EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FIJADORA DE NITRÓGENO DE CEPAS NATIVAS DE Bacillus sp. PROCEDENTES DEL CEPARIO DE LA UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA BARRERA PARADA ANA PAOLA DIAZ MORALES ADRIANA PATRICIA UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA 1
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EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FIJADORA DE NITRÓGENO DE
CEPAS NATIVAS DE Bacillus sp. PROCEDENTES DEL CEPARIO DE LA
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
BARRERA PARADA ANA PAOLA
DIAZ MORALES ADRIANA PATRICIA
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA
TRABAJO DE GRADO
BOGOTA D.C. NOVIEMBRE 2013
1
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FIJADORA DE NITRÓGENO DE
CEPAS NATIVAS DE Bacillus sp. PROCEDENTES DEL CEPARIO DE LA
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
BARRERA PARADA ANA PAOLA
DIAZ MORALES ADRIANA PATRICIA
Asesor temático:
Ligia Consuelo Sánchez Leal
Bacterióloga y Laboratorista Clínico
Ms. Biología Aplicada con énfasis en fitoprotección
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA
TRABAJO DE GRADO
BOGOTA D.C. NOVIEMBRE 2013
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EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FIJADORA DE NITRÓGENO DE
CEPAS NATIVAS DE Bacillus sp. PROCEDENTES DEL CEPARIO DE LA
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
APROBADA ______________
JURADOS _________________
_________________
_________________
ASESOR ______________
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA
TRABAJO DE GRADO
BOGOTA D.C NOVIEMBRE 2013
3
CONTENIDO
INDICE DE FIGURAS......................................................................................8
INDICE DE TABLAS.......................................................................................9
orgánico terrestre; H: o. acuático CO(NH2)2; I: en materia orgánica muerta (NH4+); J: en biomasa (NO3
-)
(NH4+); K: en plantas (NO3
-) (NH4+); L: en microbios (NO3
-) (NH4+); M: en animales (NO3
-) (NH4+).
Modificado de: Rosswall, T. (1979). (28)
Se calcula que en el planeta tierra hay más de 60.000 billones de toneladas
de nitrógeno (N), de los cuales aproximadamente el 94% está ubicado en la
corteza terrestre. Del 6.0% restante, se estima que el 99,86% se halla en la
atmósfera como nitrógeno molecular (N2), y que el 0,04% se encuentra en los
seres vivos, suelos y aguas, en forma de compuestos orgánicos e
inorgánicos (fig.1) (29).
19
El nitrógeno que se encuentra en forma molecular en la atmósfera (N2) solo
es útil para algunos microorganismos, ya que los animales, plantas y la
mayoría de los microorganismos usan el nitrógeno solo si están formando
compuestos. La mayoría de los microorganismos y las plantas son
dependientes de este elemento en forma inorgánica, como lo son nitratos
(NO3-), amonio (NH4
+), y otras moléculas sencillas; por el contrario, los
animales necesitan del nitrógeno orgánico, que es obtenido de forma directa
o indirecta de las plantas (29).
3.1.1. CICLO BIOGEOQUIMICO DEL NITROGENO
El ciclo biogeoquímico del nitrógeno consiste en los cambios cíclicos que
sufre este elemento, para que pueda ser utilizado y recuperado, esto ocurre
cuando un átomo de nitrógeno cambia del estado orgánico en el que se
encuentra a estado inorgánico o viceversa (29). Pero este ciclo solo simboliza
una parte del ciclo total de este elemento en la naturaleza.
La concentración de Nitrógeno en el suelo está regulada por varios factores,
la temperatura, humedad, plantas, microorganismos y el hombre. Un estudio
realizado en Canadá y Estados Unidos reveló que la temperatura es inversa
al contenido de nitrógeno y materia orgánica en el suelo, es decir, al
incrementar el grado de temperatura disminuye la cantidad de nitrógeno
presente en el suelo; de otra forma, al incrementar la pluviosidad aumenta la
vegetación y así mismo la concentración de nitrógeno. Con relación al tipo de
suelo, este influye en la cantidad de nitrógeno, en los suelos arcillosos este
elemento se encuentra en mayor cantidad que los suelos arenosos y limosos
(30).
El ciclo del nitrógeno está compuesto por 5 procesos los cuales se definen
como mineralización, nitrificación, desnitrificación, inmovilización o
20
asimilación, y fijación del nitrógeno en el cual se basará este proyecto de
investigación en particular.
El nitrógeno molecular (N2) está presente en la atmósfera en un 80% y es
considerada una molécula casi inerte debido al triple enlace que presenta
entre sus dos átomos de nitrógeno, debido a esto no puede ser asimilada por
las plantas directamente y necesita ser fijada previamente (31). Solo cuando
los microorganismos que la fijan se lisan, es que estos compuestos
orgánicos nitrogenados son liberados transformados en amonio o nitrato que
puede ser captado por la planta (32).
Figura 2. Ciclo redox del nitrógeno. NUTRIENTES Y GASES: NITROGENO – UPRM (33)
21
MINERALIZACIÓN O AMONIFICACIÓN
Es uno de los procesos más complejos de todo el ciclo. Este proceso
consiste en despolimerizar mediante las enzimas proteolíticas de peptonas y
polipéptidos las macromoléculas de las proteínas, ácidos nucleícos, en
aminoácidos y nucleótidos. Entre los aminoácidos alifáticos se encuentran:
valina, arginina, ácido aspártico, leucina, alanina, lisina y glicina. En esta fase
interactúan algunas bacterias, entre estas, Bacillus subtilis, B. cereus, B.
mesentericus, B. megaterium, Pseudomonas sp., Clostridium putrificum, C.
sporogenis y C. tetani y algunos hongos como Cephalotecium roseum,
Trichoderma koningii, Aspergillius sp. y Penicillium sp. Dichos aminoácidos
pueden ser metabolizados por algunos microorganismos, formar complejos
organominerales, ser usados por plantas y ser mineralizados hasta llegar a
amonio, en esta fase interactúan bacterias como Bacillus sp, Clostridium sp,
Pseudomonas sp, Escherichia sp y Streptococcus sp. (34).
NITRIFICACIÓN
La nitrificación se lleva a cabo por bacterias aerobias autótrofas y se realiza
en dos etapas, la primera es mediante la oxidación a nitrito NO3- y la segunda
mediante la oxidación a nitrato NO2-. Después de que el amoniaco pasa a
forma amoniacal las bacterias nitrificantes como Nitrosomonas o
Nitrocomonas son las encargas de oxidar al amoniaco. Posteriormente, se
oxida el nitrito a nitrato, todo esto en presencia de oxígeno, esta oxidación la
realizan Nitrobacter o Nitroccus, entre otros (30).
22
DENITRIFICACIÓN
Esta fase ocurre en ambiente anóxico y se divide en denitrificación biológica
y no biológica
BIOLOGICA
Esta etapa la realizan microorganismos heterotróficos, según la literatura hay
23 géneros de bacterias encargadas de esta fase, entre ellas se pueden
mencionar Pseudomonas sp, Bacillus sp, algunos microorganismos
autótrofos como Micrococcus denitrificans y Thiobacillus denitrificans.
Figura 3. Pasos intermedios en las reacciones de denitrificación. Química de suelos con énfasis en Suelos de América Latina. Fassbender H, Bornemisza E. (30)
En esta etapa se presenta la interacción de dos enzimas, en la primera parte
de la reacción actúa la Nitroreductasa, que es una flavoproteína con un peso
molecular en el rango de 20 kDa a 60 kDa, que requiere NADH ó NAD, la
cual reduce los grupos nitrato de los compuestos nitroaromáticos, para
obtener nitrógeno utilizado en el crecimiento celular y la hiponitroreductasa.
La velocidad de denitrificación depende de las condiciones del suelo, esta
ocurre cuando la concentración de oxígeno es limitante y la humedad es alta;
otras condiciones como el pH, entre de 8.0 y 8.6, además de la temperatura
y la concentración de nitratos influyen en la denitrificación biológica (36).
23
NO BIOLOGICA
También conocida como volatización del amonio, es el resultado de
reacciones químicas entre los componentes nitrogenados inorgánicos del
suelo y los usados como fertilizantes. El aprovechamiento del amonio es casi
nula, esto indica una pérdida considerable de Nitrógeno en el uso de
fertilizantes (36).
INMOVILIZACIÓN O ASIMILACIÓN
Varias bacterias y hongos asimilan el nitrógeno inorgánico en forma de NO3,
mediante la reductasa asimilatoria se reduce a NO2, posteriormente gracias a
la acción de la misma enzima se reduce a NH4, este se asimila por la acción
de las enzimas glutamina sintetasa (GS) y glutamato sintasa (GOGAT),
conocida como ruta GS/GOGAT (37, 38). La inmovilización y la
mineralización suceden de modo simultáneo ya que el nitrógeno orgánico
y el amonio (NH4) cambian constantemente. Este proceso es de gran
importancia puesto que la presencia de una forma inadecuada de nitrógeno
en el suelo podría perjudicar el crecimiento de la flora.
Figura 4. Asimilación de amonio. GS (glutamina sintetasa), GOGAT (glutamato sintasa), CN (compuestos nitrogenados), C (fuentes de carbono), N (fuentes de nitrógeno), (38).
FIJACIÓN SIMBIOTICA
24
Las plantas asimilan el nitrógeno principalmente de dos formas, la nítrica y la
amoniacal, sin embargo no son suficientes para cubrir las necesidades de la
vegetación de la corteza terrestre. Existe una forma alternativa de fijar
nitrógeno, la cual se da principalmente en la rizósfera, aunque también se
puede dar en la tallosfera y/o filosfera. Esta función se hace mediante
microorganismos simbióticos como Rhizobium leguminosarum, que se
desarrollan con leguminosas como Phaselous, Glycine, Leucaena,
Stylosanthes, Trifolium, Melilothus, Medicago, Pisum, Crotalaria, entre otras.
Las bacterias se ubican en el parénquima radical, allí se produce su división
celular acelerada produciendo así los nódulos radiculares en las plantas.
Inicialmente usan el nitrógeno fijado para su metabolismo y posteriormente,
al aumentar la producción empiezan a ceder nitrógeno a la planta. Aun no es
totalmente clara la forma de fijación del nitrógeno pero se sabe que primero
las bacterias oxidan el nitrógeno y producen un producto intermedio, la
hidroxilamina, esta se reduce a NH3 en presencia de una enzima ferrosa. En
esta forma de fijación también influyen factores como el pH, el cual es optimo
entre 5.0 y 6.0, temperatura, humedad, aireación, nutrientes del suelo (30).
FIJACION ASIMBIOTICA
Los microorganismos que fijan nitrógeno de esta forma requieren de varios
factores que se encuentran en el suelo para desarrollar esta actividad como
la celulosa o almidón, carbohidratos. Estos microorganismos se pueden
clasificar de la siguiente forma:
Tabla 1. Microorganismos fijadores de nitrógeno de forma asimbiótica
25
FUENTE: Formas del nitrógeno en el suelo. Fassbender H, Bornemisza E. (30)
Algas azules-verdesAnabaena, Anabaenopsis, Aulosira, Colotrix, Cylindrospermuns, Nostoc,
Tolypothrix
Bacterias fotosintéticasChlorobium, Chromatium,
Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum
El contenido de Nitrógeno en los primeros decímetros del suelo se debe a la
actividad biológica, debido al proceso de la humificación, ya que se producen
componentes nitrogenados que son unidos al suelo por la acción de
microorganismos, así mismo los restos vegetales tales como raíces,
hojarascas, etc. se humifican uniendo el nitrógeno al suelo (30).
Las diferentes formas del nitrógeno presente en el suelo podrían
representarse así:
Figura 5. Formas del nitrógeno en el suelo. Fassbender H, Bornemisza E. (30)
3.1.2 FIJACIÓN BIOLOGICA DEL NITROGENO
NITROGENASA
26
Todos estos procesos se deben a la acción del complejo enzimático
nitrogenasa que es un sistema enzimático constituido por dos proteínas
diferentes, la dinitrogenasa (también referida como proteína MoFe o proteína
I) es una proteína que tiene por función unir y reducir el nitrógeno (N2) u otros
sustratos; y la dinitrogenasa reductasa (también referida como proteína Fe o
proteína II) y tiene el rol específico de pasar electrones, uno a la vez, a la
nitrogenasa. Fuertes reductores no reducirán la dinitrogenasa directamente,
la mayor parte de la función se hace vía dinitrogenasa reductasa, además,
de presentarse una dependencia del sistema al ATP (39).
3.1.3 BACTERIAS FIJADORAS DE NITROGENO
En Colombia, las publicaciones acerca del proceso de fijación de nitrógeno
por parte de bacterias diferentes a Azospirillum y Azotobacter son escasas,
ya que se estima que aproximadamente solo el 5.0 % de la población
bacteriana realiza este proceso; por esta razón, es primordial el aislamiento,
clasificación y análisis de diferentes bacterias tales como Bacillus sp,
Pseudomonas sp y Stenotrophomonas sp, que presentan características de
bacterias promotoras de crecimiento vegetal además de presentar dentro de
sus diferentes géneros el metabolismo necesario para realizar la fijación de
nitrógeno atmosférico (40). Todo esto lleva a mostrar sus características
generales, viendo así sus diferencias morfológicas y su potencial fijador de
nitrógeno.
El género Pseudomonas pertenece a la familia Pseudomonaceae, estas son
bacterias Gram negativas, aerobias, móviles y que no presentan esporas, en
27
cuanto a un género específico de bacterias fijadoras de nitrógeno un ejemplo
que ha sido estudiado recientemente es Pseudomonas stutzeri (41).
En cuanto a los Bacillus estos pertenecen a la familia Bacillaceae, este
género se conoce por el potencial que presenta para el uso biotecnológico en
la agricultura, tienen la capacidad de producir metabolitos antimicrobianos
para el control de patógenos, presentan una alta velocidad de crecimiento,
forman endoesporas resistentes a la desecación, el calor y las radiaciones
ultravioletas y sobreviven en diversas condiciones, presentan endoesporas
las cuales les confieren resistencia, otra de sus habilidades es degradar
biopolímeros como almidón y proteínas (42), además, este género presenta la
habilidad de fijar nitrógeno biológico de manera asimbiótica lo cual es
sumamente importante y esencial para el equilibrio del medio ambiente
debido a su papel dentro del ciclo del nitrógeno que beneficia a plantas,
animales y humanos que obtienen este elemento de dichos procesos, dos
especies capaces de realizar este proceso de fijación son B. macerans y P.
polymyxa (43).
Uno de los puntos a estudiar en los últimos años han sido las aglutininas y
lectinas como proteínas polifuncionales de algunas bacterias del suelo que
desempeñan un papel importante en la formación de asociaciones
simbióticas (44) y que así mismo poseen función hemaglutinante y
enzimática. De igual forma, gracias a la presencia de enzimas hidrolíticas de
las células de Rhizobium y Azospirillum estos microorganismos logran
penetrar las raíces de las plantas, pero no se ha confirmado aún la presencia
de las mismas en células de P. polymyxa; por otra parte se ha encontrado
que las lectinas de este último microorganismo generan la unión de las
células bacterianas a las raíces de las plantas desarrollando el papel de
las adhesinas (45).
28
Por otra parte, al contacto entre los carbohidratos de las plantas y los
receptores bacterianos se produce mucina, la cual contiene residuos
como hidratos de carbono, ácido glucurónico, galactosamina y
glucosamina específicos para P. polymyxa, de igual modo estos
residuos funcionan como receptores de lectinas bacterianas lo cual
aumenta el potencial proteolítico de las enzimas y así incrementa la
penetración de la bacteria en la raíz de la planta (44, 45).
El género Stenotrophomonas es una bacteria muy común en el medio
ambiente (46), y S. maltophilia, es usualmente referida como un
microorganismo causante de infecciones nosocomiales, que representa un
agente patógeno oportunista para los humanos, además, es un promotor de
crecimiento vegetal que tiene la capacidad de fijar nitrógeno esto se mostró
debido a la presencia del gen Nif H, que codifica para la enzima nitrogenasa
este proceso lo realiza por medio de la acumulación de altas cantidades de
amonio en medios con glucosa lo cual sugiere que los procesos de fijación,
son mediados por la presencia de azúcares en el medio (47).
Son varios los medios de cultivo usados para el crecimiento de bacterias
fijadoras de nitrógeno, ente ellos están el medio Ashby, LG, NFb, LGI, entre
otros (48). El medio Ashby es altamente selectivo ya que no contiene nitrógeno
y reduce la posibilidad de contaminación con otras bacterias, por otra parte
como desventaja tiene que el crecimiento de microorganismos es lento,
alrededor de 3 a 5 días (49). Al ser un medio libre de nitrógeno hace fácil
identificar cepas capaces de suplir sus necesidades metabólicas de este
elemento utilizando el nitrógeno presente en la atmósfera de la caja de petri
(50).
3.1.4 FAMILIA BACILLACEAE
29
Esta familia de bacterias es formadora de esporas. Se distinguen dos
géneros: Bacillus: bacterias aerobias y anaerobias facultativas oxidasa y
catalasa positiva; Clostridium: bacterias anaerobias oxidasa y catalasa
negativa. El Bacillus muestra una fuerte actividad amilolitica y el Clostridium
actividad celulolitica y proteolítica (51).
Figura 6. Familia BacillaceaeFuente: Whole-genome phylogenies of the family Bacillaceae and expansion of the sigma factor gene
family in the Bacillus cereus species-group Timothy R Schmidt, Edgar J Scott and David W Dyer. 2011 (52)
30
3.1.4.1 Bacillus
El género Bacillus pertenece a la familia Bacillaceae, y presenta una alta
distribución en diferentes ambientes tales como suelo y agua (53), además
tienen la capacidad de solubilizar fosfatos (54) y producir auxinas (55), se
caracterizan por ser bacilos aerobios y anaerobios facultativos Gram
positivos, con capacidad de producir esporas como mecanismo de
resistencia, además pueden presentar flagelos, son organismos catalasa
positiva, con crecimiento en pH de 5.5 a 8.5. (56)
Bacillus circulans es un microorganismo Gram positivo, aerobio, catalasa
positivo, móvil, formador de esporas, solubilizador de fosfatos, productor de
ácido indolacético, con sideróforos, inhibidor del crecimiento de hongos (57).
Bacillus coagulans es un microorganismo Gram positivo, móvil, ácido
tolerante y resistente al calor, es además una bacteria anaerobia facultativa,
son biocatalizadores para la fermentación de la biomasa lignocelulósica en
combustibles y productos químicos y son metabólicamente versátiles,
además utilizan carbono como fuente de energía (58).
Bacillus licheniformis es una bacteria Gram positiva, formadora de esporas
es un organismo saprofito, anaerobio facultativo, este microorganismo ha
sido utilizado como productor de enzimas industriales tales como proteasas,
α-amilasa y varias enzimas pectoliticas. Las enzimas de B. licheniformis son
usadas en la industria de los detergentes y del cuero. Además en el ámbito
clínico son utilizadas para la creación de antibióticos peptídicos como la
bacitracina (59).
31
Bacillus subtilis es un microorganismo Gram positivo, aerobio, que se
encuentra ampliamente distribuido en suelo, formador de esporas, es móvil,
produce enzimas hidrolíticas extracelulares, crece a diferentes temperaturas
(15 a 55°C), crece en concentraciones de hasta 7.0 % de NaCl, es catalasa y
Voges Proskauer postitivo (60).
3.1.5 GENES FIJADORES DE NITROGENO
El gen involucrado en la fijación del nitrógeno se denomina gen Nif (nitrogen
fixation) que tiene la función de codificar para la enzima nitrogenasa
mediante sus tres genes estructurales Nif KDH los cuales se encuentran en
todos los microorganismos fijadores de nitrógeno. Los mecanismos de este
gen son múltiples incluyendo activadores y reguladores tales como un (Ntr)
que es un regulador general del nitrógeno siendo éste un sistema de control
de expresión de muchos genes incluyendo el gen de la fijación de nitrógeno.
Dentro de los complejos sistemas de este gen la transcripción se muestra por
medio del operon NifLA que requiere una DNA girasa, otra proteína que
interviene es NifA que es una activadora especifica de la expresión de genes
nif promotores por interacción con un SigN (factor Sigma) que contiene una
RNA polimerasa, esta reconoce las secuencia consenso de dinucleotidos GG
y GC en las posiciones -12 y -24 con respecto al sitio de comienzo de la
transcripción (61). La figura 7 muestra los diferentes genes Nif envueltos en el
proceso de fijación.
32
Figura.7. Mapa de genes Nif. Fuente: http://www.eez.csic.es/~olivares/ciencia/fijacion/figura3.html (62).
33
Tabla 2. Funciones del gen NifGen (Nif) Función
Q Incorporación de molibdeno en la nitrogenasa (Imperial et al., 1984)
B Síntesis de co-factor Fe_Mo (Curatti et al., 2006)
A Regulacion positiva (Lee et al., 1993; Eydmann et al., 1995; Schmitz et al., 2002)
F Transporte de electrones:flavodoxinas(Arnold et al., 1988; Taylor et al., 1990)
M Procesa la nitrogenasa reductasa (Roberts et al., 1978;Arnold et al.,1988)
Z Maduración y activación de la proteína Fe-Mo (Paul y Merrick, 1989)
W Maduración y activación; protección al oxígeno de la proteína Fe-Mo (Paul y Merrick, 1989)
V Síntesis del cofactor Fe-Mo: homocitrato-sintasa (Zheng et al., 1997; Allen et al., 1994)
S Desulfurase de cisteína homodimerica, activación de S en la sintesis del grupo metallo
U Procesa la proteína Fe-Mo (Harris et al., 1990 : Fu et al., 1994)
X Síntesis del cofactor Fe-Mo. Regulación negativa(Lee et al., 2000)
E Síntesis e inserción de Fe-Mo dentro de la proteína dinitrogenasa (Orme-Johnson, 1985; Arnold et al., 1988)
Y Transformación de la proteína Fe-Mo (Homer et al., 1993)
T Maduración de la nitrogenasa (Simon et al., 1996)
K Subunidad β Beta de la proteína Fe-Mo (Arnold et al., 1988; Kim and Rees, 1994)
D Subunidad α Alfa de la proteína Fe-Mo (Arnold et al., 1988; Kim and Rees, 1994)
H Subunidad Fe de la proteína (Arnold et al., 1988; Kim and Rees, 1994)
J Transferencia de electrones: oxidoreductasa flavodoxina-piruvato (Schmitz et al., 2001)
L Regulacion negativa (Lee et al., 1993; Eydmann et al., 1995; Schmitz et al., 2002)
Fuente: Modificado de: YAM HOK CHAI, 2007 (61)
34
3.1.6 FERTILIZANTES NITROGENADOS
Según su origen los fertilizantes nitrogenados pueden ser orgánicos o
inorgánicos:
Fertilizantes nitrogenados orgánicos: actualmente son los más
utilizados en la agricultura orgánica, su contenido de nitrógeno varía
del 1.0% al 3.0%, lo cual equivale a dosis más altas en la aplicación
para lograr un aporte de nitrógeno significativo, el nitrógeno de estos
fertilizantes no es soluble en agua, por lo que se libera por
mineralización (63).
Fertilizantes nitrogenados inorgánicos: este tipo de fertilizantes
sintéticos se comenzaron a producir en la segunda guerra mundial por
medio de la producción de nitratos, es de destacar que la mayoría de
fertilizantes nitrogenados inorgánicos se derivan del amoniaco,
aunque también hay fuentes nítricas (63).
Es importante destacar que los fertilizantes amoniacales generan acidez en
el suelo ya que al nitrificarse liberan H+ de acuerdo con la siguiente reacción:
NH4+ + 2 O2 = NO3
- + H20 + 2 H+
Tabla 3: Acidez del suelo producida por fertilizantes nitrogenados
35
Valor adoptado por la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (Pierre 1934)FUENTE: Adams Soil Acidityand Liming n° 12 p. 234. Madison, Wisc: ASA 1984.
Extraído de Tisdale et al, 1995, (64)
Efecto del Nitrógeno en la planta
La deficiencia de este elemento en la planta genera hojas pequeñas, tallos
finos y rectos, además de ramificaciones escasas, esta falta produce una
competencia interna para transferir el Nitrógeno de las partes más viejas a
las más jóvenes, es por esto que los síntomas se ven en las hojas más
longevas (63).
36
Efectos ambientales del Nitrógeno
Uno de los efectos más comúnmente observados se trata de toxicidad por la
ingesta de agua con dióxido de nitrógeno (NO2-) que es la forma reducida del
nitrato (NO3-) el cual en el estómago de animales y humanos genera variados
síntomas clínicos desde molestias estomacales, cefaleas y en casos
extremos la muerte.
Un efecto ambiental es la afectación de la capa de ozono por la emisión de
N2O el cual se transforma a monóxido de nitrógeno (NO) que es capaz de
destruir la capa de ozono (63)
37
4. DISEÑO METODOLOGICO
4.1 Hipótesis:
Las cepas nativas de Bacillus licheniformis, B. subtilis, B. brevis, B. circulans
y B. coagulans tienen un posible potencial fijador de nitrógeno y se evidencia
mediante pruebas funcionales.
4.2 Tipo de investigación: La presente investigación es de tipo Descriptivo
cualitativo transversal.
4.3 Universo: Microorganismos aislados del ambiente
4.4 Población: Cepas nativas del género Bacillus provenientes de diferentes
ambientes, las cuales se encuentran congeladas en el Banco de cepas de la
Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca
4.5 Muestra: La muestra analizar son los microorganismos con capacidad
fijadora de nitrógeno.
4.5.1 Tipo de muestreo: Selectivo.
38
4.6 Variables
Variables Dependientes Indicadores
Nutrientes y condiciones físicas de
los ensayos in vitro, de fijación de
nitrógeno que se van a realizar en
el laboratorio
Concentración de nutrientes que se
utilizaran en los medios de cultivos
pH de los medios y temperatura de
incubación de los cultivos.
Variables independientes Indicadores
Capacidad fijadora de nitrógeno de
los microorganismos nativos
Número de cepas aisladas que
presenten capacidad fijadora de
nitrógeno. Crecimiento en agar
Ashby y agar semisólido LGI
5. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS
FASE1: EVALUACION DE LA CALIDAD DE LAS CEPAS NATIVAS
De las 31 cepas existentes aisladas de anteriores trabajos del grupo
CEPARIUM (Anexo 1) se seleccionaron 14 y se codificaron según el lugar
de donde provenían:
CH: Proyecto de Chimeneas negras
BIO: Proyecto de Biocontroladores
U: Proyecto de Physalis peruviana (Uchuva)
39
Tabla 4: Codificación cepas y nombre microorganismo.Fuente autor.
CEPA MICROORGANISMO
BIO9, BIO10, BIO12, BIO15,
CH5, U2, U4 Bacillus subtilis
BIO 6A2 Bacillus circulans
BIO5, CH8 Bacillus brevis
BIO7b Bacillus coagulans
BIO8, U1 Bacillus licheniformis
U3 Stenotrophomona maltophilia
Se realizó la activación utilizando el protocolo de Sánchez y Corrales (65). Se
seleccionaron los viales congelados a -70ºC, estos se sembraron en caldo
infusión cerebro corazón BHI, para permitir el crecimiento de los
microorganismos, esto se incubo a 37°C por 24h. Las cepas fueron
sembradas en Agar Sangre y Agar McConkey, donde la glucosa es la fuente
de carbohidratos que los microorganismos utilizan mediante fermentación.
Se utilizó fosfato disódico (Na2HPO4) como tampón en el medio (66).
Posterior al crecimiento se realizó la coloración de Gram, la cual permitió
determinar la pureza de las cepas y la posterior selección de las cepas de
interés que presentaron la morfología de bacilo Gram positivo.
La identificación de las cepas se realizó por medio de pruebas bioquímicas
en tubo y pruebas de identificación rápida BBL Crystal™ el cual es un
método de identificación en miniatura (67); donde se correlacionaron los
resultados con el Manual de Bergey´s.
40
Evaluación de la viabilidad
Tiene como objetivo observar que el cultivo de interés sea viable, para así
tomar acciones específicas en caso que este se vea disminuido o afectado
en algún momento. Este chequeo se realiza antes de la preservación,
inmediatamente después y durante el almacenamiento (68).
Evaluación de la pureza
La pureza se determina mediante la demostración de la presencia de
contaminantes bacterianos y fúngicos. La pureza microbiológica es un valor
relativo a la sensibilidad de los métodos que se utilizan por lo que es
importante descartar contaminantes de especies relacionadas que pueden
encontrarse en una baja concentración (69). Así mismo se realizó la tinción de
Schaeffer Foulton, con la cual se buscaba la presencia de esporas, ya que el
género identificado, Bacillus, tiene como una de sus características la
presencia de estas.
Evaluación de la autenticidad
Se realiza para comprobar que el cultivo mantiene las características de la
cepa original. Es importante demostrar que las características y funciones
propias de los microorganismos no están alteradas. (70).
41
FASE 2. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE FIJACION DE
NITROGENO ATMÓSFERICO
Fijación de nitrógeno con medio Ashby
Las bacterias identificadas como Bacillus fueron sembradas en medio Ashby
modificado (anexo 2) dejando incubar a 40°C de 24 a 48 horas, se esperaba
crecimiento, lo cual indicaría fijación de nitrógeno por parte de éstas. Se
escogió éste medio porque permite obtener un aislamiento altamente puro,
libre de trazas de nitrógeno que pudiesen haberse adquirido mediante los
cultivos anteriores o por contaminación (71).
FASE 3: CONFIRMACIÓN DEL POSIBLE POTENCIAL FIJADOR DE
NITRÓGENO DE LAS CEPAS SELECCIONADAS
Posteriormente se realizó el mismo procedimiento en colaboración con
Corpoica Tibaitatá - Mosquera, quienes brindaron los componentes para la
preparación de 2 medios de cultivo altamente puros y libres de nitrógeno, con
el fin de confirmar los resultados que se obtuvieran. La composición de estos
medios es la misma (Manitol, Fosfato monobásico, Sulfato de magnesio,
Cloruro de sodio, Sulfato de calcio, Carbonato de calcio) con la variación en
el agar solidificante, en uno se emplea agar agar Merck y en el otro Agarosa
Merck (anexo 3 y 4), con lo cual se garantiza que no contenga alguna traza
de nitrogeno. Se prepararon 200ml para 8 cajas de petri, sirviendo por caja
20ml; 100ml se sirvieron en la fiola para agar agar y 100ml para la fiola de
agarosa. Se mezclaron los componentes, excepto el agar y la agarosa, ya
que se debió medir el pH antes de agregarlos, el pH se midió en el
potenciómetro, arrojando un pH inicial de 6.5, se agregó NaOH para
alcalinizar el pH hasta llevarlo a 7.2, posteriormente se agregó el agar y la
agarosa, respectivamente, se autoclavó a una temperatura de 121ºC por 40
42
minutos, pasado éste tiempo se sirvió el agar, se dejó gelificar y se realizó la
siembra.
La siembra se realizó por duplicado en el medio con agar y en el medio con
agarosa, esto con el fin de observar posibles diferencias en el resultado
debido a la composición de los medios, pues la agarosa es altamente pura.
Fig. 8
agar Ashby con agarosa Fig. 9 agar Ashby simple
Posteriormente para garantizar su reproducibilidad las cepas se sembraron
por triplicado en medio LGI semisólido sin ninguna fuente de nitrógeno
(anexo 5), en tubo de ensayo tapa rosca de 25ml y se sirvieron 5ml de medio
semisólido LGI, posteriormente se realizó la siembra a superficie de las
muestras en el medio y se llevaron a incubación por 10 días a 30°C.
43
6. RESULTADOS
Los resultados de la coloración del Gram mostraron la morfología de las
cepas de Bacillus, lo que permitió confirmar que todos los bacilos
seleccionados eran bacilos Gram positivos.
FASE 1: SELECCIÓN Los microorganismos Bacilos Gram positivos presentaron crecimiento y
hemolisis beta en agar sangre y la Stenotrophomonas maltophilia en agar
MacConkey presentó crecimiento, lactosa negativa.
El género de las cepas se comprobó con pruebas BBL crystal para confirmar
si correspondían a los géneros con que habían sido codificados previamente.
Tabla 5. Características de los Bacillus analizadosFuente: Autor
BacillusCaracterísticas Macroscópicas
GRAMSchaeffer
FultonHEMOLISI
S
Pruebas rápidas de Identificación y porcentaje de
confiabilidadBacillus brevis
BIO5, CH8Colonias pequeñas de 2.0-3.0 mm de diámetro aproximadamente de forma circular, con bordes irregulares de aspecto granular, consistencia cremosa brillante (fig. 12)
Bacilos Gram
positivo
Endoesporas esféricas y centrales que deforman el bacilo.
Beta hemolisis
BBL crystal99.94% y 99.57% respectivamente
Bacillus circulansBIO 6A2
Colonias de 2.0 -4.0 mm de diámetro aproximadamente de forma
Bacilos Gram
positivo
Endoesporas esféricas y centrales que deforman el
Beta hemolisis
BBL cyistal99.99%
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convexa, con bordes uniformes, de aspecto liso, consistencia cremosa, puntiformes brillantes, color crema a gris. (fig 12).
bacilo.
Bacillus coagulans
BIO7b
Colonias medianas de 2.0 -4.0 mm de diámetro aproximadamente de forma circular, con bordes irregulares, consistencia cremosa y dura, color gris claro (fig. 11)
Bacilos Gram
positivo
Endoesporas esféricas y centrales que deforman el bacilo.
Beta hemolisis
BBL crystal86.41%
Bacillus licheniformis
BIO8, U1
Colonias grandes de 4.0-5.0 mm de diámetro aproximadamente de forma circular, puntiformes con bordes irregulares, consistencia cremosa brillante, color grisaseo (fig. 14).
Bacilos Gram
positivo
Endoesporas esféricas y centrales que no deforman el bacilo.
Beta hemolisis
BBL crystal95.68% y 99.99% respectivamente
Bacillus subtilis BIO9, BIO10,
BIO12, BIO15, CH5, U2, U4
Colonias medianas de 2.0 -4.0 mm de diámetro aproximadamente de forma redonda, de aspecto rugoso, consistencia blanda, color gris claro. (fig 11) (fig 12) (fig. 14)
Bacilos Gram
positivo
Endoesporas esféricas y centrales que no deforman el bacilo