он не может синтезировать N-белок - позитивный регуляторный фактор тран-скрипции.

2. Одна из возможностей состоит в том, что вiS-мутанте образуется измененный lac-репрес-сор, который почти не имеет сродства к индук-тору, но проявляет нормальное сродство к опе-ратору. Такой lac-репрессор будет связыватьсяс оператором и блокировать транскрипцию да-же в присутствии индуктора.

3. У этого мутанта lac-оператор изменен такимобразом, что он не может связывать репрессор.Такая мутация обозначается OC (от англ.operator constitutive - конститутивный опера-тор).

4. У этого мутанта, видимо, белок, связывающийциклический AMP (БАК), либо имеет изменен-ную структуру (дефектен), либо совсем отсут-ствует.

5. Клетка E. coli, несущая профаг λ, содержит мо-лекулы λ-репрессора, которые также блоки-руют транскрипцию предранних генов другихчастиц фага λ.

6. а) Трансляция транскрипта PRE происходитв 5-10 раз быстрее, чем трансляция транскрип-та РRM, так как он содержит полноценный сиг-нал инициации синтеза белка (как это обсу-ждается в разд. 27.14).б) Более эффективная трансляция транскриптаPRE приводит к быстрому образованию боль-шого количества молекул λ-репрессора, необ-ходимых для установления лизогенного состоя-ния. Обсуждение этого процесса см. в статье:Ptashe M., Backman К., Humagun Z., Jeffrey A.,Maurer R., Meyer В., Sauer R.T., Science, 194,156 (1976).

ПРИЛОЖЕНИЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

Физические константы

и перевод единиц

из одной системы

в другую

Числовые значения физических констант

Величина Символ

Атомная еди- а.е.м.ница массы (Да)(дальтон)

Число Авогад- Nро

Постоянная kБольцманаЭлектрон- эВвольт

Число Фара- Fдея

Радиоактив- Киность

Универсаль- Rная газоваяпостоянная

Постоянная hПланка

Скорость све- ста в вакууме

Значение1

1,66•10-24 г

6,022•1023 моль-1

1,381•10-23 Дж•К-1

3,298•10-24 кал•К-1

1,602 • 10 - 1 9 Дж

3,828•10-20 кал

9,649•104 Кл•моль-1

2,306•104 кал•В-1•экв-1

3,70•1010 расп•с-1

8,314•Дж•моль-1•К-1

1,987 кал•моль-1•К-1

6,626•10-34 Дж•с1,584•10-34 кал•с

2,998•1010см•с-1

1 Использованные сокращения: В - вольт; г - грамм;Дж - джоуль; К - кельвин; кал - калория; Кл - кулон;с - секунда; см-сантиметр; экв - эквивалент.

Математические постоянные

п = 3,14159е = 2,71828

lnх = 2,303 lgx

Соотношение единиц измерения

Физическиевеличины

Длина

Масса

Объем

Температура

Энергия

Давление

Единицы измерения

1 см = 10-2м = 10мм = 104 мкм == 107нм= 108 А = 0,3937 дюйма

1 г = 10-3 кг = 103 мг = 106 мкг= 3,527•10-2 унций

1 см3 = 10-6 м3 = 103 мм3

1 мл = 1 см3 = 10-3 л = 103 мкл1 см3 = 6,1•10-2 дюйм3 = 3,53•10-5

фут3

К = °С + 273,15°С =5/9(°F-32)1 Дж = 107 эрг = 0,239 кал = 1 Вт•с

1 торр = 1 мм рт. ст. (0°C)= 1,333•102 Н/м2

= 1,333•102 Па= 1,316•10-3 атм

Приставки для образования кратных и дольных еди-ниц измерений

Приставка

КилоГектоДекаДециСантиМиллиМикроНаноПико

Обозначение

русскими латински-буквами ми или

гречески-ми буква-ми

к kг hда daд dс сМ mмк μн nп р

Числен-ный экви-валентприставки

103

102

101

10-1

10-2

10-3

10-6

10-9

10-12

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

Порядковые номера

и атомные массы

элементов

Название

АзотАктинийАлюминийАмерицийАргонАстатБарийБериллийБерклийБорБромВанадийВисмутВодородВольфрамГадолинийГаллийГафнийГелийГерманийГольмийДиспрозийЕвропийЖелезоЗолотоИндийИодИридийИттербийИттрийКадмийКалийКалифорнийКальцийКислородКобальт

Знак

NАсAlAmАгAtВаBeBkВВгVBiНWGdGaHfНеGeНоDyEuFeAuInIIrYbYCdКCfCaOCo

П о р я д -ковыйномер

78913951885564

975

352383

174643172

2326766632679495377703948199820

8

27

Атомнаямасса

14,01227,0326,98

243,0639,95

210,99137,34

9,01247,07

10,8179,9050,94

208,971,01

183,85157,2569,72

178,494,00

72,59164,93162,50151,9655,85

196,97114,82126,90

192,22173,0488,91

112,4039,10

249,0740,0816,0058,93

Название

КремнийКриптонКсенонКурчатовийКюрийЛантанЛитийЛоуренсийЛютецийМагнийМарганецМедьМенделевийМолибденМышьякНатрийНеодимНеонНептунийНикельНиобийНобелийОловоОсмийПалладийПлатинаПлутонийПолонийПразеодимПрометийПротактинийРадийРадонРений

Знак

SiКгХеKhCmLaLiLrLuMgMnCuMdMoAsNaNdNeNpNiNbNoSnOsPdPtPuPoPrPmPaRaRnRe


143654

1049657

310371122529

1014233116010932841

102507646789484596191888675


28,0983,80

131,30260245,07138,91

6,94256174,9724,3154,9463,55

255,0995,9474,9222,99

144,2420,18

237,0558,7192,91

255118,69190,20106,40195,09242,06208,98140,91145231,04226,03222,02186,20

Приложения 359

Название

РодийРтутьРубидийРутенийСамарийСвинецСеленСераСереброСкандийСтронцийСурьмаТаллийТанталТеллурТербийТехнеций

Знак

Rh

HgRbRuSmPbSeS

AgScSrSbTlТаТеTbТс


4580374462823416472138518173526543


102,91200,59

85,47101,07150,40207,20

78,9632,06

107,8744,9687,62

121,75204,37180,95127,60158,9398.91

Название

ТитанТорийТуллийУглеродУранФермийФосфорФранцийФторХлорХромЦезийЦерийЦинкЦирконийЭйнштейнийЭрбий

Знак

TiThTmСUFmРFrFClCrCsCeZnZrEsEr


229069

692

10015879

1724555830409968


47,90232,04168,93

12,01238,03257,08

30,97223,02

18,9935,4552,00

132,91140,1265,3791,22

254,09167,26

ПРИЛОЖЕНИЕ В

Значение рК' для

ряда кислот

Кислота

Аммония ион

Аскорбиновая,

pK1'pК2'АцетоуксуснаяБензойная

Вода

Глицин, рК1'рК 2 '

Имидазолияион

Какодиловая

Лимонная,

pK1'pK2'рК3'

Малеиновая,pK1'pK2'

n-Масляная

Молочная

Муравьиная

рК'(при25°С)

9,25

4,1011,79

3,584,20

14,0

2,359,78

6,95

6,19

3,144,776,39

1,836,07

4,81

3,86

3,75

Кислота

Пиридиния ион

Пирофосфорная,рК1'

рК2'рК3'

рК4'

Триметиламмо-ния ион

Трис(гидроксиме-тил)-аминометан

Угольная, pK1'

pK2'Уксусная

Фенол

Фосфорная, pK1'

pK2'рК3'

Этиламмония ионЯблочная, pK1'

pK2'Янтарная, pK1'

pK2'

pК'(при25°С)

5,25

0,85

1,495,77

8,22

9,79

8,08

6,35

10,334,76

9,89

2,12

7,2112,6710,813,405,114,215,64

ПРИЛОЖЕНИЕ Г

Стандартные длины

связей

Связь

С—Н

С—С

С=СС = СС—N

С—O

C=O

С—S

N—НO—НO—О

Р—ОS—НS—S

Структура

R2CH2

АроматическаяRCH3

УглеводороднаяАроматическаяЭтиленАцетиленRNH2

O=C—NСпиртЭфирАльдегидАмидR2S

АмидСпиртO2

ЭфирТиолДисульфид

Длина, А

1,07

1,081,10

1,541,401,331,201,47

1,341,431,361,221,241,82

0,990,97

1,21

1,561,332,05

ПРИЛОЖЕНИЕ Д

Стандартные

сокращения,

принятые в биохимии

АКТГ (АСТН)АПБ (АСР)АТРазаДИФФ (DIPF)ДНК (DNA)

кДНКДНКаза (DNase)ДНФ (DNP)РНК (RNA)

мРНК (mRNA)

рРНК (rRNA)тРНК (tRNA)

РНКаза (RNase)ААСР (АПБ)АСТН (АКТГ)ADPAlaAMP

cAMPArgAsnAspATPATPaseСCDPCMPCTPCoACoQCysdDIPF (ДИФФ)DNA (ДНК)

адренокортикотропный гормонацилпереносящий белокаденозинтрифосфатазадиизопропилфторфосфатдезоксирибонуклеиновая кислотакомплементарная ДНКдезоксирибонуклеазадинитрофенолрибонуклеиновая кислотаинформационная (матричная)РНКрибосомная РНКтранспортная РНКрибонуклеазааденинацил переносящий белокадренокортикотропный гормона денозиндифосфаталанинаденозинмонофосфатциклический AMPаргининаспарагинаспартатаденозинтрифосфатаденозинтрифосфатазацитозинцитидиндифосфатцитидинмонофосфатцитидинтрифосфаткофермент Акофермент Q (убихинон)цистеин2'-дезоксирибодиизопропилфторфосфатдезоксирибонуклеиновая кислота

cDNA (кДHK)DNase (ДНКаза)DNP (ДНФ)DPN+

DPNHFAD

FADH2

fMetFMN

FMNH2

GGDPGlnGluGlyGMP

GTPHbHbCOHbO2

HisHypIgGIleITPLeuLysMbMbO2

MetMetHbNAD+

NADH

комплементарная ДНКдезоксирибонуклеазадинитрофенолсм. NAD+

см. NADHфлавинадениндинуклеотид (окис-ленная форма)флавинадениндинуклеотид (вос-становленная форма)формилметионинфлавинмононуклеотид (окислен-ная форма)флавинмононуклеотид (восста-новленная форма)гуанингуанозиндифосфатглутаминглутаматглицингуанозинмонофосфат

гуанозинтрифосфатгемоглобинкарбоксигемоглобиноксигемоглобингистидингидроксипролиниммуноглобин Gизолейцининозинтрифосфатлейцинлизинмиоглобиноксимиоглобинметионинметгемоглобинникотинамидадениндинуклеотид(окисленная форма)никотинамидадениндинуклеотид(восстановленная форма)

362 Приложения

NADP+

NADPH

Phe

Pi

PPi

ProRNA (РНК)

mRNA (мРНК)

rRNA (pPHK)tRNA (тРНК)

никотинамидадениндинуклео-тидфосфат (окисленнаяформа)

никотинамидадениндинуклео-тидфосфат (восстановленнаяформа)фенилаланиннеорганический ортофосфатнеорганический пирофосфатпролинрибонуклеиновая кислотаинформационная (матричная)РНКрибосомная РНКтранспортная РНК

RNase (РНКаза)SerТThrTPN+

TPNH

TrpTTPTyrUUDPUMPUTPVal

рибонуклеазасеринтиминтреонинсм. NADP+

см. NADPH

триптофантимидинтрифосфаттирозинурацилуридиндифосфатуридинмонофосфатуридинтрифосфатвалин

Именной указатель

Ануин Н. (Unwin N.) I: 222Анфинсен X. (Anfinsen С.) I: 38, 40; III: 240Арбер В. (Arber W.) III: 38, 240Арнольд У. (Arnold W.) II: 185Арнон Д. (Arnon D.) II: 188Аткинсон Д. (Atkinson D.) II: 20Аттер М. (Utter M.) II: 107Афзелиус Б. (Afzelius В.) III: 278

Балтимор Д. (Baltimore D.) III: 180Баркрофт Дж. (Barcroft J.) I: 73Бенеш Р. и Рут (Benesch R., Ruth) I: 73Бензер С (Benzer S.) III: 77Беннет К. (Bennett С.) III: 249Бенс-Джонс Г. (Bence-Jones Н.) III: 242Берг П. (Berg Р.) II: 141Бергстром С. (Bergstrom S.) III: 297Бернал Дж. (Bernal J.) I: 63; III: 292Бернет M. (Burnet M.) III: 240, 255, 257Бернстил M. (Birnstiel M.) III: 141Блобел M. (Blobel G.) III: 158Блоу Д. (Blow D.) I: 154Блох К. (Bloch К.) II: 212Бор К. (Bohr Ch.) I: 72Браун Д. (Brown D.) III: 141Браун M, (Brown M.) II: 218Браунли Дж. (Brownlee G.) III: 158Браунштейн A. (Braunstein A.) II: 162Браше Ж. (Brachet J.) III: 46Бреннер С. (Brenner S.) III: 49, 68Бриттен P. (Britten R.) III: 138Брэгг Л. (Bragg L.) I: 64Бухнер Г (Buchner H.) II: 23Бухнер Э. (Buchner E.) II: 23Бьюкенен Дж. (Buchanan J.) II: 257Бэйлисс У. (Bayliss W.) III: 282

Вагелос П. (Vagelos P.) II: 151Валентайн P. (Valentine R.) III: 239Ван-Нил К. (Van Niel C.) II: 186

364Именнойуказатель

Варбург О. (Warburg О.) II: 24, 96Вейн Дж. (Vane J.) III: 298Вейсс С. (Weiss S.) III: 52Веннесланд Б. (Vennesland В.) II: 62Вестхеймер Ф. (Westheimer F.) II: 62Виноград Дж. (Vinograd J.) III: 20Вуд В. (Wood W.) III: 173

Габер Ф. (Haber F.) II: 230Гарден A. (Harden A.) II: 23Гатано С. (Hatano S.) III: 272Гауровиц Ф. (Haurowitz F.) I: 76Гаффрон Г. (Gaffron H.) II: 185Геллерт M. (Gellert M.) III: 33Гензеляйт К. (Henseleit К.) II: 164Герарт Дж. (Gerhart J.) II: 264Гиббонс Я. (Gibbons J.) III: 278Гиббс Дж. (Gibbs J.W.) II: 7Гилберт У. (Gilbert W.) III: 39, 115Гирке Э. фон (von Gierke E.) II: 129Голдстайн Дж. (Goldstein J.) II: 218Голл Дж. (Gall J.) III: 140Грин Д. (Green D.) II: 143Грин M. (Green M.) III: 239Гринберг Дж. (Greenberg G.) II: 257Гриффит Ф. (Griffith F.) III: 7Гросс Э. (Gross E.) I: 30Грюнберг-Манаго M. (Grunberg-Manago M.) III:

70Гулемин P. (Guillemin R.) III: 295Гэррод A. (Garrod A.) II: 176

Дальтон Дж. (Dalton J.) I: 25Де-Ланж P. (De-Lange R.) III: 129Де Лусия Паула (DeLucia Paula) III: 27Диккенс Ф. (Dickens F.) II: 96Диккерсон Р. (Dickerson R.) II: 88Динцис Г (Dintzis H.) III: 98Доти П. (Doty P.) III: 50Дрейер У. (DreyerW.) III: 249Дэвис Д. (Davies D.) III: 244

Ерне H. (Jerne N.) III: 240, 255

Жакоб Ф. (Jacob F.) III: 48, 49, 113, 114

Зимм Б. (Zimm В.) III: 18

Ингенхауз Я. (Ingenhousz J.) II: 182Ингольд К. (Ingold С.) II: 69Ингрем В. (Ingram V.) I: 92Йонг У. (Young W.) II: 23; III: 347

Кабат Э. (Kabat E.) III: 243Кальвин М. (Calvin М.) II: 193Кан P. (Cahn R.) II: 69Капоши М. (Kaposi M.) III: 36Карновский М. (Karnovsky M.) III: 322Картье Ж. (Cartier J.) I: 186Каспар Д. (Caspar D.) III: 168Касперсон Т. (Caspersson Т.) III: 46Катц Б. (Katz В.) III: 331Кватреказас П. (Cuatrecasas P.) III: 293Кейзер А. (Kaiser А.) III: 122Кейлин Д. (Keilin D.) II: 76Кельвин (Kelvin) II: 62Кендрью Дж. (Kendrew J.) I: 50Кеннеди Ю. (Kennedy E.) II: 141; III: 313Келлер Дж. (Koller G.) III: 241Клуг A. (Klug A.) III: 91, 168Кнооп Ф. (Knoop F.) II: 66, 141Коллман Дж. (Collman J.) I: 59Корана Г. (Khorana H.) III: 72, 74Кори Г. (Cori G.) II: 24, 115, 129; III: 282Кори К. (Cori С.) II: 24, 115, 128; III: 282Кори P. (Corey R.) III: 33Корнберг А. (Kornberg A.) III: 21, 22Корнберг P. (Kornberg R.) I: 223; III: 129Кошланд Д. (Koshland D.) I: 121, 148; II: 38;

III: 351Краут Дж. (Kraut J.) I: 160Кребс Г. (Krebs H.) II: 18, 66, 164Кребс Э. (Krebs E.) III: 287Крик Ф. (Crick F.) III: 11, 67, 68, 168Кэмпбелл А. (Campbell A.) III: 185Кэрнс Дж. (Cairns J.) III: 27Кюне Ф. (Kuhne W.) II: 24

Леви A. (Loewy A.) III: 272Леви-Монтальчини Рита (Levi-Montalcini R.) III:

300Ледер Ф. (Leder P.) III: 251Ледерберг Дж. (Lederberg J.) III: 202, 224, 225Лелуа Л. (Leloir L.) II: 120Леман P. (Lehman R.) III: 26Ленинджер A. (Lehninger A.) II: 141Лёвенштейн В. (Loewenstein W.) III: 322Ли Ч. (Li С.) III: 296Линд Дж. (Lind J.) I: 186Линен Ф. (Lynen F.) II: 143, 174Липкин Д. (Lipkin D.) III: 284

Липман Ф. (Lipmann F.) II: 17; III: 109Липском У. (Lipscomb W.) I: 145; II: 266Листер Дж. (Lister J.) I: 167Локк (Lock) III: 257Любимова М.Н. III: 263

Майер Ю. (Mayer J.) II: 183Мак-Карти M. (McCarty M.) III: 8, 10Мак-Коннелл Г. (McConnell H. M.) I: 224Мак-Леод К. (Mac Leod C.) III: 8. 10Макнаб P. (Macnab R.) III: 351, 352Марголиаш Э. (Margoliash E.) II: 90Мармур Дж. (Marmur J.) III: 50Мартиус К. (Martius С) II: 66Мейергоф О. (Meyerhof О.) II: 24Ментен М. (Menten M.) I: 111Мерфи В. (Murphy W.) II: 170Меселсон М. (Meselson M.) III: 15, 49Миллер О. (Miller О.) III: 141Милстайн Ц. (Milstein С) III: 158, 241Мино F. (Minot G.) II: 170Митчелл П. (Mitchell P.) II: 79, 91; III: 314Михаэлис Л. (Michaelis L.) I: 109, 111Моно Ж. (Monod J.) I: 118; III: 48, 49, 113, 114Мюллер П. (Mueller P.) I: 207Мюллер-Хилл Б. (Muller-Hill В.) III: 115Мэксэм A. (Maxam A.) III: 39

Натанс Д. (Nathans D.) III: 38Нахмансон Д. (Nachmansohn D.) III: 334Нидергерке P. (Niedergerke R.) III: 261Николсон Г. (Nicolson G.) I: 218Ниренберг M. (Nirenberg M.) III: 69, 70, 72, 75Нойберг К. (Neuberg C.) II: 24Номура M. (Nomura M.) III: 98

Огстон A. (Ogston A.) II: 61Оказаки P. (Okazaki R.) III: 31Осава Ф. (Osawa F.) III: 272Отто Дж. (Otto J.) I: 173Очоа С. (Ochoa S.) II: 143; III: 70

Палад Г. (Palade G.) II: 72Пардью M. (Pardue M.) III: 140Парк Дж. (Park J.) III: 225Парнас Я. (Parnus J.) II: 24Пастер Л. (Pasteur L.) II: 23, 284Перутц M. (Perutz M.) I: 50, 63Полинг Л. (Pauling L.) I: 33, 90, 101, 142; II: 240Поляк Р. (Poljak R.) III: 244Портер P. (Porter R.) III: 237, 239Прелог В. (Prelog V.) II: 69

Именнойуказатель 365

Пристли Дж. (Priestley J.) II: 181Пташне М. (Ptashne M.) III: 122Пфеффер В. (Pfeffer W.) III: 349

Раус П. (Rous P.) III: 186Ревель Ж.-П. (Revel J.-P.) III: 322Рейхард П. (Reichard P.) II: 267Рич A. (Rich А.) III: 12, 91Роузман С. (Roseman S.) III: 314Рудин Д. (Rudin D.) I: 107Рэкер Э. (Racker E.) И: 83, 96, 201

Сабатини Д. (Sabatini D.) III: 158Сазерленд Э. (Sutherland E.) III: 282Сайденем Т. (Sydenham Т.) II: 274Сатир П. (Satir P.) III: 278Сведберг Т. (Svedberg T.) III: 48Сент-Дьёрдьи A. (Szent-Gyorgyi Albert) II: 66;

III: 265Сент-Дьёрдьи Э. (Szent-Gyorgyi Andrew) III: 264Сиденхем Т. (Sydenham T.) III: 295Сингер Дж. (Singer J.) I: 218Синсхеймер P. (Sinsheimer R.) III: 16Скоу Й. (Skou J.) III: 306Слэк Х. (Slack С.R.) II: 198Смит Г. (Smith H.) III: 38Снелл Э. (Snell E.) II: 162Соссюр Т. де (de Sassure Т.) II: 182Спигелман С. (Spiegelman S.) III: 50, 183Стайнер Д. (Steiner D.) III: 291Сталь Ф. (Stahl F.) III: 15Старлинг Э. (Starling E.) III: 282Стеккениус В. (Stoeckenius W.) II: 200, 201Стромингер Дж. (Strominger J.) III: 225Строуд P. (Stroud R.) I: 162Сэнгер Ф. (Sanger R.) I: 26, 29; III: 41, 290

Татум Э. (Tatum) III: 202Тейлор Э. (Taylor E.) III: 265Темин Х. (Temin H.) III: 189, 190Тонегава С. (Tonegawa S.) III: 249, 251Торричелли Э. (Torricelli E.) I: 70Тэлмедж Д. (Talmage D.) III: 255

Уайман Дж. (Wyman J.) I: 118Уилкинс M. (Wilkins M.) III: 11Уилсон И. (Wilson I.) III: 336Уильяме P. (Williams R.) III: 169Уитеринг У. (Withering W.) III: 310Уиткоп Б. (Witkop B.) I: 30Уолд Дж. (Wald G.) III: 343Уолш Д. (Walsh D.) III: 287

366Именнойуказатель

Уотсон Дж. (Watson J.) III: 11, 32, 81, 168Уэбстер Д. (Webster D.) II: 225-226Уэйкил С. (Wakil S.) II: 149

Филлипс Д. (Phillips D.) I: 133Фишер Э. (Fischer E.) I: 110; II: 123Флеминг A. (Fleming A.) I: 132; III: 224Флори X. (Florey H.) III: 224Франклин Розалинда (Franklin Rosalind) III: 11Френкел-Конpaт X. (Fraenkel-Conrat H.) III: 169Фуллер Б. (Fuller В.) III: 168

Хайяши О. (Hayaishi О.) II: 175Хаксли Э. (Huxley A.) III: 261, 266, 327Холдейн Дж. (Haldane J.В.S.) I: 173Харрисон С. (Harrison S.) III: 176Хендерсон P. (Henderson R.) I: 222Хенсон Дж. (Hanson J.) III: 261Хеппель Л. (Heppel L.) III: 284Херик Дж. (Herrick J.) I: 88Херриот P. (Herriott R.) III: 9Херши A. (Hershey A.) III: 9, 10Хехт З. (Hecht S.) III: 340Хёрвиц Дж. (Hurwitz J.) III: 52Хилл P. (Hill R.) II: 187Ходжкин A. (Hodgkin A.) III: 327Ходжкин Д. (Hodgkin D.) I: 63; II: 170; III: 292Холдейн Дж. (Haldane J. В. S.) I: 173Холли Р. (Holley R.) III: 90Холлидей P. (Holliday R.) III: 201Хорекер Б. (Horecker В.) II: 96Худ Л. (Hood L.) III: 251Хьюбер P. (Huber R.) I: 162Хэч M. (Hatch M.D.) II: 198

Цвет М. (Tswett M.) I: 93Цукеркандл Э. (Zuckerkandl E.) I: 101

ЧансБ. (Chance В.) II: 81Чаргафф Э. (Chargaff E.) III: 14Чейз Марта (Chase Martha) III: 9, 10Чейн Э. (Chain E.) III: 224

Шанже Ж.-П. (Changeux J.-P.) I: 118Шахман X. (Schachman H.) II: 264Шемин Д. (Shemin D.) II: 248Шестранд Ф. (Sjostrand F.) II: 72

Эбаши С. (Ebashi S.) III: 269Эдгар P. (Edgar R.) III: 173Эдельман Дж. (Edelman G.) III: 238, 244Эдман П. (Edman P.) I: 30Эдмундсон A. (Edmundson A.) III: 248Эйвери О. (Avery O.) III: 8, 10

Эймс Б. (Ames В.) III: 82Эмбден Г. (Embden G.) II: 24Эмерсон P. (Emerson R.) II: 185, 187Энгельгардт В. А, III: 263Эфрусси Б. (Ephrussi В.) III: 137

Ягендорф А. (Jagendorf А.) II: 191Янофски Ч. (Janofsky С) III: 77, 118Ярдецкий О. (Jardetzky О.) III: 309

Указатель латинских названийAmantia phalloides III: 146, 147Bacillus brevis III: 107Bombix mori III: 144Clostridium histolyticum I: 191Corynebacterium diphteriae III: 155Dichapetalum cymosum II: 63Drosophila melanogaster III: 80, 128, 143, 144- virilis III: 140Electrophorus III: 332Escherichia coli III: 19, 22, 34, 51-55, 60, 116- ДНК III: 28-31- конъюгация III: 197- мРНК III: 47- оболочка III: 226- рибосомы III: 97- тРНК III: 48- хеморецепторы HI: 349- электрофорез белков I: 26

-pol-мутанты III: 27, 28Haemophilus influenzae III: 38, 178Halobacterium halobium I: 221Micrococcus lysodeikticus I: 132Penicillum III: 224Physarum polycephalum III: 64, 272Rhizobium III: 230Rhizopus I: 166Salmonella III: 82-84- typhimurium III: 226, 227, 229-- жгутики III: 350Streptomyces III: 61Strongуlocentrotus purpuratus III: 144Torpedo III: 332Vibrio cholerae III: 289Xenopus III: 151- laevis III: 143

Предметный указатель

Абеквоза III: 228Авидин II: 114Агглютинин I: 214Адаптация при зрении III: 345-- хемотаксисе III: 352Адапторная молекула III: 67-68Аденилат см. Аденозин-5'-монофосфатАденилатдезаминаза II: 273Аденилаткиназа II: 10, 264; III: 271Аденилаттрансфераза II: 247; III: 285-287Аденилатциклаза в жировой ткани II: 140- и обмен гликогена II: 123- стимуляция холерным токсином III: 289Аденилилтрансфераза II: 246-247Аденилирование II: 246-247, 283Аденилосукцинат II: 260Аденин II: 255-257; III: 6, 13, 14- таутомерные формы III: 81, 82Аденин-фосфорибозилтрансфераза II: 261S-Аденозилгомоцистеин II: 238S-Аденозилметионин II: 204, 207, 237-239; III:

60, 150, 171, 352Аденозин II: 255-257Аденозиндифосфат (ADP) II: 10, II, 256Аденозиндифосфат, рибозилирование III: 156,

289Аденозин-3',5'-монофосфат (циклический AMP,

сАМР) III: 116-117- в жировых клетках II: 140- и действие гормонов III: 282-289-- обмен гликогена II: 122-123, 125-128Аденозин-5'-монофосфат (AMP) II: 10, 256, 259-

260Аденозинтрифосфат (АТР) II: 10-13, 141, 255,

256, 280-281- в мышцах III: 270-271-- ресничках III: 278, 279- образование при гликолизе II: 31-33--- окислении жирных кислот II: 144-145--- окислительном фосфорилировании II: 71,

78-81, 83-84--- фотосинтезе II: 190-194, 200- при генетической рекомбинации III: 200-- репликации ДНК III: 32-33

368Предметныйуказатель

-- транспорте ионов III: 270-271, 304, 306-308,311-312

Аденозинтрифосфатаза см. АТРазаАдреналин II: 122-123, 248, 292; III: 282, 284,

339Адреногенитальный синдром см. ВирилизмАдренодоксин II: 222Адренокортикотропный гормон (АКТГ) I: 47;

II: 222β-Адренэргические рецепторы III: 286Азасерин II: 279Азид II: 81Азотистая кислота III: 81-82Азотистые основания. См. также Пиримидины,

Пурины-- номенклатура II: 255-257; III: 6, 24-- пары III: 11-15, 19-20Азотистый баланс II: 233Азотфиксация II: 230-232Аконитаза II: 50, 63-64Аконитат II: 50, 51Акридины III: 82Аксонема III: 277-279Аксоны III: 300, 327АКТГ см. Адренокортикотропный гормонАктивный транспорт III: 304-306- центр I: 109-110-- карбоксипептидазы А I: 146-- лизоцима I: 134, 140-- рибонуклеазы S I: 17-- химотрипсина I: 157-159Актин III: 261, 263, 265-266, 269-276Актиномицин III: 61-64, 116Актомиозин III: 265Акцелерин I: 175Алании I: 20; II: 167, 233-234Аланин-аминотрансфераза II: 160Аланиновая тРНК III: 94-95Алкаптонурия II: 176Алкенильный эфир глицерола II: 208Алкогольдегидрогеназа II: 36Аллантоиказа II: 275Аллантоин II: 273, 275Аллантоиновая кислота (аллантоат) II: 273, 275Аллантоиназа II: 275Аллельное исключение III: 252D-Аллоза II: 46Аллоксан III: 295Аллолактоза III: 112Аллопуринол II: 276Аллостерические белки I: 69, 75, 77, 84

-взаимодействия I: 106, 118-122; II: 282-283- свойства гемоглобинов I: 69-87- ферменты I: 118-122; II: 34-35, 123-125, 264-

268Аллостерический активатор II: 120Аллостерическое ингибирование I: 116, 120- различие III: 242Альдимины II: 162, 163Альдозы II: 24, 29, 46Альдолаза II: 30, 38-39- при фотосинтезе II: 195-196Альдоль-гистидиновый комплекс I: 190Альдольная конденсация I: 190Альдольное расщепление II: 27D-Альтроза II: 46α-Аманитин III: 146-147Аметоптерин II: 270; III: 189Амидная связь I: 23Амилозы II: 131Амилопектин II: 131Аминоакрилат II: 163Аминоациладенилат III: 88Аминоацил-АМР III: 89Аминоацил-тРНК III: 87-89, 103- гибридная III: 93Аминоацил-тРНК-синтетаза III: 88-90, 100Аминоацильный участок (А-участок) III: 102-104γ-Аминобутират см. γ-Аминомасляная кислотаАминобутират-глутамат-аминотрансфераза III:

3405-Аминоимидазолрибонуклеотид II: 259Аминокислотные остатки I: 81-83-- в гемоглобине I: 65-66- последовательности в адренокортикотропном

гормоне I: 47--- белках I: 26-27, 37-39, 63; III: 7--- гемоглобине I: 63-65--- гликофорине I: 216--- иммуноглобулинах III: 240-244--- инсулине I: 27--- лизоциме I: 35--- миоглобине I: 56, 63--- рибонуклеазе I: 39--- эпидермальном факторе роста III: 301-- гомологичные участки I: 63; III: 244Аминокислоты I; 19-23, 32; II: 160-179, 247-248;

III: 68-69, 75, 87-89- в гистонах III: 129- D-изомеры I: 20; III: 219- N-концевые I: 28-30- незаменимые II: 230, 233-234, 239- способность к образованию водородных свя-

зей I: 123-124- транспорт III: 312-313- рК I: 45, 46δ-Аминолевулинат II: 249δ-Аминолевулинат-синтетаза II: 249γ-Аминомасляная кислота (ГАМК) II: 274; III:

338-340Аминопептидаза III: 105β-Аминопропионитрил I: 190Аминоптерин II: 2702-Аминопурин III: 81

Аминосахара I: 193Амитал II: 81Аммоний (NH4

+) II: 160-166, 230-232Аммоникс I: 210Аммонотелические организмы II: 164Амниоцентез II: 212Амплификация II: 128; III: 141, 145Амфипатические соединения 1: 204Анаболизм II: 205Анаболические пути II: 21Аналоги оснований III: 24, 81, 83Анаплеротические реакции II: 64, 108Ангстрем I: 34Андерсена болезнь II: 130Андрогены II: 221-224Андростендион II: 223, 224Анемия I: 88-90; II: 103, 170, 172Анионный канал I: 213Антибиотики III: 304, 316-320. См. также по

названиям- как ингибиторы транскрипции III: 61-62- устойчивость к ним III: 205-206Антибиотики-каналообразователи III: 317Антибиотики-переносчики III: 316, 318Антигемофильный фактор I: 173Антиген (иммуноген) III: 234Т-Антиген III: 151Антиген-антитело, комплексы III: 238, 256Антигенная детерминанта III: 234Антиген-связывающие участки антител III: 236-

237, 240, 245-246Антидот III: 336-337Антикоагулянты I: 170, 176Антикодон III: 68, 91-95Антикодоновая петля III: 91, 93Антимицин А II: 80, 81Антипараллельный слой II: 37Антипорт III: 312-313Антисыворотка III: 236Антитела см. ИммуноглобулиныАнтитромбин I: 175Антранилат II: 241, 242АПБ см. Ацилпереносящий белокАпомиоглобин I: 62-63Апопротеин I: 48Арабиноза II: 46; III: 117Арабинозный оперон III: 117-119Арабино-изомераза III: 116, 117Арахидат II: 139Аргиназа II: 164Аргинин I: 21, 22; II: 169- в цикле мочевины II: 164—165Аргининосукциназа II: 165Аргининосукцинат II: 164—165Аргининосукцинат-синтетаза II: 164Арсенат II: 411-Арсено-3-фосфоглицерат II: 41Асимметрия биологических мембран I: 200, 214,

219- системы транспорта Na+ и К+ I: 219

Предметныйуказатель 369

Аскорбиновая кислота (витамин С) I: 181, 186,187

Аспарагин I: 21, 22; II: 168, 234Аспартат I: 21, 22; II: 233-234- в биосинтезе пиримидинов II: 262-- цикле мочевины II: 164—165- трансаминирование II: 168-169Аспартат-карбомоилтрансфераза II: 262Аспартат-транскарбамоилаза (АТКаза) II: 264-

266β-Аспартилфосфат III: 307Аспирин (ацетилсалицилат) III: 298, 299Атеросклероз II: 220Атрактилозид II: 86Аттенуация III: 59, 119-120Аутоиммунное заболевание III: 338Афинная метка I: 157-158; III: 243- хроматография I: 25-26; III: 236Ацетальдегид II: 36Ацетат I: 10; III: 334N-Ацетилгалактозамин I: 214N-Ацетилглюкозамин (NAG) I: 133, 137, 138, 214- в клеточной стенке бактерий III: 219, 221N-Ацетилглюкозамин-1-фосфат III: 221Ацетилкоэнзим А см. Ацетил-СоААцетиллипоамид II: 57N-Ацетилмурамовая кислота (NAM) I: 133- в клеточной стенке бактерий III: 219-223N-Ацетилнейраминат II: 209, 210Ацетил-трансацетилаза II: 151, 152Ацетилфосфат II: 12Ацетилхолин III: 330-334Ацетилхолиновый рецептор III: 332-338Ацетилхолинэстераза I: 114, 157; III: 330, 334-

336, 338Ацетильные группы II: 16Ацетил-СоА II: 5, 16, 49, 287-288- и жирные кислоты II: 143-144, 149-- синтез ацетилхолина III: 330- образование из лейцина II: 174--- пирувата II: 49-- при диабете III: 294Ацетил-СоА—карбоксилаза II: 149-151, 286Ацетоацетат II: 147-148, 174, 294- при диабете III: 294Ацетоацетил-АПБ II: 152Ацетоацетил-СоА II: 147, 166Ацетон II: 147; III: 194Ациладенилат I: 141-142, 161Ацилирование I: 156, 159Ацилкарнитин II: 143Ацил-коффермент А см. Ацил-СоААцилпереносящий белок (АПБ) II: 151N-Ацилсфингозин II: 208Ацил-АМР II: 142Ацил-СоА I: 35-36; II: 142-145Ацил-СоА-дегидрогеназа II: 144Ацил-СоА: карнитин-ацилтрансфераза II: 143Ацил-СоА-синтетаза II: 141Ацил-СоА-холестерол-ацилтрансфераза II: 220


AMP см. Аденозин-5'-монофосфатАТ-пары III: 13, 20АТР см. АденозинтрифосфатATP-ADP-транслоказа II: 86АТРаза в митохондриях II: 84-- мышцах III: 264-266- и транспорт ионов III: 306-313

БАК см. Белковый активатор катаболизмаБактерии, ДНК в них III: 19, 20, 100, 218-232- конъюгация III: 197, 201-205- пространственный градиент III: 351-352- хеморецепторы III: 349-353- экспрессия эукариотических генов III: 212-213Бактериородопсин I: 221-222; II: 200-201Бактериофаги см. ФагиБактериохлорофилл II: 189Бацитрацин III: 161Белки I: 18-47; III: 154-159. См. также по на-

званиям- вирусов III: 179-180, 183- вспомогательные (морфопоэтические) III:

173-174- дестабилизирующие спираль ДНК III: 33- ковалентная модификация I: 105-106; II: 283- кодируемые вирусом SV-40 III: 188- конформация I: 32-34, 38, 40-42, 120- мембран I: 208-218; III: 156-158, 326- митохондрий III: 159- при талассемии III: 154- рекомбинации (recА, recВ, recС, recВС) III: 200- рибосом III: 158- секреторные III: 156-158- синтез III: 76, 87-110. См. также Трансля-

ция, Рибосомы-- в бактериях III: 100-102- содержащие негемовое железо II: 32, 75. См.

также ЖелезопротеиныБелки соединительной ткани I: 179-198- фагов III: 124, 183- хлоропластов III: 159Белки-антидетерминаторы III: 59Белковый активатор катаболизма (БАК) III: 116,

117Cro-белок III: 124Fe-S-белок см. ЖелезосеропротеиныG-белок III: 286-287HPr-белок III: 315Mo-Fe-белок II: 231recА-белок III: .200rep-белок (хеликаза) III: 33ρ-белок (ρ-фактор) III: 58-60Белые мышцы III: 271Бензилпенициллин III: 224, 226Бензойная кислота II: 141Бенс-Джонса белок III: 242Бери-бери II: 60Бесклеточная система III: 70, 151, 155Бетаин II: 238Бехангат II: 139Библиотека ДНК III: 211-212Бикарбонат см. Диоксид углерода

Биливердин II: 251Билирубин II: 251-252Бимолекулярный слой (бислой) I: 205-208Биологические процессы, их скорость I: 12Биотин II: 107-108, 114, 149-150Биотинкарбоксилаза II: 150Биполярные ионы (цвиттерионы) I: 191,3-Бисфосфоглицерат (1,3-БФГ) I: 15; II: 41-442,3-Бисфосфоглицерат (2,3-БФГ) I: 73-75, 80-82;

II: 41-44Бисфосфоглицератмутаза I: 115; II: 42Болезнь накопления гликогена II: 131Бонгкрековая кислота II: 86Бора эффект I: 72-73, 81-84Борсодержащие кислоты I: 178Брожение II: 235-Бромдезоксиуридин III: 135Бромистый циан I: 30, 325-Бромурацил III: 81α-Бунгаротоксин III: 333Бутирил-АПБ II: 152, 153Буферная емкость раствора I: 46БФГ см. Бифосфоглицерат

Варфарин I: 170, 171Ведущая нить III: 31Векторы для клонирования ДНК III: 207, 210-

211Вернике - Корсакова синдром II: 102«Ветвящий» фермент II: 121Вирилизм II: 224-225Вирус бешенства III: 181- везикулярного стоматита III: 180-181- кустистой карликовости томата III: 176- папилломы III: 188- полиомиелита III: 179-182- полиомы III: 186-189- саркомы Рауса III: 179, 186- табачной мозаики (ВТМ) III: 167-173--- мутации III: 77- ящура III: 179- Qβ III: 182, 183- R17 III: 182, 183- SV-40 III: 55, 186-189-- генетическая карта III: 189Вирусы, оболочка III: 167-168- перекрывающиеся гены III: 78, 183- РНК-содержащие III: 178-179, 189-190- самосборка III: 167-194Витамин А (полностью-транс-ретинол) II: 17, 18;

III: 342- B1 (тиамин) II: 60- В2 II: 17- В6 (пиридоксин) II: 17, 124, 161- В12 (кобаламин) II: 170-172, 238- D II: 223-224- D2 II: 18Витамин D3 II: 223-224- Е II: 18- К I: 170; III: 248- K1 II: 17, 18; III: 248

- К2 I: 170; II: 226Витамины II: 17-18. См. также по названиямВода I: 10, 125-127Водород, стереоспецифический перенос II: 62-63Водородные связи I: 122-124-- необычные III: 92Водоросли II: 193Воротный ток III: 330Времена биологических процессов I: 11-12Временной градиент III: 351-352Вставочные последовательности (вставки, интро-

ны, IS-элементы) III: 78-83, 150-151, 196,202, 206-207

ВТМ см. Вирус табачной мозаикиВторичная структура I: 37Вырожденность кода III: 69, 76-- гипотеза качания III: 94—95Высокий потенциал переноса фосфатной группы

II: 11Высокоэнергетические связи II: 11-12

Газовая гангрена I: 191Галактиол II: 135Галактоза I: 106; II: 46, 134-135; III: 112Галактоземия II: 135β-Галактозидаза III: 112-113Галактозидпермеаза III: 112Галактозилтрансфераза II: 132Галактозо-1-фосфат II: 134Галактозо-1-фосфат-уридилтрансфераза II: 134,

135Галактокиназа II: 134Галактолипиды II: 184Галобактерии II: 200-201Галотан II: 111Ганглиозиды I: 204; II: 208-211Гаптен III: 234-236, 240Гаптен-антитело, комплекс III: 236-237Гаптенная детерминанта III: 234Гексадеканоат II: 139Гекса-NAG III: 137-138Гексозомонофосфатный путь см. Пентозофос-

фатный путьГексозы I: 25, 46, 47Гексокиназа I: 18; II: 28, 29, 38, 43Геликаза III: 33Гель-фильтрация I: 25Гель-электрофорез см. Электрофорез в полиак-

риламидном гелеГем I: 48-50; II: 249, 250- в миоглобине I: 56-60- связывание с СО2 I: 60-61Гем а II: 77Гем-гем, взаимодействие I: 72Гемоглобин I: 48-87- гены III: 154-155- мутации I: 98-100; III: 77. См. также Сер-

повидноклеточная анемия, Талассемия- плода I: 75; III: 154


Гемоглобин А, А2 I: 63- F I: 63- М I: 99- S I: 90-98- α- и β-цепи I: 63-65, 75Гем-оксигеназа II: 251Геморрагия I: 170, 175Гемофилия I: 172-173Ген. См. также Гены- овальальбумина III: 79, 81- фиброина III: 144-145- cro III: 123, 124- i III: 113-114- ilv III: 29- J III: 251-252- src III: 191-192- trp III: 30Генетическая рекомбинация III: 196-216Генетический код III: 68-69, 75-77Геномы, конструирование III: 196, 207-215- области гомологии III: 191, 200Гены. См. также по названиям- антител III: 248-250- вирусов III: 120, 121- влияние стероидных гормонов III: 298-299- гемоглобинов III: 154—155. См. также Мо-

лекулярные болезни- гистонов III: 143, 144- клонирование III: 196, 207-209, 214- коллинеарность III: 77-80- лимфоцитов III: 249-250- перекрывающиеся III: 77-79, 182-183- перестройки III: 196-216- разорванное строение III: 78-80, 145-146, 150,

151- рибосомных РНК III: 140-142- уникальные III: 144—145- фага Т4 III: 172-173- экспрессия III: 112-125- эукариот III: 78, 211-213Гепарансульфат I: 193Гепарин I: 176, 195Гептануклеотиды III: 140Гептозы II: 25; III: 228Геранилпирофосфат II: 214-216, 227Гетерогенная ядерная РНК (гяРНК) III: 148-149Гетерокарион I: 215-217Гетеротропные эффекты I: 120Гиалуроновая кислота I: 194, 195Гибридизация (гибриды) ДНК и РНК III: 29,

30, 50-52- in situ III: 140Гибридомы III: 240-241Гидразин I: 47; III: 40Гидрид-ион II: 39-40Гидроксиапатит (фосфат кальция) I: 189; III: 1383-Гидроксиацил-АПБ-дегидратаза II: 152L-Гидроксиацил-СоА II: 144D-3-Гидроксибутират II: 147


Гидроксикобаламин II: 17121-Гидроксилаза I: 181; II: 224-225Гидроксиламин I: 32; III: 82, 336Гидроксилизин I: 180, 182, 1923-Гидрокси-3-метилглутарил-СоА II: 147, 174, 2133-Гидрокси-3-метилглутарил-СоА - редуктаза II:

213, 217Гидроксиметилирование III: 1735-Гидроксиметилцитозин III: 17317α-Гидроксипрогестерон II: 2244-Гидроксипролин I: 22, 180-181, 1925-Гидрокситриптамин II: 248Гидроксифенилпируват II: 175, 176, 240n-Гидроксифенилпируват-гидроксилаза II: 175Гидроксиэтиламинопирофосфат II: 56Гидролиз I: 104Гидрофильные группы I: 204Гидрофобные взаимодействия I: 127, 205-206- группы I: 204Гипераммонемия II: 166Гипервариабельные участки III: 243, 246Гипертермия II: 1 1 1Гиперхолестеролемия II: 219-220Гиперхромизм III: 19Гипогликемия III: 290Гипоксантин II: 259, 273, 276; III: 24, 82Гипоксантин-гуанин - фосфорибозилтрансфераза

II: 261, 275-276Гипохромизм III: 138Гирке болезнь II: 129-130Гистамин I: 60; II: 248Гистидин I: 21, 22, 56; II: 242, 244- превращение в глутамат II: 168-169- участие в катализе I: 157-159Гистидиновые кодоны III: 120- опероны III: 122Гистидинол II: 244Гистидинолфосфат II: 244Гистоны III: 79, 127-130, 132-133, 136-137, 143Гладкий эндоплазматический ретикулум II: 282Гликоген II: 115-137Гликоген-синтаза II: 121, 126Гликоген-фосфорилаза (фосфорилазы α и β) II:

116, 117, 123-125Гликозаминогликаны I: 193, 195; III: 163Гликозидные связи I: 133; II: 117-118, 255Гликозилирование III: 163Гликолат II: 199Гликолиз (гликолитический путь) II: 23, 29-45,

283- наследственные нарушения II: 43-44N-Гликолилнейраминат II: 209Гликолипиды I: 203-205, 214, 216; III: 163Гликопептид-транспептидаза III: 223Гликопротеины I: 214-216; III: 159-163. См. так-

же КоллагенГликофорин А I: 213-214Гликохолат II: 215Глиоксилат II: 199, 274D-Глицеральдегид II: 25, 46Глицеральдегид-3-фосфат II: 30-32, 97, 98Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа II: 31,

39-41, 195Глицерол I: 201-203- как предшественник тейхоевой кислоты III:

223- образование из триацилглицеролов II: 140Глицерол-3-фосфат I: 201; II: 11, 12, 84-85- как предшественник фосфатидных кислот II:

205- образование из глицерола II: 140-141Глицерол-фосфатацилтрансфераза II: 205Глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа II: 84—85Глицеролфосфатный челночный механизм II: 85Глицилтирозин I: 146-148Глицил-тРНК III: 222Глицин I: 20; II: 235, 257; III: 71, 72, 97- в коллагене I: 180, 184- превращения II: 167- при синтезе порфирина II: 248Глицинамидрибонуклеотид II: 258Глицин-синтаза II: 235β-Глобин III: 78, 79, 151, 154Глобиновые гены III: 78, 79, 154Глутамат (глутаминовая кислота) I: 21, 22; II:

167-169, 232-234превращение в ГАМК III : 340

- распад II: 160-161Глутаматаминотрансфераза II: 160Глутаматдегидрогеназа II: 160-161, 169, 232-233Глутамат-декарбоксилаза III: 339, 340Глутамат-синтетаза II : 233Глутамин I: 21, 22; II: 169, 232-233- в фиброине I: 169- как донор азота II; 245Глутаминаза II: 169Глутамин-синтетаза II: 232-233, 245-247Глутатион II: 103-104, 268Глутатионредуктаза II : 103, 105, 268Глюкогенные аминокислоты II: 167Глюкагон II: 122-123, 291-293; III: 282, 284,

286Глюкоза I: 10; II: 24-27, 46, 105-106, 285; III:

112, 113- в крови II: 292-293- ингибирование синтеза циклического AMP III:

116- и образование АТР II: 86- транспорт III: 312-313Глюкозилирование III: 173Глюкозо-1,6-бисфосфат II: 119Глюкозо-1-фосфат II: 12, 116-122, 285Глюкозо-6-фосфат II: 12, 28-30, 286-- в глюконеогенезе II: 107-- обмене гликогена II: 118-120, 122-- пентозо-фосфатном пути II: 95-100Глюкозо-6-фосфатаза II: 119-120, 129, 130Глюкозо-6-фосфат—дегидрогеназа II: 96, 103-

105, 285Глюкокортикоиды II: 221-222; III: 299Глюконеогенез II: 105-110, 112, 287- влияние инсулина III: 290α-D-Глюкопираноза II: 25Глюкуронат II: 252; III: 7Глюкуронид билирубина II: 252

Голодание II: 293; III: 288Голофермент III: 54, 55Гольджи аппарат III: 161-163Гомогентизат II: 175Гомогентизатоксидаза II: 175Гомополипептиды III: 74Гомотропные эффекты I: 120Гомоцистеин II: 238-239Гомоцистеин-метилтрансфераза II: 238Гормональные регуляторы метаболизма II: 291Гормон-рецепторный комплекс III: 299-300Гормоны III: 282-309. См. также по названиям- влияние на синтез гликогена I: 122-123---- лактозы II: 133- и активность ферментов I: 106-- циклический AMP III: 282-289Гош-конформация I: 219Грама метод окрашивания III: 218Грамицидин А III: 316, 320, 321- S III: 107-109Грам-отрицательные бактерии III: 218, 226-232Грам-положительные бактерии III: 218-226Граны II: 180Грибной яд III: 146-147, 276Гуанин I: 91; II: 255; III: 6, 13, 14Гуанингидрохлорид I: 39Гуаниннуклеозидсвязывающий белок см. G-бе-

локГуанинтрифосфат III: 149Гуанозин I: 255, 256; III: 289Гуанозинмонофосфат (GMP) II: 256-260Гуанозин-5'(β,γ-имидо)-трифосфат (Gpp[NH]р)

III: 289Гуанозинмонофосфат (GMP) II: 256-260Гуанозинтрифосфат (GTP) II: 52, 109; III: 102,

103, 289, 347D-Гулоза II: 46гяРНК см. Гетерогенная ядерная ДНКGMP см. ГуанозинмонофосфатGTP см. Гуанозинтрифосфат

Дальтон I: 25ε-Дансиллизин III: 237Дансилхлорид I: 29-30Дауэкс-50 I: 28Двигательные концевые пластинки III: 330Двойная спираль ДНК (двухцепочечная, двух-

спиральная ДНК) III: 11-21Двойные связи I: 219-220Двуокись углерода см. Диоксид углеродаДвухцепочечная ДНК см. Двойная спираль ДНК- РНК III: 47, 179, 192-193Деацилирование I: 155, 156, 159-161«Деветвящий» фермент II: 118Дегидратазы II: 163Дегидратация II: 27, 50Дегидроаскорбиновая кислота I: 186Дегидрогеназы в пентозо-фосфатном цикле см.

Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа, 6-


Фосфоглюконат-дегидрогеназа- в цикле трикарбоновых кислот см. Изоцитрат-

дегидрогеназа- при гликолизе см. Глицеральдегидфосфатде-

гидрогеназа-- окислении жирных кислот II: 145-- синтезе аминокислот см. Глутаматдегидро-

геназа--- жирных кислот см. Малатдегидрогеназа-- фосфорилировании окислительном см.

NADH-дегидрогеназа, Глицерол-3-фос-фатдегидрогеназа

- янтарного полуальдегида III: 3407-Дегидрохолестерол II: 2255-Дегидрохолинат II: 2405-Дегидрошикимовая кислота (5-дегидрошики-

мат) II: 240Дезамидо-NAD+ II: 271, 272Дезаминирование аминокислот II: 160-1635'-Дезоксиаденозилкобаламин II: 171, 172Дезоксиаденозин II: 255, 2563-Дезоксиарабиногептулозонат-7-фосфат II: 240Дезоксигемоглобин I: 75-78, 80-81, 95-96Дезоксинуклеотидил-трансфераза (терминальная

трансфераза) III: 209Дезоксирибоза II: 255, 256Дезоксирибонуклеаза III: 173Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) I: 15;

III: 6-44, 128-147, 196-208. См. такжеБиблиотека ДНК, Двойная спираль ДНК,Одноцепочечная ДНК, РекомбинацияДНК, Репликация ДНК

-- клонирование III: 207-214-- кольцевая III: 20-21, 29, 184-- липкие концы III: 209, 210- нетранскрибируемые и нетранслируемые уча-

стки III: 141, 143- связывание гормон-рецепторного комплекса

III: 299-300- эукариотическая III: 133-136, 138Дезоксирибонуклеозиды II: 255Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты III: 21-24Дезоксирибонуклеотиды II: 266Дезокситимидилат (dTMP) II: 268-269Дезокситимидин II: 255, 256Дезоксиуридилат (dUMP) II: 268, 269Дезоксицитидин II: 255, 256Декаметоний III: 337Декарбоксилирование II: 49, 51, 96, 109, 152Дексаметазон III: 299-300Декстран II: 131; III: 236-237α-Декстрин II: 131α-Декстриназа II: 131Делеции III: 80, 82, 83Денатурация I: 39Деполяризация III: 330Дерматансульфат I: 195Дерматоспараксис I: 188Десенсибилизация II: 343; III: 331Десмозин I: 193, 194


Деформилаза III: 105Дефосфокофермент А II: 272, 273Диабет III: 294Диазосоединения III: 243Диализ I: 24, 25Дибутирил-сАМР III: 286Дигидробиоптеринредуктаза II: 175Дигидроксиацетон (кетоза) II: 25, 47, 102Дигидроксиацетонфосфат II: 30-31, 140-141, 1963,4-Дигидроксифенилаланин (ДОФА) III: 3393,4-Дигидроксифенилгликольалъдегид III: 340Дигидроксифенилэтиламин (дофамин) III: 339Дигидроксихолестерол II: 223Дигидролипоамид II: 57, 58Дигидролипоиддегидрогеназа II: 57Дигидролипоилтрансацетилаза II: 56, 57Дигидрооротаза II: 263Дигидрооротат II: 263Дигидросфингозин II: 209Дигидротимин II: 275Дигидрофолят II: 269Дигидрофолят-редуктаза II: 269Дигитоксигенин III: 311Диизопропилфторфосфат (ДИФФ) I: 115, 157,

161; III: 335-337Дикумарол I: 1706-Диметиладенин III: 60Диметилаллилпирофосфат II: 214Диметилксантин III: 286Динеин III: 277-278Динитрофенильное производное бычьего сыво-

роточного альбумина (ДНФ-БСА) III: 235Динитрофенол (ДНФ) III: 235, 237Диоксигеназа II: 175Диоксид углерода (двуокись углерода, СО2) в

цикле трикарбоновых кислот II: 53-- при глюконеогенезе II: 106-108--- при пентозофосфатном пути II: 95, 100--- синтезе жирных кислот II: 149---- пуринов II: 257--- фотосинтезе II: 193-195, 197, 199-- связывание с кислородом I: 72, 73, 81-- транспорт в тропических растениях II: 198Дипептиды I: 23, 37Дисахарид-дипептидное звено III: 221-223Дисахариды II: 132Дистальный гистидин I: 56Дисульфидные связи I: 23-24, 38-39; III: 105, 244-- окисление I: 32, 38Дифосфатидилглицерол I: 203Дифосфопиридиннуклеотид см. Никотинамид-

адениндинуклеотидДифракция рентгеновских лучей I: 52, 54Дифтерийный токсин III: 155-156Диффузия I: 114, 217-224- облегченная II: 86Диэлектрическая постоянная I: 126Ди-NAG I: 142ДНК см. Дезоксирибонуклеиновая кислотаДНК-гираза III: 33ДНК-зависимая РНК-полимераза III: 53ДНК-лигаза III: 26-27, 35ДНК-полимераза РНК-зависимая (обратная

транскриптаза) III: 178, 190ДНК-полимеразы I: 105; III: 21-28, 32-35- дефектные III: 81- эукариотические III: 136ДНК-топоизомераза III: 27-28, 32, 33ДНФ-аминокислоты I: 29Додекановая кислота (додеканоат) II: 139Додецилдиметиламиноксид (ДДАО) I: 210Додецилсульфат натрия (ДСН) I: 209-211, 213Додецилтриметиламмонийбромид I: 210Докозаноат II: 139Домены I: 38, 162- антител III: 244-245, 248, 253Долихол III: 159Долихолпирофосфат III: 161Долихолфосфат III: 160-161, 221ДОФА III: 339ДОФА-декарбоксилаза III: 339Дофамин III: 339Дрожжи II: 23-24, 35ДСН см. Додецилсульфат натрияДупликации генов III: 248-249Дыхание II: 71Дыхательный контроль II: 87-88- коэффициент II: 86

Еноил-АПБ-редуктаза II: 152Еноил-СоА II: 144, 146Еноил-СоА-гидратаза II: 144Енол I: 323-Енолпируватшикимат-5-фосфат II: 240Енолфосфаты II: 41Енолят-анион II: 39ES-комплекс см. Фермент-субстратные комплек-

сы

Жгутики III: 277, 350, 351Железо I: 49, 78-79- в белках см. Железопротеины, Железосеро-

протеиныЖелезопорфирин I: 59-60Железопротеины II: 32, 75Железо-серные комплексы II: 75Железосеропротеины (Fe-S-белки) II: 52, 188, 230Желчные кислоты II: 215Жидкостно-мозаичная модель мембран I: 218-

219Жир, накопление у перелетных птиц II: 295-296Жирные кислоты I: 220-221; II: 138-159, 286-

289, 291-- в крови II: 294-- незаменимые II: 156; III: 297Жировая ткань II: 100-101, 140, 289-290; III: 298

Замена оснований III: 80, 83Заменимые аминокислоты II: 233Замораживание-скалывание I: 211Замораживание - травление I: 211, 212Зарин III: 335, 336Зеленые серные бактерии II: 186Зимаза II: 24

Зимняя спячка II: 88, 91Зимогеновые гранулы I: 152, 153Зимогены I: 105, 152, 160. См, также Профер-

ментыЗингиберин II: 226Змеиные яды III: 333Зрительные рецепторы см. Колбочки, Палочки

Иглобрюх III: 328, 329D-Идоза II: 46β-Изгиб I: 37Изовалерил-СоА II: 174Изовалерил-СоА—дегидрогеназа II: 174Изозимы см. ИзоферментыИзолейцин I: 20; II: 170, 174, 243; III: 89Изомеризация II: 28-30Изомерия цис-транс (цис-транс-конфигурация)

I: 219-220; III: 343-344Изопентенилпирофосфат II: 212-214, 226Изопрен II: 212Изопреновые единицы III: 211Изопропилтиогалактозид III: 112, 113, 115Изоферменты II: 112Изоциановая кислота I: 98Изоцитраза II: 159Изоцитрат II: 50-51Изоцитратдегидрогеназа II: 51Изоэлектрическая точка I: 68, 91Икосаэдрическая симметрия III: 168-169, 177Имидазолацетолфосфат II: 244Имидазолглицеролфосфат II: 2444-Имидазол-5-пропионат II: 168Иминокислоты I: 20Иммуноген см. АнтигенИммуноглобулин A (IGA) III: 246, 248- D (IgD) III: 246- Е (IgE) III: 246, 248- G (IgG) III: 235-240, 243-244, 246, 247- M (IgM) III: 235, 236, 246Иммуноглобулиновые складки III: 244, 246Иммуноглобулины III: 160, 234-258. См. также

Антиген-связывающие участки- классы II: 246, 248, 253-254- мРНК III: 151- трехмерная структура III: 244-245, 247Иммунный ответ III: 235, 255Иммунологическая память III: 256Иммунофлуоресцентная микроскопия III: 272-

275Ингибирование (ферментативных реакций) I:

114-118- по принципу обратной связи I: 106; II: 243Индол-3-глицеролфосфат II: 247Индукторы III: 112-114Индуцированное соответствие III: 110, 111, 144,

148Инициаторная РНК III: 100-103Инициаторный комплекс III: 102Инициация синтеза белков III: 76, 101-102, 153


-- ДНК III: 134-- РНК III: 55-56. См. также Промоторы- факторы III: 102, 155, 209Инозин I: 74; III: 95Инозинат II: 259Инозитол I: 202Инсектициды I: 157; III: 335Инсерционная инактивация III: 210Инструктивная теория III: 240Инсулин I: 27; II: 291; III: 290-295- синтез у Е. coli III: 212, 214Инсулинома III: 213Интегральные мембранные белки I: 210, 213;

III: 326Интеграция (в геном эукариотической клетки)

вирусов III: 192- фагов III; 120, 184-185Интеркаляция III: 62, 64, 82Интерферон III: 192-193Интроны (прерывающие последовательности)

III: 79-80, 145, 252Информационные РНК (мРНК) III: 46-86, 148-

154-- антител III: 252, 253-- синтетические III: 69-71-- трансляция III: 99-100Иодацетамид I: 115Ионная пара I: 122Ионные связи I: 122. См. также Солевые связиИонный радиус III: 319, 320Ионообменная хроматография I: 25, 28Ионофоры см. Антибиотики-переносчикиИоны металлов III: 52. См. также Калий, Каль-

ций, НатрийIS-элементы см. Вставочные последовательно-

стиIgA, IgD, IgE, IgG, IgM см. Иммуноглобулин

A, D, E, G, M

Калиевые каналы III: 327, 328Калиевый потенциал III: 345Калий (ион К+) и возбудимость мембран III:

326-328, 331- связывание с антибиотиками III: 318-320Калликреин I: 175Кальвина цикл II: 196-199Кальмедулин III: 287Кальсеквестрин III: 270Кальциевый насос III: 270Кальций (ион Са2+), влияние на киназу фос-

форилазы II: 126--- межклеточные контакты III: 323, 324--- подвижность клеток III: 274--- свертывание крови I: 171-172- как медиатор для родопсина III: 345-346- при зрении III: 332-- освобождении ацетилхолина III: 332- регуляция мышечного сокращения III: 269-

270


- транспорт III: 270-271, 311-312Кальциферол II: 18Кальцификация I: 189Канцерогены III: 82-84Капсид III: 167, 173N-Карбамоиласпартат II: 262N-Карбамоилизобутират II: 275Карбамоиловые эфиры III: 334-335Карбомоил-производное гемоглобина I: 83Карбамоилфосфат II: 165- в синтезе пиримидинов II: 262-- цикле трикарбоновых кислот II: 164- свободная энергия гидролиза I: 12Карбамоилфосфатсинтаза II: 165, 263-264Карбанион II: 101, 103Карбоангидраза I: 81, 104, 114Карбоксибиотин II: 108Карбоксибиотин-переносящий белок II: 150γ-Карбоксиглутамат I: 22, 23, 170, 171Карбоксильная группа II: 108Карбоксипептидаза А I: 132Карбоксипротеиназы I: 1661-(о-Карбоксифениламино)-1-дезоксирибулозо-5-

фосфат II: 242Карбоний (ион) I: 140, 141Карбонилцианид-n-трифторметоксифенилгидра-

зон II: 88Кардиотонические стероиды III: 309-311Карнитин II: 142-143, 290-291β-Каротин II: 226-227Каротиноиды II: 226Каскадный механизм в обмене гликогена II:

128-- при действии гормонов III: 288-289--- свертывании крови I: 166-167-- регуляторный II: 247Катаболизм II: 205Катаболитная репрессия III: 116Катаболические опероны III: 116-117- пути II: 21Каталаза II: 273Катализ I: 104, 140Каталитическая субъединица II: 265-266Каталитические группы I: 109Катехоламины II: 292; III: 338-339Катехол-О-метилтрансфераза III: 339, 340Катионные каналы III: 331Каучук II: 226«Качания» гипотеза III: 94-95Квазиэквивалентность III: 176Кератансульфат I; 193, 194Кетимины II: 162, 163Кетогенные аминокислоты II: 166-1672-Кето-3-дезоксиоктонат III: 228Кетозо-альдозные изомеризации II: 96Кетозы II: 25, 47, 294Кетоновые тела II: 147-148, 194; III: 294β-Кетотиолаза II: 144Килобазы III: 19Килодальтон I: 25Киназа фосфорилазы II: 123, 125-127Киназы II: 28; III: 191-192, 287, 288Кинин I: 174

Кислород I: 69-72, 79-81- при гидролизе коллагена I: 181-- фотосинтезе II: 186-187, 190- транспорт I: 48Кислота I: 45Клатрин II: 219; III: 161«Кленового сиропа» болезнь II: 174-175Клетки, зародышевые линии III: 250- метаболизм II: 281-282- обкладки сосудистого пучка II: 198-200- образование антител III: 250-252, 254, 255- печени II: 28, 280, 290I-клеточная болезнь III: 163Клеточная подвижность III: 271-272, 276. См.

также Микротрубочки- стенка (оболочка) бактерий I: 132-133; III:

218-232Клеточные мембраны I: 199-224; III: 304. См.

также Белки мембран, Постсинаптиче-ская мембрана

-- асимметрия III: 163-- возбудимые III: 326-355-- проницаемость для Na+ и К+ III: 326-329-- реконструкция II: 201-- текучесть I: 219-221-- эндоплазматического ретикулума II: 156Клеточный цикл III: 136Клональная селекция III: 255-257Клонированная ДНК, библиотека III: 211-212Клонированные гены III: 196, 207-209, 214Клострипаин I: 32«Ключ-замок», модель ферментативного ката-

лиза I: 110Кобаламин II: 170-172Кобальт II: 170-171Кобратоксин III: 343Ковалентная модификация I: 105-106, 283Кодоны III: 68, 75- не кодирующие аминокислот III: 75- синонимические III: 76- узнавание антикодона III: 94-95Козимаза II: 24Колбочки III: 340, 347-348Колицин III: 202Колициногенные факторы III: 202Коллаген I: 19, 179-192Коллагеназы I: 191-192Колхицин III: 277Компартменты I: 199, 222; II: 283-284Комплемент I: 173; III: 238Комплементарная ДНК (кДНК) III: 213Кональбумин III: 146Конвергентная эволюция III: 348Конденсирующий фермент II: 50Конканавалин А I: 26, 214Конкатамеры III: 174-175Конкурентное ингибирование I: 115-118Коннексоны III: 323Константа диссоциации I: 86, 113- Михаэлиса (Км) I: 111-114Константные участки (С-области) III: 241-244,

249, 253-254Конститутивные мутанты III: 113

Конформационная гипотеза сопряжения II: 79Конформационное равновесие I: 120Конфармационное равновесие I: 120Конформация кресла I: 32-34, 137; II: 26- миоглобина I: 55, 57- полипептидных цепей I: 32-34, 37, 38, 40-42- связей С—С в мембранах I: 219-221Концевые пластинки III: 332Кооперативное связывание I: 119-121- взаимодействие в гемоглобине I: 72, 79-80--- коллагене I: 184-185--- липидных бислоях I: 205-206Копропорфириноген II: 249Корепрессор III: 118Кори болезнь II: 130- цикл II: 112Корриновое кольцо (ядро) II: 170, 171Кортизол II: 223; III: 284Кортикостерон II: 223Кортикотропин II: 222; III: 296, 297Кор-фермент III: 55, 56Кость I: 189Котранспорт III: 312Кофакторы цикла трикарбоновых кислот II: 55Кофеин III: 286Кофермент А II: 16, 17, 272- Q II: 75-76, 81«Красное падение» II: 187Красные мышцы III: 271Крахмал II: 131-132Крахмальный гель I: 92Креатин III: 270Креатинкиназа III: 270Креатинфосфат II: 12, 13Кребса цикл см. Цикл трикарбоновых кислот«Кривые Cot» III: 139Криоэнзимология I: 136Кристаллизация I: 50Кристмас-фактор I: 173-175Кристы II: 72Кротонил-АПБ II: 152, 153Крысиные яды I: 170; II: 63Ксантин II: 273Ксантиноксидаза II: 273Ксантиолат II: 290Ксантобиотические соединения II: 222Ксенопус III: 141D-Ксилоза II: 46D-Ксилулоза II: 47Ксилулозо-5-фосфат II: 97-98, 196Ксилулозо-6-фосфат III: 117Кулона закон I: 122Кумулятивная регуляция по типу обратной свя-

зи II: 245Кi I: 116-117Км см. Константа МихаэлисаCoQ см. Кофермент Q


α-Лактальбумин II: 132β-Лактамное кольцо III: 224, 225Лактат II: 36, 111-112Лактат-дегидрогеназа II: 36, 111-112Лактоза I; 106; II: 132-133; III: 112-114Лактозный аналог тетра-NAG I: 142- оператор (lac-оператор) III: 115-117- оперон (lас-оперон) III: 114-117- репрессор (lас-репрессор) III: 115-117Лактозо-синтаза I: 106; II: 132-133Лактоназа II: 96Ламеллиподии III: 271Ланостерол II: 214Латеральная диффузия I: 218Латиризм I: 190Лаурат II: 139Леггемоглобин II: 232Легкие цепи (L-цепи) III: 238-244Лед I: 126Лейкемия II: 270Лейкины I: 214Лейкоциты I: 49Лейцин I: 20; II: 173-174; III: 71Лейцин-энкефалин III: 296Лекарственная идиосинкразия III: 338Летальный синтез II: 63Леша-Нихана синдром II: 276-277Лиазы II: 155Лигноцерат II: 139Лидерная мРНК III: 119-120Лизилгидроксилаза I: 181Лизилоксидаза I: 190Лизин I: 21, 22Лизинонорлейцин I: 193Лизогенизация III: 120Лизогенизирующие фаги III: 202, 204Лизогенный цикл III: 122Лизосомы I: 166; II: 210-211, 219; III: 163Лизофосфатидат II: 205Лизоцим I: 132-144; III: 173Ликопин II: 226, 227D-Ликсоза II: 46Лимонен II: 226Лимфоциты III: 249-250- В и Т III: 235, 256, 257Линкер III: 210Линолеат II: 139, 156Липазы I: 165; II: 140Липид А III: 226-227Липидные бислои I: 205-208, 218Липидный переносчик III: 220-223Липиды I: 201, 215- мембран I: 200-207; III: 318«Липкие» концы III: 184Липоамид II: 56-59Липоевая кислота II: 57Липолиз II: 140; III: 297Липополисахариды III: 226-229Липопротеины II: 218-220, 290Липосомы I: 206-207


β-Липотропин III: 296Люмиродопсин III: 344Lac см. ЛактозаLac-оператор см. Лактозный операторLac-оперон см. Лактозный оперонLac-репрессор см. Лактозный репрессор

Магний (ион Mg2+) II: 28, 29Мак-Ардля болезнь II: 130Макрофаги II: 207; III: 271Макроэргические соединения см. Высокоэнерге-

тическая связь, Высокоэнергетические фос-фаты

Малат II: 52, 53, 155, 198Малат-аспартатный шунт II: 85Малат-дегидрогеназа II: 53, 155Малат-синтетаза II: 1594-Малеилацетоацетат II: 175Малонат I: 115, II: 67Малонил-АПБ II: 151-152Малонил-трансацилаза II: 151, 152Малонил-СоА II: 151, 152Мальтаза II: 132; III: 229Малярия I: 97; II: 104D-Манноза II: 46Маннозо-6-фосфат III: 163Марганец II: 188Масла II: 226Матрикс II: 71, 72Матричная РНК (мРНК) см. Информационные

РНКМевалонат II: 212-214Медиаторы III: 345Медь I: 192; II: 191Межгенная супрессия III: 96Межклеточное соединение III: 305- узнавание I: 215Межклеточные каналы III: 321, 322Меланин II: 177Мембранные везикулы II: 201; III: 312- липиды I: 201-207Мембранный потенциал II: 79-80; III: 304, 313,

327, 332- транспорт I: 219; III: 304-325Мембраны. См. также Клеточные мембраны- митохондрий II: 72, 83-84, 86- тилакоидов II: 180, 184β-Меркаптоэтанол I: 38-39β-Меркаптоэтиламин II: 16Меромиозин легкий (ЛММ) и тяжелый (ТММ)

III: 264, 266, 267Метаболизм II: 6-25, 280, 284-286- адаптация к голоданию II: 293Метаболическая активация II: 222- специализация органов II: 283Метаморфоз головастика I: 191Метанольное отравление I: 118Метародопсины III: 344Метгемоглобин I: 49, 99N5N10-Метенилтетрагидрофолят II: 236, 237Метил-акцепторные белки III: 352, 353L-Метилвалин III: 63

Метилглутамат III: 353β-Метилглутаконил-СоА II: 1747-Метилгуанилат III: 149, 150N5N10-Метилентетрагидрофолят II: 236, 237,

268-269Метилирование при хемотаксисе III: 352- роль кобаламина II: 172Метилированная ДНК III: 177-178Метилированный нуклеотид («колпачок», «кеп»)

III: 60, 149-151Метилкобаламин II: 238β-Метилкротонил-СоА II: 174β-Метилкротонил-СоА-карбоксилаза II: 174Метилмалонил II: 169-173Метилмалонил-СоА II: 1702'-O-Метилрибоза III: 60N5-Метилтетрагидрофолят II: 236-238Метальные группы II: 16, 207, 238-239Метионил-тРНК (Met-тРНК) III: 101Метионин I: 21, 154; II: 169-179, 238; III: 75,

76, 100-101Метионин-энкефалин III: 295, 296Метотрексат II: 270Миастения III: 338Миелинизированные нервные волокна III: 329,

330Миелома III: 240-242Микоплазма III: 19Микроворсинки III:. 275, 276, 313Микросомы II: 156Микротрубочки III: 276-279Микрофиламенты III: 261, 272-274, 276Минералокортикоиды II: 222, 224Минимальный фермент III: 55Миоглобин I: 48-62, 69-72- сравнение с гемоглобином I: 63-64, 69Миозин III: 261-264, 266-273- в немышечных клетках III: 271-273Миокиназа II: 10, 264, 293; III: 271. См. также

АденилаткиназаМиофибриллы III: 260, 262Миристат II: 139Мирицин II: 226Миссенс-супрессоры III: 97Митохондриальная АТРаза II: 79Митохондрии II: 71-72- ДНК в них III: 21, 136-138- рибосомы в них III: 153Михаэлиса константа I: 111-114Михаэлиса-Ментен уравнение I: 112, 118Мицелла I: 205Мобильные (подвижные) генетические элементы

III: 201-202, 205, 206. См. также Вста-вочные последовательности, Плазмиды

Модель из шаров и палочек I: 10-11Модифицирующая субъединица I: 106; II: 133Мозг II: 288Молекулярные болезни I: 88-103- модели I: 10Молекулярный шарнир III: 33, 176, 239, 268, 269Молибден II: 231, 276Моноаминооксидаза III: 339Моноклональные антитела III: 241

Монооксигеназы II: 175, 222Моносахариды II: 24-27Морской еж III: 143Морфин III: 296Мочевая кислота II: 274-276Мочевина I: 39; II: 164-166, 273мРНКi

Met III: 153

Муколипидоз III: 163Мутагенез III: 82Мутагены химические III: 81, 83Мутанты температурочувствительные III: 191-

192- pol III: 27, 28- rif-r III: 61Мутации III: 80-84. См. также Делеции, Дуп-

ликации, Транслокации- и вырожденность кода III: 76-- образование антител III: 250, 254-255- нонсенс III: 82, 96- со сдвигом рамки считывания III: 69, 97- супрессия III: 96-97- у бактерий III: 353Мышечное сокращение III: 260-281Мышечные клетки III: 141Мышцы I: 18, 19; II: 289; III: 260-261, 304Мюллера-Рудина способ получения мембран I:

207Меt-тРНКf см. Метионил-тРНК

Надмуравьиная кислота I: 32, 38Надпочечники II: 225Налоксон III: 296Наперстянка III: 310-311Натриевые каналы III: 327-330, 345-346Натрий (ион Na+) III: 319-320, 327-328- и транспорт сахаров III: 312-313- транспорт см. Натриевые каналы, Натрий-

калиевый насосНатрий-калиевый насос III: 305-310, 327Негемовое железо II: 52, 75Незаменимые аминокислоты II: 230, 233-234, 239- жирные кислоты II: 156Нейромедиаторы III: 330, 338-340Нейротоксины III: 333, 335Неконкурентное ингибирование I: 116-117Немиелинизированные нервные волокна III: 329Ненасыщенные жирные кислоты II: 146Неостигмин III: 334, 336Непермиссивные клетки-хозяева III: 187Неполярные взаимодействия I: 61-62Нервно-мышечное соединение III: 330Нервный импульс III: 326-327Нециклическое фотофосфорилирование II: 192Ниацин II: 17, 270. См. также НикотиноваякислотаНикотинамидадениндинуклеотид (NAD+,

NADH) II: 14, 36-38, 255, 285Никотинамидадениндинуклеотидфосфат

(NADP+, NADH) II: 15, 16, 95-100, 281


- в биосинтезе холестерола II: 214--- дезоксирибонуклеотидов II: 266-268-- гидроксилировании стероидов II: 222-- малат-дегидрогеназной реакции II: 155-156- образование в цикле трикарбоновых кислот

II: 53-- при окислении жирных кислот II: 143-144--- гликолизе II: 32--- фотосинтезе II: 189, 191- окисление II: 84-85- стереоспецифичность II: 62Никотиновая кислота II: 17, 270-272Нингидрин I: 28Нитрогеназный комплекс II: 230-2322-Нитро-5-тиоцианат I: 32n-Нитрофенилацетат I: 155, 156n-Нитрофенилдиазоний III: 243n-Нитрофенол I: 155, 156Нонактин III: 319, 320Норадреналин II: 291, 292; III: 339, 3405'—>3'-Нуклеаза III: 25-26, 35Нуклеиновые кислоты. См. также Дезоксирибо-

нуклеиновая кислота, Рибонуклеиноваякислота

-- конформация III: 11-15, 47-- области гомологии III: 55Нуклеозиддифосфаткиназа II: 264Нуклеозиддифосфаты II: 132Нуклеозидмонофосфаткиназы II: 264Нуклеозидтрифосфаты II: 256Нуклеозид-фосфорилазы II: 273Нуклеозиды II: 255-279Нуклеосомное «ядро» (минимальная нуклеосо-

ма) III: 131-132Нуклеосомы III: 129-133, 136-137Нуклеотидазы II: 273Нуклеотиддифосфаты III: 23Нуклеотиды II: 255-279; III: 6, 11-15, 19, 24Нуклеофильная атака I: 158NAD, NADH см. Никотинамидадениндинуклео-

тидNAD-связывающий участок дегидрогеназы II:

37-38NADH-дегидрогеназа II: 74NADH-Q-редуктаза II: 74-75, 82NADP+, NADH см. Никотинамидадениндину-

клеотидфосфатNAG см. N-АцетилглюкозаминNAM см. N-Ацетилмурамовая кислотаNGF см. Фактор роста нервов

Обратимое ингибирование I: 115Обратная связь I: 106; II: 243-245- транскриптаза III: 178, 190- транскрипция III: 178-179, 190Овальальбумин III: 151-153Одноуглеродные фрагменты II: 235-239


Одноцепочечная ДНК III: 16, 19, 52, 138, 167,200

Оказаки фрагменты III: 31Окаймленные пузырьки III: 161-162β-Окисление II: 143Окислительно-восстановительная пара II: 72-73Окислительно-восстановительный потенциал II:

73-74, 190Окислительное дезаминирование II: 160- фосфорилирование II: 14, 71, 78, 83, 87-88Оксалоацетат II: 49-50, 52-54, 108-109, 168, 198Оксалосукцинат II: 61Оксианион I: 159, 160Оксигемоглобин I: 75-76, 86Оксигеназы II: 195, 199, 222Оксигенирование I: 56-60Оксид азота I: 224- углерода (СО) I: 60, 61, 86-87; II: 81β-Оксоацил-АПБ-редуктаза II: 152Оксоацил-СоА II: 143, 144α-Оксобутират II: 163, 239, 243α-Оксоглутарат I: 181; II: 51, 160, 161, 168-169α-Оксоглутаратдегидрогеназный комплекс II: 51,

59α-Оксоизокапроат II: 174Оксокислоты II: 160, 162, 174, 235Октадекадиеновая кислота II: 138Олеинат I: 201, 220; II: 139, 156Олигоаденилат III: 192Олигомицин II: 84Олигонуклеотид-синтетаза III: 192Олигосахариды III: 159-163Онкогенные вирусы III: 186-192Ооциты ящериц III: 156, 157trp-Оператор III: 118Операторный ген III: 114λ-Операторы III: 122-124trp-Оперон III: 118, 119, 121Опероны III: 114-120Опий и опиаты III: 295Опсины III: 341, 348Опухолеродные (онкогенные) вирусы III: 186-

192Органические фосфаты I: 156; III: 334-337Органоспецифичность метаболизма II: 288Орнитин II: 164Орнитин-карбамоилтрансфераза II: 164Оротидилат II: 262, 263Ортофосфат II: 12Основания как акцепторы протонов I: 45Остемаляция II: 226Отжиг ДНК III: 20«Отпечатки пальцев» I: 93

Палиндром III: 38Палочки сетчатки II: 281; III: 217, 340-349Пальмитат I: 201; II: 139, 145, 156, 159Пальмитоил СоА II: 208Памахин II: 103Панкреатит I: 165Панкреатический ингибитор I: 162-164

Пантотенат (пантотеновая кислота) II: 16, 17,272-273

Папаин I: 166; II: 239Паповавирусы III: 188Паратион III: 335, 336Пастера эффект II: 284Пенициллин III: 218, 224-227Пенициллиназа III: 225-226Пеницилловая кислота III: 225Пентаглициновый мостик III: 219Пентозофосфатный путь II: 95-114, 284-285Пепсин I: 152, 166Пепсиноген I: 152, 166Пепстатин I: 166Пептидазы I: 188-189Пептидилтрансфераза III: 104Пептидильный участок III: 102Пептидная единица I: 33-34- связь I: 23, 29-30, 32, 104; III: 103-104, 223, 226Пептидные карты I: 92-93- мостики III: 223Пептиды I: 27, 30. См. также ПолипептидыПептозогликаны III: 219, 220, 223-224Первичная структура I: 37Первичные транскрипты III: 148, 149СH-Переключение III: 253, 256Перенос заряда I: 158, 176- фосфатных групп II; 11-12, 72- электронов II: 72, 74, 82, 222Перехваты Ранвъе III: 329Переходное соединение I: 166Периплазматическое пространство III: 226Пермеаза III: 113, 114, 313Пермиссивные клетки-хозяева III: 187Пернициозная анемия II: 170, 172Пероксисомы II: 199D-Петля III: 200, 202Печень II: 172, 290-291. См. также Клетки

печениПикорнавирусы III: 179Пили III: 197Пиперидин III: 40Пираноза II: 26-272-Пиридинальдоксимметиодид (ПАМ) III: 337Пиридоксальфосфат I: 108, 109; II: 161-162- в фосфорилазе II: 124Пиридоксин II: 17, 161Пиримидиновые димеры III: 35-37Пиримидины II: 255-256; III: 6, 7- биосинтез II: 262-264, 276- спаривание с пуринами III: 11-15Пирофосфат, гидролиз II: 121, 142, 273; III: 23,

88-- свободная энергия I: 12Пирофосфатная связь III: 149, 1505-Пирофосфомевалонат II: 213, 214Пиррол I: 48Пирролидоновое кольцо I: 55, 183, 185Δ-Пирролин-5-карбоксилат II: 169, 235Пируват II: 27, 54-58, 106, 108, 286-287- в С4-пути II: 198- образование и выход энергии II: 32-33, 163,

167-168

- превращение в ацетил-СоА II: 49, 54--- лактат II: 36--- этанол 35-36Пируватдегидрогеназный комплекс II: 54-59, 64-

65Пируват-Рi-дикиназа II: 198Пируват-карбоксилаза II: 107, 108Пищеварительные ферменты I: 152-178Плавление ДНК III: 19- коллагена I: 185- мембран I: 220Плазмагены II: 208Плазматическая мембрана I: 199; III: 344-345.

См. также Клеточные мембраныПлазматические клетки III: 235, 256Плазмиды III: 201-206- для пенициллиназы III: 226- как векторы III: 210-211- колициногенные III: 210- ColE1 III: 210, 211- pBR322 III: 210- pSC101 III: 205Z-Пластинки III: 271Пластохинон II: 190-191Пластоцианин II: 191Пневмококки III: 7-10Подагра II: 274-276Поджелудочная железа III: 290Полиены II: 184, 227; III: 342Полилизин III: 71Полинуклеотидкиназа III: 64Полинуклеотид-фосфорилаза III: 70Полинуклеотиды синтетические III: 99Полиоксиэтилен I; 210Полипептид гигантский III: 180, 181Полипептидные цепи I: 23-24-- конформация I: 32-34, 38, 40-42Полипептиды I: 23-32Полипиррилметан II: 250Полипролин I: 182, 183; III: 71Полирибонуклеотиды III: 73Полирибосомы III: 100Полисахарид III: 7-10Полисома III: 100, 101Политенные хромосомы III: 147, 148Полиуридилат [poly(U)] III: 70Полифенилаланин III: 70Полицистронный (полигенный) транскрипт III:

115Полицистроны III: 149Полуальдегид янтарной кислоты III: 340Полуацеталь II: 25Полукеталь II: 25-26Полуконсервативная репликация III: 15-16, 133-

134Помпе болезнь II: 130Поперечная диффузия I: 218, 224Поперечнополосатые мышцы III: 260-262Поперечные мостики III: 261, 266- связи I: 190, 192-193


Порин III: 229-230, 232Порфирины II: 248, 250-251Порфирия II: 251Порфобилиноген II: 249, 250Последовательности ДНК повторяющиеся III:

72-75, 138-140. См. также Вставочныепоследовательности

- Прибнова III: 55- сигнальные III: 74-75, 157-159, 231, 252- poly(A) III: 149-150Постсинаптическая мембрана III: 330, 331Потенциал переноса II: 11-12, 16, 72, 74- фосфорилирования II: 20Потенциалы действия III: 326-328Праймаза III: 31, 32Превитамин D3 II: 225-226Прегненолон II: 222-223Предзатравочный комплекс III: 32Прелюмиродопсин III: 344Препроинсулин III: 290-292Префенат II: 240-241Прибнова последовательности III: 55Провитамин D3 II: 225Прогестагены II: 221, 222Прогестерон II: 221, 223Проинсулин III: 290-292- синтез в Е. coli III: 214Прокарбоксипептидаза I: 152Проколлаген I: 187-189Проконвертин I: 175Пролилгидроксилаза I: 181Пролин I: 20, 21, 55Пролипопротеин III: 230, 231Промежуточные продукты цикла трикарбоновых

кислот II: 64, 65Промоторы III: 55-56, 118, 123Проницаемость, коэффициент I: 208-209- липидных бислоев I: 206-208Про-опиокортин III: 296-297Пропионил-СоА II: 146-147, 169-170Пропионил-СоА-карбоксилаза II: 169Проростки пшеницы III: 151Простагландин-синтазы III: 298, 299Простагландин-циклооксигеназа III: 298Простагландины III: 297-298Простетические группы I: 48; III: 105Протеазы I: 166; III: 174-175Протеиназы I: 32, 166Протеинкиназы III: 155, 287-288Протеогликаны I: 193-194Протеолитические ферменты I: 104-105Протонный градиент II: 79, 81-82, 91-92, 190-193;

III: 313-314Протоны, ток (поток) И: 84, 91-92Протопласты III: 224-225Протопорфирин I: 47; II: 249-250Протромбин I: 170-172Профаги III: 120-121, 185Проферменты (зимогены) I: 105-106, 152-153,

160-161, 165


Профосфолипаза А2 I: 165Прохиральная молекула II: 62Процессинг РНК III: 60-61, 148-152, 252Проэластаза I: 152Псевдоуридин III: 61Псевдохолинэстераза III: 338D-Псикоза II: 47Пурины II: 255; III: 6, 7, 14- биосинтез II: 257-262- распад II: 273-274- спаривание с пиримидинами III: 11-15Пуромицин III: 102, 107Пурпурная мембрана II: 200-201Пустые циклы II: 110Пуфы III: 147-148Пятиуглеродные единицы III: 226рК I: 45, 46, 81-83рН I: 45, 143PAS-полосы I: 211PAS-реакция см. Периодат-иод-Шифф

Рабдовирусы III: 181Равновесная седиментация III: 15, 16Радиоактивные изотопы II: 61; III: 22Радиоиммунологический анализ III: 296Разобщители II: 87-88Рак, вирусная этиология III: 167, 186-189- кожи III: 35-36- химиотерапия II: 269Рамка считывания, сдвиг III: 69, 82, 83, 97Рамноза III: 228Растения, С4-путь II: 198-199Рацемазы III: 220Рахит II: 225-226Реакционный центр II: 185Ревертанты III: 83Регуляторная субъединица II: 266Регуляторный ген III: 113-114Редуктаза см. Сукцинат-Q-редуктаза, NADH-Q-

редуктазаРекомбинация ДНК III: 196-216- фага λ III: 185Релаксация ДНК III: 20, 21, 33Ренатурация антитела III: 240, 241- миоглобина I: 62-63- РНКазы III: 240Рентгеноструктурный анализ I: 50-52-- гемоглобина I: 63-64, 76, 83-- ДНК III: 11-- миоглобина I: 50-58Реовирус III: 181-182Репарация ДНК III: 35-37Репликазы III: 183. См. также тРНК-репли-

казаРепликационная вилка III: 28-34, 134-137Репликация ДНК III: 14-19, 28-44, 133-136-- ошибки III: 24-26- РНК III: 180- фага Т4 III: 174-175- ферментативная III: 41-42Репрессор III: 113-119, 122-124. См. также Лак-

тозный репрессор, Триптофановый репрес-сор

Реснички III: 277-278Рестрикция III: 177, 208-209- фермента III: 38-39, 176-178Ретикулоциты III: 98-99, 155Ретинали в пурпурной мембране II: 200- транс- и цис-изомеры III: 341-344, 348-349Ретинол II: 17, 18Ретинол-дегидрогеназа III: 343Ретровирусы III: 179, 189-190Рецепторные ямки II: 219Рецепторы антигенов III: 256-257, 293-294- эстрадиола III: 299-300Рибоза II: 255; III: 46Рибонуклеаза S I: 17Рибонуклеазы I: 39-41, 123, 124; III: 64- ренатурация III: 240Рибонуклеиновая кислота (РНК) III: 46-48, 52-

61. См. также Гибридизация ДНК-РНК,Двухцепочечная РНК

-- положительная (+РНК) и отрицательная(—РНК) III: 179-182

Рибонуклеозиддифосфаты III: 70Рибонуклеозидтрифосфаты III: 52, 73Рибонуклеотид 5-аминоимидазола II: 259- 5-аминоимидазол-4-карбоксамида II: 244, 259- 5-аминоимидазол-4-карбоксилата II: 259- 5-аминоимидазол-4-N-сукцинкарбоксиламида

II: 259- никотиновой кислоты II: 270-271- 5-формиламидоимидазол-4-карбоксамида II:

259- N'-5'-фосфорибозилформимино-5-аминоими-

дазол-4-карбоксамида II: 244Рибонуклеотид-редуктаза II: 267-268Рибонуклеотиды II: 255; III: 34-35Рибосомная РНК (рРНК) III: 47-48, 149Рибосомы III: 46, 49-50, 72, 97-99, 101-103, 157-

158- митохондрий III: 153- реконструирование III: 98, 99- эукариотические (80S) III: 152-153Риботимидин III: 61Рибофлавин II: 17Рибофлавин-5'-фосфат II: 271Рибофорины III: 157D-Рибулоза I: 47Рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза II: 195-197,

203Рибулозо-5-фосфат II: 96-100, 196, 197, 257Рибулозо-5-фосфат-эпимераза III: 117Рибулокиназа III: 117Рилизинг-факторы II: 172Риновирус III: 179Рифампицин III: 61-62РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная

транскриптаза) III: 178, 190- РНК-полимераза III: 178РНК-затравка III: 31-32РНК-матрица III: 46, 52РНК-полимеразы III: 52-56, 146-147РНК-репликаза III: 52, 178, 179

РНК-синтетаза III: 178РНК-содержащие вирусы III: 178-179-- опухолеродные III: 189-190РНК-транскрипты III: 148-152Родопсин III: 340-348Ротенон II: 80, 81рРНК см. Рибосомная РНК

Сакситоксин III: 328-330Самосборка вирусов III: 168-176- липидных бислоев I: 205- рибосом III: 98Саркозин III: 63Сарколемма III: 260Саркомер III: 261Саркомы III: 186Саркоплазма III: 260Саркоплазматический ретикулум I: 209; III: 271-- и транспорт Са2+ III: 270, 311Сателлитная ДНК III: 139, 140Сахара II: 24-27, 132- абсолютная конфигурация II: 25, 46, 47- номенклатура III: 159- транспорт III: 312-316Сахароза II: 132Свертывание крови I: 152, 166-176-- каскад реакций I: 166-167Свет, спектр поглощения I: 68. См. также

Экстинкция--- миоглобина и гемоглобина I: 59--- родопсина III: 342--- хлорофиллов II: 184--- цветовых рецепторов III: 348Световые реакции (фотосинтеза) II: 185, 187Связь С—С I: 219-220Седиментация III: 48Седогептулозо-1,7-дифосфат II: 196Седогептулозо-7-фосфат II: 97-98Секвенатор I: 32Селекционная теория III: 240Серин I: 21, 22, 156-157, 202; II: 163, 168, 235- связывание с сахарами I: 214, 216Сериндегидратаза II: 163Сериновые протеазы I: 157, 163, 165-166Серотонин II: 248Серповидноклеточная анемия I: 88-90, 94, 97-98Сефадекс I: 25Сиаловые кислоты II: 209Симметрия вирусов III: 168- во взаимодействии белков с нуклеиновыми

кислотами III: 62, 125--- репрессора с оператором III: 115-116- рестрикции III: 178Симпорт III: 312-314Синапсы III: 330-331- электронная микрофотография III: 326Синаптическое тельце III: 340Синаптосомы III: 331Синтетазы II: 154; III: 87-90


Сквален II: 212, 214, 215, 217Скваленоксид II: 217Скелетные мышцы III: 260-262β-Складчатый слой I: 34-37Скольжение филаментов III: 261-262, 267-269Скорость ферментативной реакции максималь-

ная (Vmax) I: 112-113Слепота ночная («куриная») III: 343Слизевик III: 272, 273Согласованная регуляция по типу обратной свя-

зи II: 245Соединительная ткань I: 179Солевые мостики I: 122- (ионные) связи I: 77, 122Соматическая рекомбинация III; 250, 252, 254-

255Соматические гипермутации III: 250Соматостатин III: 213-214Соматотропин (гормон роста) III: 283Сопрягающий фактор (F1) II: 83-84Сопряжение, сопряженные реакции II: 9, 13, 79,

86-88, 92; III: 308-309Сопряженная пара кислота-основание I: 45D-Сорбоза II: 47Спаривание оснований или гомологичных цепей

ДНК III: 11-15, 19-20, 196, 198-200Спектрин I: 213α-Спирали I: 34-36, 55; III: 269. См. также

Двойная спираль ДНК- суперспирализованные I: 30, 36, 178, 183; III:

264Спиртовое брожение II: 36Сплайсинг III: 26, 61, 79, 81, 150-151, 249-253Стеарат I: 220; II: 139Стероидные гормоны II: 221-222; III: 298-300-- врожденные нарушения II: 224Стероиды кардиотонические III: 282, 309-310Стоп-кодоны III: 76Стрептомицин III: 105-107Структурные гены III: 114Стюарта фактор I: 175Субмитохондриальные частицы II: 83Субстрат см. Фермент-субстратные комплексыСубстратные циклы II: 110-111Субтилизин I: 105, 163-164Субъединица I: 38Сукцинат II: 116; III: 340Сукцинат-дегидрогеназа I: 115; II: 32Сукцинат-Q-редуктаза II: 75, 82Сукцинилхолин III: 337-338Сукцинил-СоА II: 31-32, 169, 248-250Сукцинил-СоА—синтетаза II: 32Сульфаниламид II: 279Сульфгидрильный буфер II; 104Сульфолипиды II: 184Суперспирализация ДНК I: 183; III: 20-21Сфингозин I: 203; II: 208, 209Сфингомиелин I: 203, 204Сшивки см. Поперечные связиСэнгера реактив I: 29


Табун III: 335, 336D-Тагатоза II: 47Талассемия III: 154-155D-Талоза II: 46Таурин II: 215Таурохолат II: 215Таутомеры III: 81Твин III: 333Тейхоевая кислота III: 223-224Текучесть мембран I: 219-221Темновые реакции (фотосинтеза) II: 185, 193,

195-196Температура плавления (Тп л) I: 185- сжатия (T s) I: 185- тела I: 88Температурный переход мембраны I: 219-220Теофиллин III: 286Терминальная трансфераза III: 209Терминация синтеза белка III: 104, 105- транскрипции III: 55, 58-60, 74-76, 119, 154Термодинамика II: 6Термодинамическая стабильность I: 41Терпены II: 226Тестостерон II: 220, 223, 224; III: 299Тетрагидробиоптерин II: 175Тетрагидроптероилглутамат см. Тетрагидрофо-

лятТетрагидрофолят II: 235-237, 257, 269Тетраглициновый мостик III: 221Тетрадеканат II: 139Тетраиодтиронин II: 248Тетракозаноат II: 139Тетраоксипиримидин III: 295Тетрапептид III: 219Тетрапиррольное кольцо I: 48Тетрациклин III: 107Тетраэдрическое переходное состояние I: 159, 160Тетродотоксин III: 328-330Тетрозы II: 25, 46, 47Тея-Сакса болезнь II: 210-211Тиазолидиновое кольцо III: 224, 226Тиамин см. Витамин B1

Тиаминпирофосфат II: 55-56, 101-102Тилакоиды II: 180, 184, 190, 194Тимидилатсинтетаза II: 271Тимидин (Т) II: 255, 275; III: 6, 13, 14- димеры III: 35, 37Тимидин-5'-фосфат (ТМР) (дезокситимидилат)

II: 256, 257Тиогалактозид-трансацетилаза III: 112Тиоловые протеиназы I: 166Тиоредоксин II: 267Тиоредоксин-редуктаза II: 268Тиоэфиры II: 40; III: 108Тироглобулин III: 160Тирозин I: 21, 22, 175, 176; II: 241; III: 152- как предшественник нейромедиаторов III: 339Тирозингидроксилаза III: 339Тирозин-О-сульфат I: 168Тироксин II: 248Титрование I: 46Тканевой фактор I: 174Тозил-L-фенилаланинхлорметилкетон I: 157-158

α-Токоферол II: 18Толстые нити III: 261-264, 266-267-- реконструкция III: 266Топоизомеразы III: 21Торр I: 70Транзиции III: 80-81Трансальдолаза II: 96-98, 102-103Трансамидаза I: 169Трансамидирование I: 169Трансаминазы II: 160Трансаминирование II: 160-162Трансверсии III: 80-81Трансгликозилирование I: 144Транскарбоксила за II: 150Транскетолаза II: 96-98, 101-102, 196транс-Конформация I: 219-220Транскрипты см. РНК-транскриптыТранскрипция III: 46-86, 112- выбор цепи III: 53-56, 58-62- с РНК III: 180-181Транслоказы II: 86; III: 104, 156Транслокация в белках III: 156-157- в мРНК III: 103-104- группы III: 314-316- иммуноглобулиновых генов III: 249-250Трансляция III: 46. См. также Белки, синтез- лидерной мРНК III: 119-120- направление III: 99-100Трансмембранные каналы III: 320-322Транспептидаза III: 225Транспептидирование III: 223, 225Транспозиция (перенос) генов III: 119, 206Транспозоны III: 206Транспорт см. Мембранный транспорт, Сим-

порт, Транслокация группы- пассивный III: 304- СО2 у тропических растений II: 198Транспортные антибиотики III: 316-320- РНК (тРНК) III: 47-48, 61, 67-68, 90-95, 151-

152-- мутантные III: 95-97-- связывание с рибосомами III: 72Транссукцинилаза II: 59Трансфераза II: 118Трансферрин I: 18Трансформация ДНК III: 7-10- клеток III: 186-187, 192D-Треоза II: 46Треонин I: 21, 22; II: 169- дезаминирование II: 163- превращение в изолейцин I: 106; II: 243- связывание с сахарами I: 214, 216Треониндегидратаза II: 163Треониндезаминаза I: 106; II: 243Третичная структура I: 32Три-N-ацетилглюкозамин I: 136-137Триацилглицерол-синтетазный комплекс II: 205-

206Триацилглицеролы II: 138-140, 205Трикарбоновые кислоты см. Цикл трикарбоно-

вых кислот1,3,7-Триметилксантин III: 286Тринуклеотиды III: 72

Триозы II: 24, 46, 47Триокиназа II: 133Триоксикопростановая кислота (тригидроксико-

простаноат) II: 215, 217Трипсин I: 30, 105, 152, 161-165Трипсиноген I: 165Триптофан I: 21, 22; II: 241, 242; III: 71, 72,

75, 118, 121Триптофанил-мРНК III: 119Триптофановая мРНК (trp-мРНК) III: 118, 121Триптофановый оперон III: 53, 59, 118-119, 121-- клонирование III: 212- репрессор III: 118, 119Триптофансинтаза I: 108, 109, 114; II: 241; III:

77, 78Тритон X I: 210Трифосфатизомераза I: 114; II: 30Трифосфопиридиннуклеотид (TNP) см. Никотин-

амидадениндинуклеотидфосфатТри-NAG см. Три-N-глюкозаминтРНК см. Транспортные РНКтРНКf см. Инициаторная РНКтРНКm III: 100Тромбин I: 105, 168-170Тромбопластин I: 175Тромбоциты I: 166; III: 271Тропические растения II: 198-200Тропоколлаген I: 179, 182Тропомиозин III: 261, 269-270Тропонин III: 261, 269-270Тропониновые комплексы III: 269, 270Т-трубочки (поперечные трубочки) III: 270, 271d-Тубокурарин III: 337, 338α-, β-Тубулин III: 276Туникамицин III: 161Тяжелые (Н) цепи III: 238-239, 241-243, 253Тяжелый меромиозин III: 264, 266, 267

Уабаин III: 311Убихинон II: 75Углекислый газ см. Диоксид углеродаУглеродные атомы II: 166-167, 212Ультрафиолетовый свет III: 35Умеренные фаги III: 120-125Уникальные гены III: 144-145Уотсона-Крика модель III: 11-14Уравнение фотосинтеза II: 180-183, 186Урацил II: 255, 257- димеры III: 35-36Урацил-ДНК-гликозидаза III: 37Уреаза II: 275Уреотелические организмы II: 164Уридилат (уридинмонофосфат, UMP) II: 256,

257, 262-265Уридилтрансфераза II: 247Уридин (U) II: 255-257Уридинтрифосфат (UTP) II: 264, 265Уридинфосфат-N-ацетилглюкозамин (UDP-

NAG) III: 220-223


Уридинфосфат-N-ацетилмуаровая кислота(UDP-NAM) III: 220-223

Уриказа II: 275Урикотелические организмы II: 164Уроканат II: 168Уропорфириноген-синтаза II: 251Уропорфириногены I и III II: 249-251Усиление сигнала при фоторецепции III: 345UDP-галактоза II: 134UDР-галактозо-4-эпимераза II: 134UDP-глюкоза II: 120-121, 134, 206UDP-глюкозо-пирофосфорилаза II: 120-121UDP-глюкуронат II: 252UMP см. Уридилат (уридинмонофосфат)UTP см. Уридинтрифосфат

Фаги III: 9- кольцевая ДНК III: 184- лизогенные III: 184-185- трансдуцирующие III: 205- умеренные III: 184- F2 III: 182- G4 III: 78- Mu III: 202- Р22 III: 229- Т2 III: 9, 10, 19, 48-51- Т4 III: 171-176- Т7 III: 20, 55- λ III: 18-20, 55, 120-124, 183-185, 202-- генетическая карта III: 123— как вектор III: 210-212- φХ174 III: 16-24, 53, 183Фаговая конверсия III: 229Факторы инициации III: 102, 155- освобождения III: 104- роста нервов (NGF) I: 19; III: 300-301- свертывания крови I: 167, 175; II: 172; III: 152- устойчивости III: 205- F II: 83, 84; III: 201-206- R III: 202, 205-206- RTF III: 205Фаллоидин III: 276Фарадея число II: 74Фарнезилпирофосфат II: 214Фенилаланин I: 21; II: 175, 240, 241; III: 71- при фенилкетонурии II: 176-178Фенилаланингидроксилаза II: 175, 177-178Фенилаланиновая тРНК III: 93Фенилаланиновый оперон III: 122Фенилизотиоцианат I: 30Фенилкетонурия II: 177-178Фенилпропионат II: 142Фенилтиогидантоин (ФТГ-аминокислоты) I: 30-

32Фенилуксусная кислота II: 142Феноксозановое кольцо III: 62, 64Ферментативный катализ I: 104, 108-109, 136-

144, 154-156-- кинетика I: 114


Фермент-субстратные комплексы I: 102, 108-110,148, 154-156

Ферменты I: 104-133; II: 283. См. также Ак-тивный центр и по названиям

- аденилированные II: 246- взаимодействие с субстратом I: 108-110, 122-

123, 148, 154-156. См. также Фермент-субстратные комплексы

- ковалентный комплекс с AMP II: 263; III: 26- множественность II: 245- рестрикции III: 38, 208-209Ферредоксин II: 188-189, 231Ферредоксин-NADP+-редуктаза II: 189Ферригемоглобин I: 45Ферритин I: 18, 214Феррицианид II: 187Феррогемоглобин I: 49Феррохелатаза II: 250Ферроцианид II: 187Фертильность см. Фактор FФибрин II: 167-169Фибриновый сгусток I: 167Фибриноген I: 167-168, 175Фибринопептиды I: 168Фибробласты III: 273Фиброин шелка III: 144Физостигмин III: 334, 336Филаменты мышц III: 261-268Фитоин II: 227Фитольная боковая цепь II: 226Флавикадениндинуклеотид (FAD, FADH2) II: 14-

15, 52-53, 73, 84-85, 143, 275Флавинмононуклеотид (FMN) II: 75, 271Флагеллин III: 350Флуорескамин I: 28Фолиевая кислота II: 270Формамид I: 10Формилглицинамидинрибонуклеотид II: 258, 259Формилметионил-тРНК (fMet-тРНК) III: 76, 87,

100-105Формилметионин (fMet) III: 76, 100N10-формилтетрагидрофолят II: 236Формил-L-триптофан I: 158, 159N-Формилиминоглутамат II: 169N5-Формиминотетрафолят II: 236Фосфагены III: 271Фосфатаза II: 127Фосфатидальхолин II: 208Фосфатидат (фосфотидная кислота) II: 205, 206Фосфатидилинозитол I: 203Фосфатидилсерин I: 203; II: 206Фосфатидилхолин I: 203, 204, 224; II: 207-209Фосфатидилэтаноламин I: 203; II: 207-208Фосфатидат I: 202Фосфатные группы II: 11, 12, 72Фосфаты высокоэнергетические II: 12Фосфоангидридные связи II: 10Фосфоаргинин III: 270, 271Фосфоацилглицеролы I: 201-203; II: 206-2073-Фосфогидроксипируват II: 235Фосфогистидин III: 315Фосфогликолат II: 1992-Фосфоглицерат II: 32

3-Фосфоглицерат II: 31-32, 194-196, 235Фосфоглицераткиназа II: 31-32Фосфоглицеромутаза II: 32, 119Фосфоглюкомутаза II: 118, 3626-Фосфоглюконатдегидрогеназа II: 96, 976-Фосфоглюконо-δ-лактон II: 96Фосфодиэстеразы II: 127; III: 285, 346-347- змеиного яда III: 64Фосфодиэфирная связь III: 6, 7, 23, 26-27Фосфоенолпируват I: 32; II: 106-107, 239, 240- в С4-пути II: 198- и активный транспорт III: 314-315- при гликолизе II: 32-- синтезе UDP-N-ацетилмурамовой кислоты

III: 221- свободная энергия гидролиза II: 12Фосфоенопируват-карбоксикиназа II: 107Фосфокреатин III: 270, 271Фосфолипаза А2 I: 165Фосфолипазы II: 208, 210Фосфолипиды I: 201-203- влияние на свертывание крови I: 171-1725-Фосфомевалонат II: 2144'-Фосфопантетеин II: 272, 2734'-Фосфопантотенат II: 272, 2734'-Фосфопантотенилцистеин II: 272Фосфопентозоизомераза II: 96-98, 196З-Фосфо-5-пирофосфовалонат II: 213, 2145'-Фосфорибозил-1-амин II: 258N-5'-Фосфорибозилантранилат II: 241, 2425-Фосфорибозил-1-пирофосфат (ФРПФ) II: 240,

242, 258, 261Фосфорибомутаза II: 273Фосфорибулозокиназа II: 196Фосфорилаза II: 123-125, 130Фосфорилирование II: 283- и активный транспорт III: 307-308, 311, 314-

316-- регуляция активности ферментов II: 65, 123-

127- субстратное II: 32Фосфорил-ферментные комплексы III: 335Фосфорилхолин II: 207-208Фосфорильная группа II: 27Фосфорная кислота I: 202Фосфоролиз II: 116Фосфосерин I: 22, 23; II: 235Фосфотрансферазная система III: 314-316Фосфофруктокиназа II: 30, 33-35, 284Фотодыхание II: 199, 200Фотореактивирующий фермент III: 35Фоторецепторы III: 340-349Фотосинтез II: 180-203Фотосинтезирующие бактерии II: 186, 200Фотосинтетическая единица II: 184-185Фотосистемы I и II II: 187-193Фототрофы II: 10Фотофосфорилирование II: 188, 192, 200-201- циклическое II: 191, 193Фрагменты иммуноглобулинов (Fab, Fc) III: 237-

239Фруктоза II: 25-26, 47, 133Фруктозо-1,6-бисфосфат II: 28, 30, 106, 107, 196

Фруктозо-6-фосфат II: 28-29, 106, 195-197Фруктозо-1-фосфатный путь II: 133α-D-Фруктофураноза II: 26Фторацетат II: 63Фторацетил-СоА II: 63Фтордезоксиуридилат II: 2695-Фтордезоксиуридин III: 189Фтординитробензол I: 29Фторурацил II: 269Фторцитрат II: 63-64Фумараза II: 53Фумарат (фумаровая кислота) II: 52-53, 165, 169,

175, 1764-фумарилацетоацетат II: 175Фураноза II: 26Фурье разностный метод I: 135FAD, FADH2 см. ФлавинадениндинуклеотидfMet см. ФормилметионинfMet-тРНК см. Формилметионил-тРНКFMN см. Флавинмононуклеотид

Хаворта проекционные формулы II: 26Хагемана фактор I; 175Хеликаза см. ГеликазаХемиосмотическая гипотеза II: 79Хеморецепторы III: 349-350, 352Хемотаксис у бактерий III: 349-353Хемотрофы II: 10Хендерсона-Хассельбалъха уравнение I: 45Хилла коэффициент I: 72- реакция II: 187Хиломикроны II: 218Химерная ДНК III: 208Химическое сопряжение II: 79Химотрипсин I: 153-159, 161-164Химотрипсиноген I: 152-154, 160Хиральность (RS) II: 62, 69Хитин I: 133; II: 131Хлорамфеникол III: 107Хлоропласты II: 180, 181, 184- ДНК в них III: 137-139- рибосомы в них III: 153Хлорофиллы II: 183-184Холат натрия I: 210Холекальциферол II: 223Холерный токсин III: 156, 289Холестерол II: 212-227. См. также Гиперхо-

лестеролемия- в клеточных мембранах II: 204, 221Холил-СоА II: 215Холин I: 202; II: 207-209; III: 331, 334Холлидэя модель III: 201Хондроитинсульфат I: 193, 195Хоризмат II: 239-241Хориокарциномы II: 270Хроматин III: 128-133Хроматография аффинная I: 25- гель-фильтрация I: 25- ионообменная I: 25


- на бумаге I: 92-93Хромосомы (эукариотические) III: 127-165. См.

также Политенные хромосомы- типа ламповых щеток III: 127Хромофор III: 341Хрящ I: 194Хэча-Слэка путь (С4-путь) II: 198

Цветовая слепота III: 348Цветовое зрение III: 347-348Цвиттерионы I: 19Целлюлаза II: 131Целлюлоза II: 131Центромеры III: 140χ-Цепи III: 242, 249, 251λ-Цепи III: 242, 251Цепь переноса электронов II: 82, 222Церамид II: 208-209Цереброзиды I: 203, 204; II: 208Цианид ( C N - ) II: 80, 81, 171Цианкобаламин II: 171Цикл Кальвина II: 196-199- мочевины II: 164-166- трикарбоновых кислот II: 49-70, 284--- связь с циклом мочевины II: 165Циклический AMP см. Аденозин-3',5'-монофос-

фат- GMP (cGMP) III: 345-347Циклическое фотофосфорилирование II: 191Циклогексимид III: 107, 152, 153Циклопропановые жирные кислоты I: 223Цинга I: 186-187Цинк I: 144-146Цис-аконитат II: 50, 51Цис-вакценат II: 156Цис-конфигурация I: 220Цистатионин II: 239Цистатиониназа II: 239Цистатионин-синтетаза II: 239Цистеин I: 10, 21-24; II: 167, 168, 239; III: 71Цистеиновая кислота I: 32Цистин I: 24Цистидин II: 255-257Цитидиндифосфодиацилглицерол (CDP-диацил-

глицерол) II: 206-207Цитидинмонофосфат (цитидилат, СМР) II: 206,

256, 257Цитидинтрифосфат (СТР) II: 206-207, 264-266Цитозин II: 255, 257; III: 6, 13, 14- дезаминирование III: 36, 37- спаривание с аденином III: 81, 82Цитозинарабинозид III: 189Цитохалазин В III: 276Цитохром-с-оксидазный комплекс II: 76-78, 80-

82Цитохром(ы) а II: 76-78, 81, 82- b II: 76-77, 81, 191- с II: 76-78, 81, 82, 88-91, 191- f II: 191

- Р450 II: 222Цитохромоксидаза II: 77QН2-Цитохром с II: 82QН2-Цитохром-с-редуктазный комплекс II: 76,

77, 80-82Цитрат II: 34-35, 50, 51, 60, 155Цитрат-лиаза II: 155Цитрат-синтетаза II: 50Цитрил-СоА II: 50Цитруллин II: 164, 165сАМР см. Аденозин-3',5'-монофосфатCDP-диацилглицерол см. Цитидиндифосфоди-

ацилглицеролСТР см. Цитидинтрифосфат

Четвертичная структура I: 64, 76-77, 81Число оборотов (фермента) I: 113-114

Шарнир в молекуле иммуноглобулинов III: 239--- миозина III: 268Шелковичный червь III: 144Шикимат II: 240Шиффово основание I: 190, 194; II: 39, 102-103,

161-162; III: 342, 343

Щавелевая кислота I: 118Щавелевоуксусная кислота см. ОксалоацетатЩавелевояблочная кислота см. ОксалосукцинатЩелевые соединения III: 322-324Щелочная фосфатаза III: 64Щеточная каемка III: 275

Эволюция белков I: 69, 84- дивергентная I: 163-164- единичный период III: 129- иммуноглобулинов III: 248-250, 253- конвергентная III: 348- молекулярная I: 101Эдмана реакция (деградация по Эдману) I: 30-32Эзерин III: 334Эйкозаноат II: 139Эйкозотетраеноат II: 139Эйкозотриеноат III: 298Экваториальные заместители II: 26, 27Экдизон III: 1483'—>5'-Экзонуклеаза III: 24-26Экзонуклеазы III: 64Экзоны III: 79, 145Экстинкции коэффициент I: 68Эластаза I: 152, 161Эластин I: 192-193Электрический орган III: 332- угорь III: 332Электрогенный насос III: 307-308Электронная микроскопия II: 211, 221-222- плотность I: 52-53, 58Электроны, перенос и транспорт II: 14-16, 71-

78, 81, 85, 87. См. также Цепь переносаэлектронов

- смещение I: 144, 148-149Электростатические взаимодействия I: 122388

Предметныйуказатель

Электрофорез I: 25, 26, 90-91- в крахмальном геле I: 92-- полиакриламидном геле с додецилсульфатом

натрия I: 208-210, 213Электрохимический потенциал III: 304Элерса-Данлоса синдром I: 188Элонгация III: 103-104, 106- ДНК III: 23, 24- жирных кислот II: 149, 151-153, 156- РНК III: 52, 53- факторы III: 103-104Эмбдена-Мейергофа путь см. ГликолизЭмбриональные гемоглобины I: 75- клетки и образование антител III: 250-251, 253Эндонуклеаза (эндонуклеазы) III: 63, 64, 192- активатор II: 237- расщепление чужеродных ДНК III: 176- рестрикции III: 176-178, 196- УФ-специфичная III: 35Эндоплазматический ретикулум II: 282; III: 156-

161Эндорфины III: 295-296Эндоцитоз II: 219Энергетические ресурсы организма II: 288-289Энергетический заряд II: 20, 35, 65Энергия (в биологических процессах) I: 12; III:

32-33- активации I: 106-108- извлечение II: 16-19- метаболические источники II: 288-289- перенос II: 185-186- преобразование II: 91-92- фотосинтеза II: 197Энзим (фермент) II: 24

Энкефалины III: 297Энтальпия II: 7Энтеропептидаза I: 165Энтропия II: 6-7Эпидермальный фактор роста III: 300-301Эпимеразы в обмене галактозы II: 134-- пентозофосфатном пути см. Фосфопентозо-

изомеразыЭпинефрин см. АдреналинD-Эритроза II: 46Эритромицин III: 107, 153Эритропоэтическая порфирия II: 250Эритрозо-4-фосфат II: 98, 196, 240Эритроциты I: 48, 49, 209, 211-214- плода I: 75- тени III: 307D-Эритрулоза II: 47Эстрадиол II: 224; III: 299Эстрогены II: 222-224Эстрон И: 224; III: 299Этанол I: 118. См. также Спиртовое брожениеЭтаноламин I: 202Этидий бромистый III: 39Этиленгликоль I: 117-118Этиленимин I: 47Эукариоты III: 127Эфирная связь I: 104, 155, 178

«Яблочный» фермент II: 155Ядерная мембрана III: 127, 188Ядовитые грибы III: 146, 276Ядро III: 136Ядрышко III: 141Яды III: 335. См. также Грибной яд, Змеиный

яд

ОГЛАВЛЕНИЕ


Глава 24. ДНК: генетическая роль, структура ирепликация 624.1. Ковалентная структура и номенклатураДНК 624.2. Трансформация пневмококков с помощьюДНК показала, что гены состоят из ДНК 724.3. Гены некоторых вирусов состоят изРНК 10244. Двойная спираль ДНК Уотсона-Кри-ка 1124.5. Комплементарные цепи служат матрицамидруг для друга при репликации ДНК 1424.6. Репликация ДНК полуконсервативна 1524.7. Некоторые вирусы содержат на определен-ных стадиях жизненного цикла одноцепочеч-ную ДНК 1624.8. Молекулы ДНК очень длинные 1824.9. Двойная спираль может быть обратиморасплавлена 1924.10. Некоторые молекулы ДНК имеют коль-цевую форму 2024.11. Кольцевые двухспиральные молекулыДНК могут находиться в суперспирализован-ном состоянии 2024.12. Открытие ДНК-полимеразы 2124.13. ДНК-полимераза получает инструкции отматрицы 2424.14. ДНК-полимераза I исправляет ошибкив ДНК 2424.15. ДНК-лигаза соединяет фрагментыДНК 2624.16. Открытие ДНК-полимераз II и III 2724.17. Расплетание родительской ДНК и синтезновой ДНК происходят в репликационной вил-ке 2824.18. Репликация ДНК начинается в строгоопределенном месте и продолжается последо-

390 Оглавление

вательно в обоих направлениях 2924.19. Одна цепь ДНК синтезируется преры-висто 3024.20. Затравкой синтеза ДНК служит РНК 3124.21. Энергия гидролиза АТР используется длярасплетания родительской ДНК в области реп-ликационной вилки под действием белкагер 3224.22. ДНК-гираза вводит отрицательные супер-витки в родительскую ДНК, чтобы облегчитьее расплетание 3324.23. Сложность аппарата репликации, по-види-мому, необходима для обеспечения очень вы-сокой надежности 3324.24. Повреждения ДНК постоянно репариру-ются 3524.25. Рак кожи при золотистой ксеродермеобусловлен нарушением нормальной репарацииДНК 3524.26. ДНК содержит тимин вместо урацила,что делает возможной репарацию дезаминиро-ванного цитозина 3624.27. Рестриктирующие эндонуклеазы соверши-ли переворот в анализе ДНК 3724.28. Последовательность нуклеотидов в ДНКможно быстро определить с помощью специфи-ческого химического расщепления 3924.29. Полная последовательность основанийДНК фага φХ174 была определена с помощьюметода ферментативной репликации 41Заключение 42Вопросы и задачи 45

Глава 25. Информационная РНК и транскрип-ция 4625.1. Структура РНК 4625.2. Клетки содержат три типа РНК: рибо-сомную, транспортную и информационную 4725.3. Формулирование концепции информацион-ной РНК 4825.4. Экспериментальные данные о существова-нии информационной РНК-посредника в син-тезе белка 4925.5. Опыты по гибридизации показали, чтоинформационная РНК комплементарна кодиру-

ющей ее ДНК-матрице 5025.6. Рибосомные РНК и транспортные РНКтакже синтезируются на ДНК-матрице 5125.7. Все клеточные РНК синтезирует РНК-по-лимераза 5225.8. РНК-полимераза получает инструкции отДНК-матрицы 5325.9. Обычно в данном участке генома транс-крибируется только одна цепь ДНК 5325.10. РНК-полимераза Е. coli состоит изсубъединиц 5425.11. Транскрипция инициируется на промотор-ных участках матричной ДНК 5525.12. σ-Субъединица обеспечивает узнаваниепромоторных участков РНК-полимеразой 5525.13. Цепи РНК начинаются с pppG илирррА 5625.14. Цепи РНК синтезируются в направле-нии 5'—>3' 5725.15. Матричная ДНК содержит стоп-сигналыдля транскрипции 5825.16. Белок р участвует в терминированиитранскрипции 5825.17. Многие молекулы РНК после транскрип-ции расщепляются и химически модифицируют-ся 6025.18. Антибиотики-ингибиторы транскрипции:рифамицин и актиномицин 6125.19. Разработаны совершенные методы опре-деления последовательности нуклеотидов вРНК 62Заключение 63Вопросы и задачи 66

Глава 26. Генетический код и зависимость меж-ду генами и белками 6726.1. Транспортная РНК - адапторная молекулав синтезе белка 6726.2. Аминокислоты кодируются группами изтрех оснований, начиная со строго определен-ной точки 6826.3. Расшифровка генетического кода: синтети-ческие РНК могут служить информационнымиРНК 6926.4. Состав кодонов многих аминокислот былопределен с помощью сополимеров в качествематриц 7126.5. Тринуклеотиды способствуют связываниюопределенных молекул тРНК с рибосома-ми 7226.6. Еще один инструмент расшифровки кода -сополимеры с определенной последователь-ностью 7226.7. Основные свойства генетического ко-да 75

26.8. Сигналы инициации и терминации синте-за белка 7626.9. Генетический код универсален 7626.10. Последовательность оснований гена и по-следовательность аминокислот соответствующе-го полипептида коллинеарны 7726.11. Некоторые последовательности вирусныхДНК кодируют более одного белка 7726.12. Гены эукариот представляют собой мо-заику из транслируемых и нетранслируемыхпоследовательностей ДНК 7826.13. Мутации возникают в результате изме-нений последовательности оснований ДНК 8026.14. Некоторые химические мутагены весьмаспецифичны 8126.15. Многие мутагенные канцерогены можновыявить по их мутагенному действию на бак-терии 82Заключение 84Вопросы и задачи 85

Глава 27. Синтез белка 8727.1. Аминокислоты активируются и присоеди-няются к транспортным РНК под действиемспецифических синтетаз 8727.2. Надежность синтеза белка определяетсявысокой специфичностью аминоацил-тРНК——синтетаз 89273. Молекулы транспортных РНК имеют об-щий план строения 9027.4. Транспортная РНК имеет L-образную фор-му 9127.5. В узнавании кодона участвует антикодон,а не активированная аминокислота 9327.6. Молекула транспортной РНК может узна-вать более одного кодона благодаря «кача-ниям» 9427.7. Мутантные молекулы транспортных РНКмогут подавлять другие мутации 9527.8. Рибосомы - органеллы, в которых происхо-дит синтез белка,- состоят из большой и ма-лой субчастиц 9727.9. Рибосомы можно реконструировать из сос-тавляющих их молекул белков и РНК 9827.10. Белки синтезируются в направлении отаминоконца к карбоксильному концу 9827.11. Информационная РНК транслируется внаправлении 5'—>3' 9927.12. Одну молекулу мРНК одновременнотранслирует несколько рибосом 10027.13. Синтез белка в бактериях инициируетсяформилметиониновой тРНК 10027.14. Сигналом инициации служит кодон AUG

Оглавление 391

(или GUG), которому предшествует несколькооснований, способных спариваться с 16S-рнк 10127.15. В результате образования инициирующе-го 70S-комплекса формилметиониновая тРНКсвязывается с Р-участком 10227.16. Фактор элонгации Tu доставляет амино-ацил-тРНК в А-участок рибосомы 10327.17. После образования пептидной связи про-исходит транслокация 10327.18. Синтез белка терминируется факторамиосвобождения 10427.19. Многие белки модифицируются послетрансляции 10527.20. Стрептомицин ингибирует инициацию ивызывает неправильное считывание информа-ционной РНК 10527.21. Пуромицин вызывает преждевременнуютерминацию цепи, так как имитирует амино-ацилированную транспортную РНК 10727.22. Некоторые короткие пептиды синтезиру-ются без участия рибосом 107Заключение 109Вопросы и задачи 1 1 1

Глава 28. Регуляция выражения гена в феноти-пе 11228.1. β-Галактозидаза - индуцибельный фер-мент 11228.2. Открытие регуляторного гена 11328.3. Оперон - единица координированной гене-тической экспрессии 11428.4. lac-Репрессор - тетрамерный белок 1 1 528.5. Последовательность оснований в lac-опе-раторе симметрична 11528.6. Циклический AMP стимулирует транскрип-цию многих индуцибельных катаболических опе-ронов 11628.7. Различные формы одного и того же белкаактивируют и ингибируют транскрипцию ара-бинозного оперона 11728.8. Транскрипция триптофанового оперона ре-гулируется и аттенюатором, и операто-ром 11828.9. Аттенюация опосредуется трансляцией ли-дерной мРНК 11928.10. Аттенюаторный участок гистидиновогооперона содержит семь гистидиновых кодоновподряд 12028.11. Репрессоры и активаторы детерминируютразвитие умеренных фагов 12028.12. Два оператора фага лямбда содержатряд участков связывания репрессора 122


28.13. λ-Репрессор регулирует собственный син-тез 123Заключение 125Вопросы и задачи 126

Глава 29. Эукариотические хромосомы и выра-жение генов у эукариот 12729.1. Эукариотическая хромосома содержит однумолекулу двухспиральной ДНК 12829.2. Эукариотическая ДНК прочно связана сосновными белками - гистонами 12829.3. Последовательности аминокислот в гисто-нах Н3 и Н4 почти одинаковы у всех жи-вотных и растений 12929.4. Нуклеосомы - повторяющиеся субъедини-цы хроматина 12929.5. Минимальная нуклеосома («ядро» нуклео-сомы) состоит из ДНК длиной 140 пар осно-ваний, намотанной на октамер гистонов 13129.6. Нуклеосома - первый уровень конденсацииДНК 13329.7. Репликация эукариотической ДНК начина-ется во многих местах и идет в двух направ-лениях 13329.8. Новые гистоны образуют новые нуклео-сомы на отстающей дочерней нити ДНК 13629.9. Митохондрии и хлоропласты содержат соб-ственную ДНК 13729.10. Эукариотическая ДНК содержит многоповторяющихся последовательностей основа-ний 13829.11. Высокоповторяющаяся ДНК (сателлитнаяДНК) локализована в центромерах 14029.12. Гены, кодирующие рибосомные РНК, рас-положены один за другим тандемно и повто-ряются несколько сот раз 14029.13. Гены гистонов собраны вместе и повто-ряются тандемно много раз 14329.14. Многие белки, синтезирующиеся в боль-ших количествах, кодируются уникальными ге-нами 14429.15. Большинство уникальных генов переме-жается повторяющимися последовательностя-ми 14529.16. Почти все гены высших эукариот, коди-рующие белки, имеют разорванное строе-ние 14529.17. РНК в эукариотических клетках синтези-руется тремя различными РНК-полимераза-ми 14629.18. Грибной яд α-аманитин - мощный ингиби-тор РНК-полимеразы II 14629.19. Специфические гены могут активировать-ся для транскрипции 14729.20. Три вида рибосомных РНК образуются

в результате процессинга одного первичноготранскрипта 14829.21. Информационные РНК избирательно об-разуются из больших ядерных предшествен-ников РНК (гетерогенной ядерной РНК,гяРНК) 14829.22. На 5'-конце мРНК находятся «колпачки»,а на 3'-конце, как правило, роlу(А)-последова-тельности 14929.23. Ферменты сплайсинга с высокой точ-ностью удаляют интроны из первичных транс-криптов разорванных генов 15029.24. В настоящее время известны последова-тельности оснований многих информационныхРНК 15129.25. Эукариотическая рибосома (80S) состоитиз малой (40S) и большой (60S) субчастиц 15229.26. Талассемия - генетически обусловленноенарушение синтеза гемоглобина 15429.27. Трансляция регулируется каскадом про-теинкиназ, инактивирующим один из факторовинициации 15529.28. Дифтерийный токсин блокирует синтезбелка у эукариот, ингибируя транслока-цию 15529.29. Рибосомы, связанные с эндоплазматиче-ским ретикулумом, синтезируют секреторные имембранные белки 15629.30. Сигнальные последовательности позволя-ют секреторным белкам проходить через мем-брану эндоплазматического ретикулума 15729.31. Присоединение сахарных остатков «ядра»к гликопротеинам происходит в эндоплазмати-ческом ретикулуме при участии донора доли-хола 15929.32. Модификация и сортировка гликопротеи-нов происходит в аппарате Гольджи 161Заключение 163

Глава 30. Вирусы 16730.1. Оболочка мелких вирусов состоит из мно-жества идентичных белковых субъединиц 16730.2. Самосборка вируса табачной мозаики(втм) 16830.3. При сборке вирусной частицы ВТМ бел-ковые диски присоединяются к петле РНК 16930.4. Заражение фагом Т4 полностью перестраи-вает синтез макромолекул в клетке 17130.5. В упорядоченной сборке фага Т4 участ-вуют вспомогательные белки и протеазы 17330.6. В репликации фага Т4 участвует конка-темерный промежуточный продукт 17430.7. ДНК фага Т4 вводится в предобразован-ную головку 17530.8. Гибкость белка оболочки ВККТ позволяет

ему образовывать икосаэдрический кап-сид 17630.9. Бактериальные рестрикционные эндонукле-азы расщепляют чужеродные молекулыДНК 17630.10. Стратегия репликации РНК-содержащихвирусов 17830.11. Белки вируса полиомиелита образуютсяпутем множественного расщепления гигантско-го предшественника 17930.12. С геномной РНК вируса везикулярногостоматита транскрибируется пять моноцистрон-ных мРНК 18030.13. Геном реовируса состоит из десяти раз-личных молекул двухцепочечной РНК 18130.14. Мелкие РНК-содержащие фаги содержатперекрывающиеся гены 18230.15. Дарвиновская эволюция фаговой РНК внеклетки 18330.16. Лизогенные фаги могут включать своюДНК в состав ДНК клетки-хозяина 18430.17. Ретровирусы и некоторые ДНК-содержа-щие вирусы могут вызывать рак у чувстви-тельных клеток-хозяев 18630.18. Вирусы SV-40 и полиомы могут вызы-вать продуктивную инфекцию или трансфор-мацию клеток-хозяев 18730.19. Ретровирусы содержат обратную транс-криптазу, которая синтезирует двухспиральнуюДНК, используя в качестве матрицы(+)РНК 18930.20. Ретровирусная ДНК транскрибируетсятолько в том случае, если она интегрированас геном клетки-хозяина 19030.21. Киназа, кодируемая геном src вируса сар-комы птиц, участвует в трансформации 19130.22. Двухцепочечная РНК подавляет синтезбелка в клетках, обработанных интерферо-ном 192Заключение 193

Глава 31. Перестройки генов: рекомбинация,транспозиция и клонирование 19631.1. В основе генетической рекомбинации ле-жат разрыв и воссоединение цепей ДНК 19631.2. При генетической рекомбинации происхо-дит спаривание гомологичных цепей ДНК с об-разованием двухцспочсчного промежуточногопродукта 19831.3. Белок recА катализирует AТР-зависимыйобмен цепей ДНК при генетической рекомби-нации 20031.4. Бактерии содержат плазмиды и другие


подвижные генетические элементы 20031.5. Фактор F позволяет бактериям передаватьгены реципиентам путем конъюгации 20131.6. Плазмиды факторы R придают бактериямустойчивость к антибиотикам 20531.7. IS-элементы могут присоединяться к не-родственным генам 20631.8. В лаборатории можно сконструировать но-вые геномы и клонировать их в клетках-хо-зяевах 20731.9. Ферменты рестрикции и ДНК-лигаза - не-обходимые инструменты для получения реком-бинантных молекул ДНК 20831.10. Плазмиды и фаг лямбда - наиболее под-ходящие векторы для клонирования ДНК в бак-териях 21031.11. Из суммарной геномной ДНК, расщеплен-ной рестриктирующими эндонуклеазами, можновыделить с помощью клонирования определен-ные эукариотические гены 21131.12. Эукариотические гены могут транскриби-роваться в бактериальных клетках 21231.13. Химически синтезированный ген пептид-ного гормона соматостатина экспрессируетсяв клетках Е. coli 21331.14. Перспективы клонирования генов 214Заключение 215

Часть V.МолекулярнаяфизиологияГлава 32. Оболочки бактериальных кле-ток 21832.1. Клеточная стенка - это огромная мешко-видная макромолекула 21932.2. Стадии синтеза пептидогликана 22032.3. Синтез UDP-углевод-пептидного зве-на 22032.4. Перенос углевод-пептидного звена на ли-пидный переносчик 22032.5. Синтез дисахарид-пептидного звена, при-крепленного к липидному переносчику 22132.6. Перенос дисахарид-пептидного звена нарастущую полисахаридную цепь 22232.7. Поперечные мостики между полисахарид-ными цепями образуются в реакции транспеп-тидирования 22332.8. У грам-положительных бактерий пептидо-гликан покрыт тейхоевой кислотой 22332.9. Пенициллин вызывает гибель растущихбактерий, ингибируя синтез клеточных сте-нок 22432.10. Пенициллин блокирует синтез клеточных


стенок путем ингибирования реакции транспеп-тидирования 22532.11. Некоторые бактерии резистентны к пени-циллину, так как синтезируют разрушающийего фермент 22532.12. Грам-отрицательные бактерии окруженынаружной мембраной, богатой липополисахари-дами 22632.13. Благодаря разнообразию О-боковых це-пей грам-отрицательные бактерии противостоятзащитным силам организма-хозяина 22832.14. Порин образует в наружной мембранеканалы для небольших полярных молекул 22932.15. Новообразованные белки наружной мемб-раны содержат отщепляемую сигнальную по-следовательность 230Заключение 231

Глава 33. Иммуноглобулины 23433.1. Основные определения 23433.2. Синтез специфических антител в ответ наантиген 23533.3. Участки антител, связывающие антиген,подобны активным центрам ферментов 23633.4. Препараты антител с определенной специ-фичностью обычно гетерогенны 23733.5. При ферментативном расщеплении имму-ноглобулина G образуются активные фраг-менты 23733.6. Иммуноглобулин G состоит из L- и Н-цепей 23833.7. Иммуноглобулин G - гибкая Y-образнаямолекула 23933.8. Антитела под действием отбора или инст-рукции образуются 24033.9. Конец инструктивной теории 24033.10. Иммуноглобулины миеломы и гибридомыгомогенны 24033.11. Каждая L- и Н-цепь состоит из вариа-бельного и константного участков 24133.12. Участок связывания антигена образовангипервариабельными фрагментами L- и Н-це-пей 24333.13. Вариабельная и константная области вы-полняют разные функции 24333.14. Молекулы антител уложены с образова-нием компактных доменов, имеющих гомологич-ные последовательности 24433.15. Рентгеноструктурный анализ связываю-щих участков антител показал, как происходитсвязывание некоторых гаптенов 24533.16. Разные классы иммуноглобулинов разли-чаются по биологической активности 24633.17. Молекулы антител возникли в результа-те дупликации и последующей дивергенции ге-нов 24833.18. Вариабельные и константные области ко-

дируются разными, но соединившимися гена-ми 24933.19. Как возникает разнообразие специфично-сти антител? 25033.20. Вариабельные участки L- и Н-цепей ко-дируются несколькими сотнями генов 25033.21. Открытие генов J (соединяющих) - допол-нительного источника разнообразия анти-тел 25133.22. Соединение генов V и J в различныхрамках также способствует разнообразию ан-тител 25233.23. мРНК для L- и Н-цепей образуются пу-тем сращивания (сплайсинга) первичных продук-тов транскрипции 25233.24. Разные классы антител образуются в ре-зультате перескока генов VH 25333.25. Разнообразие антител обусловлено сома-тической рекомбинацией многих генов клетокзародышевого пути и соматической мута-цией 25433.26. Клонально-селекционная теория образова-ния антител 25533.27. На поверхности клеток, продуцирующихантитела, имеются рецепторы антигенов 25633.28. Биологическое значение клональной селек-ции 257Заключение 257

Глава 34. Мышечное сокращение и подвижностьклеток 26034.1. Мышца состоит из взаимодействующихдруг с другом толстых и тонких белковыхнитей 26034.2. При мышечном сокращении происходитскольжение толстых и тонких нитей относитель-но друг друга 26134.3. Миозин образует толстые нити; он гид-ролизует АТР и связывает актин 26234.4. Миозин можно расщепить на активныефрагменты 26434.5. Актин образует нити, которые соединяют-ся с миозином 26534.6. Актин повышает АТР-азную активностьмиозина 26534.7. Толстые и тонкие нити мышечного волок-на определенным образом ориентирова-ны 26634.8. Полярность толстых и тонких нитей в се-редине саркомера меняется на противополож-ную 26734.9. «Рабочим ходом» является поворот связан-ной с актином S1-головки миозина 26734.10. Тропонин и тропомиозин опосредуют ре-гуляторное действие ионов кальция на мышеч-ное сокращение 269

34.11. Потек ионов Са2+ регулируется сарко-плазматическим ретикулумом 27034.12. Фосфокреатин - форма запасания~Р 27034.13. Актин и миозин служат сократительны-ми элементами почти во всех эукариотическихклетках 27134.14. Распределение микрофиламентов в клеткевыявляется методом иммунофлуоресцентноймикроскопии 27234.15. Прикрепленные к мембране нити актинаопосредуют сокращение микроворсинок кишеч-ника 27434.16. Цитохалазин и фаллоидин тормозят под-вижность, сопряженную с процессами сборкии дезагрегации нитей актина 27634.17. Микротрубочки участвуют в различныхвидах клеточной подвижности и частично фор-мируют цитоскелет 27634.18. Биение ресничек и движение жгутиковобусловлено скольжением микротрубочек, инду-цированным динеином 277Заключение 279

Глава 35. Действие гормонов 28235.1. Открытие циклического AMP - посредникав действии многих гормонов 28235.2. Циклический AMP синтезируется адени-латциклазой и расщепляется фосфодиэстера-зой 28535.3. сАМР служит вторым посредником придействии многих гормонов 28535.4. Сопряжение рецепторов гормонов с адени-латциклазой осуществляется белком, связываю-щим гуаниннуклеотиды 28635.5. Циклический AMP активирует протеинки-назы 28735.6. Циклический АМР - эволюционно древнийсигнал голодания 28835.7. Холерный токсин стимулирует аденилатки-назу, ингибируя GТРазную активность G-бел-ка 28935.8. Инсулин стимулирует анаболические про-цессы и ингибирует катаболические процес-сы 29035.9. Препроинсулин и проинсулин - предшест-венники активного гормона 29035.10. Трехмерная структура инсулина 29235.11. Рецепторы инсулина локализованы в плаз-матической мембране клеток-мишеней 29335.12. Недостаточность инсулина вызывает диа-бет 29435.13. Эндорфины - пептиды мозга, действующие


подобно опиатам 29535.14. При расщеплении проопиокортина обра-зуется несколько пептидных гормонов 29635.15. Простагландины - модуляторы действиягормонов 29735.16. Простагландины образуются из ненасы-щенных жирных кислот 29835.17. Стероидные гормоны активируют специ-фические гены 29835.18. Белковые факторы роста типа ФРН иЭФР стимулируют пролиферацию клеток-ми-шеней 300Заключение 301

Глава 36. Мембранный транспорт 30436.1. Различие между пассивным и активнымтранспортом 30436.2. Открытие системы активного транспортаионов натрия и калия 30536.3. И фермент, и насос ориентированы в мемб-ране 30736.4. АТР преходяще фосфорилирует натрий-калиевый насос 30736.5. Транспорт ионов и гидролиз АТР тесносопряжены 30836.6. Натрий-калиевый насос - олигомерныйтрансмембранный белок 30836.7. Модель механизма действия натрий-калие-вого насоса 30936.8. Кардиотонические стероиды - специфиче-ские ингибиторы (Na+ + К+)-АТРазы и (Na+ ++ К+)-насоса 30936.9. Транспорт кальция осуществляется другойАТРазой 31136.10. Поток Na+ обеспечивает энергией актив-ный транспорт сахаров и аминокислот в жи-вотных клетках 31236.11. Поток протонов служит движущей силойво многих процессах транспорта у бакте-рий 31336.12. Активный транспорт ряда сахаров сопря-жен с их фосфорилированием 31436.13. Транспортные антибиотики повышаютионную проницаемость мембран 31636.14. Транспортные антибиотики функциониру-ют либо как подвижные переносчики, либо какканалообразователи 31736.15. Антибиотики-переносчики имеют формускорлупы ореха и связывают ионы в своейцентральной полости 31836.16. Валиномицин связывает К+ в 1000 раз


прочнее, чем Na+ 31936.17. Можно выявить поток ионов через еди-ничный канал в мембране 32036.18. Через щелевые соединения ионы и не-большие молекулы перетекают из клетки вклетку 322Заключение 324

Глава 37. Возбудимые мембраны и сенсорныесистемы 32637.1. Потенциалы действия опосредованы крат-ковременными изменениями проницаемости дляNa+ и К+ 32637.2. Тетродотоксин и сакситоксин блокируютнатриевые каналы в мембранах аксонов нерв-ных клеток 32837.3. Ацетилхолин является нейромедиато-ром 33037.4. Ацетилхолин открывает в постсинаптиче-ской мембране каналы для катионов 33137.5. Ацетилхолин высвобождается кванта-ми 33137.6. При добавлении ацетилхолина реконструи-рованные мембранные пузырьки становятся про-ницаемыми для катионов 33237.7. Ацетилхолин быстро гидролизуется, и кон-цевая пластинка реполяризуется 33437.8. Ингибиторы ацетилхолинэстеразы исполь-зуются как лекарственные средства и какяды 33437.9. Разработка антидота для лечения отрав-лений органическими фосфатами 33637.10. Ингибиторы ацетилхолинового рецепто-ра 33737.11. К числу нейромедиаторов относятся так-же катехоламины и γ-аминомасляная кислота(ГАМК) 33837.12. Для возбуждения палочки сетчатки глазадостаточно одного фотона 34037.13. Родопсин - фоторецепторный белок пало-чек 34037.14 Свет вызывает изомеризацию 11-цис-pe-тиналя 34337.15. Свет вызывает гиперполяризацию плаз-матической мембраны наружного сегмента па-лочек 34437.16. Медиаторы передают сигнал от фото-лизированного родопсина на плазматическуюмембрану 34537.17. Свет снижает содержание циклическогоGMP путем активации фосфодизстеразы 34637.18. Цветовое зрение опосредуется фоторецеп-торами трех типов 34737.19. 11-цис-ретиналь - хромофор всех извест-ных органов зрения 34837.20. Хеморецепторы бактерий воспринимаютспецифические молекулы и передают сигналы

на жгутики 34937.21. В основании бактериального жгутика на-ходится вращающий его реверсивный «мо-тор» 35037.22. Бактерии различают временной градиент,а не одномоментный пространственный градиентконцентраций 35137.23. При бактериальном хемотаксисе переда-ча информации обеспечивается метилированны-ми белками 352Заключение 353Ответы на вопросы и задачи 356

Приложения 358Приложение А. Физические константы и пере-вод единиц из одной системы в другую 358Приложение Б. Порядковые номера и атомныемассы элементов 359Приложение В. Значение рК' для ряда кис-лот 360Приложение Г. Стандартные длины свя-зей 360Приложение Д. Стандартные сокращения, при-нятые в биохимии 361Предметный указатель 362

УВАЖАЕМЫЙ ЧИТАТЕЛЬ!

Ваши замечания о содержании книги, ее оформ-лении, качестве перевода и другие просим при-сылать по адресу:129820, Москва, И-110, ГСП1-й Рижский пер., д. 2,издательство «Мир».

Люберт Страйер

БИОХИМИЯ, ТОМ 3

Ст. научн. редактор Л. Г. Тер-СаркисянМл. научн. редактор О. А. ГоргунХудожник И. Б. КравцовХудожественный редактор Л. М. КузнецоваТехнический редактор 3. И. РезникКорректор М. А. Смирнов

ИБ № 3853

Сдано в набор 24.01.84.Подписано к печати 6.08.85.Формат 70 х 100/16.Бумага офсетная № 1.Гарнитура тайме. Печать офсетная.Объем 12,5 бум. л. Усл. печ. л. 32,5.Усл.кр.-отт. 130,54. УЧ.-ИЗД.Л. 37,22.Изд. № 4/2707. Тираж 17100 экз. Зак. 97.Цена 3 р. 70 к.

ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»Москва, 1-й Рижский пер., 2.

Можайский полиграфкомбинат Союзполиграф-прома при Государственном комитете СССРпо делам издательств, полиграфии и книжнойторговли.143200, г. Можайск, ул. Мира, 93.

Замеченные опечатки

Страница

76 (подписьк рис. 4.11)

173

196

728896

200201273

Колонка

Левая

(подпись крис. 9.27)

ЛеваяПраваяЛевая

»»

Правая

Строка

5 сн.

3 сн.

1-3 сн.

13 сн.17 сн.8-я св.8 сн.17 св.5 сн.

Напечатано

Том I

α2β1-контактов

Халдейн

North-Holland,1975, р. 105. За-каз 667. стр. 33-38 Голдобина С.

Том II

СъёстрандДикерсонДикенсСтекениус

»Аллантоевую

Следует читать

α1β2-контактов

Холдейн

North-Holland,1975, р. 105

ШестрандДиккерсонДиккенсСтеккениус

»Аллантоиновую

Шлегель Г. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Пер. 6-го нем. изд.- М.: Мир, 1987-38л., ил.- В пер.: 3 р.

Книга представляет собой переводшестого издания популярного в ФРГучебника микробиологии, в которомчетко, ясно и компактно изложены сов-ременные сведения об организации ижизнедеятельности микроорганизмов.Шестое издание значительно перерабо-тано и дополнено по сравнению совторым, выпущенным в 1972 году изда-тельством «Мир».

Для микробиологов - научных сот-рудников и работников микробиологи-ческой промышленности, преподавате-лей и студентов биологических фа-культетов.

Biochimija Sryer v3

Documents

franklin stahl

matthew meselson

oswald avery

maurice wilkins

udp udp

acg gca

papcpg acg

colin macleod