A. JUDUL Optimasi Produksi dan Penghambatan Bakteriosin dari Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Air Susu Ibu (ASI) Terhadap Bakteri Escherichia coli ATCC 25922. B. LATAR BELAKANG Kebutuhan manusia akan pangan terus meningkat. Kebutuhan ini tidak akan pernah berhenti dalam kehidupan makhluk hidup. Selain kebutuhan terhadap pangan, kebutuhan terhadap mutu pangan pun terus meningkat. Kontaminan mikrobiologis merupakan salah satu penyebab mutu pangan berkurang dan menjadi tidak aman untuk dikonsumsi. Mutu pangan dapat dinilai dari tingkat kontaminan mikroba patogen. Escherichia coli pertama kali diidentifikasikan oleh dokter hewan Jerman, Theodor Escherich dalam studinya mengenai sistem pencernaan pada bayi hewan. Pada tahun 1885, beliau menggambarkan organisme ini sebagai komunitas bakteri coli (Escherich 1885) dengan membangun segala perlengkapan patogenitasnya di infeksi saluran pencernaan. Escherichia coli merupakan bakteri yang 2
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
A. JUDUL
Optimasi Produksi dan Penghambatan Bakteriosin dari Bakteri Asam
Laktat yang Diisolasi dari Air Susu Ibu (ASI) Terhadap Bakteri Escherichia
coli ATCC 25922.
B. LATAR BELAKANG
Kebutuhan manusia akan pangan terus meningkat. Kebutuhan ini tidak
akan pernah berhenti dalam kehidupan makhluk hidup. Selain kebutuhan terhadap
pangan, kebutuhan terhadap mutu pangan pun terus meningkat. Kontaminan
mikrobiologis merupakan salah satu penyebab mutu pangan berkurang dan
menjadi tidak aman untuk dikonsumsi. Mutu pangan dapat dinilai dari tingkat
kontaminan mikroba patogen.
Escherichia coli pertama kali diidentifikasikan oleh dokter hewan Jerman,
Theodor Escherich dalam studinya mengenai sistem pencernaan pada bayi hewan.
Pada tahun 1885, beliau menggambarkan organisme ini sebagai komunitas bakteri
coli (Escherich 1885) dengan membangun segala perlengkapan patogenitasnya di
infeksi saluran pencernaan. Escherichia coli merupakan bakteri yang banyak
dijumpai pada pangan terutama pada pangan yang memiliki kandungan protein
tinggi seperti daging segar. Strain pathogen Escherichia coli dapat menimbulkan
penyakit diare berdarah , pembengkakan dan kelainan ginjal, demam, kelainan
saraf, bahkan kematian (Velcerc et al., 2002 dalam Usmiati dan Marwati, 2007).
Escherichia coli ATCC 25922 merupakan strain Escherichia coli yang sering
digunakan utnuk tes kerentanan antibiotik. Strain Escherichia coli ATCC 25922
tidak menghasilkan racun Shiga like toxin yang dapat menyebabkan diare akut
pada manusia.
2
Bakteri Asam Laktat (BAL) merupakan bakteri kelompok gram positif,
tidak berbentuk spora, dan dapat membentuk kokus maupun batang, yang
memproduksi asam laktat sebagai produk akhir dalam fermentasi karbohidrat.
BAL dapat bersumber dari makanan, feses, maupun air susu ibu (ASI).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan Puspawati & Nocianitri, 2012, diperoleh
28 isolat bakteri asam laktat dari ASI. Dari 28 isolat BAL tersebut, terdapat 9
isolat BAL yang memiliki karatkeristik sebagai probiotik. Karakteristik dari 9
isolat BAL tersebut adalah memiliki karakteristik gram positif, katalase negatif,
bentuk koloni bulat, batang pendek dan seperti huruf Y, mampu tumbuh pada
suhu 10oC sampai suhu 45oC, tahan dan mampu tumbuh pada media yang
mengandung garam NaCl, bersifat homofermentatif (tidak memproduksi gas CO2
dari glukosa), tidak membentuk dekstran dari sukrosa, tahan dan mampu tumbuh
pada pH 2 sampai pH 6, mampu tumbuh pada kondisi lingkungan yang
mengandung garam empedu dari konsentrasi 0,2 mM sampai 0,6 mM.
BAL dapat digunakan sebagai probiotik. Salah satu sifat bakteri probiotik
adalah memiki kemampuan (aktivitas) antimikroba terhadap mikroba patogen.
Aktivitas antimikroba disebabkan oleh senyawa-senyawa metabolit yang
dihasilkan seperti asam organik, CO2, H2O2, diasetil, dan bakteriosin. Beberapa
strain bakteri asam laktat dapat memproduksi protein bakteriosin yang dapat
mencegah mikroba pembusuk dan patogen (Anon, 2009 dalam Ruzanna, 2011).
Bakteriosin merupakan peptida yang bersifat antimikroba yang diproduksi
oleh bakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri lain. Beberapa galur
BAL dapat menghasilkan senyawa protein yang disebut bakteriosin, dan bersifat
3
bakterisidal terhadap bakteri gram positif dan gram negatif (Tahara et al., 1996
dalam Usmiati dan Marwati, 2007).
Pemakaian bakteriosin komersial sebagai pengawet sudah dilakukan di
beberapa negara dan diaplikasikan pada beberapa jenis makanan. Bakteriosin
merupakan senyawa protein yang dieksresikan oleh bakteri yang bersifat
menghambat pertumbuhan bakteri lain. Bakteriosin banyak diteliti karena
berpotensi sebagai pengawet makanan alami dan dapat diaplikasikan di bidang
farmasi.
Dari penelitian yang dilakukan Sundari (2014), diketahui bahwa BAL
yang diisolasi dari ASI memiliki aktivitas antimikroba yang berasal dari
bakteriosin. Namun belum diketahui waktu optimum dan daya penghambatannya.
Berdasarkan hal tersebut, maka perlu dilakukan peneelitian untuk mengetahui
waktu produksi bakteriosin yang optimum yang dihasilkan oleh bakteri asam
laktat dan daya penghambatannya terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.
C. RUMUSAN MASALAH
1. Kapan waktu optimum produksi bakteriosin dari BAL yang diisolasi
dari ASI?
2. Bagaimana daya penghambatan bakteriosin dari bakteri asam laktat
yang disolasi dari ASI terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922?
D. HIPOTESIS
1. BAL yang diisolasi dari ASI akan memproduksi bakteriosin pada
waktu tertentu.
2. Bakteriosin yang dihasilkan BAL yang diisolasi dari ASI memiliki
daya penghambatan terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.
4
E. TUJUAN PENELITIAN
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Mengetahui waktu optimum produksi bakteriosin dari BAL yang
diisolasi dari ASI.
2. Mengetahui daya penghambatan bakteriosin dari BAL yang diisolasi
dari ASI terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.
F. MANFAAT PENELITIAN
Manfaat dari penelitian ini adalah :
1. Sebagai informasi untuk mengetahui waktu optimum produksi
bakteriosin dari BAL yang diisolasi dari ASI serta daya
penghambatannya terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922..
2. Bakteriosin dari BAL yang diisolasi dari ASI dapat diaplikasikan pada
produk pangan sebagai pengawet.
G. TINJAUAN PUSTAKA
G.1. Bakteriosin
Bakteriosin merupakan peptida antimikroba yang diproduksi oleh bakteri
yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri lain. Beberapa galur BAL dapat
menghasilkan senyawa protein yang disebut bakteriosin, dan bersifat bakterisidal
terhadap bakteri gram positif dan gram negatif (Tahara et al., 1996 dalam Usmiati
dan Marwati, 2007). Umumnya ukuran peptida bakteriosin berkisar antara 3
hingga 6 kDa.
Bakteriosin pertama kali ditemukan oleh A. Gratia pada tahun 1925,
dengan senyawa yang dikenal sebagai colicin yang berasal dari Eschericia coli V
dan dapat menghambat pertumbuhan Eschericia coli S. Bakteriosin dapat
5
membunuh bakteri dengan cara menghambat sintesis dinding sel bakteri (Jack, et
al, 1995; Fimland, et al, 2002; Quadri, 2002; dalam Evelina, 2012)
Pemakaian bakteriosin komersial sebagai pengawet sudah dilakukan di
beberapa negara dan diaplikasikan pada beberapa jenis makanan. Bakteriosin
dapat diproduksi oleh Lactococcus, Lactobacillus, dan Pediococcus yang diisolasi
dari berbagai bahan makanan, misalnya nisin diproduksi oleh Lactococcus lactis,
pediosin AcH dihasilkan oleh Pediococcus acidilactic. Beberapa kelebihan
bakteriosin sehingga potensial digunakan sebagai pengawet yaitu :
1. Bukan bahan toksik dan mudah mengalami degradasi oleh enzim
proteolitik karena merupakan senyawa protein.
2. Tidak membahayakan mikroflora usus karena mudah dicarna oleh
enzim saluran pencernaan.
3. Dapat mengurangi penggunaan bahan kimia sebagai pengawet
pangan.
4. Stabil terhadap pH dan suhu yang cukup luas sehingga tahan terhadap
proses pengolahan yang melibatkan asam dan basa, serta kondisi
panas dan dingin (Cleveland, et al., 2001 dalam Usmiati dan Marwati,
2007).
Berdasarkan sifat kimia, struktur, dan fungsinya, bakteriosin dibagi
menjadi empat kelompok. Bakteriosin kelas I memiliki ciri – ciri yaitu
mempunyai berat molekul lebih kecil dari 5 kDa, mengandung lanthionine dan β
– methyl lanthionine. Kelompok ini dibagi lagi menjadi dua tipe, yaitu tipe A dan
tipe B berdasarkan struktur kimia dan aktivitas antimikrobanya. Tipe A berbentuk
ulir, bermuatan positif dan aktivitasnya berhubungan dengan pembentukan pori
6
pada membran sel. Contoh dari tipe ini adalah, nisin dan lacticin (Lactococcus
Isolat bakteri Escherichia coli ATCC 25922 yang telah disegarkan,
dibiakan pada media EMBA dengan metode streak for single colony untuk
memperoleh koloni tunggal yang terpisah. Koloni tunggal diambil kemudian
dimasukan kedalam masing-masing 5 ml media LB dan diinkubasi 24 jam.
Kemudian dibuat stok patogen dengan menginokulasikan bakteri yang telah
18
dibiakkan pada media LB ke media NA agar miring dan diinkubasi pada suhu
37oC selama 24 jam.
1.6.2. Penelitian Tahap II adalah Uji Konfirmasi Isolat BAL dari Air Susu Ibu dan Bakteri Patogen Escherichia coli ATCC 25922.
Penelitian tahap kedua ini dilakukan untuk mengetahui karakterisasi fisik
dari BAL dan bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922. Hal yang dilakukan
antara lain :
a. Pewarnaan Gram dan Pengamatan Bentuk (Harrigan dan McCance, 1998 dalam Puspawati dan Nociantri, 2012).
Isolat bakteri dihapuskan pada kaca objek yang bersih dan difiksasi ± 20
cm di atas nyala api bunsen. Preparat ditetesi dengan pewarna kristal violet,
didiamkan selama 1 menit dan dicuci menggunakan air mengalir dalam keadaan
terbalik dan dikeringkan. Preparat ditetesi dengan larutan lugol dan didiamkan
selama 2 menit, selanjutnya dibilas dengan air mengalir kemudian dikeringkan
dengan kertas tisu. Preparat ditetesi dengan etanol 95% dan didiamkan selama 10-
20 detik. Sediaan dicuci lagi dengan air dalam keadaan terbalik. Selanjutnya
diwarnai dengan safranin selama 10-20 menit. Sediaan dicuci lagi dengan air dan
kelebihan air dihilangkan dengan menggunakan kertas hisap tanpa menggosok
sediaan. Lalu diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000x dan
digunakan minyak imersi.
Uji gram positif jika sel berwarna ungu dan gram negatif jika sel berwarna
merah. Dimana, bakteri asam laktat pada pewarnaan gram akan menunjukkan
warna ungu karena tergolong bakteri gram positif. Sedangkan bakteri patogen
Escherichia coli ATCC 25922 akan menunjukkan warna merah karena tergolong
bakteri gram negatif.
19
b. Uji Katalase (Harrigan dan McCance, 1998 dalam Puspawati dan Nociantri, 2012).Isolat bakteri asam laktat dari ASI diambil satu ose, kemudian dioleskan
pada gelas obyek yang telah diberi alkohol. Gelas benda ditetesi 2 tetes larutan
H2O2 10%. Diamati terbentuknya gelembung gas pada preparat. Uji katalase
positif ditandai dengan adanya gelembung gas oksigen yang dihasilkan dari
degradasi H2O2 oleh enzim katalase. Dimana, bakteri asam laktat akan
menunjukkan hasil negatif pada uji katalase ini.
1.6.3. Penelitian Tahap III adalah Produksi Bakteriosin dengan Variasi Waktu Inkubasi.
Penelitian tahap ketiga dilakukan untuk mengetahui waktu optimum
produksi bakteriosin dan daya penghambatan SBS yang mengandung bakteriosin
terhadap bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922. Hal yang dilakukan
antara lain :
a. Produksi Bakteriosin dari BAL dengan Variasi Waktu Inkubasi (Juniartati, 2011).
Isolat BAL dari working culture dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang
berisi MRS broth masing-masing sebanyak 5 mL dan diinkubasi selama 24 jam.
Selanjutnya, diambil masing-masing 1000 μL suspensi bakteri yang telah tumbuh
dan diinokulasi ke dalam 5 buah tabung reaksi yang masing-masing telah berisi
9ml MRS broth kemudian diinkubasi selama 12, 24, 36, 48, dan 60 jam pada suhu
370C. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama ± 15 menit.
Supernatan Bebas Sel (SBS) hasil sentrifugasi kemudian dinetralkan dengan
NaOH 0,1% dan dipanaskan dengan suhu 100oC selama 15 menit. Tujuan
penetralan adalah untuk menghilangkan asam-asam organik, sedangkan tujuan
20
proses pemanasan adalah untuk menghilangkan H2O2, CO2, dan diasetil. Sehingga
yang diperoleh hanya SBS yang mengandung bakteriosin.
b. Uji Aktivitas Antimikrobial SBS yang mengandung Bakteriosin Isolat BAL dengan Variasi Waktu Inkubasi terhadap Escherichia coli (Juniartati, 2011).
Bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922 dalam stok NA agar miring
kemudian diinokulasi ke dalam media lactosa broth dan diinkubasi selama 24
jam. Bakteri patogen uji sebanyak 100 µL disebar menggunakan hoky
streak/batang bengkok ke dalam cawan petri yang berisi media NA yang
sebelumnya telah disterilisasi dan telah memadat. Setelah ± 15 menit, media
tersebut kemudian dilubangi dengan pipet Pasteur. Lubang tersebut kemudian
diisi dengan SBS yang telah dinetralkan dan dipanaskan sebanyak 20 μL dan
diinkubasi pada suhu 37ºC selama ± 24 jam. Zona bening yang terbentuk dengan
berbagai variasi waktu inkubasi dari masing-masing isolat BAL diamati dan
diukur. Zona bening yang terbentuk menunjukan daya penghambatan bakteriosin
terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922.
1.6.4. Penelitian Tahap IV adalah Isolasi Bakteriosin
Penelitian pada tahap keempat dilakukan pada isolat BAL yang
menunjukkan hasil positif dan penghambatan terbesar terhadap bakteri patogen
Escherichia coli ATCC 25922 pada SBS netral yang dipanaskan. Isolasi
bakteriosin ini dilakukan dengan pengendapan SBS menggunakan garam
ammonium sulfat. Setelah diisolasi, dilakukan kembali pengujian aktivitas
bakteriosin terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 25922 untuk mengetahui
daya hambat bakteriosin yang telah diisolasi terhadap bakteri Eschericia coli
ATCC 25922. Hal yang dilakukan pada tahap ini antara lain :
21
a. Isolasi Bakteriosin (Juniartati, 2011).
Isolasi bakteriosin dilakukan pada isolat BAL yang menunjukkan hasil
positif dan penghambatan terbesar terhadap bakteri patogen Escherichia coli
ATCC 25922 pada SBS netral yang dipanaskan. Isolasi ini dilakukan dengan
pengendapan menggunakan garam ammonium sulfat.
Tahapan ini diawali dengan sentrifugasi bakteri yang telah diinokulasi ke
dalam MRS broth kemudian diinkubasi selama waktu terbaik yang telah diperoleh
dengan kecepatan 3000 rpm selama ± 15 menit. Tiap 1 mL SBS dipindahkan ke
dalam effendorf, dipanaskan selama ± 15 menit pada suhu 100ºC kemudian
didiamkan selama 10 menit. Ke dalam SBS tadi ditambahkan amonium sulfat
sebanyak 0,52 gram dan divortex hingga homogen. SBS yang telah tercampur
homogen dengan ammonium sulfat disimpan selama 24 jam pada suhu 5oC dan
disentrifugasi kembali dengan kecepatan 15.000 rpm selama ± 30 menit pada suhu
4oC. SBS hasil sentrifugasi kemudian dibuang dan filtrat yang diperoleh dibilas
dengan air steril. Air steril hasil bilasan dibuang, kemudian filtrat ditambah
dengan air steril kembali sebanyak 50 µL dan divortex hingga homogen. Larutan
bakteriosin tersebut digunakan untuk uji antimikroba terhadap bakteri patogen
Escherichia coli ATCC 25922.
b. Uji Aktivitas Antimikrobial Bakteriosin Isolat BAL dengan Variasi Waktu Inkubasi terhadap Escherichia coli ATCC 25922 (Juniartati, 2011).
Bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25922 dalam stok NA agar miring
kemudian diinokulasi ke dalam media lactosa broth dan diinkubasi selama 24
jam. Bakteri patogen uji sebanyak 100 µL disebar menggunakan swab steril ke
dalam cawan petri yang berisi media NA yang sebelumnya telah disterilisasi dan
22
telah memadat. Setelah ± 15 menit, media tersebut kemudian dilubangi dengan
pipet Pasteur. Lubang tersebut kemudian diisi dengan dengan larutan bakteriosin
yang telah diisolasi dari SBS netral yang dipanaskan sebanyak 20 μL dan
diinkubasi pada suhu 37ºC selama ± 24 jam. Zona bening yang terbentuk dengan
berbagai variasi waktu inkubasi dari masing-masing isolat BAL diamati dan