Biochimie appliquée Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA Préparé par: Mr. HALLA Noureddine II- Biochimie des substances d’origine animale (2)
Feb 24, 2016
Biochimie appliquée
Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA
Préparé par:
Mr. HALLA Noureddine
II- Biochimie des substances d’origine animale (2)
Culture de cellules animales (eucaryotes):
L'hybridation cellulaire - application à la production d'anticorps monoclonaux
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
Introduction
Anticorps
Antigène Protéine
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
Introduction
Utilisation en diagnostic dans pratiquement tout le domaine du monde vivant : agroalimentaire,
vétérinaire, microbiologique.
Une action ciblée sur un antigène spécifique d’une cellule responsable du processus pathogène
assurant sa destruction.
Historique
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
1975
1984
1986
1989
1994
Présent
Georges Köhler et César Milstein:la technique d’obtention des anticorps monoclonaux
premier Ac monoclonal mis sur le marché: Muromomab (anti-CD3)
Ac monoclonaux humanisés
production d’Ac monoclonaux humains par des souris transgéniques ou transchromosomiques
Plusieurs progressions
Ac monoclonaux chimériques souris/homme
Définition
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
Ils sont très largement utilisés en biologie et en médecine, à la fois comme outils de diagnostic
et dans des buts thérapeutiques.
Ils sont homogènes contrairement aux anticorps polyclonaux.
Ils reconnaissent un type unique de site antigénique,
Les anticorps monoclonaux ou monoclonal antibody sont identiques car produits par un
clone de cellules spécialisées du système immunitaire (les plamocytes).
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
Rappel
Lorsque les immunoglobulines lient une molécule ou une particule virale ou bactérienne, les immunoglobulines sont
toutes désignées sous le nom d’anticorps, et l’entité reconnue est appelée antigène.
Deux propriétés :- capacité de lier spécifiquement un ou plusieurs ligands, et
- participation à une ou plusieurs fonctions effectrices (activation du complément, stimulation de la phagocytose,
sécrétion d’amines …)
Anticorps
Caractérisation
L’Ac joue un rôle essentiel dans la réponse immunitaire :- c’est le récepteur, à la surface des lymphocytes B ou en
solution dans le sérum,- c’est le transmetteur ou l’activateur de signaux
physiologiques.
Rôles
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
Rappel
Structure
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
Deux principales techniques sont utilisées dans la plupart des laboratoires producteurs des anticorps
monoclonaux
la technique de transformation
lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV
La technique des hybridomes
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
La technique des hybridomes
fusiondes
cellules
sélectiondes
hybridomes
isolementdes
hybridomes
testdes
hybridomes
productiondes
hybridomes
Déroulement de la production des hybridomes
obtention des cellules
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
La technique des hybridomes
Obtention des cellules1
+
Immunisation de la souris avec l’antigène étudié
Obtention des lymphocytes spécifiques
Utilisation de cellules myélomateuses
HGPRT
Obtention des cellules immortelles
Fusion
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
La technique des hybridomes
Fusion des cellules2
+
Par méthode chimique Par méthode physique
fusion des membranes cellulaires avec poly éthylène glycol
fusion des membranes cellulaires par électroporation
sélection
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
La technique des hybridomes
Sélection des hybridomes3
+
Culture sur milieu HAT (Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine)
MORT CELLULAIRE
Impossibilité de se diviser
Cellule myélomateuse HGPRT-
HYBRIDOME SELECTIONNE
Lymphocyte B
MORT CELLULAIREdisparition après quelques
divisions
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
La technique des hybridomes
Isolement des hybridomes4
+
Dès que la croissance est suffisante, il faut propager les cultures d'hybridomes productrices de l'anticorps désiré
(transferts des puits de 0,3 à 2 ml, puis à des bouteilles de 25 ml), les conserver et les cloner. Deux méthodes sont
utilisées pour obtenir un clone à partir d'une cellule :
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
La technique des hybridomes
Isolement des hybridomes4
+
Sur milieu gélosé
Par dilution limite
Une colonie = une cellule initiale Une ou zéro cellules par puit
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
La technique des hybridomes
Test des hybridomes5
+
Test sur le surnageant de chaque puits
de la présence des anticorps monoclonaux par la méthode ELISA
du type d’anticorps produit par des méthodes d’immunoprécipitation
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
La technique des hybridomes
Production des ACM6
+
Amplification des hybridomes
obtention des anticorps monoclonaux
Conservation des hybridomes
Production par
cultures cellulaires
Production dans
les liquides d'ascites
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
La technique des hybridomes
Hypoxanthine IMP
AMP
GMP
Synthèse endogène
TMPThymidine
HGPRT
Thymidine Kinase
AzasérineAminoptérine
Aminoptérine
Milieu HAT : Hypoxanthine, aminoptérine, thymidineMilieu Haza : Hypoxanthine, azasérine
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV
Il s’agit de transformer et de rendre cancéreux un lymphocyte humain sécréteur d’un anticorps donné en y introduisant le
virus d’Epstein-Barr EBV.
L’EBV possède la propriété remarquable d’induire la prolifération continue des
lymphocytes B infectés.
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV
Le virus est un membre de la famille des herpès virus. Il infecte 90 % à 95 % des adultes.
Il est responsable de la mononucléose infectieuse et du lymphome de Burkitt.
Production
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV
Les lymphocytes sécréteurs d’un anticorps obtenus chez un sujet immunisé suite à une infection ou à une transfusion, sont séparés des
autres éléments figurés du sang sur gradient de densité 1.077.
Ils sont ensuite incubés en présence du virus selon différents protocoles.
Applications
Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux
Ils sont utilisés pour la détermination des groupes sanguins ABO et Rhésus, pour les groupages tissulaires HLA et pour l’immunomarquage des
leucémies aigues.
la compréhension de nombreux processus biologiques.
Pour distinguer plusieurs sous-populations lymphocytaires.
la protéomique et les tests de dépistage biologiques en masse.
D’une façon générale, les anticorps monoclonaux sont utilisés en diagnostic dans pratiquement tout le domaine du monde vivant :
agroalimentaire, vétérinaire, microbiologique.
Une action ciblée sur un antigène spécifique d’une cellule responsable du processus pathogène assurant sa destruction.