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This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag
Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck
Society for the Advancement of Science under a Creative Commons
Attribution4.0 International License.
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für
Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur
Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender
Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0
Lizenz.
über die Biosynthese des Cumarins II V o n F R I E D R I C H W E
Y G A N D , H E L M U T S I M O N , H E I N Z - G Ü N T E R F L O S
S u n d U T E M O T H E S
Aus dem Organisch-chemischen Institut der Technischen Hochschule
München ( Z . N a t u r f o r s c h g . 15 b , 7 6 5 — 7 6 8 [ 1 9
6 0 ] ; e i n g e g a n g e n am 20. O k t o b e r 1960)
Herrn Professor K U H T M O T H E S in Verehrung zum 60.
Geburtstage gewidmet
Durch Versuche mit Wurzelkulturen von Melilotus off. wurde
festgestellt, daß Umbelliferon-[2-14C] nicht in Cumarin übergeht.
Damit wird ein von HAWORTH vorgeschlagener Mechanismus der biogenen
Lactonringbildung äußerst unwahrscheinlich.
Im Zusammenhang mit den Arbeiten über die Bildung der
Phenylpropan-Derivate in der Natur ist in jüngster Zeit über eine
Reihe von Untersu-chungen berichtet worden, die sich mit der
Biogenese von Cumarinen befassen.
W E Y G A N D und W E N D T 1 fanden in Wurzelkulturen von
Melilotus off. Einbau von L-Phenylalanin-[uni-form- 1 4 C] in
Cumarin und konnten durch Abbau zeigen, daß dabei das
Kohlenstoffgerüst intakt bleibt. Glucose - [1 - 1 4 C] wurde
ebenfalls verwertet und lieferte ein Cumarin, das eine ähnliche
Radio-aktivitäts-Verteilung besaß, wie sie D A V I S 2 in der aus
E. coli nach Verabfolgung von Glucose - [1 - 1 4 C] isolierten
Shikimisäure fand. Hierdurch wurde erst-mals der Beweis geliefert,
daß auch in Pflanzen das von D A V I S aufgestellte und an
Mikroorganismen er-mittelte Entstehungsschema für aromatische
Verbin-dungen aus Zuckern gilt. K O S U G E und C O N N 3 zeig-ten,
daß in Melilotus alb. die Verwertung von Glu-cose, Phenylalanin und
Zimtsäure für die Cumarin-biosynthese in der angegebenen
Reihenfolge zu-nimmt. Bei Hierochloe odorata fanden B R O W N und
Mitarb. 4 den Einbau von L-Phenylalanin, Zimtsäure und o-Cumarsäure
sowie o-Cumarsäure-glucosid in Cumarin. Für Acetat wurde von allen
Autoren über-einstimmend ein vernachlässigbar geringer Einbau in
Cumarin gefunden.
Versuche über die Biogenese substituierter Cuma-rine bestätigen
diese Ergebnisse. R E Z N I K und U R B A N 5
fanden, daß Ferulasäure in Scopoletin von Weizen-, Mais- und
Sonnenblumenblättern eingebaut wird
1 F . W E Y G A N D U . H . W E N D T , Z . N a t u r f o r s c
h g . 1 4 b , 4 2 1 [1959],
2 B. D. DAVIS, Advances in Enzymology 16, 247 [1955]; Arch.
Biochem. Biophysics 78, 497 [1958]; vgl. audi A. C. NEISH, Ann.
Rev. Plant Physiol. 11, 55 [I960],
3 T . KOSUGE U . E . E . C O N N , J . b i o l . C h e m i s t r
y 2 3 4 , 2 1 3 3 [1959].
und R E I D 6 beobachtete, daß von Nicotiana tabacum
L-Phenylalanin besser zur Scopoletin-Synthese ver-wertet wird als C
0 2 , Essigsäure oder Phenylessig-säure. Schließlich berichteten K
E N N E R und Mitarb. 7
kürzlich darüber, daß das Kohlenstoffgerüst des L-Tyrosins
unverändert in den Cumarinring des Novobiocins übergeht.
Nach all diesen Befunden steht fest, daß das Ring-system des
Cumarins aus Glucose über Shikimi-säure, Phenylalanin und Zimtsäure
gebildet wird. Ungeklärt ist dagegen bisher, wie der Lactonring
entsteht. Nach H A W O R T H 8 könnte er nach einer primär
erfolgenden p-Hydroxylierung über eine chinoide Zwischenstufe
entstehen, wobei im Falle des Cumarins selbst die Hydroxylgruppe
aus der p-Stellung entfernt werden muß. Diese Hypothese sollte das
häufige Vorkommen von 7-Hydroxy-cuma-rinen erklären. Eine zweite
Möglichkeit ist eine pri-märe Hydroxylierung in o-Stellung zur
Seitenkette und ein normaler Lactonringschluß unter
Wasser-abspaltung 1 . Dieser W e g steht im Einklang mit dem Einbau
von o-Cumarsäure und seinem Glucosid, ob-wohl hier zu bedenken ist,
daß o-Cumarsäure auch spontan in Cumarin übergehen kann. K E N N E
R und Mitarb. 7 ziehen noch eine dritte Möglichkeit in Be-tracht,
nämlich die direkte Cyclisierung durch intra-molekularen Angriff
eines Carboxylradikals oder eines potentiellen Carboxylkations.
In der vorliegenden Untersuchung haben wir durch Verwendung von
1 4C-markiertem Umbelli-feron zu klären versucht, ob dem
Lactonringschluß
4 S . A . B R O W N , G . H . N . T O W E R S U . D . W R I G H
T , C a n a d . J . B i o -chem. Physiol. 38, 143 [I960].
5 H . REZNIK U. R . URBAN, Naturwissenschaften 4 4 , 1 3 [ 1 9 5
7 ] . 6 W . W . REID, Chem. and Ind. 1 9 5 8 , 1439. 7 K .
CHAMBERS, G . W . K E N N E R , E . J . T . ROBINSON U . R . B
.
WEBSTER, Proc. chem. Soc. [London] 1960, 291. 8 R . D. HAWORTH,
J. chem. Soc. [London] 1942 , 448.
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eine para-Hydroxylierung vorangeht. W ä r e dies der Fall, so
müßte Umbelliferon unmittelbarer Vorläu-fer des Cumarins sein.
Sterile Wurzelkulturen von Melilotus off. wurden mit Umbel l i
feron- [2 - 1 4 C] ( 0 , 3 9 m C / m M o l , 4 5 m g / /
Nährlösung) inkubiert. Die Wurzeln wurden nach 4, 8 und 1 4 Tagen
geerntet, worauf das Cumarin nach Zusatz einer definierten Menge
nichtradioaktiven Cumarins isoliert und seine spez. Aktivität
bestimmt wurde. Der Zusatz von Trägersubstanz erwies sich als
notwendig, da sich sonst das Cumarin aus der geringen Menge
Wurzelmaterial nicht in reinem Zu-stand isolieren ließ.
In der Lit. 4 wird der Cumaringehalt von Meli-lotus off. zu ca.
2 % des Trockengewichtes angegeben. Durch Chromatographie 9 von
Wurzelextrakten und Vergleich der Fleckengröße wurde die gleiche
Grö-ßenordnung für den Cumaringehalt der Wurzeln gefunden. Damit
läßt sich aus der zugesetzten Cu-marinmenge, der spez. Aktivität
und dem Trocken-gewicht der verarbeiteten Wurzeln die spez.
Aktivi-tät des pflanzeneigenen Cumarins abschätzen (vgl. die T a b
. ) .
Das angebotene Umbelliferon wurde von den Wur-zeln in starkem M
a ß e aufgenommen. Die Aktivität der Nährlösung war nach 1 4 Tagen
auf ca. */3 der Ausgangsaktivität zurückgegangen. Aus den Wurzeln
konnte Umbelliferon isoliert werden, das dieselbe spez. Aktivität
hatte wie eingesetztes Umbelliferon. Ein wässeriger Extrakt aus den
Wurzeln wurde nach Entfernung des frei vorliegenden Umbelliferons
mit-tels Äther mit Emulsin behandelt. Danach ließ sich erneut
Umbelliferon nachweisen. Dies zeigt, daß Umbelliferon in den
Wurzeln teilweise in ein Gly-kosid verwandelt worden ist.
Die spez. Einbaurate des Umbelliferons ergibt sich zu 0 , 0 2 -
0 , 0 6 % (vgl. die T a b . ) . W ä r e Umbelli-feron ein direkter
Vorläufer des Cumarins, so hätte das isolierte Cumarin um zwei
Größenordnungen aktiver sein müssen und ferner hätte, da Umbelli-f
e r o n - [ 2 - 1 4 C ] im Überschuß angeboten wurde, die Aktivität
mit steigender Versuchsdauer zunehmen
9 Dünnschichtchromatographie mit Benzol als mobiler Phase nach
Dr. G. BILLEK, Org.-chem. Inst. d. Universität Wien;
Privatmitteilung.
10 Privatmitteilung von S. A. BROWN, Prairie Regional
Labo-ratory, Saskatoon, Saskatchewan, Canada. Vgl. Z.
Natur-forschg. 15b, 768 [I960].
* Die Radioaktivitäts-Messungen wurden, falls nichts ande-res
angegeben ist, durch Oxydation der Substanzen mit Kaliumperchlorat
zu Kohlendioxyd und Messung der
müssen. Dies ist jedoch nicht der Fall. Schließlich hat das
zugesetzte Umbelliferon in den Wurzeln keine Verdünnung erfahren,
was der Fall sein sollte, wenn es ein Zwischenprodukt bei der
Biosynthese des Cumarins wäre.
Es ergibt sich daher, daß der Lactonring des Cumarins nicht nach
der Vorstellung von H A W O R T H gebildet wird.
In Übereinstimmung mit diesen Resultaten stehen Versuche von B R
O W N 1 0 , bei denen p-Cumarsäure mit Zimtsäure und Tyrosin mit
Phenylalanin als Vorläufer für Cumarin bei Hierochloe verglichen
wurden. In beiden Fällen wurde die p-Hydroxy-verbindung viel
schlechter verwertet.
Es bleibt somit zu klären, ob der Ringschluß über eine
o-Hydroxylierung oder durch direkten Angriff des Carboxyls auf den
aromatischen Ring erfolgt.
Beschreibung der Versuche *
U m b e l l i f e r o n - [2-1 4C]
Die Darstellung erfolgte analog bekannten Verfah-ren 11 ~ 1 3 .
200 mg Malonsäure- [1.3-1 4C] (ca. 0,8 mC/ mMol) und 266 mg
2.4-Dihydroxy-benzaldehyd wurden in einem Reagenzglas mit Schliff
in 0,6 ml trocknem Pyridin gelöst. Nach Zusatz von 0,1 ml Anilin
wurde das Glas verschlossen 86 Stdn. im Trockenschrank auf 4 0 °
erwärmt. Nach dem Ansäuern mit verd. Salzsäure wurde die
Umbelliferon-3-carbonsäure abzentrifugiert, einmal mit Wasser
gewaschen und im Hochvakuum ge-trocknet. Durch 1-stdg. Erhitzen auf
2 6 0 ° wurde sie decarboxyliert, wobei das freiwerdende 1 4 C 0 2
mit Stickstoff in Natronlauge überführt und als Barium-carbonat
gefällt wurde (304 mg, 80% d. Th.) . Das De-carboxylierungs-Produkt
wurde 4-mal mit je 8 ml Me-thanol ausgekocht, und die nach
Zentrifugieren erhal-tenen Lösungen wurden eingeengt und in einem
Sub-limationsrohr durch Aufblasen von Stickstoff zur Trockne
gebracht. Das Umbelliferon wurde sodann unter 14 Torr bei 1 8 0 - 2
0 0 ° sublimiert. Ausb. 80,6 mg, 0,39 mC/ mMol, Schmp. 225 — 2 2 7
° . Durch mehrtägige Sublima-tion des Rückstandes bei etwas höherer
Temperatur konnten noch 27,0 mg weniger reines Umbelliferon und
schließlich nach Zugabe von inaktivem Träger noch wei-tere 8,7 mg
in verdünnter Form isoliert werden. Gesamt-ausbeute, bezogen auf
Malonsäure, 35,6%, radioaktive
Aktivität in Gaszählrohren im Proportionalbereich aus-geführt ;
Zählausb. 67 ,5 Prozent. H. SIMON, H . DANIEL U. J. F. KLEBE,
Angew. Chem. 71, 303 [1959].
11 F. VORSATZ, J. prakt. Chem. [2] 145, 265 [1936]. 1 2 K . C.
PANDYA U. T . S. SODHI, Proc. Ind. Acad. Sei. 7 A , 3 8 1
[1938]; C. A.32, 7435 [1938]. 1 3 H . v. PECHMANN U. E. GRAEBER,
Ber. dtsch. chem. Ges. 3 4 ,
378 [1901].
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Tab.l. Einbau von Umbelliferon-[2-14C] (5,8• 108 ipm/mMol, 45
mg/Z Nährlösung) in Cumarin in Wurzelkulturen von Melilotus off. *
Unter der Annahme von 2% Cumarin in den
Wurzeln.
Verunreinigungen unter 1% (nach papierchromatogra-phischer
Reinheitsprüfung).
K u l t u r d e r W u r z e l n Es wurden Wurzelkulturen von
Melilotus off. (MEL
9/57, Sortiment Gatersleben) verwendet. Die Kultur er-folgte in
der bereits beschriebenen Weise wobei die folgende Nährlösung nach
B O N N E R 14 verwendet wurde (in g pro l aqua bidest.).
Versuchsdauer (Tage) 4 . 8 14
Frischgewicht der Wurzeln (mg)
1394 1525 1669
Trockengewicht in % des Frischgewichtes 10 13,3 14,4 Auf Cumarin
auf-gearbeitete Wurzel-menge (mg Frischgewicht) 693 829 762
Zugesetztes nicht-radioaktives Cumarin (mg) 20,0 20,1 22,6
Spez. Aktivität des isolierten Cumarins (ipm/mMol) 2320 2558
1220 Spez. Aktivität des pflanzeneigenen Cumarins (ipm/mMol)* 3,4 •
105 2,4 • 105 1,3-105
Spez. Einbaurate in %
0,06 0,04 0,02
Spez. Aktivität des wiederisolierten Umbelliferons
(ipm/mMol)
5,78 • 108 5,64 • 108 5,92 • 108
Ca(N03 )2 -4H20 0,240 MgS04 • 7 H20 0,040 KNOs 0,085 KCl 0,060
KH2P04 0,020
Fe-III-citrat 0,0015 Vitamin Bx • HCl 0,0002 Vitamin B6 -HCl
0,0002 Nicotinsäureamid 0,0003 Saccharose 20,0
Je 16 Wurzeln wurden im Alter von 7 Tagen unter sterilen
Bedingungen in einen F e r n b a c h - Kolben mit 4,5 mg
Umbelliferon-[2-14C] (0,39 mC/mMol, ent-sprechend 5,8 • 108
ipm/mMol) in 100 cm3 Nährlösung gebracht. Insgesamt wurden 12
Kolben angesetzt. Je 4 Kolben wurden am 4., 8. und 14. Tag
geerntet. Die Wurzeln wurden abfiltriert, gewogen und aufgeteilt.
Etwa die Hälfte wurde für die Isolierung des Cumarins verwendet,
ein Viertel wurde bei 55° getrocknet und nach Bestimmung des
Trockengewichts auf Umbelliferon
14 J. SEELIGER, Flora [Jena] 144,47 [1956/57].
aufgearbeitet, der Rest wurde zum Nachweis des
Um-belliferon-glykosids verwendet.
I s o l i e r u n g d e s C u m a r i n s Die frischen Wurzeln
wurden mit Sand zerrieben
und mit 30 ml Wasser in einen Kolben gebracht. Nach Zusatz von
nichtradioaktivem Cumarin (Mengen s. Ta-belle) wurde bei 45 — 50
Torr wasserdampfdestilliert. Die ca. 400 ml Destillat wurden 6-mal
mit Äther aus-geschüttelt, worauf die ätherische Lösung einmal mit
einer Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen und mit
Natriumsulfat getrocknet wurde. Nach dem Ab-dampfen des Äthers
wurde der Rückstand im Vakuum sublimiert und sodann nochmals in
einem liegenden Rohr mit Temperaturgefälle sublimiert. Es wurden
zwi-schen 8,7 und 15,5 mg Cumarin isoliert, dessen Radio-aktivität
bestimmt wurde (s. Tabelle).
I s o l i e r u n g von U m b e l l i f e r o n a u s d e n W u
r z e l n
Die getrockneten Wurzeln wurden in einem S o x -1 e t h -
Apparat mit trocknem Aceton extrahiert. Der Extrakt wurde auf 2 ml
eingeengt. Durch Dünnschicht-chromatographie mit Benzol als
Laufmittel9 würde zu-erst Cumarin abgetrennt (Rf 0,25). Das
Umbelliferon blieb am Start liegen, wurde mit Aceton eluiert und
erneut auf eine Dünnschichtplatte aufgetragen. Nach Entwicklung mit
Chloroform-Äther (9 : 1 vol.) wurde der Umbelliferonfleck (Rf 0,3)
eluiert und auf Papier (Schleicher & Schüll Nr. 2043 bm,
gewaschen mit Was-ser und Isopropanol) mit Wasser
rechromatographiert. Das Umbelliferon wurde sodann mit Isopropanol
in einem 5-ml-Meßkolben eluiert und seine Konzentration bei 327 m/u
an Hand einer Eichkurve und in 1 ml davon die Radioaktivität
bestimmt. Aus beiden Werten ergab sich die spez. Aktivität (s.
Tabelle).
P r ü f u n g d e r V o l l s t ä n d i g k e i t d e r T r e n
-n u n g v o n C u m a r i n u n d U m b e l l i f e r o n Um
festzustellen, inwieweit das isolierte Cumarin
mit Spuren des hochradioaktiven Umbelliferons bei der oben
angegebenen Isolierung verunreinigt sein kann, wurde folgender
Blindversuch ausgeführt.
In nichtradioaktiver Nährlösung gewachsene Wur-zeln wurden in
gleicher Weise wie bei den aktiven Ver-suchen auf Cumarin
aufgearbeitet, jedoch wurden vor der Wasserdampfdestillation zur
Lösung 0,2 mg Um-belliferon-[2-14C] (5,8-IO8 ipm/mMol) gegeben. Das
isolierte Cumarin hatte nur eine Aktivität von 89 ipm/ mMol.
N a c h w e i s e i n e s Um b e l l i f e r o n - g l y k o s i
d s 1,19 g frische Wurzeln (aus allen drei Versuchen)
wurden im S o x l e t h - Apparat im Wasserstrahlpum-pen-Vakuum
mit Wasser extrahiert. Der wässerige Ex-trakt wurde 3-mal
ausgeäthert (Ätherlösung a), erneut ausgeäthert (Ätherlösung b) und
sodann nach Ver-kochen des gelösten Äthers mit 0,2 mg Emulsin
versetzt. Nach Stehen über Nacht wurde erneut ausgeäthert
(Ätherlösung c). Das Volumen der Ätherlösungen
-
wurde gemessen, dann wurde je 1 ml auf einem Proben-sehälchen
eingedampft und die Radioaktivität des Rück-standes mit einem
dünnwandigen Fensterzählrohr (Zähl-ausbeute ca. 1%) bestimmt. Die
Aktivität betrug für die gesamte Ätherlösung a 1,88-IO5 ipm, für
Lösung b 2,5-IO3 ipm und für Lösung c 8,56-IO4 ipm. In Lö-sung c
war sie also ca. 34-mal höher als in Lösung b. — Die Lösungen a und
c wurden eingedampft, aus den Rückständen wurde Umbelliferon
isoliert, und die Radioaktivität wurde nach Verbrennung zu C02
im
Gaszählrohr bestimmt. Sie betrug 5,54-108 bzw. 5,95 • 108
ipm/Mol. Bei der Chromatographie konnte außer Umbelliferon keine
weitere radioaktive Verbin-dung entdeckt werden.
Wir danken der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s -g e m e i
n s c h a f t bestens für eine Sachspende und ebenso dem B u n d e
s m i n i s t e r i u m f ü r A t o m -k e r n e n e r g i e u n d
W a s s e r w i r t s c h a f t für Bereitstellung von Mitteln.
Uber die Lactonringbildung des Cumarins * V o n S T E W A R T A
. B R O W N
Aus dem Prairie Regional Laboratory, National Research Council,
Saskatoon, Saskatchewan, Kanada (Z. Naturforschg. 15 b , 768—769
[1960] ; e ingegangen am 7. November 1960)
Tracer experiments with 14C have shown that p-coumaric acid is
over 70 times less efficient than cinnamic acid as a precursor of
coumarin in Hierochloe odorata, and that tyrosine is over 60 times
less efficient than phenylalanine. The results show that in this
species the reaction sequence postu-lated by HAWORTH, in which
coumarins are formed from p-coumaric acid, is not significantly
involved in the biosynthesis of coumarin itself. It is suggested
that, in higher plants, cinnamic acid (or an "activated" form of
it) is a common precursor of all coumarins, and that ortho- or
para-hydroxylation of this compound leads subsequently to the
formation of coumarin and the 7-hydroxycoumarins, respectively.
Different enzyme systems may be required for the formation of the
lactone ring of coumarin and the 7-hydroxycoumarins.
Die Biogenese des Cumarins in höheren Pflanzen wurde kürzlich in
mehreren Laboratorien unter-sucht 1 _ 3 . Die Befunde haben die
Theorie unter-stützt, daß Cumarin aus o-Cumarinsäure und ihrem
Glucosid, welche die Pflanze aus einfachen Kohlen-hydraten über
Shikimisäure und Phenylalanin bil-det, entsteht.
Der Mechanismus der Bildung des Lactonringes ist jedoch noch
Gegenstand von Spekulationen. Vor fast 20 Jahren schlug H A W O R T
H 4 einen Mechanismus vor, der die Tatsache in Betracht zieht, daß
alle Cumarine außer Cumarin selbst in der 7-Stellung, d. h.
para-ständig zur Seitenkette hydroxyliert sind. Nach diesem Schema
betrachtet man p-Hydroxy-zimtsäure (p-Cumarsäure) als Vorläufer,
und der Sauerstoff des Lactonringes soll von der Carboxyl-gruppe
stammen. Die allgemeine Anwendung die-ser Theorie würde die
nachträgliche Entfernung der 7-ständigen Hydroxylgruppe nach der
Cyclisierung nur in dem einzigen außergewöhnlichen Fall des
Cumarins erfordern.
* N.R.C. Nr. 6083. 1 S . A . BROWN , G . H . N . TOWERS U. D .
WRIGHT , C a n . J. B i o -
chem. Physiol. 38, 143 [I960]. 2 T . KOSUGE U. E. E . CONN, J.
biol. Chemistry 234, 2133
[1959]. 3 F . WEYGAND U. H. WENDT, Z . Naturforschg. 14 b,
421
ri959].
Die Leichtigkeit, mit der sich o-Cumarsäure und ihr Glucosid in
Cumarin in Hierochloe odorata um-wandeln, beweist, daß, zumindest
in dieser Species, der Lactonring durch eine klassische Reaktion,
näm-lich über cts-o-Hydroxyzimtsäure gebildet werden kann. Da
jedoch neben Cumarin auch p-Cumarsäure vorkommt1 und da ferner
diese Säure noch nicht als Cumarinvorläufer getestet wurde, bleibt
die mög-liche Bedeutung des alternativen Weges unbestimmt. Wegen
des erneuten Interesses an den Vorstellun-gen von H A W O R T H 3 '
5 ' 6 soll über das Ergebnis eines Versuches berichtet werden, bei
dem p-Cumarsäure und Tyrosin mit ihren nichthydroxylierten
Analo-gen, der Zimtsäure und dem Phenylalanin, als Vor-läufer des
Cumarins und des o-Cumaryl-glucosids in H. odorata verglichen
wurden.
Methodik
Die Synthese der markierten Verbindungen, ihr Ein-bringen in die
Pflanzen, die Isolierung und die 14C-Ana-lyse des Cumarins wurden
bereits beschrieben 7. Die
4 R. D. HAWORTH, J. chem. Soc. [London] 1942, 448. 5 K .
CHAMBERS, G . W . KENNER, M . J . TAMPLE ROBINSON U. B .
R. WEBSTER, Proc. chem. Soc. [London] 1960, 291. 6 T . GEISSMAN,
in: W . RUHLAND, Handbuch der Pflanzen-
physiologie, Bd. 1 0 , S. 5 4 3 [ 1 9 5 8 ] . 7 S. A. BROWN U.
A. C. NEISH , Can. J. Biochem. Physiol. 34,
7 6 9 [ 1 9 5 6 ] .