Biblioteki metagenomowe jako zród³o genów przydatnych w ... · Biblioteki metagenomowe jako zród³o genów przydatnych w biotechnologii Edyta Deja-Sikora, Marcin Sikora, Marcin

Biblioteki metagenomowe jako zród³ogenów przydatnych w biotechnologii

Edyta Deja-Sikora, Marcin Sikora, Marcin Go³êbiewski,Andrzej Tretyn

Zak³ad Biotechnologii, Wydzia³ Biologii i Nauk o Ziemi, UniwersytetMiko³aja Kopernika, Toruñ

Metagenomic libraries as sources of genes useful for biotechnology

S u m m a r y

The vast majority of microorganisms cannot be cultured under laboratoryconditions. It was estimated that over 99% of microbial genetic information areinaccessible due to the inability to isolate and culture bacteria. It is also widelyknown that among those uncultured organisms there are such that bear thegenes which are interesting from the biotechnological point of view, i.e. codingfor novel enzymes (lipases, amylases, cellulases, polymerases etc.), responsiblefor resistance to various chemical substances (heavy metals, aromatic com-pounds, pesticides, antibiotics), or the genes encoding the elements of biosyn-thetic pathways (for instance producing novel antibiotics). Recently, the meth-ods have been developed that allow (i) isolation and purification of environmen-tal DNA, (ii) construction of random fragment libraries of such DNA, and (iii) ef-fective screening of those libraries in search for interesting genes. These meth-ods are collectively known as ‘metagenomics’ or ‘environmental genomics’.

We aim to review the metagenomic methods, which will be done in Part I ofour paper, and to present the up – to – date achievements and future per-spectives for obtaining biotechnologically important genes from environmentalsamples in Part II. The main attention will be paid to soil metagenomics, as thiskind of environment seems to be the most promising in terms of microbialbiodiversity and the spectrum of biochemical reactions performed by inhabitingbacteria.

We will treat the perspectives for isolation of novel, useful genes such asthose coding for biosynthesis of antibiotics, organic compounds degradingpathways, and heavy metal resistance and prospects for their biotechnologicalapplication. Assessing the microbial biodiversity through metagenomic meth-ods will also be covered.

Key words:

metagenomics, environmental DNA, metagenomic libraries, screening, pol-luted environments, bioremediation, biodiversity.

P R A C E P R Z E G L ¥ D O W E

Adres do korespondencji

Marcin Go³êbiewski,Zak³ad Biotechnologii,Wydzia³ Biologii i Nauko Ziemi,Uniwersytet Miko³ajaKopernika,ul. Gagarina 9,87-100 Toruñ;e-mail:[email protected]

4 (79) 125–139 2007

1. Wstêp

Wszystkie ekosystemy funkcjonuj¹ce w przyrodzie zdominowane s¹ przez jed-nokomórkowe organizmy prokariotyczne. G³ówn¹ grupê wœród nich stanowi¹ eu-bakterie. Dziêki swojej ró¿norodnoœci fizjologicznej, plastycznoœci, zdolnoœci szyb-kiego wzrostu i adaptacji do zmieniaj¹cych siê warunków œrodowiskowych, bakterieopanowa³y nisze ekologiczne niedostêpne dla organizmów eukariotycznych. Wa¿n¹rolê w zasiedlaniu przez nie wszelkich mo¿liwych œrodowisk odgrywa ogromny po-tencja³ biochemiczny komórek, które przystosowa³y siê do wykorzystywania bardzoz³o¿onych Ÿróde³ energii, dostêpnych w œrodowisku. Aktywnoœci metaboliczne po-szczególnych grup mikroorganizmów oraz zachodz¹ce pomiêdzy nimi interakcje re-guluj¹ funkcjonowanie ca³ych ekosystemów poprzez rozk³ad i przekszta³canie ma-terii organicznej i nieorganicznej, co jest podstaw¹ obiegu pierwiastków w przyro-dzie.

Potencja³ biochemiczny mikroorganizmów ma swoje Ÿród³o w olbrzymiej ró¿no-rodnoœci informacji genetycznej zawartej w ich komórkach. W genomach bakteriiznajduj¹ siê u¿yteczne geny mog¹ce kodowaæ np. nie znane do tej pory enzymyo znaczeniu przemys³owym, opornoœæ na antybiotyki, metale ciê¿kie czy pestycydy,szlaki degradacji trudno rozk³adalnych zwi¹zków organicznych (wêglowodory aro-matyczne i ich halogeno-pochodne, pestycydy itp.), czy wreszcie szlaki biosyntezyu¿ytecznych zwi¹zków (np. nowych rodzajów antybiotyków).

1.1. Bioró¿norodnoœæ mikroorganizmów

Na podstawie wyników ostatnio przeprowadzanych badañ w celu oszacowanialiczebnoœci organizmów prokariotycznych sugeruje siê, ¿e ogólna liczba komórekbakteryjnych, ¿yj¹cych na Ziemi, zbli¿ona jest do wartoœci 4-6 × 1030, z czegooko³o 2,6 × 1029 komórek egzystuje w glebie (1). Identyfikacja i porównywanie zesob¹ genów koduj¹cych 16S rRNA ma³ej podjednostki rybosomalnej (SSU, ang. smallsubunit), ze wzglêdu na bardzo nisk¹ zmiennoœæ sekwencji, dostarcza informacjio obecnoœci poszczególnych grup bakteryjnych w danym œrodowisku. Pozwala rów-nie¿ na wykrycie nowych i nie scharakteryzowanych do tej pory rodzin (2).

Szacuje siê, ¿e w jednym gramie gleby znajduje siê oko³o 109 organizmów pro-kariotycznych i wiêcej ni¿ dwa tysi¹ce ró¿nych typów genomów. Œrednia reprezen-tacja jednego rodzaju genomu wynosi zatem mniej ni¿ 0,05% (3). Analizuj¹c d³ugoœciposzczególnych typów genomów mikroorganizmów glebowych, zauwa¿ono, ¿e ich³¹czny rozmiar przewy¿sza d³ugoœæ genomu Escherichia coli oko³o 6-10 tysiêcy razyw glebach nie zanieczyszczonych oraz 350-1500 razy w glebach wysoko zanieczysz-czonych metalami ciê¿kimi (4). Ponadto podczas badania ró¿norodnoœci glebowychorganizmów prokariotycznych, wykazano, ¿e tylko 0,1-1,0% bakterii mo¿e byæ pozy-skanych ze œrodowiska za pomoc¹ tradycyjnych metod mikrobiologicznych i nastêp-

Edyta Deja-Sikora i inni

126 PRACE PRZEGL¥DOWE

nie hodowanych w warunkach laboratoryjnych (4,5). Wynik ten wskazuje, ¿e pozo-sta³e 99% glebowej populacji bakterii pozostaje niezbadane i mo¿e byæ Ÿród³em nie-znanych genów.

1.2. Czym jest metagenomika?

Ogromna liczebnoœæ, ró¿norodnoœæ form i szeroka gama przeprowadzanychprzez bakterie procesów biochemicznych nakierowa³y uwagê badaczy na ogromnebogactwo puli genetycznej tych organizmów (6). Badania nad dostêpem do „genówœrodowiskowych” zaowocowa³y wyodrêbnieniem nowej ga³êzi genomiki, która na-zwana zosta³a metagenomik¹. Okreœlenie to wywodzi siê z po³¹czenia dwóch termi-nów – metaanalizy i genomiki. Metaanaliza oznacza proces statystycznego ³¹cze-nia oddzielnych analiz lub wtórnego odkrywania wiedzy metod¹ uogólniania infor-macji zawartych w publikacjach naukowych lub Ÿród³ach pierwotnych, natomiastgenomika obejmuje kompleksow¹ analizê materia³u genetycznego organizmów (6).Jej pole zainteresowania obejmuje budowê i dzia³anie genomów, poszczególnychgenów i operonów, a tak¿e badanie produktów ich ekspresji (6). Na tej podstawied¹¿y siê do poznania: ró¿norodnoœci organizmów prokariotycznych, zale¿noœci po-miêdzy budow¹ ich genomów a funkcj¹ œrodowiskow¹ oraz do zidentyfikowania no-wych genów koduj¹cych bia³ka o po¿¹danych funkcjach (7,8). Od strony metodolo-gicznej metagenomika wykorzystuje podstawowe techniki biologii molekularnej ta-kie jak: ekstrakcja kwasów nukleinowych ze œrodowiska, ich amplifikacja za pomoc¹reakcji PCR oraz bezpoœrednie klonowanie DNA œrodowiskowego w celu konstrukcjitzw. bibliotek metagenomowych.

Sformu³owanie „metagenom” po raz pierwszy pojawi³o siê w literaturze nauko-wej w 1998 r. i zosta³o u¿yte jako okreœlenie obejmuj¹ce genomy wszystkich mikro-organizmów wystêpuj¹cych w przyrodzie (9). Do tej pory analizie metagenomicznejpoddano mikroorganizmy bytuj¹ce w kilku œrodowiskach, m. in. w wodach mor-skich (10) i osadach czynnych (11). Bardzo du¿ym zainteresowaniem cieszy siê rów-nie¿ gleba (12).

2. Izolacja DNA metagenomowego

Wyizolowanie œrodowiskowego DNA jest pierwszym etapem ka¿dego doœwiad-czenia metagenomicznego. Opracowanie prostej i wydajnej techniki izolacji jesttrudne i wci¹¿ pozostaje przedmiotem badañ. Dobra metoda pozyskiwania œrodo-wiskowego DNA powinna (13):

– zapobiegaæ zbytniej fragmentacji materia³u genetycznego na skutek dzia³aniaczynników fizycznych,

– uniemo¿liwiaæ degradacjê DNA, bêd¹c¹ wynikiem dzia³ania nukleaz,

Biblioteki metagenomowe jako zród³o genów przydatnych w biotechnologii

BIOTECHNOLOGIA 4 (79) 125-139 2007 127

– zapewniaæ uzyskanie materia³u genetycznego o wysokiej jakoœci i niskimstopniu zanieczyszczenia substancjami hamuj¹cymi reakcje enzymatyczne.

Wyró¿niamy dwa typy izolacji DNA metagenomowego: metodê bezpoœredni¹i poœredni¹ (14). Metoda bezpoœrednia polega na przeprowadzeniu lizy komórekbakteryjnych, znajduj¹cych siê w swoim naturalnym œrodowisku (np. macierzy gle-bowej) (15). Uwolniony materia³ genetyczny kontaktuje siê zatem ze zwi¹zkamiobecnymi w œrodowisku, np. w przypadku gleby z kwasami humusowymi, stano-wi¹cymi trudne do usuniêcia zanieczyszczenia hamuj¹ce reakcje enzymatyczne. Ko-nieczne jest zatem doczyszczenie DNA w celu przygotowania go do tych reakcji.G³ówn¹ zalet¹ metod bezpoœrednich jest uzyskanie du¿ej iloœci materia³u genetycz-nego, dobrze reprezentuj¹cego ró¿norodnoœæ metagenomu. Pominiêcie etapu izo-lacji bakterii ze œrodowiska nie dyskryminuje mikroorganizmów zaadsorbowanychna powierzchni cz¹stek sta³ych (14). Najwiêkszymi wadami tych metod s¹: zanie-czyszczenie wyizolowanego DNA inhibitorami reakcji enzymatycznych (16) orazDNA eukariotycznym, a tak¿e znaczna fragmentacja DNA (17). Metody bezpoœredniestosowane s¹ najczêœciej do izolacji DNA s³u¿¹cego jako matryca w reakcji PCR b¹dŸdo konstrukcji bibliotek o ma³ych wstawkach (18).

W metodzie poœredniej bakterie wyodrêbnione ze œrodowiska, np. na drodze wi-rowania w gradiencie gêstoœci, mog¹ byæ poddane standardowej lizie alkalicznej(14,19), enzymatycznej (20,21) lub ³agodnej lizie w ¿elu agarozowym i elektrofore-zie (22). Metoda poœrednia zosta³a opracowana aby zmniejszyæ iloœæ zanieczyszczeñchemicznych oraz zredukowaæ mechaniczn¹ i enzymatyczn¹ degradacjê materia³ugenetycznego, co pozwala uzyskaæ fragmenty DNA o d³ugoœci powy¿ej 300 kpz (22).Ostateczny wybór techniki izolacji uwarunkowany jest w³aœciwoœciami œrodowiskai póŸniejszym zastosowaniem DNA (14).

Omówienie metod izolacji i oczyszczania metagenomowego DNA dotyczy g³ów-nie gleb, jako œrodowiska najbogatszego w mikroorganizmy.

2.1. Metody bezpoœrednie

Na metody te sk³adaj¹ siê dwa krytyczne etapy: pierwszy polega na zniszczeniuœcian i b³on komórkowych mikroorganizmów w celu uwolnienia kwasów nukleino-wych do buforu ekstrakcyjnego, drugi to oddzielenie DNA od pozosta³ych wyekstra-howanych substancji.

Wyró¿nia siê trzy rodzaje lizy komórek: mechaniczn¹ (fizyczn¹), chemiczn¹ i en-zymatyczn¹. Sposoby te stosuje siê oddzielnie lub w kombinacjach.

Metody fizyczne niszcz¹ struktury komórkowe i powoduj¹ rozdrobnienie agre-gatów glebowych, co umo¿liwia dostêp do komórek znajduj¹cych siê w mikropo-rach macierzy glebowej. Destrukcji ulegaj¹ zarówno postaci wegetatywne, jak i spo-ry. Pozwalaj¹ one uzyskaæ najwiêksze iloœci DNA, jednak jest ono mocno pofrag-mentowane. Œrednia wielkoœæ fragmentów przy zastosowaniu lizy mechanicznej wy-



nosi od 600 pz do 25 kpz, co umo¿liwia wykorzystanie ich do konstrukcji bibliotekplazmidowych, fagowych lub kosmidowych i przeprowadzenie reakcji PCR. Do me-tod fizycznych zalicza siê: zamra¿anie-rozmra¿anie oraz zamra¿anie-gotowanie(23), rozdrabnianie homogenizatorem ostrzowym (ang. warring blender) (24), roz-drabnianie w tak zwanym m³ynie ziarnowym (ang. bead-beater) (25), rozdrabnianiew moŸdzierzu w obecnoœci ciek³ego azotu (26), ultrasonifikacja i mikrofalowy szoktermiczny (23).

Metody chemiczne s¹ ³agodniejsze ni¿ metody fizyczne. Wymagaj¹ wstêpnegorozdrobnienia materia³u co umo¿liwia dostêp buforu lizuj¹cego do komórek by-tuj¹cych wewn¹trz agregatów glebowych. Do lizy u¿ywa siê najczêœciej SDS z do-datkiem CTAB, który dzia³a jako detergent i w obecnoœci wysokiego stê¿enia NaClwytr¹ca z roztworu zwi¹zki polifenolowe (27). W niektórych protoko³ach stosuje siêzwi¹zki denaturuj¹ce, takie jak izotiocyjanian guanidyny (28), czy ditiotreitol (DTT)(19). Zapobiegaj¹ one degradacji DNA dezaktywuj¹c nukleazy poprzez redukcjêmostków dwusiarczkowych.

Metody enzymatyczne s¹ naj³agodniejsze dla DNA. Opieraj¹ siê na enzymatycz-nym trawieniu œcian komórkowych, co jest szczególnie u¿yteczne w przypadku bak-terii gramdodatnich, odpornych na metody mechaniczne i chemiczne. Metody enzy-matyczne stosuje siê zw³aszcza, gdy wielkoœæ DNA ma podstawowe znaczenie (naprzyk³ad w konstrukcji bibliotek BAC). Enzymów u¿ywa siê równie¿ do niszczenianukleaz degraduj¹cych DNA i do usuwania zanieczyszczaj¹cego RNA. Najczêœciejstosowane enzymy to lizozym (E.C. 3.2.1.17) (20,21), achromopeptydaza (E.C. 3.4.21.50;niszczy œciany komórkowe, skuteczna w przypadku bakterii opornych na lizozym)(29), proteinaza K (E.C. 3.4.21.64) (27) i RNAza A (rybonukleaza A, EC 3.1.27.5).

2.2. Metody poœrednie

W metodach poœrednich pierwszym i najwa¿niejszym etapem jest dyspersja ma-cierzy glebowej i wyizolowanie jak najwiêkszej iloœci nienaruszonych komórek bak-teryjnych, co gwarantuje otrzymanie nieuszkodzonego DNA. Oddzielone komórkimusz¹ reprezentowaæ mo¿liwie najpe³niej ró¿norodnoœæ mikroflory próbki gleby.Drugi etap to liza komórek i izolacja DNA. Ostatnim etapem jest oczyszczenie kwa-sów nukleinowych.

Do rozdrabniania gleby stosuje siê metody chemiczne i fizyczne.Najpowszechniej stosowane metody fizyczne to homogenizacja homogenizato-

rem ostrzowym, sonifikacja i ³agodne rozpraszanie przez wytrz¹sanie i wiruj¹cyt³uczek. Najskuteczniejsze w rozpraszaniu cz¹steczek gleby s¹ homogenizatoryostrzowe i wiruj¹ce t³uczki (30), których zastosowanie jest mo¿liwe dla ma³ych i du-¿ych próbek.

Metody chemiczne stosowane s¹ najczêœciej w po³¹czeniu z fizycznymi. Efektyw-ne okaza³y siê ¿ywice kationowymienne (31), stosowano równie¿ zwi¹zki takie jak


BIOTECHNOLOGIA 4 (79) 125-139 2007 129

cholinian sodu i deoksycholinian sodu (32) oddzia³uj¹ce na bakteryjne lipopolisa-charydy oraz glikol polietylenowy (PEG) i SDS, które rozpuszczaj¹ materia³ hydrofo-bowy (28). Powa¿n¹ wad¹ metod chemicznych jest uszkadzanie komórek bakteryj-nych.

Innym sposobem oddzielenia komórek bakterii od macierzy glebowej jest wiro-wanie oparte na ró¿nicach w sedymentacji miêdzy poszczególnymi komponentamipróbki (32). Metoda sk³ada siê z dwóch nastêpuj¹cych po sobie wirowañ: przy ni-skim przyspieszeniu, s³u¿¹cego do usuniêcia du¿ych fragmentów gleby i plech grzy-bowych oraz przy du¿ym przyspieszeniu, podczas którego wiruj¹c supernatant uzy-skuje siê frakcjê bakteryjn¹ w postaci osadu. Jeden cykl wirowañ pozwala na oddzie-lenie oko³o 10% zawartych w próbce gleby bakterii i wed³ug autorów metody, iloœætaka reprezentuje ca³¹ ró¿norodnoœæ biologiczn¹ próbki. Kolejne cykle zwiêkszaj¹tylko iloœæ otrzymywanego materia³u genetycznego (24).

Kolejn¹ z metod jest wirowanie w gradiencie gêstoœci. Jako medium gradiento-we testowano m.in. Metryzamid, Percoll (33), Nycodenz (30) i sacharozê (34). Wy-dajnoœæ tej metody oddzielania bakterii od gleby to od 6 do 50% ogólnej liczby ko-mórek bakterii zawartych w próbce gleby. Skutecznoœæ zale¿y g³ównie od sk³adugleby. Najtrudniejsze do obróbki s¹ gleby z du¿¹ zawartoœci¹ gliny. W porównaniuz metod¹ sedymentacyjn¹ wirowanie w gradiencie Nycodenzu pozwala na otrzyma-nie mniej zanieczyszczonych komórek bakteryjnych (24).

Po oddzieleniu komórek od gleby nastêpuje izolacja i doczyszczanie DNA. Proce-dury izolacji s¹ podobne jak w przypadku metod bezpoœrednich. W celu usuniêcianiektórych zanieczyszczeñ glebowych opracowano dodatkowe protoko³y. Delikatnaliza komórek po³¹czona z wirowaniem w gradiencie chlorku cezu jest metod¹ po-zwalaj¹c¹ uzyskaæ DNA o wysokiej czystoœci i rozmiarach przekraczaj¹cych 100 kpz,jest zatem niezwykle przydatna przy konstruowaniu bibliotek z u¿yciem BAC (ang.Bacterial Artificial Chromosome) (19). Skompilowana metoda uwzglêdniaj¹ca izolowa-nie bakterii przez wirowanie w gradiencie, lizê komórek w korkach agarozowychi elektroforezê pulsacyjn¹, pozwoli³a na uzyskanie fragmentów o d³ugoœci powy¿ej300 kpz i czystoœci odpowiedniej dla klonowania i wytworzenia biblioteki fosmido-wej lub z u¿yciem BAC (22).

3. Oczyszczanie metagenomowego DNA po izolacji

DNA po izolacji ze œrodowiska, a zw³aszcza po ekstrakcji z gleby, musi zostaæpoddane oczyszczeniu. Surowy ekstrakt zawiera najczêœciej zanieczyszczenia unie-mo¿liwiaj¹ce zastosowanie technik biologii molekularnej takich jak na przyk³ad PCRczy hybrydyzacja oraz powoduj¹ce inaktywacjê enzymów restrykcyjnych i ligazy.Najpowa¿niejszym zanieczyszczeniem preparatów DNA lub RNA izolowanych z gle-by s¹ kwasy humusowe. Ich usuniêcie umo¿liwia przeprowadzenie reakcji PCR, od-wrotnej transkrypcji, trawienia czy ligacji. Techniki oczyszczania obejmuj¹:



– zastosowanie rozpuszczalników organicznych takich jak fenol i chloroform,– wirowanie w gradiencie chlorku cezu (CsCl) lub chlorku cezu-bromku etydyny

(CsCl-EtBr) (35),– oczyszczanie na kolumnach hydroksyapatytowych z u¿yciem mocznika (25),– elektroforeza w ¿elu agarozowym,– molekularne s¹czenie ¿elowe (26),– chromatografia jonowymienna z u¿yciem komercyjnych zestawów do oczysz-

czania DNA (36).

4. Charakterystyka bibliotek metagenomowych

Biblioteka genomowa to kolekcja klonów zawieraj¹cych losowe fragmenty hete-rologicznego DNA, reprezentuj¹ce ca³y genom okreœlonego organizmu lub grupyorganizmów (37). Reprezentatywnoœæ biblioteki (prawdopodobieñstwo znalezie-nia w niej klonu zawieraj¹cego okreœlon¹ sekwencjê) zwi¹zana jest z ca³kowitymrozmiarem klonowanego DNA, œredni¹ d³ugoœci¹ wstawki i liczb¹ klonów. Zewzglêdu na du¿y ³¹czny rozmiar DNA metagenomowego skonstruowanie repre-zentatywnej biblioteki wymaga zgromadzenia du¿ej liczby klonów. Teoretyczniebank DNA reprezentuj¹cy ca³y metagenom wyizolowany z próby glebowej, powi-nien zawieraæ w ok. 106 klonów z insertami o d³ugoœci 100 kpz (38). Kalkulacja taoparta jest na za³o¿eniu, ¿e wszystkie typy genomów posiadaj¹ równe reprezenta-cje w wyizolowanym DNA. W rzeczywistoœci w glebie wystêpuje tak¿e frakcja bar-dzo rzadkich genomów, co sprawia, ¿e liczba klonów potrzebna do odzyskaniaca³ej informacji genetycznej powinna byæ du¿o wiêksza ni¿ 106 (12). Je¿eli biblio-teka przeszukiwana bêdzie pod k¹tem funkcji, prawdopodobieñstwo zidentyfiko-wania genu zale¿y dodatkowo od spodziewanego typu ekspresji tego genu w ko-mórce gospodarza (39).

Biblioteki metagenomowe reprezentuj¹ zbiór wszystkich genomów prokario-tycznych, wystêpuj¹cych w danym œrodowisku. Konstruowane s¹ wed³ug standardo-wej procedury, wymagaj¹ jednak modyfikacji protoko³ów stosowanych na poszcze-gólnych etapach. Najistotniejsze w konstrukcji biblioteki jest dobranie odpowied-niej pary gospodarz-wektor.

Gospodarzem najczêœciej wykorzystywanym do klonowania s¹ specjalnie skon-struowane szczepy Escherichia coli (12,37,38). Spoœród laboratoryjnych szczepówE. coli do konstrukcji bibliotek metagenomowych najczêœciej wykorzystywane s¹DH10B i DH5�, zdolne do efektywnego pobierania i stabilnego utrzymywania frag-mentów DNA o d³ugoœci wiêkszej ni¿ 100 kpz (38). Wykazano, ¿e w komórkachE. coli zachodzi ekspresja heterologicznego DNA, pochodz¹cego od Bacillus cereus(2). Jednak zastosowanie E. coli jako jedynego gospodarza ogranicza ró¿norodnoœægenów ulegaj¹cych ekspresji, dlatego powsta³a koncepcja wykorzystania innychbakterii, np. Streptomyces lividans i Pseudomonas putida (40).


BIOTECHNOLOGIA 4 (79) 125-139 2007 131

S. lividans to bakterie nale¿¹ce do rzêdu Actinomycetales, który znany jest z ol-brzymiego potencja³u metabolicznego i produkcji licznych metabolitów wtórnych(np. antybiotyków, poliketonów) oraz enzymów (19,41). Jako gospodarza do ekspre-sji bibliotek metagenomowych stosuje siê szczep zmodyfikowany genetycznie.Z jego chromosomu usuniêto operony red i act, odpowiedzialne za syntezê barwni-ków i antybiotyków – brak zatem endogennych aktywnoœci, które mog¹ interfero-waæ z detekcj¹ heterologicznych genów (40). Ekspresja metagenomowego DNAw komórkach S. lividans mo¿liwa jest dziêki konstrukcji wektorów bifunkcjonalnych(wahad³owych, ang. shuttle vectors). Zawieraj¹ one sekwencjê oriT, umo¿liwiaj¹c¹transfer wektora z E. coli do S. lividans na drodze mobilizacji przez plazmidy IncPoraz kasetê attP-int, pochodz¹c¹ od faga �C31 umo¿liwiaj¹c¹ integracjê z miejscemattB na chromosomie (40). Ponadto wektor wyposa¿ony jest w marker opornoœci –np. na tiostrepton (Th). Tak skonstruowany system zapewnia stabilne utrzymywanieobcego DNA w formie zintegrowanej z chromosomem S. lividans (42).

Innym typem bakteryjnego gospodarza do ekspresji metagenomowego DNA jestniepatogenny, glebowy szczep Pseudomonas putida KT 2240 (43). Modyfikacja tegoszczepu, umo¿liwiaj¹ca integracjê wektorów wahad³owych, polega na wprowadze-niu do chromosomu Pseudomonas sekwencji attB (40).

Wykazano, ¿e wektory wahad³owe na bazie BAC, mog¹ przenosiæ i utrzymywaæfragmenty DNA o wielkoœci 120 kpz w gospodarzu innym ni¿ E. coli (42). Wysoka wy-dajnoœæ transferu koniugacyjnego sprawia, ¿e ekspresja i przeszukiwanie biblioteko du¿ych insertach w gospodarzach takich jak Streptomyces i Pseudomonas jest znacz-nie ³atwiejsze (40).

Wybór wektora do tworzenia biblioteki jest bardzo istotny i decyduje o w³aœ-ciwoœciach otrzymanego banku genów. Biblioteki metagenomowe klasyfikuje siê napodstawie typu wykorzystanego wektora. Mo¿na wyró¿niæ biblioteki oparte na:ma³ych plazmidach bakteryjnych i wektorach bakteriofagowych (18), kosmidachi fosmidach (13,44), sztucznych chromosomach bakteryjnych (BAC) (45).

4.1. Biblioteki oparte na ma³ych plazmidach o wysokiej liczbie kopii i fa-gach

Wektory plazmidowe i bakteriofagowe stosowane s¹ do konstrukcji bibliotekmetagenomowych, zawieraj¹cych ma³e fragmenty heterologicznego DNA. Ich po-jemnoœæ jest bardzo ograniczona, poniewa¿ maksymalny rozmiar przyjmowanegoprzez nie insertu wynosi od 10 kpz (dla plazmidów) do 20 kpz (dla wektorów fago-wych). Oba typy wektorów posiadaj¹ na ogó³ elementy, które umo¿liwiaj¹ ekspresjêobcych genów w komórkach gospodarza (46). Wœród plazmidów bardzo popularnes¹ wektory pUC18/19.

Wektory fagowe znacznie ró¿ni¹ siê od plazmidowych i najczêœciej oparte s¹ nagenomie bakteriofaga lambda. Ligacja heterologicznego materia³u genetycznego



z ramionami faga daje d³ugie, liniowe cz¹steczki DNA, które nastêpnie s¹ fragmen-towane i pakowane do bia³kowego kapsydu (46). Zalet¹ stosowania wektorów prze-nosz¹cych ma³e fragmenty DNA jest ³atwoœæ ich izolacji oraz proste i dobrze opraco-wane metody transformacji i dalszej manipulacji materia³em genetycznym. Wad¹jest ma³a pojemnoœæ, która umo¿liwia odnajdywanie pojedynczych genów lub ma-³ych operonów.

4.2. Biblioteki kosmidowe i fosmidowe

Kosmidy i fosmidy s¹ wektorami do klonowania fragmentów DNA o d³ugoœci30-45 kpz. Kosmidy ³¹cz¹ w sobie cechy wektorów plazmidowych i fagowych. Nios¹plazmidow¹ sekwencjê ori, gen opornoœci na antybiotyk oraz sekwencjê cos (umo¿li-wiaj¹c¹ pakowanie do kapsydów fagowych). Wektory kosmidowe wprowadzane s¹do komórki gospodarza jako fagi, natomiast wewn¹trz tych komórek namna¿aj¹ siêjak typowe plazmidy. Fosmidy to odmiana wektorów kosmidowych, opartych na re-plikonie plazmidu F E. coli, zdolnych do przenoszenia fragmentów DNA o d³ugoœci do45 kpz. Po transformacji komórka bakteryjna utrzymuje tylko jedn¹ kopiê fosmidu,dziêki czemu materia³ genetyczny klonowany w wektorze jest bardziej stabilny (45).

4.3. Biblioteki oparte na sztucznych chromosomach bakteryjnych (BAC)

Spoœród wszystkich wektorów dostêpnych do konstrukcji bibliotek metageno-mowych, sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) wykorzystywane s¹ najczêœciej.Wektory te odznaczaj¹ siê bardzo wysok¹ pojemnoœci¹, pozwalaj¹c¹ na utrzymywa-nie w komórce insertów DNA o wielkoœci do 350 kpz oraz szeregiem cech, któreczyni¹ je dogodnym narzêdziem do klonowania obcych fragmentów DNA (17).Sztuczne chromosomy bakteryjne skonstruowane zosta³y w oparciu na replikonieplazmidu F E. coli (45). Sztuczne chromosomy bakteryjne daj¹ mo¿liwoœæ identyfika-cji ca³ego zespo³u genów tworz¹cych szlak metaboliczny (39), oraz wykazuj¹ du¿¹stabilnoœæ materia³u genetycznego, co zapobiega jego rearan¿acjom (38). Wad¹wektorów BAC jest trudnoœæ w izolacji (ze wzglêdu na ekstremalnie nisk¹ liczbê ko-pii) oraz transformacji nimi komórek gospodarza.

5. Ocena bioró¿norodnoœci mikroorganizmów w œrodowisku

Izolacja DNA metagenomowego w celu prowadzenia badañ filogenetycznych,opartych na analizie sekwencji genów 16S rRNA, stanowi obecnie jedn¹ z najdogod-niejszych metod charakteryzowania mikroorganizmów glebowych (47). Identyfika-cja i porównywanie ze sob¹ tych genów dostarcza informacji o obecnoœci poszcze-


BIOTECHNOLOGIA 4 (79) 125-139 2007 133

gólnych grup bakteryjnych w metagenomie, oraz pozwala na wykrycie nowych i niescharakteryzowanych do tej pory rodzin i gatunków (2). Na podstawie analizy se-kwencji genów 16S rRNA, wyodrêbnionych z ekosystemów wysoko zanieczyszczo-nych, zasugerowano, ¿e systemy te w ogromnej przewadze sk³adaj¹ siê z nie zna-nych jeszcze organizmów prokariotycznych, które mog¹ byæ zaanga¿owane w pro-cesy bioremediacji (48).

Typowy schemat doœwiadczenia badaj¹cego bioró¿norodnoœæ mikroorganizmóww danym œrodowisku wygl¹da nastêpuj¹co: z badanej próbki izolowane jest DNAmetagenomowe, które s³u¿y jako matryca do namno¿enia genów 16S rRNA za po-moc¹ zdegenerowanych primerów, specyficznych dla poszczególnych grup bakterii.Namno¿one fragmenty s¹ klonowane w wektor o wysokiej liczbie kopii, a powsta³abiblioteka jest sekwencjonowana. Po ustaleniu sekwencji wystarczaj¹cej liczby klo-nów porównuje siê je z obecnymi w bazach danych, np. w Ribosomal Database Pro-ject (RDP-II) i konstruuje drzewa filogenetyczne (49).

6. Przeszukiwanie bibliotek metagenomowych

Biblioteki metagenomowe mo¿na przeszukiwaæ pod k¹tem identyfikacji klonówwykazuj¹cych po¿¹dan¹ funkcjê lub przenosz¹cych okreœlon¹ sekwencjê.

Wykrywanie aktywnoœci klonów w bibliotece zachodziæ mo¿e poprzez: wizualn¹identyfikacjê charakterystycznego dla nich fenotypu (np. zabarwienia) lub bezpo-œredni¹ selekcjê w warunkach wzrostowych, w których zachodzi preferowanywzrost komórek bakteryjnych, posiadaj¹cych po¿¹dan¹ aktywnoœæ (np. zdolnoœæwykorzystywania danego substratu jako jedynego Ÿród³a wêgla lub azotu) (43,50).

Zalet¹ przeszukiwania bibliotek pod k¹tem okreœlonej aktywnoœci jest mo¿li-woœæ detekcji œrodowiskowych genów koduj¹cych nowe typy i klasy enzymów orazca³ych szlaków syntezy nie znanych dot¹d metabolitów wtórnych. Techniki te niewymagaj¹ znajomoœci sekwencji genów i s¹ wysoce selektywne wobec tych genów,których sekwencja jest pe³na i ekspresja daje funkcjonalny produkt (12). Ponadto s¹one proste w wykonaniu i pozwalaj¹ na jednoczesne przetestowanie tysiêcy klonówtworz¹cych bibliotekê (50). Jednym z najtrudniejszych do rozwi¹zania problemówjest niewielka iloœæ aktywnych klonów w bibliotece, co wynika z braku ekspresji he-terologicznego DNA w komórkach zastêpczego gospodarza (39). Ekspresja obcegomateria³u genetycznego wymaga bowiem rozpoznania charakterystycznych dla in-nych mikroorganizmów sekwencji regulatorowych w obrêbie DNA oraz obecnoœcispecyficznych dla nich czynników transkrypcyjnych. Dodatkowo formowanie siê ak-tywnego produktu bia³kowego uwarunkowane jest zajœciem efektywnej translacjioraz poprawnego fa³dowania bia³ka, a tak¿e obecnoœci¹ odpowiednich chaperonówi kofaktorów, reguluj¹cych jego aktywnoœæ. Czêsto wymagana jest równie¿ obec-noœæ specyficznych enzymów, uczestnicz¹cych w potranslacyjnych modyfikacjachbia³ka oraz wydajny proces jego sekrecji (37,39).



W celu ominiêcia tych ograniczeñ skonstruowano nowe systemy do ekspresji he-terologicznego DNA (np. wektory wahad³owe oraz zmodyfikowane szczepy E. coliwykazuj¹ce podwy¿szon¹ ekspresjê obcych genów), a tak¿e zaprojektowano nowemetody przeszukiwania bibliotek, wykorzystuj¹ce pod³o¿a p³ynne, które zapew-niaj¹ swobodn¹ dyfuzjê substratów i produktów pomiêdzy komórkami i dziêki temupozwalaj¹ na identyfikacjê klonów uzupe³niaj¹cych siê metabolicznie (nale¿¹cychdo tzw. konsorcjów metabolicznych – ang. metabolic consortium) (44).

Na podstawie analizy dokonanej pod k¹tem funkcji nie mo¿na odnaleŸæ wszyst-kich potencjalnie u¿ytecznych genów ze wzglêdu na ograniczenia opisanej ekspre-sji. Identyfikacjê takich genów pominiêtych przy poszukiwaniu funkcjonalnych klo-nów mo¿e zapewniæ przeszukiwanie pod k¹tem sekwencji, poprzez zastosowaniereakcji ³añcuchowej polimeryzacji (PCR) (15,16), sond molekularnych (12), sekwen-cjonowania (10,46), mikromacierzy (51) i analiz bioinformatycznych. Detekcja po-szukiwanej sekwencji za pomoc¹ reakcji PCR lub sond molekularnych wymaga za-projektowania wysoce specyficznych oligonukleotydów hybrydyzuj¹cych z konser-wowanymi regionami poszukiwanych genów. Informacje na temat konserwowanychsekwencji uzyskuje siê poprzez analizy genów zgromadzonych w bazach danych(12). Do sekwencjonowania najczêœciej u¿ywa siê bibliotek o niewielkich wstawkachw wysokokopiowych plazmidach. Ustalenie sekwencji du¿ej liczby klonów pozwalana z³o¿enie genomów najbardziej reprezentatywnych organizmów i ich póŸniejsz¹analizê (52). Na podstawie porównania uzyskanych sekwencji z homologami z bazdanych mo¿na wnioskowaæ o potencjalnej u¿ytecznoœci genów. Z posk³adanych se-kwencji genomowych uzyskuje siê dodatkowe informacje, np. o kontekœcie w jakimwystêpuj¹ dane geny, czy o pozycji taksonomicznej organizmu z którego pochodz¹.

Mikromacierze umo¿liwiaj¹ jednoczesn¹ i szybk¹ analizê wielu tysiêcy fragmen-tów metagenomowego DNA (51). Ich wykorzystanie w celach badawczych polega nahybrydyzowaniu znakowanych fluorescencyjnie cz¹steczek DNA z odpowiednimipolami mikromacierzy, w obrêbie których znajduj¹ siê sekwencje komplementarnedo badanych prób. Dziêki temu mo¿liwe jest ustalenie sekwencji DNA lub wzorcaekspresji genów w komórce (53).

7. Zastosowanie i perspektywy rozwoju metagenomiki

Najwiêkszym do tej pory projektem metagenomicznym by³o sekwencjonowanieDNA populacji mikroorganizmów z Morza Sargassowego. Badania te prowadzonozgodnie z klasycznym schematem (izolacja, klonowanie, sekwencjonowanie). W pierw-szym etapie wyizolowano z wody morskiej mikroorganizmy (filtracja, zebrano osadz filtrów o porach od 0,1 do 3 �m), nastêpnie wyekstrahowano z nich ca³kowiteDNA, które pofragmentowano na odcinki o d³ugoœci od 2 do 6 kpz i sklonowanow wektor o du¿ej liczbie kopii. Wygenerowano w sumie 993 tysi¹ce klonów, któ-rych inserty zsekwencjonowano z obu koñców, co da³o 1,63 Gpz sekwencji (52).


BIOTECHNOLOGIA 4 (79) 125-139 2007 135

Na podstawie uzyskanych wyników istnieje mo¿liwoœæ z³o¿enia prawie komplet-nych sekwencji genomowych z losowych klonów DNA metagenomowego. Otrzyma-no m. in. genom organizmu zbli¿onego do Burkholderia, dwa genomy bakterii spo-krewnionych z Shewanella oneidensis, zestaw kontigów reprezentuj¹cych SAR86,Prochlorococcus i nie znan¹ do tej pory archebakteriê. Ponadto, zidentyfikowano m.in. 1800 nie znanych do tej pory genów bakteriorodopsyny, co uwidacznia bogac-two informacji genetycznej nawet w tak oligotroficznym œrodowisku, jakim jestwoda morska (52).

Oprócz znaczenia poznawczego, dostêp do metagenomów œrodowiskowych,a zw³aszcza glebowych, ma znaczenie biotechnologiczne. Gleba ju¿ od dawna uwa-¿ana jest za jedno z wa¿niejszych Ÿróde³ substancji u¿ytecznych w procesach pro-dukcyjnych. Poniewa¿ liczba gatunków bakterii znajduj¹cych siê w jednej tonie gle-by, mo¿e wynosiæ nawet 4 miliony (54), mo¿liwoœci odkrycia nie znanych jeszczezwi¹zków aktywnych biologicznie s¹ ogromne. Zró¿nicowanie budowy i w³aœciwoœ-ci metabolicznych mikroorganizmów oraz opracowanie technik pozwalaj¹cych wy-izolowaæ geny ze œrodowiska, przyczyni³o siê do zainteresowania metagenomemjako Ÿród³em genów koduj¹cych:

– bia³ka odpowiedzialne za syntezê zwi¹zków biologicznie czynnych takich jakantybiotyki, substancje antynowotworowe i immunosupresyjne (55),

– biokatalizatory zdolne do przeprowadzania procesów biochemicznych w wa-runkach przemys³owych lub katalizuj¹ce nowe typy przemian (37),

– szlaki degradacji ksenobiotyków (53) oraz odpornoœci, np. na metale ciê¿kie(56).

Obecnie wiêkszoœæ antybiotyków odkrywana jest na drodze izolacji z czystychkultur mikroorganizmów hodowanych laboratoryjnie, jednak liczba antybiotykówidentyfikowanych metodami tradycyjnymi wci¹¿ spada (4). Alternatywnym i znacz-nie bogatszym ich Ÿród³em staje siê metagenom glebowy, w którym mo¿liwa jestzarówno identyfikacja nowych produktów jak i wykrywanie mechanizmów oporno-œci na antybiotyki (4). Wyizolowano m.in. geny odpowiadaj¹ce za syntezê nowegotypu antybiotyków (turbomycyn A i B) (57).

Biblioteki metagenomowe umo¿liwiaj¹ równie¿ uzyskanie wielu rodzajów enzy-mów. Izolowano m.in. lipazy (58), esterazy (59), endoglukanazy (60), pektynazy (61)proteazy (62), dehydrogenazy (63) i oksygenazy (64). Spoœród enzymów o du¿ymznaczeniu biotechnologicznym w metagenomie szczególnie poszukiwane s¹ lipazyi esterazy, poniewa¿ pozostaj¹ one wysoce aktywne w rozpuszczalnikach organicz-nych, wykazuj¹ wysok¹ stereoselektywnoœæ i nie wymagaj¹ obecnoœci kofaktorówdo funkcjonowania (41). W bibliotece skonstruowanej z DNA wyizolowanego z pró-by gleby pobranej na pustyni alkalicznej zidentyfikowano 120 nowych genów na-le¿¹cych do klasy lipaz i esteraz, uwidaczniaj¹c tym samym olbrzymi¹ ró¿norodnoœæbiokatalizatorów kodowanych przez metagenomowe DNA (65). Równie poszukiwa-ne i szeroko stosowane w procesach katalizy s¹ oksydoreduktazy wykorzystywaneg³ównie do syntezy zwi¹zków, których produkcja na drodze chemicznej jest bardzo



trudna i kosztowna, np. hydroksy- i aminokwasów oraz chiralnych alkoholi (66). Sol-bak (61) i Rhee (59) w swoich pracach dobrze pokazuj¹ mo¿liwoœci wyizolowaniaz próbek œrodowiskowych biokatalizatorów przydatnych w przemyœle. W pierwszejz nich autorzy donosz¹ o izolacji nowych genów pektynaz maj¹cych zastosowaniew przemyœle tekstylnym, natomiast w drugiej opisali identyfikacjê termofilnych li-paz i esteraz. Szczególnie istotny w tego typu badaniach jest dobór œrodowiskao okreœlonych w³aœciwoœciach selekcyjnych, w którym egzystuj¹ specyficzne popula-cje bakteryjne. Przyk³adem mo¿e byæ poszukiwanie genów koduj¹cych pektynazyw metagenomie wyizolowanym z gleby lasu tropikalnego bogatej w rozk³adaj¹c¹ siêmateriê organiczn¹ (61).

W zwi¹zku z coraz bardziej obni¿aj¹cymi siê kosztami sekwencjonowania i do-skonaleniem narzêdzi bioinformatycznych umo¿liwiaj¹cych sk³adanie i analizê se-kwencji metagenomowych, przysz³oœæ, jak siê wydaje, le¿y w masowym sekwencjo-nowaniu bibliotek o niewielkich insertach.

Literatura

1. Torsvik V., Øvreås L., (2002), Curr. Opin. Microbiol., 5, 240-245.2. Osoegawa K., Woon P. Y., Zhao B., Frengen E., Tateno M., Catanese J. J., de Jong P. J., (1998), Geno-

mics, 52, 1-8.3. Stein J. L., Marsh T. L., Wu K. Y., Shizuya H., DeLong E. F., (1996), J. Bacteriol., 178, 591-599.4. Steele H. L., Streit W. R., (2005), FEMS Microbiol. Lett., 247, 105-111.5. Hugenholtz P., Goebel B. M., Pace N. R., (1998), J. Bacteriol., 180, 4765-4774.6. Cowan D. A., (2000), Trends Biotechnol., 18, 14-16.7. Radajewski S., McDonald I. R., Murrell J. C., (2003), Curr. Opin. Biotechnol., 14, 296-302.8. Daniel R., (2002), Construction of environmental libraries for functional screening of enzyme activity, in:

Directed Molecular Evolution of Proteins, Eds. Brakmann S., Weinheim J. K., Wiley-VCH Verlag GmbH.,Weinheim.

9. Handelsman J., Rondon M. R., Brady S. F., Clardy J., Goodman R. M., (1998), Chem. Biol., 5,R245-249.

10. Beja O., Suzuki M. T., Koonin E. V., Aravind L., Hadd A., Nguyen L. P., Villacorta R., Amjadi M., Garri-gues C., Jovanovich S. B., Feldman R. A., DeLong E. F., (2000), Environ. Microbiol., 2, 516-529.

11. Abraham W. R., Nogales B., Golyshin P. N., Pieper D. H., Timmis K. N., (2002), Curr. Opin. Micro-biol., 5, 246-253.

12. Daniel R., (2004), Curr. Opin. Biotechnol., 15, 199-204.13. Kim U., Birren B. W., Slepak T., Mancino V., Boysen C., Kang H. L., Simon M. I., Shizuya H., (1996),

Genomics, 34, 213-218.14. Bertrand H., Poly F., van Tran V., Lombard N., Nalin R., Vogel T. M., Simonet P., (2005), J. Microbiol.

Methods, 62, 1-11.15. Hallin S., Lindgren P., (1999), Appl. Environ. Microbiol., 65, 1652-1657.16. Tsai Y.-L., Olson B. H., (1992), Appl. Environ. Microbiol., 58, 2292-2295.17. Rondon M. R., Goodman R. M., Handelsman J., (1999), Trends Biotechnol., 17, 403-409.18. Hanahan D., (1985), Techniques for transformation of Escherichia coli, in: DNA cloning, a practical

approach, Eds. Glover D. M., Homes B. D., Oxford.19. Berry A. E., Chiocchini C., Selby T., Sosio M., Wellington E. M. H., (2003), FEMS Microbiol. Lett.,

223, 15-20.20. Tsai Y.-L., Olson B. H., (1991), Appl. Environ. Microbiol., 57, 1070-1074.


BIOTECHNOLOGIA 4 (79) 125-139 2007 137

21. LaMontagne M. G., Michel Jr. F. C., Holden P. A., Reddy C. A., (2002), J. Microbiol. Methods, 49,255-264.

22. Robe R. P., (2002), United States Patent 6989249.23. Picard C., Ponsonnet C., Paget E., Nesme X., Simonet P., (1992), Appl. Environ. Microbiol., 58,

2717-2722.24. Holben W. E., Jansson J. K., Chelm B. K., Tiedje J. M., (1987), Appl. Environ. Microbiol., 54, 703-711.25. Bürgmann H., Pesaro M., Widmer F., Zeyer J., (2001), J. Microbiol. Methods, 45, 7-20.26. Maarit-Niemi R., Heiskanen I., Wallenius K., Lindstrom K., (2001), J. Microbiol. Methods, 45, 155-165.27. Turner P. C., McLennan A. G., Bates A. D., White M. R. H., (1999), Biologia molekularna, PWN, War-

szawa.28. Steffan R. J., Goksoyr J., Bej A. K., Atlas R. M., (1988), Appl. Environ. Microbiol., 54, 2908-2915.29. Ezaki T., Suzuki S., (1982), J. Clinical. Microbiol., 16, 844-846.30. Lindahl V., Bakken L. R., (1995), Microbiol. Ecol., 16, 135-142.31. Jacobsen C. S., Rasmussen O. F., (1992), Appl. Environ. Microbiol., 58, 2458-2462.32. Faegri A., Torsvik V. L., Goksoyr J., (1977), Soil Biol. Biochem., 9, 105-112.33. Bakken L. R., (1985), Appl. Environ. Microbiol., 49, 1482-1487.34. Mayr C., Winding A., Hendriksen N. B., (1999), J. Microbiol. Methods, 36, 29-33.35. Ogram A., Sayler G. S., Barkay T., (1987), J. Microbiol. Methods, 7, 57-66.36. Miller D. N., Bryant J. E., Madsen E. L., Ghiorse W. C., (1999), Appl. Environ. Microbiol., 65,

4715-4724.37. Shizuya H., Kouros-Mehr H., (2001), Keio J. Med., 50, 26-30.38. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., (1989), Molecular Cloning: a Laboratory Manual., 2nd ed., Cold

Spring Harbor Laboratory Press., New York.39. Gabor E. M., de Vries E. J., Janssen D. B., (2003), FEMS Microbiol. Ecol., 44, 153-163.40. Liles M. R., Manske B. F., Bintrim S. B., Handelsman J., Goodman R. M., (2003), Appl. Environ. Micro-

biol., 69, 2684-2691.41. Jaeger K. E., Eggert T., (2002), Curr. Opin. Biotechnol., 13, 390-397.42. Sosio M., Giusino F., Cappellano C., Bossi E., Puglia A. M., Donadio S., (2000), Nat. Biotechnol., 8,

43-345.43. Schloss P. D., Handelsman J., (2003), Curr. Opin. Biotechnol., 14, 303-310.44. Entcheva P., Liebl W., Johann A., Hartsch T., Streit W. R., (2001), Appl. Environ. Microbiol., 67,

89-99.45. Beja O., (2004), Curr. Opin. Biotechnol., 15, 187-190.46. Rondon M. R., August P. R., Bettermann A. D., Brady S. F., Grossman T. H., Liles M. R., Loiacono K.

A., Lynch B. A., MacNeil L. A., Minor C., Tiong C. L., Gilman M., Osburne M. S., Clardy J., Handels-man J., Goodman R. M., (2000), Appl. Environ. Microbiol., 66, 2541-2547.

47. Abed R. M., Safi N. M. D., Köster J., de Beer D., El-Nahhal Y., Rullkötter Y., Garcia-Pichel F., (2002),Appl. Environ. Microbiol. 68, 1674-1683.

48. Cole J. R., Chai B., Marsh T. L., Farris R. J., Wang Q., Kulam S. A., Chandra S., McGarrell D. M.,Schmidt T. M., Garrity G. M., Tiedje J. M., (2003), Nucleic Acids Res., 31, 442-443.

49. Cole J. R., Chai B., Farris R. J., Wang Q., Kulam S. A., McGarrell D. M., Garrity G. M., Tiedje J. M.,(2005), Nucleic Acids Res., 33, D294-D296.

50. Gabor E. M., (2004), Harvesting novel biocatalysts from the metagenome, PhD thesis, Groningen.51. Zhou J., Thompson D. K., (2002), Curr. Opin. Biotechnol., 13, 204-207.52. Venter J. C., Remington K., Heidelberg J. F., Halpern A. L., Rusch D., Eisen J. A., Wu D., Paulsen I.,

Nelson K. E., Nelson W., (2004), Science, 304, 66-74.53. Eyers L., George I., Schuler L., Stenuit B., (2004), Appl. Microbiol. Biotechnol., 66, 123-130.54. Curtis T. P., Sloan W. T., Scannell J. W., (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 10494-10499.55. Brady S. F., Chao C. J., Clardy J., (2002), J. Am. Chem. Soc., 124, 9968-9969.56. Strohl W. R., (2000), Drug Discov. Today, 5, 39-41.57. Gillespie D. E., Brady S. F., Bettermann A. D., Cianciotto N. P., Liles M. R., Rondon M. R., Clardy J.,

Goodman R. M., Handelsman J., (2002), Appl. Environ. Microbiol., 68, 4301-4306.



58. Henne A., Schmitz R. A., Bomeke M., Gottschalk G., Daniel R., (2000), Appl. Environ. Microbiol., 66,3113-3116.

59. Rhee J.-K., Ahn D.-G., Kim Y.-G., Oh1 J.-W., (2005), Appl. Environ. Microbiol., 71, 817-825.60. Yun J., Kang S., Park S., Yoon H., Kim M. J., Heu S., Ryu S., (2004), Appl. Environ. Microbiol., 70,

7229-7235.61. Solbak A. I., Richardson T. H., McCann R. T., Kline K. A., Bartnek F., Tomlinson G., Tan X., Par-

ra-Gessert L., Frey G. J., Podar M., Luginbuhl P., Gray K. A., Mathur E. J., Robertson D. E., Burk M. J.,Hazlewood G. P., Short J. M., Kerovuo J., (2005), J. Biol. Chem., 280, 9431-9438.

62. Santosa D. A., (2001), Mol. Biotechnol., 17, 59-64.63. Henne A., Daniel R., Schmitz R. A., Gottschalk G., (1999), Appl. Environ. Microbiol., 65, 3901-3907.64. Erwin D. P., Erickson I. K., Delwiche M. E., Colwell F. S., Strap J. L., Crawford R. L., (2005), Appl.

Environ. Microbiol., 71, 2016-2025.65. Miller C. A., (2000), Biotechnol. Reports, 11, 489-495.66. Davis B. G., Boyer V., (2001), Nat. Prod. Rep., 18, 618-640.


BIOTECHNOLOGIA 4 (79) 125-139 2007 139

Biblioteki metagenomowe jako zród³o genów przydatnych w ... · Biblioteki metagenomowe jako zród³o genów przydatnych w biotechnologii Edyta Deja-Sikora, Marcin Sikora, Marcin

Documents