Aleksandra Plotta 15 listopada 2016 Badanie genotoksyczności substancji aktywnych testem Amesa
AGENDA
1. Substancje aktywne.
2. Genotoksyczność.
3. Testy służące do wykrywania genotoksyczności.
4. Test Amesa.
5. Wady i zalety.
htt
p:/
/od
kry
wcy.p
l/g
id,1
5139499,p
ag
e,8
,tit
le,O
rgan
izm
-w-l
iczb
ach
,ga
leri
azd
jecie
.htm
l
2. Substancje aktywne
Wytyczna ICH M7 odnośnie wykrywania i kontroli DNA-reaktywnych (mutagennych) zanieczyszczeń w środkach
farmaceutycznych w celu ograniczenia ryzyka karcenogennego.
EMA/CHMP/ICH/83812/2013
1. Substancje aktywne
Grupy substancji o wysokim potencjale TTC*
- aflatoxin-like,
- N-nitroso compounds,
- azoxy compounds
TTC – próg zagrożenia toksykologicznego
1.5 mcg/dzień/osobę = teoretyczne zagrożenie rakowe z 1 na 105 w trakcie życiowej ekspozycji
Odnosi się to do mutagennych zanieczyszczeń w farmaceutykach przeznaczonych do leczenia długoterminowego (> 10 lat).
Bazując na wytycznej ICH M7
2. Genotoksyczność
Genotoksyczność- szerokie pojęcie odnoszące się do wszelakich szkodliwychzmian w materiale genetycznym, niezależnie od mechanizmu jakim zmianajest indukowana.
GENOTOKSYCZNOŚĆ ≠ KARCENOGENNOŚĆ
htt
p:/
/ww
w.m
uta
cje
ge
nety
czn
e.p
l/
3. Testy służące do wykrywania genotoksyczności
1. Test Umu (Szczep testowy TA1535/pSK1002 posiada zwielokrotniony plazmid pSK1002).
2. Klasyczny Test Amesa (metoda płytkowa).
3. Test Amesa II (metoda mikropłytkowa).
4. Test wykorzystujący szczepy bakteryjne Vibrio harvey (nadaje się do oznaczania mutagenności czwartorzedowych soli amoniowych).
Większość testów do badania genotoksyczności opiera się na podwalinach klasycznej metody Amesa ( lata 70. XX wieku ), jednak powstaje szereg udogodnień i usprawnień metody (np. wprowadzenie mikropłytki)
4. Test Amesa
ZAŁOŻENIA TESTU
1. Test badający siłę mutagenności danej substancji.
2. Wykorzystujący auksotroficzne szczepy bakteryjne z wprowadzoną mutacją punktową w operonie danego aminokwasu.
3. Wykorzystujący szczepy z mutacją ramki odczytu bądź substytucją par zasad.
4. Wykorzystujący aktywację metaboliczną z wykorzystaniem homogenatu ssaczej wątroby, w celu sprawdzenia czy związek pod wpływem aktywacji nie przekształca się w mutagenne pochodne.
4. Test Amesa
Indicator
medium
Test sample, controls
Bacterial stock
-80ºC
Overnight
culture
Assay preparation
37ºC, 11-15 h
250 rpm
Exposure cultures
24-well plate
37ºC, 90 min, 250 rpm
(E.Coli +S9: 20 min)
Bacterial culture
-/+ S9-mix
Exposure Medium
C-
D1
D2
D3
D4
D5
D6
C+
TAxxx
384-well plates
37oC
48 h
A
B
C
D
C-
D1
D2
D3
D4
D5
D6
C+
Transfer to 24-well plate
A
B
C
D
C-
D1
D2
D3
D4
D5
D6
C+
C- C- D4D4
D1D1
D2D2
D3D3
D5D5
D6 D6
C+ C+
Transfer
4. Test Amesa
Punkty krytyczne:
1. Transport.
2. Hodowla całonocna.
3. Dodanie substancji badanej.
4. Transfer z płytki 24 - dołkowej na 384 - dołkową.
5. Stężenie 2-aminoantracenu (2 – AA) w kontroli pozytywnej.
htt
ps:/
/ww
w.b
rita
nnic
a.c
om
/scie
nce/S
alm
onella
-typhim
urium
4. Test Amesa
Dzień I- Założenie hodowli całonocnej
Warunki inkubacji:37°C, 200 rpm, 14-16 hnatlenienie
Zamrażarka -70°C
1
2
3
4
4. Test Amesa
DZIEŃ II
5. PRZENIESIENIE HODOWLI PO EKSPOZYCJI Z PŁYTKI 24-DOŁKOWEJ DO PŁYTEK 384-DOŁKOWYCH