Bacilus Subtilis Sobre Clavibacter

UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA DE AGRONOMÍA

“Evaluación in vitro del control de Bacillus sp. sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis”

MEMORIA DE TÍTULO FERNANDO E. FLORES ROJAS

TALCA-CHILE 2004

UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA DE AGRONOMÍA

“Evaluación in vitro del control de Bacillus sp. sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis”

Por

FERNANDO ENRIQUE FLORES ROJAS

MEMORIA DE TÍTULO

Presentada a la Universidad de Talca como

Parte de los requisitos para optar al título de

INGENIERO AGRÓNOMO

TALCA – CHILE 2004

APROBACIÓN: Profesor Guía Ing. Agr. M.Sc. Ph. D. Mauricio Lolas Caneo

Profesor Escuela de Agronomía

Facultad de Ciencias Agrarias

Universidad de Talca

Profesor Informante Ing. Agr. M.Sc. Ph. D. Claudio Sandoval Briones

Profesor Escuela de Agronomía

Facultad de Ciencias Agrarias

Universidad de Talca

Fecha presentación Defensa Memoria: 23 de Abril de 2004

RESUMEN

El objetivo general del presente trabajo consistió en evaluar el efecto como controlador biológico de

Bacillus sp. sobre el agente causal de cancro bacteriano en tomate (Clavibacter michiganensis

subsp. michiganensis). Para ello se analizó el efecto de tres cepas nativas de Bacillus sp.

recolectadas de diferentes partes de la región del Maule; las cepas utilizadas se rotularon con los

siguientes códigos 40-1A, 102-3 y 115-1.Se realizaron ensayos para determinar el tiempo de

incubación para tres cepas nativas de Bacillus sp. en la que se logra la mayor actividad

biocontroladora sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Los tiempos de incubación

probados fueron 3, 6 ,24 y 48 horas. Los resultados de este ensayo arrojaron que la mayor

actividad biocontroladora se presentó a las 24 horas; la cepa nativa de Bacillus sp. mas destacada

y con mayor inhibición sobre Clavibacter fue la cepa 102-3.También se elaboró una curva de

crecimiento para cada cepa nativa de Bacillus sp. y Clavibacter; para ello se realizó conteos en una

cámara de Neubauer en 5 tiempos diferentes de incubación a las 3, 6, 24, 48 y 72 horas. Con estos

datos se hizo la curva de crecimiento, donde Clavibacter presentó una mayor población que las

cepas nativas de Bacillus sp., y entre las cepas nativas de Bacillus sp. la de mayor población fue

102-3. El crecimiento exponencial de todas las poblaciones tanto de Clavibacter como de Bacillus

sp. se presentó entre las 6 y 24 horas de incubación. Finalmente se procedió a determinar y

comparar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de las tres cepas nativas de Bacillus sp. y

Serenade® sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Al se evaluar las tres cepas

nativas de Bacillus sp. con 24 horas de incubación y el producto comercial Serenade®, la CMI para

Serenade® se alcanzó a la concentración 107 Bacillus/ml y para el caso de las cepas evaluadas

ésta fue a la concentración 105 Bacillus/ml; la cepa mas destacada y que logró una control

significativamente mayor a las demás fue 102-3.Este estudio contribuirá a desarrollar nuevas

alternativas de control de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis por medio del uso de

cepas nativas de Bacillus sp., las cuales se perfilan como una buena opción para el manejo de esta

enfermedad.

Palabras claves: control biológico – Bacillus - Clavibacter - cancro bacteriano

ABSTRACT

The efficacy as biocontrol agent of different native strains of Bacillus sp. on bacterial canker of

tomatoes (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) was determined under in-vitro

conditions. Therefore, native strains 40-1A, 102-3 and 115-1, isolated from different localities of the

VII Region of Chile, were incubated in nutrient broth for 3, 6, 24 and 48 h, in order to know when

they were most active against the pathogen. So, 50 µl of biocontrol agent suspension were

deposited in 5 mm wells made in agar plates grown with the pathogenic bacterium and after 24 h,

the inhibition halo was registered and compared among them. Bacillus sp. native strain 102-3

shown a significantly high activity against C. michiganensis. This excellent activity was

demonstrated again when the minimal inhibitory concentration (MIC) was estimated for each native

strain, resulting in only 105 cfu ml

-1 compared to the 10

7 cfu ml

-1 of the commercial product

Serenade®. Then, this study suggests that this native strain of Bacillus could be used in a

preventive programme against C. michiganensis subsp. michiganensis in tomatoes.

ÍNDICE

Página

1. INTRODUCCIÓN 1

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 3

2.1 Antecedentes generales del cultivo de tomate 3

2.2 Enfermedades del tomate 3

2.2.1 Enfermedades de origen biótico 4

2.3 Antecedentes generales Cáncer bacteriano del tomate causado por Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis

5

2.3.1 Organismo Causal 5

2.3.2 Ciclo y epidemiología de la enfermedad 6

2.3.3 Control del cáncer bacteriano en tomate 7

2.4 Control biológico 9

2.5 Antecedentes del control de patógenos con Bacillus subtilis 11

2.5.1 Mecanismo de acción 13

3. MATERIALES Y MÉTODOS 14

3.1 Material bacteriano a utilizar 14

3.2 Determinación del tiempo de incubación para tres cepas de Bacillus sp. que logra la

mayor actividad biocontroladora sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

14

3.2.1 Diseño experimental 16

3.3 Determinación de la curva de crecimiento de Bacillus sp. y Clavibacter michiganensis

subsp. michiganensis

16

3.4 Determinación y comparación de la CMI de tres cepas Bacillus sp. sobre Clavibacter


17

3.4.1 Diseño experimental y análisis de datos 18

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 19



19

4.2 Determinación de la curva de crecimiento de Bacillus sp. y Clavibacter michiganensis

subsp. michiganensis

21

4.3 Determinación y comparación de la CMI para Bacillus sp. sobre Clavibacter


23

5. CONCLUSIONES 26

6. BIBLIOGRAFÍA 27

ÍNDICE DE FIGURAS

Página CAPITULO III

Figura 3.1 Esquema del ensayo in vitro para determinar en las cepas de Bacillus sp. el

tiempo de incubación óptimo, en cuanto a inhibición del crecimiento de Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis.

15

Figura 3.2 Esquema del ensayo in vitro utilizado para determinar para tres cepas de

Bacillus sp. y Serenade® la concentración mínima inhibitoria (CMI) sobre Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis, en medio de cultivo agar nutritivo.

18

CAPITULO IV

Figura 4.1 Halo de inhibición sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis de

tres cepas nativas de Bacillus sp. en diferentes tiempos de incubación.

19

Figura 4.2 Comparación del halo de inhibición de las cepas nativas de Bacillus sp. con

24 horas de crecimiento sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

20

Figura 4.3 Curvas de crecimiento de las cepas nativas de Bacillus sp. (40-1A, 102-3 y

115-1) y el patógeno (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis).

21

Figura 4.4 Halo de inhibición de cepas nativas de Bacillus sp. y Serenade® a distintas

diluciones, sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

23

Figura 4.5 Comparación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cepas nativas

de Bacillus sp. sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

24

1.- INTRODUCCIÓN

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (sin. Corynebacterium michiganense)

agente causal de cáncer o cancro bacteriano en tomate (Lycopersicum esculentum), está

presente en muchas partes del mundo y produce pérdidas importantes en producción y

superficie del cultivo (Agrios, 1993). Esta enfermedad se caracteriza por su severidad de

ataque tanto al aire libre como en invernadero, siendo específica del tomate, la cual si tiene las

condiciones favorables puede llegar a destruir completamente las plantaciones (Besoain,

1994).

El tomate (Lycopersicum esculentum) es la hortaliza mas importante, en cuanto a

superficie se refiere, cultivada en el país. Su fruto es utilizado tanto para el consumo en fresco

como industrial. En la temporada 1999-2000 la superficie cultivada de esta especie alcanzó las

21.756 hectáreas, de las cuales un 45,1% se encuentran en la VII región (ODEPA 2003).

Las alternativas para el control de enfermedades bacterianas son más bien reducidas y

la mayoría de ellas se basan en prácticas de manejo cultural, al no existir disponibilidad de

productos químicos en el mercado con el que se logre un buen control. Por otra parte, durante

los últimos años se ha observado una tendencia a un manejo mas integrado de enfermedades

bacterianas con lo que ha adquirido mayor importancia el uso de controladores biológicos.

Uno de estos controladores biológicos son Bacillus sp. los cuales han sido evaluados

como eficientes controladores de patógenos de importancia agrícola. De acuerdo a esto, podría

constituirse en una alternativa eficiente para reducir la incidencia de enfermedades como

cancro bacteriano en tomate producida por Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,

enfermedad considerada de importancia primaria en el cultivo.

De acuerdo a lo anterior, el presente trabajo de investigación plantea como objetivo

general, determinar el efecto como controlador biológico de Bacillus sp. sobre el agente causal

de cancro bacteriano en tomate (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis).

Como objetivos específicos se señalan:

- Determinar el efecto inhibitorio de cepas nativas de Bacillus sp. en el control de

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

- Determinar el tiempo de incubación para la mayor actividad de Bacillus sp. sobre el

control de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

- Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cepas nativas de Bacillus sp.

sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis y compararlas con la cepa

comercial de Bacillus subtilis (Serenade®).

1

2.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Antecedentes generales del cultivo de tomate

El tomate (Lycopersicum esculentum) es una planta dicotiledonea, perteneciente a la

familia de las solanáceas (Nuez ,1995). Es nativo del área del Ecuador-Bolivia-Perú, en los Andes

de América del sur, y su hábitat natural corresponde a una estrecha franja costera que se extiende

desde el Ecuador (0º latitud) hasta el norte de Chile (30º latitud Sur), entre el océano Pacifico y la

Cordillera de los Andes. El tomate una vez domesticado fue llevado a Europa, Asia y

posteriormente a América del Norte. Esta especie ha sido seleccionada intensivamente y es el

resultado de un largo trabajo humano. Los cultivares de frutos carnosos en su mayoría han sido

desarrollados en los últimos 50 años en Europa y en los Estados Unidos de Norteamérica

(Izquierdo et al., 1992).

Los principales países productores de tomate son China, Estados Unidos, Turquía, Egipto,

India e Italia, de los cuales el mayor productor es China, el cual el año 2002 alcanzó una

producción de 25.466.211 toneladas (FAO, 2002).

El tomate se ha transformado en el cultivo hortícola de mayor importancia económica en

Chile. En la actualidad se cultivan casi 23.000 ha al año, de las cuales casi el 60% se destina a la

agroindustria para pastas y pulpas, jugos, enlatados, salsas y otros productos que son en mayoría

destinados a mercados externos. El 40% restante se dedica a la producción de tomate fresco; se

estima que casi 2.300 ha del total se producen en invernaderos. El cultivo se realiza desde la I a la

XII Regiones pero se concentra en las Regiones V, VI y VII (Krarup y Konar, 2003).

2.2 Enfermedades del tomate

El tomate es muy sensible al ataque de enfermedades y plagas. La incidencia y la

severidad del ataque va a estar en función del tipo de patógeno o plaga que esté atacando al

cultivo, las condiciones de clima y de suelo de la localidad y principalmente de la susceptibilidad del

cultivar utilizado (Izquierdo et al., 1992).

2

Las enfermedades del tomate se convierten en el factor limitante de la producción. Hay

casi 200 enfermedades conocidas de esta especie, con diversas causas y etiologías. El control de

estas enfermedades implica: el uso de cultivares resistentes; evitar que el patógeno entre en

contacto con la planta; la extirpación que considera la eliminación del patógeno después de

establecido en el área que ocupa el cultivo. Así, se busca un control integrado de las enfermedades

(Jones et al., 1993).

2.2.1 Enfermedades de origen biótico

Son aquellas causadas por bacterias, hongos, virus y nematodos fitopatógenos. Para que

una enfermedad se desarrolle debe haber un huésped susceptible, un patógeno virulento, y un

ambiente apropiado para el desarrollo de la enfermedad (Jones et al., 1993).

Entre las bacterias que provocan enfermedades en tomate están Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis agente causal de cancro bacteriano en tomate; Pseudomonas

syringae pv. tomato responsable de la peca bacteriana y Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

agente causal de mancha bacteriana (Blancard, 1990). Dentro de los hongos se encuentran

Alternaria sp. y Botrytis sp., los cuales son los principales agentes causales de problemas

fitosanitarios de tomate en Chile. También se puede nombrar Phytophthora infestans que causa

tizón tardío. El virus más importante presente en Chile que afecta al cultivo es el Virus del Mosaico

del Tabaco (Tobacco Mosaic Virus - TMV) (Izquierdo et al., 1992).

En cuanto a nematodos el de mayor acción en el cultivo es Meloidogyne spp. que ataca

las raíces provocando agallas, nódulos o tumores, reduciendo en forma importante la actividad de

éstos (Bravo y Aldunate., 1988).

3

2.3 Antecedentes generales del cáncer bacteriano del tomate causado por Clavibacter


Este patógeno fue descrito por primera vez en el año 1909, por Edwin F. Smith sobre

tomates bajo invernadero en Grand Rapids, en el estado de Michigan, Estados Unidos. La

denominó en una primera instancia como enfermedad de Grand Rapids, pero más tarde le dio el

nombre de marchitez bacteriana. A esta enfermedad se le dio importancia hacia 1926 cuando

produjo daños importantes en algunas zonas de Estados Unidos, y en los años siguientes se

extendió por el mundo ocasionando grandes perdidas en producción (Aguirre, 1965).

2.3.1 Organismo Causal

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis es una bacteria Gram-positiva, aeróbica,

perteneciente a los Actinomycetes, que no forma esporas. Los informes sobre motilidad y

encapsulación son variados, pero en general la bacteria no presenta estas características. Las

células pueden ser de diferentes formas dependiendo de las condiciones de crecimiento

(pleomorficas, cocoidales, etc.) La reproducción es caracterizada por la división “snapping” o

“encajarse a presión”, la cual da como resultado los arreglos en V y en forma de Y de las células.

La taxonomía de este género se basa en gran parte en la presencia del ácido 2,4-diamino-butírico

en los peptidoglicanos de la pared celular. Además, los ácidos grasos de la célula son en su

mayoría saturados de cadenas largas, con 15-17 átomos del carbono. Sin embargo, un compuesto

característico para esta subespecie es que posee un ácido graso no saturado, el ácido

pentadecenoico. Las colonias en agar son de color amarillo característico y alcanzan un diámetro

de 2-3 mm en 5 días. Estas son lisas y tienen márgenes enteros y una consistencia butirosa.

(Jones et al., 1993).

4

2.3.2 Ciclo y epidemiología de la enfermedad

Las fuentes de inoculo para esta enfermedad incluyen residuos de planta infectadas en el

suelo, malezas, estacas de madera contaminadas, y semillas. Otras vías son por medio de agua,

equipo contaminado, y trabajadores (Jones et al., 1993).

Las bacterias invernan en o sobre las semillas y, en algunas áreas, en los restos de las

plantas depositadas en el suelo. Las infecciones primarias pueden deberse a la propagación de

esas bacterias desde las semillas hasta los cotiledones u hojas, pero la mayoría de las veces se

debe a la penetración de dichas bacterias a través de heridas en las raíces, tallos, hojas y frutos.

Las bacterias son llevadas hasta ellos a través de la manipulación de estos órganos, la cual tiene

lugar durante el trasplante, aunque también son diseminadas por el agua del suelo o la lluvia

acarreada por el viento. Una vez que se encuentran dentro de la planta, las bacterias llegan al

sistema vascular y se desplazan y propagan principalmente en los tejidos del floema. La bacteria

también invade los vasos espirales, y se mueven a través de ellos y llegan al floema, medula y

corteza, donde forman grandes cavidades que originan cancros (Agrios, 1993).

La propagación puede ser por la lluvia y el riego por aspersión. En cultivos sin suelo esta

se puede transmitir a través de la solución nutritiva, pero en especial la propagación de la

enfermedad se ve favorecida en las labores de poda y deshoje, que da lugar a una distribución en

línea bastante característica.

Las condiciones optimas de desarrollo son de 18 – 24 ºC con más de un 80 % de

humedad. Como la mayoría de las bacterias se ve favorecida por periodos climáticos húmedos.

Las plantas muy vigorosas, después de un aporte excesivo de nitrógeno, serían mas sensibles

(Blancard, 1990).

Uno de los síntomas mas frecuentes de esta enfermedad es la perdida de turgencia de

porciones internerviales de los foliolos que rápidamente se desecan. En el interior de los tallos se

aprecia un amarillamiento de los tejidos medulares en contacto con los vasos; tejidos que

comienzan a necrosar rápidamente, al tiempo que se forman oquedades en la medula. Estos

síntomas sistémicos pueden no ser únicos. Pequeñas pústulas grises o negras sobre hojas, tallos y

5

frutos pueden hacerse visibles como consecuencia de las penetraciones bacterianas por estomas

y/o heridas (Nuez, 1995).

Las bacterias invaden los tallos resultando en la muerte de foliolos, hojas enteras y ramas

completas. Si el ataque se produce cuando la planta es pequeña, ella puede morir. Las heridas

causadas en las raíces, al trasplantar a raíz desnuda favorecen considerablemente la enfermedad

(Bravo y Aldunate, 1988).

2.3.3 Control del cáncer bacteriano en tomate

Una vez que la planta de tomate esta infectada en el campo o invernadero, no existe un

tratamiento curativo satisfactorio o efectivo, ya que al expresarse los síntomas la planta por lo

general muere. De ahí que todas las medidas o estrategias de control son de carácter preventivo,

es decir se deben tomar previo a la infección (Besoain, 1994).

Es fundamental tomar las precauciones para evitar su ataque u ocurrencia, para lo cual se

debe recurrir a un conjunto de medidas de higiene, como el lavado y desinfección de las manos y

de los equipos al trabajar con las plantas, en forma habitual; así como efectuar labores en forma

cuidadosa y prolija.

Las principales medidas de control son la utilización de semillas sanas, no

trasplantar a raíz desnuda sino que utilizando contenedores para no dañar la raíz, no realizar

plantaciones en áreas infectadas, rotar con gramíneas y eliminar del cultivo las plantas con

síntomas de la enfermedad (Izquierdo et al., 1992).

Para el control integrado de esta enfermedad se debe partir con una semilla sana y si no

existen antecedentes que aseguren esto, se debe recurrir a la aplicación de un tratamiento

erradicante a esta (se ha usado fermentación con la pulpa, agua caliente, ácido clorhídrico,

hipoclorito de sodio). Durante esta etapa no es aconsejable el uso de antibióticos, evitando de este

modo “desgastarlos” o producir problemas de resistencia con aplicaciones posteriores. Igualmente

se debe evitar manipular excesivamente las plantas, como tampoco resulta aconsejable rebajarlas,

ya que este manejo deja tejido vascular expuesto.

6

En los primeros meses del cultivo se deben proteger las plantas con bactericidas, rotando

los productos, o combinando productos con distintos modos de acción, realizando aplicaciones

frecuentes, ya que esta es una etapa critica en donde la bacteria se multiplica con facilidad y se

producen infecciones sistémicas. Los síntomas pueden aparecer hasta 90 días después de

producida la infección.

Luego, durante la etapa de mayor intervención manual del cultivo, se debe evitar realizar

podas y desbrotes en días con alta humedad relativa, y efectuar aplicaciones preventivas

inmediatamente después de realizada esta labor. En los primeros focos de esta enfermedad, se

tendrá que erradicar las plantas infectadas que presenten los primeros síntomas, para disminuir al

máximo las infecciones secundarias. En el caso de los invernaderos, una vez terminado el cultivo

se deben extraer todos los restos de las plantas, evitando de este modo que la bacteria pueda

sobrevivir asociada a restos de él. En plantaciones al aire libre, se recomienda incorporar

debidamente los rastrojos, y en el caso de haber habido un ataque severo, se recomienda realizar

una rotación de al menos dos años con cultivos no pertenecientes a la familia de las solanáceas

(tomate, papa, pimentón, ají, berenjena, etc.) (Besoain, 1994).

Para el tratamiento químico existen varios productos, especialmente preventivos, pero con

algún poder curativo según el grado de ataque y oportunidad de aplicación. Estos van desde los

derivados de cobre hasta los antibióticos. Los derivados de cobre actúan sobre varios puntos del

metabolismo de la bacteria; mientras los antibióticos son específicos en su modo de acción, lo cual

puede conllevar a una resistencia del patógeno a éstos. Esta situación podrá variar zonal o

predialmente incluso, según la virulencia de los ataques o de la presión de las aplicaciones

químicas.

Por otra parte, hay que considerar que el uso de los derivados del cobre tiene limitaciones

en el momento de floración, ya que se pueden presentar problemas de abortos de flores en la

planta. Esto se acentúa en el caso de los oxicloruros más que en los cuprosos (Rev. E y A agrícola,

1993).

7

2.4 Control biológico

El control biológico es el uso de elementos de la naturaleza en la regulación de

poblaciones de especies dañinas al hombre, como son las plagas y enfermedades de la

agricultura, las malezas y los desperdicios. Los fundamentos de este tipo de control son aquellos

que regulan los ciclos naturales de las poblaciones, las relaciones biológicas y abióticas entre

especies, y las relaciones ecológicas, donde se trata de promover el restablecimiento del equilibrio

natural de un ecosistema, roto por la intervención humana.

En la agricultura existe un sin número de plagas que interfieren el eficiente

aprovechamiento de los recursos naturales a través de cultivos anuales, perennes y animales.

Estas plagas son de diferente origen, siendo las principales derivadas de insectos, arácnidos,

pájaros y malezas perjudiciales al hombre. Sólo en Chile se estima que existen más de 400

especies de insectos que son plagas de la agricultura, gran parte de ellas de origen foráneo. El

control biológico es un método de control de plagas insectiles, ácaros, microorganismos y malezas

que utiliza organismos vivos entomófagos (parasitoides y depredadores), entomopatógenos (virus,

bacterias, hongos, etc.) y fitófagos para controlarlos o regularlos. El uso del control de insectos con

insectos es el ejemplo más conocido en nuestros días, sin embargo, en épocas recientes se trata

de controlar insectos plaga con microorganismos que les causan enfermedades mortales, por

medio de hongos, virus, bacterias, protozoos y otros. En otros casos los patógenos son utilizados

como bioinsecticidas.

Se han encontrado interesantes perspectivas para el control de nemátodos .El Centro

Internacional de la Papa, ha confirmado la eficacia del hongo Paecylomyces lilacinus como control

biológico del nematodo del nudo (Meloidogyne spp.) que causa daños a la papa y tomates.

El control biológico se inicia en Chile en 1903, cuando los agricultores del Valle de Quillota,

con funcionarios del Ministerio de Agricultura introducen enemigos naturales para controlar los

pulgones y la conchuela negra del olivo. Desde 1903 se han introducido a nuestro país 91 especies

de enemigos naturales; estas especies han sido traídas desde Alemania, Brasil, Canadá,

Checoslovaquia, Francia, India, Irán, Israel, Perú, Uruguay, Estados Unidos y Sudáfrica.

8

Las perspectivas del control biológico se basan en que es un mecanismo dinámico

continuo y permanente. Existe un programa activo de largo plazo, que estudia las diferentes plagas

de los cultivos y fruticultura, analizando su biología y ecología, buscando mecanismos eficientes de

frenar su desarrollo. Esta metodología de control de plagas es un elemento natural activo que se

complementa con acciones culturales y de manejo de los cultivos y aplicaciones específicas de

pesticidas selectivos que controlan la plaga, pero no afectan a los enemigos naturales,

conformando lo que se llama control integrado de plagas (Ortiz, 1983).

El control biológico de enfermedades microbianas de plantas normalmente implica el uso

de microorganismos específicos, antagonistas del patógeno, limitando así la iniciación y

propagación de la enfermedad.

Una de las grandes ventajas del control biológico es que con frecuencia los agentes de

biocontrol están dotados de propiedades similares al patógeno, entre las que cabe destacar las de

multiplicación y dispersión. Pueden actuar a varios niveles en el ciclo de la enfermedad,

interfiriendo la supervivencia del patógeno en el ambiente externo, el desarrollo del patógeno sobre

la superficie del hospedador, la entrada del patógeno en el hospedador, y la transmisión del

patógeno entre los hospedadores; incluso el antagonista puede competir con el patógeno dentro

del tejido del hospedador. En realidad se trata de un aprovechamiento de ciertos principios

ecológicos como la competencia y el antagonismo que rigen los procesos de interacción entre

seres vivos.

Una desventaja es que debido a que los agentes de control biológico son seres vivos, su

colonización y multiplicación está interferida por el uso de muchos productos fitosanitarios,

especialmente de los antibacterianos, así como de algunos fungicidas y herbicidas.

Entre los sistemas de control que se han ensayado cabe resaltar los basados en el

antagonismo o en la competencia. Los sistemas basados en el antagonismo se aprovechan de la

capacidad de producción de bacteriocinas o antibióticos por algunos microorganismos que afectan

negativamente al desarrollo de la bacteria fitopatógena.

Se ha comprobado que la inoculación de las semillas con el agente antagonista del

patógeno produce efectos beneficiosos sobre el crecimiento de la planta. La población inoculada

que se establece sobre la semilla no deja progresar la invasión del potencial del microorganismo

9

patógeno que llega a la planta. Un ejemplo claro es el de algunas cepas de Pseudomonas

fluorescens y Pseudomonas putida que se inoculan en semillas de girasol para protegerlas frente a

la marchitez producida por Sclerotinia sclerotium.

Además, se puede enfocar el control biológico no sólo sobre las plantas en crecimiento

como en el caso anterior, sino también en la producción vegetal almacenada para evitar

enfermedades postcosecha.

El avance en los estudios de biocontrol, no sólo permite usar en campo las cepas

bacterianas que tienen la capacidad de dificultar el desarrollo del patógeno y así disminuir la

incidencia de enfermedades. En la actualidad se tiende a emplear como agentes de biocontrol

productos secundarios del metabolismo microbiano (toxinas, antibióticos, bacteriocinas), como en

el caso de algunas especies de Pseudomonas que producen metabolitos antifúngicos, tales como

la pirrolnitrina, 2,4-diacetilfloroglucinol, piocianina y el ácido fenacín-1-carboxílico. Se ha

demostrado que algunos de estos productos, no sólo tienen actividad antifúngica y antibacteriana,

sino también actividad herbicida y antivírica.

A diferencia del control químico, en el control biológico, los efectos sobre el patógeno son

más específicos y además, sus repercusiones sobre el medioambiente son menores por la

biodegradabilidad de estas moléculas. En este sentido, las bacterias productoras de toxinas se han

revelado también como un agente de gran potencial en el biocontrol de microorganismos

fitopatógenos (hongos y bacterias) (Durán y Cazorla, 2003).

2.5 Antecedentes del control de patógenos con Bacillus subtilis

Con el objetivo de determinar si las aplicaciones al suelo de Bacillus subtilis mejoran el

control de Fusarium oxysporum en arveja china y determinar la rentabilidad de estas prácticas, se

realizó un ensayo en el verano de 1995-96, en Guatemala. El trabajo se efectuó en un terreno con

antecedentes de la presencia de este patógeno. Se evaluaron 3 dosis (1.7, 2.5, y 3.4 kg/ha de

Kodiac, producto comercial a base de B. subtilis) en 1 y 2 aplicaciones del suelo. Además un

tratamiento de Kodiac a la semilla (1 libra/100 libras de semilla). Se evaluó incidencia de Fusarium

oxysporum; rendimiento experimental, costos de producción y rentabilidad.

10

Los tratamientos con menor porcentaje de incidencia de Fusarium oxysporum fueron el de

3.4 kg/ha de Bacillus subtilis aplicado al suelo en 2 ocasiones con 9.6% de incidencia y el de

Bacillus subtilis aplicado a la semilla con 11.2% de incidencia. Ambos fueron estadísticamente

iguales y superiores al resto.

Con la aplicación de 3.4 kg/ha de B. subtilis en 2 aplicaciones se obtuvo el mejor

rendimiento (6.56 tm/ha), seguido de los tratamientos con 2 aplicaciones de B. subtilis (1.7 kg/ha y

2.5 kg/ha de B. subtilis al suelo) con 6.7 tm/ha y 5.42 tm/ha respectivamente.

El tratamiento más rentable fue el de 1.7 kg/ha de B. subtilis en 2 aplicaciones con 17.42%

de rentabilidad seguido del tratamiento con 3.4 kg/ha de B. subtilis al suelo (2 aplicaciones) con

16.60%. El resto de los tratamientos presentaron rentabilidades sumamente bajas de 9.14% a -

7.76%.

Se concluye que las aplicaciones de Bacillus subtilis al suelo mejoran el control de

Fusarium oxysporum, pero incrementan fuertemente los costos de producción. Se recomienda su

uso aplicado al suelo, en suelos muy infestados por el patógeno (Solís, 1996).

Virgen y García (1990) obtuvieron una reducción en la incidencia de Fusarium oxysporum f.

sp. niveum, en plantas de sandía (Citrullus vulgaris), mediante el tratamiento de la semilla con

Bacillus subtilis (1.6 x 104 bacterias g

-1 de semilla). Virgen-Calleros et al. (1996) lograron en papa

(Solanum tuberosum) cierto control de Rhizoctonia solani con la aplicación de Bacillus subtilis

(Zabaleta-Mejía, 2000).

También hay antecedentes donde se determinó el efecto de Bacillus spp sobre la

germinación y el desarrollo de semillas de tomate infectadas con Fusarium oxysporium var.

cubensis (Brada et al., 1995).

Su efecto benéfico cuando se aplica junto a las semillas o en forma individual no se debe

exclusivamente al antagonismo con los patógenos sino que influye positivamente en la

germinación, desarrollo y rendimiento del cultivo debido a la producción de sustancias promotoras

del crecimiento y al mejoramiento de la nutrición de las plantas.

Con respecto a B.subtilis, se ha estudiado la liberación de compuestos con propiedades

antifúngicas como la subtilina y otros antibióticos de la familia de las Iturinas (Fernández, O., 2001).

11

2.5.1 Mecanismo de acción

Las bacterias como Bacillus subtilis al ser habitantes comunes en el suelo se establecen

por sí solas en la rizosfera del cultivo tratado y colonizan el sistema radical, compitiendo con los

organismos que la atacan y por lo tanto suprimen enfermedades causadas por patógenos como

Fusarium spp. y Rhizoctonia spp.; es decir su mecanismo de acción en este caso es por

competencia. Bacillus subtilis también es una bacteria eficaz contra varios hongos patógenos, ya

que es capaz de producir un antibiótico, llamado iturin, el cual es particularmente activo contra el

hongo, Sclerotina fruticola, y también se ha probado para el control del hongo patógeno,

Verticillium (Anónimo, 2002).

1

3.- MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Material bacteriano utilizado

El aislado utilizado de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (C.m.m.) fue

proporcionado por el Laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Agronomía de la Universidad

Católica de Valparaíso. Este organismo fue inicialmente aislado desde plantas de tomate

(Lycopersicum esculentum) infectadas con este patógeno. También para este estudio se utilizaron

diferentes cepas nativas de aislados de Bacillus sp. que se obtuvieron de muestras de suelo

recolectado de distintas zonas de la VII Región, en la cordillera, valle central y costa. Las cepas

utilizadas se les asignó un número para su mejor reconocimiento en el ensayo, donde la cepa

40-1A proviene del sector del muelle de Constitución; la cepa 102-3 del sector de Laguna Torca y

la cepa 115-1 del sector de Vilches alto (Enladrillado).

Todas las cepas estudiadas pertenecen a la colección realizada a través del proyecto FIA

PI-C-2002-1-A-84: Evaluación de cepas nativas de la bacteria Bacillus subtilis en el biocontrol de

enfermedades bacterianas de cultivos hortofrutícolas de importancia regional.



Para realizar este experimento, cada cepa nativa de Bacillus sp., se inoculó en un tubo con

6 ml de caldo nutritivo (CN). Luego estos fueron colocados en agitación permanente a 20°C,

obteniéndose posteriormente de ellos una alícuota en cuatro tiempos diferentes de incubación

(3, 6, 24 y 48 horas).

El patógeno Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis se sembró en un matraz

conteniendo 200 ml de medio de cultivo líquido, dejándose crecer en agitación constante por 24

horas a 20°C. Una vez cumplido este tiempo, sobre placas Petri con 30 ml de agar nutriente, se

agregó 1 ml del cultivo de la bacteria patógena (Clavibacter), el que fue esparcido

homogéneamente sobre la placa. Después de 30 minutos se retiró el sobrenadante y se procedió a

2

realizar orificios en el agar con un sacabocado de 5 mm, en un número de tres por placa Petri

(Figura 3.1). En cada uno de éstos, se agregó 50 µl del cultivo de las cepas de Bacillus sp.

incubados por 3, 6, 24 y 48 horas. Luego las placas, fueron colocadas a 4ºC por 2 horas

Posteriormente todas las placas se incubaron en una estufa a una temperatura constante de 25ºC,

midiendo el halo de inhibición a las 48 horas después de la inoculación, cabe destacar que los

halos de inhibición no presentaron un diámetro uniforme, por lo que se debió sacar un promedio de

cada uno de ellos.

Con este ensayo se logró determinar el tiempo de crecimiento en el que las diferentes

cepas de Bacillus sp. eran más activas sobre el patógeno.

Figura 3.1 Esquema del ensayo in vitro para determinar en las cepas de Bacillus sp. el tiempo de incubación óptimo, en cuanto a inhibición del crecimiento de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

Clavibacter

michiganensis

Subsp. michiganensis

Cepa 40-1A

Cepa 115-1

Cepa 102-3

3

3.2.1 Diseño experimental

Los tratamientos en este ensayo se ordenaron en un diseño completamente al azar (DCA),

donde cada unidad experimental correspondió a cada uno de los orificios (tres por placa petri)

realizados en la placa petri con agar nutritivo. El ensayo constó de tres tratamientos cada uno con

12 repeticiones.

Los datos obtenidos de las distintas mediciones en cada tiempo de incubación por

separado, fueron sometidos a un análisis de varianza (ANDEVA), y posteriormente se procedió

a separar sus medias por medio del test LSD (p ≤ 0,05).

3.3 Determinación de la curva de crecimiento de Bacillus sp. y Clavibacter


La determinación fue llevada a cabo en tubos con 6 ml de caldo nutritivo, los cuales se

sembraron tanto con las cepas 40-1A, 102-3 y 115-1, como con el patógeno, en tubos de ensayo

independientes. Posteriormente estos tubos fueron colocados en agitación permanente a 20ºC.

Luego se procedió a sacar una alícuota de cada tubo a las 3, 6, 24, 48 y 72 horas de incubación,

y con la ayuda de una cámara de Neubauer se procedió a hacer el conteo bacterial. Los valores

obtenidos a partir del conteo realizado con la cámara, fueron ingresados a la siguiente formula para

estimar el número de bacterias/ml:

Formula 1

Nº Bacterias Bacterias / ml = 0,0025 mm

2 *0,1*1000

Con los resultados obtenidos desde la formula se elaboraron las curvas de crecimiento

para cada una de las cepas nativas de Bacillus sp. y Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis.

4

3.4 Determinación y comparación de la CMI de tres cepas Bacillus sp. sobre Clavibacter


La actividad antimicrobiana se puede medir y comparar determinando la cantidad mas

pequeña del agente que se necesita para inhibir el crecimiento del organismo a controlar. A este

valor se le conoce con el nombre de concentración mínima inhibitoria (CMI) (Brock, et al., 1999). El

procedimiento utilizado en este ensayo para determinar la CMI fue el método de difusión en agar.

De esta forma, el patógeno fue inoculado en un matraz con 200 ml de medio de cultivo

líquido, dejándose crecer en agitación constante por 24 horas a 20ºC. Luego se sembró en forma

uniforme 1 ml de este cultivo en una placa petri conteniendo 30 ml de agar nutritivo. Después de

30 minutos se eliminó el excedente y se procedió a realizar seis orificios de 5 mm de diámetro con

un sacabocado. En estos se añadió cantidades conocidas del agente antimicrobiano (50 µl), que

en este experimento correspondió a tres diferentes cepas de Bacillus sp., mas un producto

comercial en base a la cepa QST 713 de Bacillus subtilis (Serenade®, Moviagro). Además se

incluyó un testigo con solo agua destilada. En el caso del producto comercial Serenade® su

concentración inicial fue de 5 x109 Bacillus/ml la cual debió ser ajustada a una concentración de 10

8

Bacillus/ml para igualarla con las concentraciones iniciales de las cepas nativas de Bacillus sp..

Cada cepa nativa de Bacillus sp. se inoculó en un tubo con 10 ml de caldo nutritivo (CN) y

fueron colocados en agitación permanente a 20ºC por 24 horas. Una vez que las cepas nativas

cumplieron 24 horas de crecimiento se procedió a preparar las diferentes diluciones. Tanto las

cepas de Bacillus sp., como Serenade®, en las distintas concentraciones fueron colocadas en

cantidad de 50 µl en los orificios hechos en el agar nutritivo. Se ocuparon placas separadas para

cada cepa, al igual que para Serenade®, cada una con seis orificios en que se evaluaron cinco

diferentes diluciones más un testigo. El ensayo constó de doce repeticiones para cada tratamiento

(Figura 3.2).

Una vez que las placas fueron inoculadas con las diferentes diluciones de las cepas de

Bacillus sp. y del producto comercial Serenade®, estas fueron colocadas a 4ºC por 2 horas

Posteriormente todas las placas se incubaron en una estufa a una temperatura constante de 25ºC,

midiendo el halo de inhibición a las 48 horas después de la inoculación, cabe destacar que los

5

halos de inhibición no presentaron un diámetro uniforme, por lo que se debió sacar un promedio de

cada uno de ellos.

Figura 3.2 Esquema del ensayo in vitro utilizado para determinar para tres cepas de Bacillus sp. y Serenade® la concentración mínima inhibitoria (CMI) sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, en medio de cultivo agar nutritivo.

3.4.1 Diseño experimental y análisis de datos Los tratamientos a evaluar en este ensayo se ordenaron en un diseño completamente al

azar (DCA), donde cada unidad experimental correspondió a cada uno de los orificios (seis por

placa petri). El ensayo consto de cuatro tratamientos más un testigo, cada uno con 12 repeticiones.

Los datos obtenidos de las distintas mediciones fueron sometidos a un análisis de

varianza (ANDEVA), y posteriormente se procedió a la separación de medias por

medio del test de LSD (p≤0.05).

Clavibacter

michiganensis

Subsp. michiganensis

Bacillus sp. 108

(sin diluir)

Bacillus sp. 107

Bacillus sp. 105 Bacillus sp. 10

6

Bacillus sp. 104

Agua estéril (testigo)

1

4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN



Los resultados de este ensayo son fundamentales dentro del estudio ya que a partir de

ellos se pudo determinar el tiempo en el cual las diferentes cepas nativas de Bacillus sp.

alcanzaron su mayor control sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

0

10

20

30

40

50

3 6 24 48

Tiempo de incubación (horas)

Halo inhibición (mm)

40-1A 102-3 115-1

Figura 4.1 Halo de inhibición sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis de tres cepas nativas de Bacillus sp. en diferentes tiempos de incubación.

Las cepas nativas de Bacillus sp. utilizadas demostraron tener un efecto en el control de

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Figura 4.1). Todas ellas luego de seis horas de

crecimiento, mostraron ya inhibición sobre el patógeno. A las 24 horas de incubación se alcanzó el

máximo halo de inhibición sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, siendo la cepa

mas destacada la 102-3, logrando un halo inhibitorio de 44,3 mm, seguida de la cepa 115-1 con 34

mm. La que mostró el menor efecto fue 40-1A con 29,2 mm de halo inhibitorio. A las 48 horas las

tres cepas redujeron su control y las diferencias entre ellas se hicieron menores.

2

En estudios realizados por Casanova (2002) en el control in vitro de Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis con diferentes cepas de Pseudomonas spp. se obtuvieron

resultados positivos, logrando halos inhibitorios en varias de las cepas analizadas, sin embargo al

comparar estos resultados con los obtenidos en este ensayo en Bacillus sp. presenta un efecto

controlador mas importante, con lo que se puede concluir que estas cepas nativas podrían

constituir una buena alternativa para el control biológico de Clavibacter.

Con los resultados anteriores se efectuó una separación de medias de los halos obtenidos

a las 24 horas, con las tres cepas evaluadas. En este análisis estadístico se encontraron

diferencias altamente significativas entre ellas, donde la cepa 102-3 es la que logró

significativamente el mejor control sobre el patógeno, seguida de 115-1 y luego 40-1A. (Figura 4.2).

a

b

c

0

10

20

30

40

50


24


102-3 115-1 40.1A

Figura 4.2 Comparación del halo de inhibición de las cepas nativas de Bacillus sp. con 24 horas de crecimiento sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

3

4.2 Determinación de la curva de crecimiento de Bacillus sp. y Clavibacter


Al realizar el conteo de Bacillus sp. y el patógeno en cinco diferentes tiempos de

incubación, se elaboró una curva que coincidió con la curva de crecimiento bacteriano descrita

tanto para las cepas nativas de Bacillus sp. como para el patógeno Clavibacter michiganensis

subsp. michiganensis. La población del patógeno fue siempre mayor que la de las tres cepas

nativas de Bacillus sp.. En el caso de estos últimos la que presentó una mayor población fue la

102-3, mientras que en las cepas 40-1A y 115-1, sus poblaciones fueron bastante similares

(Figura 4.3).

1

2

3

4

5

6

7

3 6 24 48 72


108 Bacterias / ml

40-1A 102-3 115-1 Cmm

Figura 4.3 Curvas de crecimiento de las cepas nativas de Bacillus sp. (40-1A, 102-3 y 115-1) y el patógeno (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis).

La curva de crecimiento bacteriano puede dividirse en distintas fases: fase lag o latencia,

fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. La fase de latencia en este caso abarcó entre

las 3 y 6 horas desde inicio de incubación. Entre las 6 y 24 horas se observó la fase de mayor

crecimiento, llamada fase de crecimiento exponencial, alcanzando a las 24 horas su máxima

4

capacidad de crecimiento. Según los autores Brock y Madigan (1991), lo anterior es una

consecuencia del hecho de que cada célula se divide para formar dos células, cada unas de las

cuales también se divide para formar dos células más y así sucesivamente. En general, las

bacterias tienen una mayor rapidez de crecimiento comparada con otros microorganismos. Esta

fase de crecimiento exponencial se ve afectada por la composición del medio de cultivo, la

temperatura, entre otros. La fase de muerte de la población bacteriana se empezó a producir

posterior a las 24 horas de incubación, la fase estacionaria no se ve representada en el grafico.

Brock y Madigan (1991) afirman que en la fase estacionaria no existe crecimiento, generalmente

debido al agotamiento de nutrientes indispensables o también por algún producto de desecho del

metabolismo bacteriano liberado al medio, el cual llega a un nivel en que es inhibidor, cesando el

crecimiento exponencial. Aunque no hay crecimiento en la fase estacionaria, muchas de las

funciones pueden continuar, incluyendo el metabolismo energético y algunos procesos

biosintéticos. Sí la incubación continúa después de que una población alcanza la fase estacionaria,

las células pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero lo más probable es que mueran. Si

esto último ocurre, la población se encuentra en la fase de muerte.

Finalmente cabe señalar que el tiempo de incubación con el que se logró el mayor control

de Bacillus sp. sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, fue también 24 horas,

pudiendo a partir de esto concluir que existe una directa relación entre máximo crecimiento

bacterial de Bacillus sp. y el nivel de control que logró este sobre el patógeno. Esto se corrobora si

comparamos el control logrado a las 6 y 48 horas de incubación donde el biocontrolador logró una

menor inhibición del crecimiento del patógeno, lo que se asociaría a que su población a las 6 horas

es aún muy baja y a las 48 horas esta va decreciendo.

5

4.3 Determinación y comparación de la CMI para Bacillus sp. sobre Clavibacter


Al determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI), que es la cantidad mas pequeña

del agente antimicrobiano que se necesita para inhibir el crecimiento del organismo a controlar, los

resultados obtenidos al probar cinco diluciones diferentes, mas un testigo con agua destilada

estéril, fue que los mayores halos inhibitorios se obtuvieron con la concentración mayor de 108

bacterias/ml para las tres cepas de Bacillus sp., lo que era esperable ya que correspondió a la

concentración sin diluir. La CMI para las tres cepas nativas de Bacillus sp. se alcanzó a la

concentración 105 Bacillus/ml, mientras que para el producto Serenade® esta estuvo muy por

encima y se logró a la concentración de 107 Bacillus/ml, Con estos resultados de CMI se hace

evidente que las cepas nativas de de Bacillus sp. a bajas concentraciones fueron mas eficaces en

el control de Clavibacter que el producto comercial Serenade®. En el caso del testigo con agua

destilada estéril no presento halo inhibitorio. Para todos los agentes testeados su acción a la

concentración menor de 104 Bacillus/ml fue cero (Figura 4.4).

0

10

20

30

40

50


102-3 115-1 40.1A Serenade®

Bacillus sp./ml

Figura 4.4 Halo de inhibición de cepas nativas de Bacillus sp. y Serenade® a distintas diluciones, sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

108 107 106 105

104

6

Cabe destacar que a la concentración en la cual el producto comercial Serenade® alcanzó

su CMI, su halo de inhibición fue menor a cualquiera de las cepas nativas de Bacillus sp., de lo cual

se puede deducir que a bajas concentraciones las cepas nativas de Bacillus sp.. se comportan de

mejor manera ante el patógeno a controlar.

Con los datos obtenidos se procedió a comparar los halos de inhibición para las tres cepas,

a la concentración 105 bacterias/ml, para lo que se realizó una separación de medias. De acuerdo

a estos, existen diferencias altamente significativas entre ellas. La cepa que tuvo estadísticamente

el mejor comportamiento para esta concentración fue la 102-3, la cual obtuvo un halo inhibitorio de

28,2 mm. siendo superior a las otras dos cepas, 40-1A fue la que presento una menor inhibición

sobre el patógeno (Figura 4.5).

a

b

c

0

5

10

15

20

25

30

35


10E+5

Bacillus sp./ml

102-3 115-1 40-1A

Figura 4.5 Comparación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cepas nativas de Bacillus sp. sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

Como ya se mencionó, a bajas concentraciones las cepas nativas de Bacillus sp. se

mostraron como un mejor controlador de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis que el

producto comercial Serenade®.

105

7

El obtener resultados positivos en cuanto al control de Clavibacter abre una ventana

alentadora para continuar con estos estudios. Además, como menciona Ortega (1998), en general

los costos y el tiempo involucrados en la formulación de agentes biocontroladores son mucho

menores que los empleados en la obtención de pesticidas químicos, aspecto muy positivo que

motiva y que permite visualizar como una alternativa el control biológico de patógenos vegetales.

Finalmente, es conveniente destacar la poca existencia de literatura mundial respecto a

investigaciones de esta naturaleza, en las que se emplea Bacillus subtilis para el control de

enfermedades causadas por bacterias fitopatógenas. Lo contrario ocurre en el caso de

enfermedades que son causadas por hongos fitopatógenos en donde existe abundante información

respecto a control biológico.

Este estudio contribuirá a desarrollar nuevas alternativas de control de Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis por medio del uso de cepas nativas de Bacillus sp., las cuales

se perfilan como una buena opción para el manejo de esta enfermedad.

5.-CONCLUSIONES

En los diferentes ensayos realizados se logró concluir que las cepas nativas de Bacillus

sp. 102-3, 115-1 y 40-1A son capaces de inhibir el crecimiento de Clavibacter michiganensis

subsp. michiganensis.

El tiempo de incubación en el cual las cepas de Bacillus sp. se encuentran más activas

sobre el patógeno es de 24 horas, tiempo en el cual tanto las cepas como el patógeno se

encuentran en el máximo de su crecimiento exponencial (fase exponencial).

La concentración mínima inhibitoria (CMI) reveló que las cepas nativas de Bacillus sp.

fueron capaces de controlar a Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis a una menor

concentración que el producto comercial Serenade®. De las tres cepas analizadas la de mejor

acción controladora fue la 102-3, la cual se destacó en todos los ensayos practicados.

1

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Bacilus Subtilis Sobre Clavibacter

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