INSTITUTO POLITCNICO NACIONALEscuela Nacional de Ciencias
BiolgicasLaboratorio de Bioqumica Microbiana Balance de
fermentacin.Integrantes:Esquivel Arviz LizbethGarca Paredes
JazmnMartnez Arce Claudia LizetheMorn Carpio AbigailVilchis Torrez
Joel David
Grupo 5IV1Seccin 1
Profesores: Susana Alfaro AguilarEduardo Montoya Daz
Hiptesis y diseo experimental3%
Objetivos1%
Registro de datos3%
Manejo de datos4%
Discusin de resultados5%
Conclusiones3%
Referencias Biliogrficas1%
Hiptesis. Si la fermentacin llevada a cabo por Saccharomyces
cerevisiae es una fermentacin alcohlica entonces tendr como
productos el Etanol y liberacin de CO2. S las determinaciones por
el mtodo de Conway para etanol, gravimtrico de CO2 y glucosa
residual se llevan a cabo con la mayor precisin posible, entonces
tendr un ndice de O/R cercano a 1.Diseo experimental.Se realiza un
micro-ensayo de fermentacin con Saccharomyces cerevisiae,
utilizando glucosa como sustrato, en el cual se cuantificar los
productos obtenidos: etanol y dixido de carbn, as como la glucosa
residual.Mtodo de Conway Se basa en el poder oxidante del dicromato
de potasio (K2Cr2O7) en cido sulfrico (H2SO4), el Cr2O7= de color
amarillo-naranja produce, por reduccin, al in cromoso de una
tonalidad verde-azul que es oxidado cuantitativamente cido actico
(CH3COOH) y agua.2 K2Cr2O7 +8 H2SO4 + 3 CH3CH2OH 2 K2SO4 + 2
CH3CHOO + 2 Cr2(SO4)3 + 11 H2OEl in reducido es colorido, se puede
leer en el espectro visible a 445nm debido a que sta es la longitud
de onda mxima a la que absorbe el dicromato de potasio. Lo que se
lee realmente es el dicromato que no reaccion, ya que al aumentar
la concentracin de etanol aumenta el cromato. La grfica resulta ser
una recta cuya pendiente es negativa.Determinacin de C02 por
gravimetra.A partir de la formacin de bicarbonato de sodio por la
reaccin del CO2 con el NaOH se pone a reaccionar con BaCl2 se forma
el precipitado BaCO3 que se recolecta en papel filtro y por
diferencias de pesos entre el papel filtro sin el precipitado y el
papel filtro con el precipitado se obtiene la cantidad de
precipitado que en base a la conversin por un factor gravimtrico se
cuantifica la cantidad de CO2 producido durante la fermentacin.2
NaOH + CO2 Na2CO3 + H2ONa2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2 NaCl CO2
BaCO3Determinacin de la glucosa residualSe realizara por medio del
mtodo del DNS. El cual se basa en la reduccin del DNS (color
amarillo) por la Glucosa (azcar reductor) al acido
3-amino-5-nitrosalicilico (Fig. 1) de color rojo previo
calentamiento por 10 min en bao mara en ebullicin. El cual el
3-amino-5-nitrosalicilico es equivalente a la concentracin de
glucosa en el medio, siendo as que se leer la absorbancia a 540nm
en el espectrofotmetro.
Ilustracin 1. Reaccin del DNS con la glucosa como azcar
reductor.
Reactivos.ReactivoFuncin
N2Crea una atmosfera de anaerobiosis dentro del matraz lo que
permitir el desarrollo de la fermentacin.
cido tricloroacticoDetiene el proceso de fermentacin.
Agua destiladaLlevar a volmenes indicados, realizar lavado o
aforar.
Agua detilada libre de CO2Realizar los lavados del precipitado
formado por el mtodo de gravimetra para la determinacin de CO2.
DNS en tartrato de sodio-potasioLa determinacin de azcares
reductores, involucra la oxidacin del grupo funcional aldehdo
presente.
Carbonato de potasio saturadoAgente liberador del etanol.
Cloruro de bario al 5% en agua libre de CO2Forma un precipitado
(BaCO3) con el CO2, para ser determinado por gravimetra.
Dicromato de potasioAgente atrapante de etanol, este realiza una
oxidacin sobre el etanol
GlucosaSustrato a fermentar.
Glucosa 100 mg/mLSe realiza la curva tipo para determinar la
glucosa residual.
Etanol 1500mg/mLSe realiza la curva tipo para la derminacin de
etanol por el mtodo de Conway.
NaOH 10%Reacciona con CO2 de la fermentacin para la formacin de
Na2CO3.
KOH 10%Neutralizante de Ac. Tricloroactico.
Regulador de fosfatosMantiene el pH a 6.8 constante durante la
fermentacin.
Suspensin CelularMicroorganismo que realiza la fermentacin. S.
cerevisiae.
Objetivos generales. Realizar un micro ensayo para la
fermentacin de glucosa por la levadura Saccharomyces cerevisae para
la cuantificacin de sus productos. Llevar a cabo un proceso de
fermentacin utilizando una levadura de uso industrial y conocer la
eficiencia de dicho proceso.Objetivos especficos. Cuantificar los
productos de inters liberados durante un proceso de fermentacin
(etanol y dixido de carbono) a travs del mtodo de Conway, para el
caso del etanol y gravimetra, para el caso de CO2. Realizar un
balance de fermentacin utilizando los datos obtenidos
experimentalmente. Determinar la prdida de carbono efectuada
durante el proceso de fermentacin de Saccharomyces
cerevisiae.Registro de datos.1. Curva tipo etanol.Tabla 1. Curva
tipo de etanol 1500 mg/mL leda a 445nm.g de etanolAbsorbencia a
445nm
01.075
2500.979
5000.849
10000.691
15000.520
20000.432
25000.220
2. Determinacin de etanol formado en la fermentacin.Tabla2.
Absorbancia obtenida a 445nm por el etanol producido en la
fermentacin de glucosa por S. cerevisiae.MuestrasAbsorbencia a 445
nm
0.2 mL de muestra fermentada0.419
0.4mL de muestra fermentada0.551
1.0 mL de muestra testigo0.902
3. Curva tipo de glucosaTabla 3. Curva tipo de glucosa 100 mg/mL
a 540nm por mtodo colorimtrico DNS.g de glucosaAbsorbencia a
540nm
00
1000.188
2000.405
3000.656
4000.883
5001.098
4. Determinacin de glucosa residual por la fermentacinTabla 4.
Absorbancia obtenida a 540nm por la glucosa residual producida de
la fermentacin de glucosa por S. cerevisiae.MuestrasAbsorbencia a
540nm
0.2 mL de sobrenadante diluido 1:10
0.4 mL de sobrenadante diluido 1:200.325
1 mL de sobrenadante testigo sin diluir0.221
5. Determinacin de CO2Tabla 5. Determinacin de BaCO3 por el
mtodo gravimtrico a travs de diferencia de pesos de papel
filtro.MuestrasPeso en gramos (g)
Papel filtro0.8131
Papel filtro + BaCO30.9261
BaCO3 de fermentacin0.1130
Papel filtro Testigo0.8158
Papel filtro + BaCO3 Testigo0.8548
BaCO3 Testigo0.0390
Manejo de datos. 1. Determinacin de etanol producido durante la
fermentacin.Ecuacin de la recta y = ax+bEcuacin emprica y= -
3.28x10-3 X + 1.0445r2=0.9899a=-3.28x10-3b = 1.0445Despeje de x
Se sustituyen los datos de A (445nm) obtenidos en la tabla
anterior en la ecuacin de la recta obtenida de la curva tipo de
Etanol.
Problema:Alcuota 0.2ml:
Alcuota 0.4ml:
Testigo:
Se obtiene un promedio de la interpolacin de los testigos:
y se le resta al testigo el promedio del problema para
obtener:
Y se obtiene al fin el nmero de moles deEtanol formado en la
fermentacin en mmoles, tomando en cuenta que se tienen 46mg/mol de
Etanol tericamente:
n= 2. Determinacin de glucosa residual.Ecuacin de la recta y =
ax+bEcuacin emprica y= 2.236 x10-3 X + 0.0206
r2=0.999a= 2.236x10-3b = 0.0206Despeje de x
Se sustituyen los datos de A (540nm) obtenidos en la tabla
anterior en la ecuacin de la recta obtenida de la curva tipo de
Glucosa.Problema (dilucin 1:20):
Testigo:
y se le resta al testigo el resultado del problema para
obtener:
Se obtiene la glucosa fermentada, tomando en cuenta que se
tienen 180mg/ml de Glucosa inicial:Glucosa inicial:180g --- 1M---
1000 ml360g --- 2M ---1000 ml x-------------- 0.5 ml
Y se obtiene as el nmero de moles de Glucosa fermentada en
mmoles:
3. Determinacin de CO2.Fg= factor gravimtrico Se resta BaCO3
testigo a BaCO3 de fermentacin para despus multiplicarlo por el
factor gravimtrico y obtener con este el nmero de moles de BaCO3
obtenidos en la fermentacin.
4. Balance de fermentacin.Tabla 6. Balance de fermentacin.1
(mmol)2 (mmol)3456 (mmol)N de C
Fuente de Carbono
Glucosa0.6631066
Productos
EtOH1.3582.048- 2-4.0964.0962
CO20.3750.566+ 21.1310.5661
= 4.662
Columna 3: H=-0.5 O= +1Etanol (CH3-CH2-OH):CO2:H = -0.5 X 6 =-3O
= +1 X 2 = +2O = +1 X 1 = +1 = -2
Columna 4: Productos oxidadosColumna 5: Productos reducidosCO2=
(0.564)(2)= 1.131EtOH= (2.048)(-2)= -4.096Columna 6:
% de Carbono recuperado: 6 mol --- 100 %4.662 mol --- x % X=77.7
%1 mmol x 6= 6mmol 2.048mmol x 2= 4.096 mmol0.566 x 1 = 0.566
mmolndice O/R:
Discusin.Cuando en una fermentacin se producen varios productos
finales la bacteria dispone de diferentes alternativas para
reoxidar del NADH, no existe a priori una estequiometria definida.
En cada caso concreto, segn sea la bacteria y las condiciones de
cultivo, puede cuantificarse tanto el consumo de glucosa (u otro
sustrato) como la produccin de productos finales I.Las levaduras
como microorganismos quimiohetertrofos, necesitan compuestos
orgnicos como fuentes de carbono y energa (FCE). Los glcidos,
principalmente las hexosas, son los compuestos ms utilizados como
FCE tanto para el metabolismo aerbico como anaerbico VIII.
Saccharomyces cerevisiae es un microorganismos muy utilizado en la
microbiologa industrial, en la produccin de pan, grasas glicerina y
la ms importante la de bebidas fermentadas I. En las levaduras,
bajo condiciones anaerbicas el NAD+ se regenera por medio de la
fermentacin alcohlica: la conversin del piruvato en etanol y CO2.
Mediante dos reacciones consecutivas catalizada por dos enzimas III
(ilustracin 2). Por cada mol de glucosa que entra en la va Embden
Meyerhof Parnas se producir 2 moles de piruvato, los cuales al
incorporase al metabolismo fermentativo (fermentacin alcohlica), se
producir 2 moles de dixido de carbono y 2 moles de etanol. Esto es
muy importante que sea tomado en cuanta en el momento de elaborar
un balance de fermentacin IX.
Ilustracin 2. Reacciones llevadas a cabo en fermentacin
alcohlica.
Por lo anterior podemos decir que S. cereviciae, en condiciones
de anaerobiosis, por cada mol de glucosa produce 1 mol de Dixido de
carbono y 1 mol de etanol, por esta razn nuestros clculos dependen
de muchos factores, tales como el mtodo y los errores cometidos
durante su ejecucin. Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis
(fermentacin del pulque) y otras levaduras como Leuconostoc
descomponen la glucosa para producir etanol, reoxidando NADH aunque
cabe mencionar que la estequiometria vara dependiendo el
microorganismo, pues tericamente no tienen la misma relacin de
productos oxidados y reducidos y en la prctica estos pueden variar
an ms. La fermentacin alcohlica es un proceso muy complejo; el
incremento de la concentracin de etanol a medida que transcurre la
fermentacin supone un obstculo para el correcto crecimiento y
desarrollo de la levadura por los efectos negativos que esto
conlleva. El etanol afecta la permeabilidad de la membrana celular
disminuyendo su selectividad, de forma que las levaduras en un
medio con alta concentracin alcohlica pierden propiedades
funcionales y no pueden retener cofactores y coenzimasVIII. Una
diferencia importante entre las levaduras silvestres y las
levaduras de vino cultivadas es su tolerancia al etanol. La mayor
parte de las levaduras silvestres pueden tolerar solamente
alrededor de un 4 % v/v de etanol; cuando la concentracin de
alcohol llega a este punto, la fermentacin se detiene.XLos balances
de fermentacin son esenciales para su aplicacin en la industria, el
principal objetivo del anlisis de las fermentaciones es el de
dirigir tanto carbono como sea posible desde un sustrato hacia un
producto metablico de importancia industrial, y obtener el mximo
rendimiento posible. VIIIAhora bien en la prctica se realizo un
microensayo de una fermentacin alcohlica, una de las fermentaciones
que solo tiene dos productos metablicos: el etanol y el dixido de
carbono. Los cuales se les determin su concentracin por los mtodos
de Conway y gravimtrico, respectivamente, para conocer el % de
carbono recuperado en el proceso fermentativo, as como tambin se
determin la concentracin de glucosa fermentada. Estos mtodos pueden
presentar interferencias que afectan los balances de fermentacin.El
mtodo de Conway, como ya hemos mencionado, se basa en la oxidacin
del alcohol por accin de una solucin de dicromato de potasio en
medio cido por cido sulfrico. El alcohol es oxidado
cuantitativamente a cido actico y el dicromato es reducido a cromo
trivalente, de acuerdo con la siguiente reaccin.2 K2Cr2O7 +8 H2SO4
+ 3 CH3CH2OH 2 K2SO4 + 2 CH3CHOO + 2 Cr2(SO4)3 + 11 H2OEn cuanto a
la manera en que fue llevado a cabo el experimento, podemos decir
que fue adecuada, ya que se estuvo al tanto de que no se mezclaran
el contenido de la cmara central (K2Cr2O7), con el contenido de la
cmara externa (H2SO4 y K2CO3) y se procur recuperar la mayor
cantidad posible de K2Cr2O7.
El rendimiento terico estequiomtrico para la transformacin de
glucosa en etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1g
de glucosa XI. Nosotros obtuvimos una recuperacin de 1.358 mmol de
Etanol que correspondera a 67.9% del total, tomando como base 2
mmol de Etanol. Por lo que podemos decir que nuestro rendimiento
fue bueno.
Como resultados observamos en la tabla 6 el balance de
fermentacin obtenido, el rendimiento de la reaccin se aprecia en el
porciento de carbono recuperado, siendo este entre 80% y 100%.
Cuando hay un bajo rendimiento es atribuido a una prdida de
productos, en el caso del CO2, una fuga en el sistema, o en el caso
de que en el sistema presentara un escaso residuo de oxigeno en el
medio, el cual se vera afectado por el efecto PasteurI. En el caso
de la glucosa pudo ser una interferencia del mtodo del DNS como no
controlar el Ph, ya que el mtodo reacciona en condiciones
alcalinas, el no controlar la temperatura ya que es a ebullicin
durante 10 minutos,se podra utilizar un mtodo como el de glucosa
oxidasa es un mtodo de referencia por su alta especificidad gran
sensibilidad. El mtodo se basa en la siguiente reaccin
enzimtica:
-D-Glucsa + NADD-glucono-lactona +,
catalizada por la glucosa-dehidrogenasa; por adicin simultnea de
mutarotasa se aumenta la velocidad de la reaccin. Se determina
finalmente la cantidad delformado, la cual es proporcional a la
concentracin de glucosa. La lectura se hace fotomtricamente a una
longitud de onda de 340 366 nm.XIIEste mtodo es apropiado para la
determinacin de glucosa en diversos jugos y nctares de fruta
(naranja, durazno, tomate) y de verduras (zanahoria), como tambin
en vinos y mieles. Dada la especificidad de la glucosadehidrogenasa
frente a la glucosa, no reacciona con la fructosa, ni la sacarosa.
Se eliminara la incubacin a ebullicin ya que la incubacin es a
temperatura ambiente y el tiempo de incubacin ya que son 5 mim
adems de poder trabajas con alcuotas pequeas.VIII
La ventaja del mtodo de Conway, es que el material y el equipo
que se utiliza para la determinacin es ms accesible, aunque tambin
presenta una fuerte desventaja, ya que es relativamente
inespecfico, ya que otros alcoholes, cetonas y aldehdos reducen el
dicromato, as como tambin existe la posibilidad de la descomposicin
del dicromato por exposicin a la luz y considerando que es un mtodo
indirecto de oxido reduccin colorimtrico y depende del complejo
colorido que se forma por la reaccin del dicromato con el etanol,
ste no es muy estable, con lo que se pierde la intensidad del color
y el complejo colorido no tiene la misma absorcin por lo que
produce una seal distinta a la inicial y existe prdida. Otra
situacin a considerar por prdida es que el etanol presenta una
elevada presin de vapor, en donde es parcialmente miscible y la
presin atmosfrica es relativamente baja. Otras formas para
determinar etanol son: Cromatografa de gases Micro difusin
Determinacin por picnmetro Determinacin enzimtica (Alcohol
Deshidrogenasa) TitulacinSi bien los mtodos sugeridos requieren del
tratamiento previo el que podra presentar mayores inconvenientes
sera la determinacin por medio de una titulacin, ya que presenta
interferencias en el mtodo, al no ser especfico para un sola
especie qumica y en general para un cambio de vire solo depende el
pH.Asimismo, la relacin de productos oxidados entre productos
reducidos es de 0.276 (donde el producto oxidado es CO2 y el
reducido es el CH3CH2OH), lo que significa que existe mayor
cantidad de productos reducidos que de oxidados y a sabiendas de
que para determinar la cantidad de CO2 se realiz por un mtodo
gravimtrico, podemos pensar que de entrada, el CO2 no se captur
totalmente en el NaOH acuoso y por consiguiente en los lavados no
se encontrara el CO2 en su totalidad, tambin podemos considerar
como una prdida con slo destapar el matraz microfermentador ya que
el gas contenido en este es CO2. Sabiendo que se trata de un mtodo
gravimtrico, tambin se puede considerar que hay prdidas al momento
de realizar los lavados, ya que pudieran quedar trazas de BaCO3 en
el matraz y obviamente estas no son cuantificadas.Viendo las
anteriores situaciones podemos considerar que la relacin entre la
cantidad de productos oxidados y reducidos (O/R) no es cercana a
uno debido a que durante las determinaciones para cada producto,
pudieron haber tenido prdidas de producto en la determinacin de la
relacin, y podemos corroborarlo con nuestro por ciento de carbono
recuperado. Notamos que la cantidad de carbono recuperado en funcin
de la glucosa suministrada a Saccharomyces cerevisiae, existe un
rendimiento del 77.7 %, cuando las prdidas de CO2 permitidas estn
en un intervalo del 87-95%. Por lo que en cuanto a recuperacin de
CO2 podemos decir que fue deficiente.Tomando en cuenta, la citas
bibliogrficas y los antecedentes, podemos dar anlisis de la prdida
de producto que existi o que delimit la cuantificacin total de los
productos en medida de la glucosa que se aadi para obtener etanol y
dixido de carbono y deducir que las variaciones presentadas por la
relacin de los productos oxidados y reducidos se debi meramente a
errores aleatorios tanto del mtodo como de los analistas, sabiendo
que Saccharomyces cerevisiae se encontraba en las condiciones
ptimas para llevar a cabo la fermentacin.Conclusiones. El ndice O/R
fue de un valor de 0.276 donde el producto oxidado es CO2 y el
reducido es el CH3CH2OH por lo que no se llev a cabo un flujo de
carbonos correspondiente nicamente a la fermentacin alcohlica. La
recuperacin de CO2 fue deficiente al tener un rendimiento de 77.7%
con respecto a los intervalos establecidos de 87-95% Los errores en
la fermentacin representados en el balance de fermentacin pudieron
verse en su mayora por errores de los analistas al formarse ms
producto reducido durante la fermentacin. La fermentacin por
Saccharomyces cerevisiae debido al anlisis de sus productos fue una
fermentacin alcohlica. Para un mejor balance de fermentacin para la
cepa utilizada S. cerevisiae es necesario utilizar equipos para
evitar su prdida de gas y un equipo que se encuentre estable para
su ptimo manejo.Referencias bibliogrficas.I. Pars I Farras, R., y
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