Bachiller en Ingeniería Química (3.314Mb) - UNIVERSIDAD ...

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS EN LA OBTENCIÓN DE 1-FENILETANOL EMPLEANDO COMO

BIOCATALIZADOR Diplogelasinospora grovesii IMI 171018 EN MEDIO ACUOSO”.

TESIS

PARA OPTAR EL TITULO DE:

INGENIERO QUÍMICO

AUTOR:

Br. CARLOS JOHANN FALCÓN JAVE

ASESOR:

Dr. MEDARDO ALBERTO QUEZADA ALVAREZ

TRUJILLO – PERÚ 2012

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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Presidente: Secretario

Dr. Luis Moncada Albitres Dr. José Luis Silva Villanueva

Dr. Alberto Quezada Alvarez

Asesor de Tesis



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III

DEDICATORIA

A mis padres: Adolfo y Diana

que con su amor, educación y ejemplo,

son inspiración de mi desarrollo

y mi superación.

A mis hermanos menores: Elizabeth y Franz

y para que sean perseverantes y

llenos de ímpetu en el alcance de sus metas.

.



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IV

AGRADECIMIENTO

A Dios por guiar mis pasos y por iluminar mi día a día.

A mis padres que me apoyaron en todo el transcurso de mi desarrollo

profesional. Todo gracias a su afecto, educación, trabajo y esfuerzo.

A los docentes de mi facultad, quienes me brindaron su orientación en la

adquisición de conocimientos que afianzaron mi vocación profesional.

Al Dr. Alberto Quezada por su asesoramiento, dedicación, tiempo y gestión en el

desarrollo y cumplimiento de la presente tesis.

Al Dr. José Vicente Sinisterra Gago por sus capacitaciones en sus constantes

visitas a nuestra facultad de Ingeniería Química, por su apoyo e interés mi

formación científica.

Al Ing. Cruz Monzón por su apoyo en los temas de análisis instrumental y

acceso a los equipos de instrumentación.

Al Ing. Wilson Reyes por facilitarnos en un inicio el laboratorio de Investigación

IV, para el desarrollo de las investigaciones respectivas.

Al grupo inicial de investigación: Diana, Pilar, Melva y Gonzalo con quienes

realicé los primeros ensayos para la ejecución de éstas investigaciones.



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ÍNDICE

Pág.

I. INTRODUCCIÓN

1.1. Problemática 2

1.2. La Química y el Desarrollo Sostenible 4

1.3. Química Sostenible 5

1.4. Química Sostenible y Biotecnología Blanca 7

1.5. Biotransformaciones 9

1.5.1. Diferencias entre Fermentación y Biotransformación 10

1.6. Ventajas de las Biotransformaciones 11

1.7. Reacciones de Reducción 13

1.7.1. Regeneración de Coenzima 14

1.8. Enzimas frente aisladas frente a células enteras:

Ventajas y Desventajas 16

1.9. Reducción de Aldehídos y Cetonas usando Células Enteras 18

1.9.1. ADH Dehidrogenasas 20

1.10. Screening de Nuevos Biocatalizadores 22

1.10.1. Screening a partir de banco de genes 22

1.10.2. Screening a partir de enzimas comerciales 22

1.10.3. Screening a partir de colecciones de microorganismos 23

1.11. Metodología de Screening 23

1.12. Diplogelasinospora grovesii 25

II. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

2.1. Objetivos 27

2.1.1. Objetivo General 27

2.1.2. Objetivos Específicos 27

2.2. Plan de Trabajo 28



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III. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. Materiales 30

3.1.1. Materiales para vidrio 30

3.1.2. Materiales de plástico 30

3.1.3. Material Auxiliar 31

3.1.4. Instrumental de laboratorio 32

3.2. Métodos 33

3.2.1. Procedimiento para el Screening Global 33

3.2.1.1. Estado de Colección 33

3.2.1.2. Medios de Cultivo 33

a. Medio de Cultivo para Ascomicetos 34

b. Medio de Cultivo para Bacterias 34

c. Medio de Cultivo para Levaduras 35

3.2.1.3. Preparación del medio sólido de cultivo 35

3.2.1.4. Esterilización de medios de cultivo 35

Reacción test para el screening global 35

3.2.2. Cualificación de los E. de Instrumentación Analítica 36

3.2.2.1. Cualificación de las Balanzas Analíticas 36

3.2.2.2. Cualificación del Espectrofotómetro UV 37

3.2.2.3. Cualificación del HPLC 38

a. Cualificación de la Bomba del HPLC 38

b. Cualificación del Sistema de Inyección 39

c. Cualificación del Detector UV-Visble 40

d. Cualificación de la Columna Cromatográfica 41

3.2.3. Validación y Cualificación del Método de Análisis 43

3.2.3.1. Determinación de la Longitud de Onda Óptima 43

3.2.3.2. Validación del Método de Análisis Cromatográfico 44

3.2.3.3. Obtención de las Curvas de Calibración para

Acetofenona y 1-Feniletanol 45

3.2.3.4. Obtención de las Concentraciones de Acetofenona

y 1-Feniletanol durante la Reacción de Reducción 46

3.2.4. Metodología Experimental para el proceso de

biotransformación con Diplogelasinospora grovesii 48

3.2.4.1. Asentamiento de la Colección 48

3.2.4.2. Crecimiento de ascomiceto Diplogesinospora grovesii 49



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a. Crecimiento de ascomicetos en medio sólido 49

b. Crecimiento de ascomicetos en medio líquido 51

3.2.4.3. Replicación del ascomiceto Diplogesinospora grovesii 52

3.2.4.4. Curva de crecimiento del ascomiceto 53

3.2.4.5. Preparación del Medio de Reacción 54

a. Preparación de la Solución Buffer 54

b. Preparación de la Solución Reacción 55

3.2.5. Estudio Cinético de Bioreducción 57

3.2.5.1. Velocidad inicial de reacción observada (Vo) 58

3.2.5.2. Orden de reacción (n) 61

3.2.5.3. Parámetros cinéticos de reacción 61

a. Conversión 61

b. Rendimiento 62

c. Productividad 62

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1. Cualificación de los Instrumentos Analíticos 64

4.1.1. Cualificación de Balanza Analítica 64

a. Primer Rango de Cualificación: 0 a 1g 65

b. Segundo Rango de Cualificación: 0 a 100g 66

4.1.2. Cualificación de Espetrofotómetro Ultravioleta-Visible 67

a. Absorbancia de Benzoato de Sodio a 236nm 68

b. Absorbancia de Benzoato de Sodio a 254nm 69

c. Absorbancia de Benzoato de Sodio a 270nm 70

4.1.3. Cualificación de Cromatógrafo de Líquidos

Alta Performancia 71

4.1.3.1. Cualificación de la Bomba Cuaternaria 71

a. Cualificación del Canal A 71

b. Cualificación del Canal B 72

c. Cualificación del Canal C 73

d. Cualificación del Canal D 74

4.1.3.2. Cualificación del Sistema de Inyección 74

a. Precisión del Inyector 75

b. Magnitud del efecto memoria (efecto “carryover”) 76

4.1.3.3. Cualificación del Detector UV-Visible 78



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4.1.3.4. Cualificación de la Columna 80

4.2. Validación del Método de Análisis 82

4.2.1. Longitud de Onda Óptima de análisis 82

4.2.2. Validación de Método de Análisis Cromatográfico 83

4.2.3. Curvas de Calibración para Acetofenona y 1-Feniletanol 84

4.3. Proceso de Bioreducción con Diplogelasinospora grovesii 86

4.3.1. Screening Taxonómico 86

4.3.2. Curva de Crecimiento 88

4.3.3. Estudio Cinético 90

4.3.4. Orden de Reacción 95

4.3.5. Parámetros Cinéticos 97

a. Parámetros Cinéticos del sustrato Acetofenona 97

b. Parámetros Cinéticos del producto 1- Feniletanol 97

4.3.6. Productividad de la Biotransformación 99

V. CONCLUSIONES 101

VI. BIBLIOGRAFÍA 104

VII. ANEXOS 108

- Cualificación de la Balanza Sartorious AG Germany CPA 224S

- Cualificación del Equipo Espectrofotómetro UV- visible

Hewlett Packard Mod 8452 A

- Cualificación del Equipo HPLC Agilent 1100 Series.



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XI

RESUMEN

Es patente que las sociedades más avanzadas se han hecho muy

sensibles a todo aquello que pueda afectar la calidad medioambiental

como uno de los indicadores de la calidad de vida. En este contexto la

población señala a la industria química como la principal causante del

deterioro medio ambiental ocurrido en el último siglo, sin embargo, las

investigaciones realizadas en la ciencia química han contribuido a evitar o

a paliar estos males.

En esta tesis se muestran los resultados obtenidos después de un

screening de microorganismos en busca de nuevos biocatalizadores

activos a la reducción de cetonas en medio acuoso. El grupo taxonómico

más activo para la reducción de cetonas catalizadas por células fueron

los ascomicetos y entre ellos el mejor biocatalizador fue

Diplogelasinospora grovesii. La principal ventaja de la utilización de

biocatalizadores es el remplazo de catalizadores tradicionales para el

mismo propósito como metales y boranos, los cuales generan bajas

productividades, contaminación por subproductos que son incompatibles

con el medio ambiente. La actividad reductasa del microorganismo se

evaluó con la reacción test de reducción de la acetofenona. Asimismo se

muestran los resultados cinéticos obtenidos en esta reacción como:

velocidad inicial de reacción, constante especifica de velocidad,

productividad, conversión, rendimiento, etc. Finalmente, resaltar que

todos los análisis para este propósito se realizaron con equipos

cualificados (HPLC, UV-VIS, Balanzas analíticas, etc.) y métodos de

análisis validados.



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XII

ABSTRACT

It is clear that the most advanced societies have become very sensitive to

anything that might affect environmental quality as one of the indicators of

quality of life. In this context the population draws the chemical industry as

the main cause of environmental deterioration occurred in the last century,

however, research in chemical science have helped prevent or alleviate

these evils.

In this thesis the results are displayed after a screening of microorganisms

for new active biocatalysts to the reduction of ketones in aqueous media.

The most active for the reduction of ketones catalyzed by taxonomic

group cells were Ascomycetes and among them the best biocatalyst was

Diplogelasinospora grovesii. The main advantage of the use of

biocatalysts is the replacement of traditional catalysts for the same

purpose as metals and boranes, which generate low yields, contamination

by products that are incompatible with the environment. Reductase activity

of the microorganism was evaluated with the test reaction acetophenone

reduction. initial reaction rate constant specific speed, productivity,

conversion, yield, etc.: also the kinetic results obtained in this reaction as

shown Finally, note that all analyzes were conducted for this purpose with

qualified equipment (HPLC, UV-VIS, analytical balances, etc.) and

validated methods of analysis.



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I. INTRODUCCIÓN

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I. INTRODUCCION



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I. INTRODUCCIÓN

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I. INTRODUCCION

1.1. Problemática

No corren buenos tiempos para la química. Aunque nuestra sociedad

occidental demanda cada vez una mayor cantidad de productos químicos,

la percepción que se tiene de lo químico es, de forma paralela, cada vez

más negativa. Es cierto que el sector químico ha tenido un elevado

crecimiento en la producción de compuestos químicos demandados por una

sociedad cada vez más depredadora de bienes de consumo, y además, las

previsiones indican que este crecimiento continuará en el futuro. Esta

presión incrementa la actividad productiva, pero también aumenta la

actividad contaminante y generadora de residuos molestos, dando lugar a

una imagen sucia de todo aquello que se relaciona con la química.1

En ese sentido desarrollar procesos en el campo de la Química Sostenible

(Green Chemistry & Engineering) hoy en día juega un rol muy importante

toda vez que utiliza un conjunto de principios que reducen o eliminan el uso

y generación de sustancias peligrosas en el diseño, manufactura y

aplicación de los productos químicos, manteniendo la calidad del producto

final y la rentabilidad económica del proceso; lo que lleva implícito, alcanzar

un proceso que sea inocuo en sí mismo y respetuoso con el medio

ambiente.2

La Biotecnología Blanca es un campo emergente dentro de la moderna

Biotecnología, que está implicado en procesos industriales de

producción. Su desarrollo viene determinado por el cumplimiento de las

nuevas normativas de la Unión Europea sobre control del medio ambiente y

producción de bienes y servicios en condiciones sostenibles. La

Biotecnología Blanca se suele definir como la producción de productos de



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I. INTRODUCCIÓN

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alto valor añadido o de servicios, en condiciones sostenibles tanto desde el

punto de vista del empleo de disolventes y de reactivos así como en la

obtención de productos no contaminantes y/o no agresivos con el medio

ambiente, utilizando biocatalizadores no patógenos.3,4,5

Los biocatalizadores (enzimas o células, libres o inmovilizadas) son ahora

instrumentos indispensables para químicos y biotecnólogos, y están siendo

cada vez más empleados en la síntesis asimétrica de productos

farmacéuticos, agroquímicos, vitaminas y fragancias.6,7 La reducción de

cetonas empleando biocatalizadores para obtener alcoholes constituye una

alternativa muy eficiente y atractiva, que opera a condiciones de pH y

temperatura mucho más suaves. La ventaja de las reacciones biocatalíticas

sobre las reacciones químicas tradicionales consiste en que aquellas son

estereoselectivas y pueden realizarse a presión atmosférica y temperatura

ambiente. Dado que muchos procesos biocatalíticos se pueden llevar a

cabo en medio acuoso u orgánico/acuoso empleando disolventes poco

tóxicos, justifica que la biocatálisis sea una de las líneas fundamentales en

el desarrollo de la Química Sostenible. Además, las enzimas y células

microbianas se pueden inmovilizar y reutilizar lo cual rebaja los costes de

producción.8

En el 2002, la producción de alcoholes quirales supuso unas ventas de 7

billones de dólares, estimándose un aumento de hasta 14,9 billones para el

2009.9 Debido a la enorme importancia de este tipo de compuestos en la

síntesis de moléculas bioactivas, la reducción estereoselectiva de cetonas

ha adquirido un enorme interés industrial, y a éste efecto se han descrito

numerosas rutas catalíticas; así, la hidrogenación asimétrica de cetonas

catalizada por metales10 o el empleo de boranos11,12 constituyen procesos

que han sido descritos de manera eficiente a escala industrial; no obstante,

se suelen precisar condiciones poco compatibles con la Química Sostenible

(Green Chemistry & Engineering)13-17, tales como temperaturas elevadas, el



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I. INTRODUCCIÓN

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empleo de disolventes y/o reactivos tóxicos y obtener productos

concomitantes.

En ese sentido, la presente tesis para optar el título de ingeniero químico,

pretende contribuir en la determinación de los parámetros cinéticos en

procesos biocatalíticos para obtener alcoholes a través de biorreducciones

de cetonas en condiciones sostenibles.

1.2. La Química y el Desarrollo Sostenible

Básicamente el término desarrollo sostenible tiene dos implicaciones:

- El uso de recursos naturales a ritmos suficientemente bajos como para

que no se agote el suministro de largo plazo.1,13

- La generación y disipación de los recursos y emisiones a velocidades

suficientemente bajas, de forma que puedan ser asimiladas por el medio

natural. 1,13

Así pues, para poner en práctica mejoras ambientales en el proceso

productivo, no solo se debe centrar el interés en la instalación concreta en

la que se realiza el proceso químico, sino que deben evaluarse los procesos

de forma global, en un amplio escenario temporal, y sobre grandes

dominios territoriales.15

Con esta perspectiva, el reto para el químico es desarrollar nuevos

productos y nuevos procesos de acuerdo con los beneficios del desarrollo

sostenible. Ello requiere una nueva aproximación consistente en la

reducción de la intensidad material y energética utilizada durante las

reacciones químicas, minimizando o eliminando la liberación de sustancias

químicas nocivas para la salud y el medio ambiente, y maximizando el uso

de recursos renovables y la durabilidad de los productos obtenidos.13-17



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I. INTRODUCCIÓN

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1.3. Química Sostenible

Esta rama de la química tiene como objetivo el diseño de compuestos y

procesos químicos que reduzcan o eliminen la generación de sustancias

peligrosas para la salud humana y el medio ambiente, haciendo un uso

sostenible de los recursos. Debe señalarse que, muchas de las acciones

que introduce la química sostenible (química verde) para la mejora

ambiental llevan implícitas unas mejoras económicas (ecoeficiencia) para

los sectores industriales involucrados, de factor positivo para su

implementación.13

Tal como está definida la química sostenible, ésta se centra en el diseño, la

investigación y la implementación de productos y procesos. Es decir, no

sólo su ámbito de acción es el diseño de estructuras moleculares para que

el compuesto no sea tóxico, sino que, además debe incluir todas las

transformaciones a lo largo de la manufactura del producto, las cuales

deberán evitar el uso de sustancias tóxicas, así como tampoco generarlas.13

Los retos de la química sostenible (química verde) se centran en cuatro

ámbitos: los recursos, los residuos, los reactivos, y las reacciones:13-17

1. Recursos: Utilización de recursos materiales y energéticos obtenidos de

fuentes renovables para la obtención de los productos básicos. Uso

eficiente de la energía, a través de un diseño apropiado de las

condiciones de reacción. Desmaterialización, a través del uso de

materiales nanométricos y técnicas que minimicen el uso de materiales,

con el objetivo de conseguir la función demandada por un determinado

material, intentando reducir la cantidad de recursos materiales.13-17

2. Residuos: Maximización de la eficiencia molecular durante las

transformaciones, evitando al máximo la obtención de subproductos y



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I. INTRODUCCIÓN

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residuos que incrementen el coste ambiental y económico del

proceso.13-17

3. Reactivos: Disminución del uso de reactivos, a través de catalizadores

duraderos. Diseño de compuestos químicos inocuos, mediante

manipulación de la estructura molecular y el conocimiento de su

mecanismo de acción toxicológica.13-17

4. Reacciones: Reducción del uso de disolventes por medio de sistemas

reactivos sin disolventes o del uso de disolventes alternativos a los

tradicionales, más fácilmente reciclables o de un menor impacto

ambiental, como por ejemplo, el uso de fluidos supercríticos. O líquidos

iónicos. Aplicación de técnicas analíticas in situ, con el fin de llevar a

cabo un control de las condiciones de reacción a tiempo real.13-17

El desarrollo de la Química Sostenible se basa una serie de principios que

se enumeran a continuación (Mestres, 2003):17

1. Es mejor prevenir la formación de residuos que tratarlos o eliminarlos

tras su formación.

2. Los métodos sintéticos deben ser diseñados para conseguir la máxima

incorporación en el producto final de todas las materias usadas en el

proceso.

3. En tanto sea posible, se deben diseñar metodologías sintéticas para el

uso y la generación de substancias de escasa toxicidad humana y

ambiental.

4. Se deben diseñar productos químicos que, preservando la eficacia de su

función, presenten una toxicidad escasa.

5. Las substancias auxiliares (disolventes, agentes de separación, etc.)

deben resultar innecesarias en lo posible o cuanto menos deben ser

inocuas.

6. Las necesidades energéticas deben ser consideradas en relación a sus

impactos ambientales y económicos, y deben ser minimizadas. Los



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I. INTRODUCCIÓN

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métodos de síntesis deben llevarse a cabo en condiciones de

temperatura ambiente y presión atmosférica.

7. Las materias de partida deber ser renovables y no extinguibles, en la

medida en que esto sea posible técnica y económicamente.

8. La formación innecesaria de derivados (bloqueo de grupos,

protección/desprotección, modificación temporal de propiedades

químicas o físicas debe ser evitada en tanto sea posible.

9. Los reactivos catalíticos deben ser tan selectivos como sea posible.

10. Los productos químicos han de ser diseñados de manera que al final de

su función no persistan en el medio ambiente, sino que se fragmenten

en productos inocuos para el medio ambiente.

11. Se deben desarrollar las metodologías analíticas que permitan el

seguimiento en tiempo real del proceso y el control previo de la posible

formación de substancias peligrosas.

12. Las sustancias y las formas de su uso en un proceso químico deben ser

elegidas de manera que resulte mínima la posibilidad de accidentes

químicos incluyendo emisiones, explosiones e incendios.

1.4. Química Sostenible y Biotecnología Blanca

Anastas P.T y Warner J.C. (1998) definen la Química Sostenible (Green

Chemistry) como la utilización de un conjunto de principios que reducen o

eliminan el uso y generación de sustancias peligrosas en el diseño en el

diseño, manufacturación y aplicación de los productos químicos,

manteniendo la calidad del producto final y la rentabilidad económica del

proceso; esto lleva implícito el alcanzar un proceso que sea inocuo en sí

mismo y respetuoso con el medio ambiente. La aplicación industrial de

estos criterios basados en Química Sostenible se conoce como

Biotecnología Blanca.13 Además, cabe resaltar que mientras la Química

medioambiental tiene como objetivo la remediación, la Química Sostenible



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I. INTRODUCCIÓN

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intenta que no se produzcan daños en el medio ambiente por efecto de la

actividad química.

Los procesos industriales basados en procesos biotecnológicos suelen ser

altamente sostenibles. Así lo reconoce la OCDE en sus publicaciones como

la ya clásica “Biothecnology for clean industrial products & products:

towards industrial sustainability” de 1998, donde hace notar que la

biotecnología es una herramienta poderosa para alcanzar el desarrollo

industrial sostenible. Ello se debe a que muchos de sus desarrollos están

basados en:18

- El uso directo de materias primas obtenidas de fuentes sostenibles.

- La obtención de productos como los polímeros biodegradables, de un

alto valor añadido a partir de aceites vegetales, fibras, hidratos de

carbono, etc.

- La conversión de la biomasa en productos intermedios de síntesis tales

como la glucosa, etanol, etc.

- La potencial producción por semisíntesis de productos agroindustriales o

farmacéuticos.

Existe una estrecha relación entre las Biotransformaciones y la Química

Sostenible debido en concreto a los siguientes puntos fundamentales del

trabajo en Biotecnología:1,13-18

- Minimización de residuos y control de efluentes.

- Simplificación de los procesos de purificación del producto final.

- Obtención de buenos rendimientos.

- Reducción al mínimo de la formación de productos concomitantes.

- Trabajar con disolventes no contaminantes.

- Evitar o reducir al mínimo el riesgo de producción de fuegos,

explosiones o emisiones contaminantes.



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I. INTRODUCCIÓN

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1.5. Biotransformaciones

La aplicación de biotransformaciones catalizadas por células enteras es un

campo emergente que abre un horizonte de nuevas posibilidades para la

aplicación industrial de los biocatalizadores.

En biotransformaciones el uso de enzimas libres como biocatalizadores es

actualmente una metodología sintética plenamente aceptada y validada

para preparar los compuestos homoquirales utilizados en farmacéuticos,

aditivos alimentarios, o la industria de agroquímicos.19

Además, la biocatálisis al emplear células enteras como biocatalizadores en

las aplicaciones comerciales se ha limitado en gran medida a casos

especiales en que el microorganismo contiene la enzima necesaria para

reacciones de una sola etapa o donde la célula es un productor natural de

una sustancia química como el etanol o un producto complejo natural, como

la tetraciclina.19

Esta utilidad reducida se ha asociado con la falta de herramientas

experimentales generales y eficaces para desarrollo de cepas microbianas

para aplicaciones industriales. Sin embargo, los enormes avances en

ingeniería metabólica, la genómica, la metabolómica, la proteómica, la

evolución dirigida, etc., en los últimos años han abierto la puerta a la

creación apropiada de microorganismos con fines industriales.19

Estos avances están a favor de la introducción de procesos con células

enteras llamándose entonces biotecnología blanca. Hoy en día, algunos

procesos industriales están utilizando células enteras como

biocatalizadores, por ejemplo: nicotinamida a partir de 3-cianopiridina



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I. INTRODUCCIÓN

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utilizando Rhodococcus rhodochrous, acrilamida a partir del acrilonitrilo

utilizando R. rhodochrous, entre otros.20

1.5.1. Diferencias entre Fermentación y Biotransformación

Las diferencias más resaltantes entre un proceso fermentativo y una

biotransformación se encuentran descritas de manera sucinta en la

siguiente tabla:

Tabla 1-1. Principales diferencias entre una Fermentación y Biotransformación

FERMENTACION BIOTRANSFORMACION

Reacción

Producto del metabolismo del microorganismo: Existen varios pasos catalíticos en la transformación del sustrato en producto.

Existe un solo paso catalítico en la transformación del sustrato en producto.

Procesos largos. Muchas reacciones. Muchas enzimas.

Procesos acotados catalíticos. Una o pocas reacciones. Una o pocas enzimas.

Sustrato Fuentes de carbono y nitrógeno. Complejo natural.

Producto

La estructura química de los productos no suele ser semejante a la de los sustratos. Productos solo naturales

La estructura química de los productos es semejante a la de los sustratos. Productos naturales y no naturales.

Tolerancia al

producto final

Concentraciones bajas. Concentraciones bajas y altas.

Aislamiento del

producto final

Complejo. Sencillo

Productos secundarios Generalmente muchos. Generalmente pocos.



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1.6. Ventajas de las Biotransformaciones

Entre las principales ventajas que presentan las Biotransformaciones

(Biotecnología) con respecto a los procesos químicos tradicionales

podemos mencionar: 1-19

a) Reduce el número de pasos de síntesis dada la gran selectividad de los

biocatalizadores.

b) Evita la producción de subproductos. Esto es importante en la síntesis

de productos quirales dada la gran estereoselectividad de los

biocatalizadores.

c) Necesitan condiciones suaves de proceso pues los catalizadores

trabajan a temperatura ambiente, presión atmosférica, en medio acuoso

o en disolventes poco contaminantes.

d) Utiliza catalizadores muy activos y lo más selectivo posible, siendo los

biocatalizadores poco contaminantes.

e) Desarrolla metodologías analíticas que permiten el seguimiento en

tiempo real del proceso y el control previo de la posible formación de

substancias peligrosas; por ejemplo los biosensores.

Para mejor ilustración, se tomará como ejemplo la reducción química de

manera regio-, esterero-, o quimioselectiva de una molécula polifuncional,

es decir una molécula con varios grupos funcionales sensibles a reaccionar.

Para eso, a partir de los esquemas 1-1 y 1-2, se hace la comparación de la

reducción química, a través de un proceso químico y otro a través de un

proceso biotecnológico. Como se muestra en la siguiente tabla:



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I. INTRODUCCIÓN

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Tabla 1-2. Cuadro comparativo de los Esquemas 1-1 y 1-2

Reducción Regio-, estereo- o quimioselectiva de una molécula polifuncional

Proceso Químico Proceso Biotecnológico

Aparte de la reducción, necesita de otros 5 pasos más.

Consta de 2 pasos

Necesidad de proteger los otros grupos funcionales

Alta selectividad, no necesitan protegerse los otros grupos funcionales

Catalizadores contaminantes o peligrosos Catalizadores Biológicos

Consumo de disolventes

Trabaja en medios no contaminantes

Disolventes a recuperar Trabaja en condiciones

ambientalmente compatibles Productos concomitantes

Esquema 1-1: Proceso Químico de Reducción Selectiva de un grupo Y en

presencia de otro X sensible a la reducción. Ejemplo X: CHO e Y: C=O.



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Esquema 1-2: Proceso Biotecnológico de Reducción Selectiva de un

grupo Y en presencia de otro X sensible a la reducción. Ejemplo X:

CHO e Y: C=O.

1.7. Reacciones de Reducción

Las enzimas empleadas en reacciones redox son clasificadas en tres

categorías: deshidrogenasas, oxigenasas y oxidasas.21-23. Entre ellos, las

alcohol deshidrogenasas – también llamadas reductasas de carbonilo – han

sido ampliamente utilizadas para la reducción de grupos carbonilo

(aldehídos, cetonas) y las enoatoreductasas (Ver Figura 1-1), empleadas

con frecuencia en la reducción de dobles enlaces carbono-carbono.

Desde que la reducción implica la transformación de un carbono con

hibridación planar sp2 en un átomo tetraédrico sp3, esto va de la mano con

la formación de centros estereogénicos. Por lo contrario, el proceso inverso

correspondiente (por ejemplo la oxidación alcohólica o de

deshidrogenación) conduce a la destrucción de un centro estereogénico,

que generalmente es de uso ilimitado. Las oxidasas, que son responsables

de la transferencia de electrones, han jugado un papel menor en la

biotransformación de compuestos orgánicos no naturales, pero son cada

vez más utilizadas recientemente.6



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Figura 1-1. Reacciones de reducción catalizados por deshidrogenasas.

1.7.1. Regeneración de la Coenzima

La distinción más importante de las enzimas redox, es el requerimiento de

coenzimas redox, los cuales donan o aceptan equivalentes químicos para la

reducción (u oxidación). Para la mayoría de enzimas redox, la nicotinamida

adenina dinucleótido [NAD(H)] y su respectivo fosfato [NADP(H)] son

aproximadamente requeridos en un porcentaje de 80% y 10%

respectivamente. Las Quinona, Flavinas (FMN, FAD) y pirroloquinolina

quinona (PQQ) son encontrados con menor frecuencia.6

Los coenzimas nicotinamidas son parecidos a un “complejo híbrido natural”,

que tienen dos características en común, es decir, son relativamente

moléculas inestables y costosas si se utilizan en cantidades

estequiométricas. Además, éstos no pueden ser reemplazados por otros

sustitutos más económicos creados por el hombre. Como sólo el estado de

oxidación es el que cambia durante la reacción, y el resto de la estructura



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del complejo queda intacta, éstos pueden ser regenerados in situ mediante

una segunda reacción concurrente redox, que les permita entrar

nuevamente al ciclo de la reacción principal.24

El proceso de reducción estereoselectiva de cetonas permite la creación de

alcoholes homoquirales de gran interés como intermedios de síntesis. Al ser

enzimas intracelulares, dependen de una coenzima como NAD(P)H, NADH,

etc. que se consumen en cantidades equimoleculares respecto al substrato

a reducir. Esto implica que la regeneración de la coenzima hace al proceso

económicamente inviable con enzimas libres sin la regeneración del

cofactor (el precio aproximado de un mol de NADH es de 3.000$ USA y el

de un mol de NADPH 25.000$ USA).25

Así como la coenzima es muy costosa en cantidades catalíticas, esto lleva a

buscar una drástica reducción en los costos. La eficiencia de un proceso de

reciclado del cofactor se mide por el número de ciclos que se puede lograr

antes de que una molécula coenzima sea finalmente destruida. Este

reciclado se puede medir como número total de moles de producto formado

por un mol de coenzima durante toda su vida. Como regla general, unos

pocos miles de ciclos (103-104) son suficientes para las reacciones redox a

escala de laboratorio, mientras que para fines técnicos, ésta medida es

altamente deseado en el orden de 105. El impedimento económico para las

reacciones a gran escala es el costo de la coenzima, el cual ha sido

reconocido así por muchos años y gran parte de los esfuerzos en

investigación sobre las alcohol deshidrogenasas se han empleado con el fin

de resolver el problema del reciclado de la coenzima.26-29

La regeneración de la coenzima no es un problema cuando células

microbianas enteras son usadas como biocatalizadores en reacciones

redox. Además, como fuentes no costosas de equivalentes redox, se

pueden emplear ciertos carbohidratos, ya que el microorganismo posee



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todas las enzimas y coenzimas necesarias que se necesiten en su

metabolismo.27

Es por ello que se utilizan células enteras como biocatalizadores ya que

éstas poseen sistemas para la regeneración de la coenzima. El único

problema existente es que dentro de las células suele haber más de una

enzima que cataliza el proceso, obteniéndose en algunos casos bajos

excesos enantioméricos (%e.e.). La reacción se puede representar como se

muestra en la siguiente figura:27

Figura 1-2. Sistema de Reciclado del Cofactor

1.8. Enzimas aisladas frente a células enteras: Ventajas y Desventajas

El estado fisiológico de los biocatalizadores que se utilizan en

Biotransformaciones puede ser muy diverso. La decisión final de utilizar

enzimas aisladas y purificadas, o microorganismos completos (células

enteras) en forma libre depende de varios factores, como son: 2,6

- Tipo de reacción.

- Necesidad o no necesidad de reciclar las coenzimas.

- Escala a la que se quiere desarrollar la biotransformación (mg, g o Kg).

La mayoría de las Biotransformaciones llevadas a cabo por

microorganismos parten de moléculas orgánicas relativamente complejas, y



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utilizan sólo una reacción bioquímica del potencial enzimático del

microorganismo para llegar al producto deseado.

En la siguiente tabla se observa una secuencia de ventajas y desventajas

de usar enzimas aisladas o enzimas enteras: 2,6

Tabla 1-3. Ventajas y Desventajas de usar Sistemas con Enzimas Aisladas vs.

Células Enteras.2,6

Biocatalizador Forma Ventajas Inconvenientes

Enzimas Aisladas

En general

Dispositivo de trabajo simple. Mayor productividad debido a la

elevada tolerancia a concentración de sustrato.

Necesario el reciclaje de la coenzima

Disuelta en agua

Elevadas actividades catalíticas.

Posibles reacciones colaterales. Los sustratos lipófilos son solubles.

Recuperación de la enzima.

Suspendidas en disolventes orgánicos

Fácil de realizar, los sustratos lipófilos son solubles.

Recuperación de la enzima Actividades reducidas

Biocatalizador Forma Ventajas Inconvenientes

Células Enteras

En general

No es necesario el reciclaje de la coenzima.

No se requiere de purificación de la enzima.

Equipamiento caro. Proceso tedioso debido a los elevados volúmenes.

Baja productividad debido a la menor tolerancia a la concentración, baja tolerancia a disolventes orgánicos, reacciones colaterales debidas al

metabolismo incontrolado.

Cultivo en crecimiento Elevadas actividades

Elevada cantidad de biomasa, mayor cantidad de subproductos, difícil

control del proceso

Células en Reposo

Trabajo más fácil. Menor cantidad de

subproductos al estar el metabolismo controlado.

Menores actividades



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1.9. Reducción de Aldehídos y Cetonas usando Células Enteras

En vez del aislamiento de la deshidrogenasa, el cual requiere de una

sofisticada regeneración de la coenzima, se emplean mayormente células

microbianas. Ellas contienen múltiples deshidrogenasas, las cuales están

aptas de aceptar sustratos no naturales, además tienen todas las

coenzimas necesarias y las rutas metabólicas para su regeneración. Por lo

tanto la regeneración o reciclado de la coenzima puede ser omitida ya que

se realiza automáticamente gracias al metabolismo de la célula viva.

Además, fuentes económicamente cómodas de carbono tales como

sacarosa o glucosa pueden ser usados como sustratos auxiliares para

reacciones asimétricas de reducción. Por otro lado, todas las enzimas y

coenzimas están bien protegidas dentro de su entorno celular natural.6

Sin embargo, estas ventajas tienen que ser tomadas en cuenta junto con

algunos inconvenientes importantes:

- La productividad de las conversiones microbianas son generalmente

bajas, ya que la mayoría de los sustratos no naturales son tóxicos para

los organismos vivos, y por lo tanto sólo son toleradas a bajas

concentraciones (0.1-0.3% por volumen aprox.).

- La gran cantidad de biomasa presente en el medio de reacción causa

bajos rendimientos y la recuperación del producto se torna problemático,

sobre todo cuando el producto es almacenada dentro de las células y no

se elimina al medio de reacción. Debido a que solo una menor fracción

(normalmente 0,5-2%) del sustrato auxiliar se utiliza para la

regeneración de la coenzima, la mayor parte se metaboliza, formando

subproductos polares, que a menudo impiden la purificación del

producto. Por lo tanto, el control de la reacción se hace más dificultosa.6



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- Finalmente, es más probable que diferentes cepas de un

microorganismo cuenten con diferentes especificidades, por lo que es

importante usar exactamente el mismo cultivo para obtener resultados

comparables con la literatura.30

La estereoselectividad puede variar en gran medida debido a las siguientes

razones: Por un lado, un sustrato puede ser reducido por una sola vía

oxidorreductasa para dos enantiómeros que tienen valores similares de

energía libre. En otras palabras, el reconocimiento estereogénico permite

un ajuste alternativo del substrato dentro de una sola enzima. Si dos

enzimas compiten para el mismo sustrato, la pureza óptica del producto

está determinada por las velocidades relativas de las reacciones

individuales.30

Las técnicas generales siguientes se pueden aplicar para mejorar la

selectividad de las reacciones de reducción microbiana:

- Modificación del sustrato, por ejemplo, la variación de los grupos

protectores que pueden ser eliminados después de la transformación.32-

34

- La variación de los parámetros metabólicos de inmovilización.35-37

- El uso de células de diferentes edades.38

- La variación de las condiciones de fermentación.39-41

- Selección de microorganismos para obtener las cepas con las

propiedades óptimas.42,43

- La inhibición selectiva de una de las enzimas en competencia.



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El buen nivel de la tecnología de las reducciones de compuestos

carbonílicos, ha permitido su implementación a escalas industriales, y como

se ve hacen uso de células enteras, y tienen el cuidado respectivo en la

regeneración de sus cofactores. Ejemplos representativos son mostrados

en la siguiente figura: 6

Figura 1-3. Bioreducción de Compuestos Carbonílicos de Escala Industrial

1.9.1. ADH Deshidrogenasas

Las Alcohol deshidrogenasas (ADH) son enzimas ubicuas involucradas en

muchos procesos fisiológicos. Algunas de estas contienen Fe (II) para la

activación de la enzima, como es el caso de la ADH de Zymomonas

mobilis.44Otros ADHs no presentan un catión en la enzima, por ejemplo, el

ADH de la Drosophila lebanoniensis.45



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Sin embargo, la mayoría de ADHs tienen muchos iones Zn(II) cerca al sitio

activo. Este es el caso del ADH de la levadura de pan 46, el cual contiene 4

átomos de Zn (II). Estos cationes pueden ser sustituidos por Co (II) después

de un tratamiento con material quelante seguido de la inserción de cobalto.

Estas enzimas catalizan la oxidación/reducción reversible de

alcoholes/aldehídos o cetonas usando NAD+/NADH como el hidruro

aceptor/donor. 45,46 Sólo en pocos casos el NADP(H) ha sido utilizado como

coenzima, por ejemplo el ADH del Clostridium beijerinckii.47El mecanismo

de reacción fue descrito por Theorell y Chanwe en 1951.48

Figura 1-4.Mecanismo de reacción

La etapa que controla la velocidad es la transferencia de hidruro en el

complejo ternario [enzima + co-enzima + compuesto orgánico].En el sitio

activo, la presencia de Ser, Tyr y Lys o Arg es reconocido generalmente

como una maquinaria catalítica fundamental para la etapa de transferencia

de hidruro, ya que el caso del ADH-2 de ratas, usando difracción de rayos X

y modelado molecular ha sido probado por Svensson.49



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1.10. Screening de Nuevos Biocatalizadores

La primera cuestión a decidir es la fuente de las enzimas que vamos a

utilizar en el screening, pudiendo optar entre varias alternativas:

1.10.1. Screening a partir de bancos de genes

El screening en busca de nuevas enzimas a partir de bancos de genes

puede llegar a ser muy satisfactorio. Mediante el establecimiento de bancos

de genes en un pequeño grupo de microorganismos hospedadores

(bacterias como E. coli, o levaduras), sólo se necesita implementar un

limitado número de métodos de propagación de los genes a los organismos

permitiendo una realización sencilla de las técnicas sistemáticas del

screening.

El ADN utilizado para clonar puede proceder de ADN preparado a partir de

cultivos de microorganismos o a partir de microorganismos salvajes. Se

estima que sólo un 1% de los microorganismos existentes en la naturaleza

han sido cultivados en laboratorio.

1.10.2. Screening a partir de enzimas comerciales

Sin duda la forma más rápida y fácil de encontrar un biocatalizador que se

ajuste a nuestras necesidades es localizada en las colecciones de enzimas

comerciales, lo que permite un acceso rápido al biocatalizador en

cantidades suficientes. Existen pocas bibliotecas de enzimas de carácter

comercial, entre las que debemos destacar: Amano, Sigma-Aldrich, Fluka,

Toyobo, Diversa, ThermoGen, Altus Biologics y Roche (anteriormente

Boehringer-Mannheim).



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1.10.3. Screening a partir de colecciones de microorganismos

Desde los orígenes de vida en la Tierra, como primeros habitantes, los

microorganismos han tenido mucho tiempo para desarrollar nuevos genes y

funciones (Wackett y Herschberger, 2000). Los microorganismos se

reproducen mucho más rápidamente que los organismos macroscópicos lo

que favorece que se desarrollen con mayor rapidez nuevas subespecies, es

decir nueva biodiversidad.

La mayoría de enzimas de importancia industrial proceden de especies

microbianas de tipo I o II en la escala de bioseguridad (consideradas en

líneas generales seguras). Entre ellas se incluyen géneros bacterianos

como Bacillus, Pseudomonas, levaduras, especialmente Saccharomyces y

hongos de las clases Ascomycota y Zygomycota.

1.11. Metodología de Screening

Debido a que el número de enzimas y el tamaño de colecciones de

microorganismos van aumentando, los métodos de screening a gran escala

son cada vez más importantes. Estos métodos incluyen el screening a gran

escala automatizado, y los screening consecutivos estructurados de modo

jerárquico. En un screening jerárquico, se realizan varios ensayos que se

combinan en series consecutivas hasta alcanzar, paso a paso, el objetivo

del screening. En primer lugar el screening nos permite seleccionar un

grupo de microorganismos positivos frente a una biotransformación o a la

producción de un metabolito, que pasan al siguiente paso del estudio. Las

pruebas más lentas, caras o complicadas son realizadas al final para

reducir la duración y el número de ensayos. Este tipo de screening es



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rápido, útil y muy efectivo. En este trabajo se realizó un screening jerárquico

de tres fases:

a) Screening primario.- Es rápido y simple. En este tipo de selección se

deben eliminar todos los candidatos negativos y seleccionar los

positivos potenciales. Elimina todos los candidatos que carecen

absolutamente de la actividad deseada, reduciendo en gran medida el

tamaño de la colección objetivo de estudio. Sin embargo, el uso de

sustratos análogos y no el sustrato específico de estudio puede eliminar

positivos potenciales de la reacción de interés.

b) Screening secundario o intermedio.- En este paso se emplean mayor

número de sustratos y sirve para seleccionar los mejores candidatos

que pueden ser considerados como potenciales de la actividad

enzimática en estudio. Este segundo ensayo se realiza con criterios

cuantitativos claros que nos permitan reducir la colección a un número

razonable según la escala del screening específico a realizar a

continuación.

c) Screening específico.- En este paso se ensaya el sustrato específico

para evaluar la actividad enzimática en estudio, así el número de

candidatos es reducido.



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1.12. Diplogelasinospora grovesii.

Diplogelasinospora grovesii es un nuevo hongo filamentoso, el cual muestra

una alta actividad y enantioselectividad en la reducción de algunas cetonas

hidrofóbicas acíclicas o policíclicas.

Estos son hongos filamentosos, que tienen como unidad estructural a las

hifas, que pueden ser simples o ramificadas y estar tabicadas o no. El

crecimiento se produce por alargamiento de las hifas, y da lugar a una

masa filamentosa conocida como micelio. Su reproducción puede ser

asexual o sexual. En la reproducción asexual, a partir del micelio vegetativo

se diferencian hifas aéreas especiales (los conidióforos) que dan lugar a

esporas denominadas conidios. En el ciclo sexual se produce la fusión de

estructuras especializadas, los anteridios y ascogonios, pero sin fusión de

sus núcleos. El crecimiento de los hongos filamentosos dentro de un medio

líquido puede producirse en forma dispersa o como pequeñas colonias

denominadas pellets. La formación de los pellets puede ser debida a la

coagulación de esporas e hifas, o bien al crecimiento de hifas a partir de

una sola espora. Pero, en cualquier caso, es el resultado de la interacción

entre factores de tipo estructural (composición y naturaleza de las cargas de

la pared celular) y ambiental (tipo de nutrientes, relación entre carbono y

nitrógeno del medio, presencia del material particular, concentración de

inóculo, etc.) lo que determina una u otra forma de crecimiento. Además, el

microorganismo se aisla durante un proceso de screening de cepas

microbianas con alta actividad reductasa.2



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2.1. OBJETIVOS De manera tal que existan nuevos métodos de reducción de cetonas, en vez de los métodos comerciales que son incompatibles con el medio ambiente, se propone el uso de las alcohol-deshidrogenasas que poseen los hongos filamentosos como inherentes de su metabolismo, siendo estas reacciones de cinética batch con biocatalizadores de células enteras.

Para lo cual se planteó los siguientes objetivos que se desarrollaron extensamente en la siguiente tesis de pregrado:

2.1.1. Objetivo General

Determinar los principales parámetros cinéticos en la obtención del 1-Feniletanol en medio acuoso empleando Diplogelasinospora grovesii como biocatalizador.

2.1.2. Objetivos Específicos

- Aislar y caracterizar un microorganismo con actividad reductasa.

- Realizar la curva de crecimiento del biocatalizador, para encontrar el tiempo en el cual se encuentra en mejores condiciones para hacer la bioreducción.

- Desarrollar métodos validados de análisis instrumental (HPLC, UV-VIS) para monitorear la reacción de reducción.

- Desarrollar cinéticas de reacción para determinar los principales parámetros cinéticos de la reacción.



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2.2. PLAN DE TRABAJO Para alcanzar todos los objetivos planteados de esta tesis de pregrado, se desarrolló el siguiente plan de trabajo:

2.2.1. Se realizó la bioreducción para obtener 1-feniletanol como reacción test.

2.2.2. Se realizó la cualificación de cada uno de los componentes del

equipo HPLC, comprobando su linealidad, repetitividad, precisión y exactitud.

2.2.3. Se validó el método de análisis de la pareja acetofenona/1-

feniletanol, determinando: columna a utilizar, composición de la fase móvil, flujo (ml / min), longitud de onda (nm), determinado las condiciones óptimas de separación.

2.2.4. Se determinó el límite de cuantificación (LQ) que será muy importante a la hora de seguir la reacción de reducción por HPLC ya que nos indica la mínima conversión detectable.

2.2.5. Se realizó la curva de crecimiento del hongo filamentoso, para lo cual se desarrolló un protocolo de trabajo, desde el cuidado de almacenamiento del microorganismo, crecimiento en medio sólido y en medio líquido.

2.2.6. Se realizó las curvas de cinética de reacción a la reacción de reducción. Y se analizó y calculó los parámetros cinéticos que intervienen en la reacción.



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3.1. MATERIALES

3.1.1. Materiales de Vidrio.

Matraces Erlenmeyer de 100 ml y 250 ml. Marcas: Pirex, Kyntel y LBY Boro 3.3

Fiolas de 25 ml, 50 ml, 100 ml y 250 ml. Marcas: Kyntel y Fortuna

Vasos de Precipitación graduados de 50 ml, 100 ml, 250 ml y 400

ml. Marcas: Pirex, Kyntel y Duran.

Viales encapsulables para cromatografía líquida de 2ml.Marca: Agilent. Color: Ambar

Pipetas de 10 ml y 25 ml. Marcas: Pirex y Qualicolor.

Frascos para medio de cultivo de 250 ml, 500 ml y 1000

ml.Marca: Boeco

Tubos de ensayo de 16*100 mm – MARCA: PYREX Varillas de agitación. Lunas de reloj. Embudos de vidrio de vástago corto de 70 mm de diámetro.

3.1.2. Material de Plástico.

Tubos tipo Falcon de 14 ml.Marca: Fisherbrand

Placas Petri estériles. Marca: Miniplast-ein-shener

Probetas graduadas de 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml y 500 ml

Espátulas.

Puntas para micropipetas azules y amarillas.



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Rackspara viales.

Criotubos.

Porta puntas de micropipeta.

Sacabocados.

3.1.3. Material Auxiliar.

Guantes de látex.

Gafas de seguridad.

Porta objetos.

Asas de siembra metálicas.

Cinta Parafilm.

Filtros para viales de PTFE 0.2 µm.

Cinta para esterilización con vapor.

Tapones. Papel Aluminio.Algodón. Jeringas desechables de 1 ml. Marca: Qualimaxx Mascarillas. Bolsas para eliminación de puntas de pipeta contaminadas.

Bolsas para eliminación de residuos.



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3.1.4. Instrumental de Laboratorio.

Balanza de precisión. Marca: Sartorious AG Germany CPA 224S

Incubadora de agitación orbital de temperatura y RPM controlados.

Incubadora tipo estufa (JSGI – 150 T)

Autoclave JSR. Marca: JSAC-40.

Espectrofotómetro UV–VIS. Marca: HEWLETT 8452A PACKARD DIODE ARRAY

Cromatógrafo líquido de alta resolución. Marca: Agilent 1100 Vortex. Marca: Mixer.

Estufa. Marca: SP

Juego de micropipetas de volumen variable.

Lab Mate+(100-1000 µL) Pipet 4u (20 - 200µL) DragonMed(20 - 200 µL) Microlit(20 - 200 µL) Pipette pump de 10 ml.

Centrifuga.Marca: EBA 20.

Columna Cromatográfica mediterránea C-18 de fase reversa.

Refrigeradoras.Marcas: INRESA Y DAEVOO.

pH-metro portable. Marca: PH-009 (II) ATC.

Termómetro de -10°C hasta 400 °C.

Mechero bunsen.



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3.2. METODOS

3.2.1. Procedimiento para el Screening global

La colección de microorganismos utilizada como punto de partida fue

propuesta por el Dr. José Sinisterra Gago (UCM) y Dr. Alberto Quezada

(UNT), las cuales sonde diferentes grupos taxonómicos (bacterias,

levaduras, y ascomicetos), y de las cuales se seleccionó el microorganismo

apropiado como biocatalizador para la reacción de estudio.

3.2.1.1. Estado de la colección

Las cepas microbianas utilizadas en ésta tesis se encuentran almacenadas

a 5°C en solución de glicerol-agua al 30% v/v. Para ello se colocaron en

cada criotubo 1ml de solución glicerol-agua al 30%v/v y cubitos de medio

sólido que contienen microorganismo que ha crecido previamente en placas

Petri. Se utilizó glicerol por ser no tóxico para las células y por contar a nivel

molecular con espacios intersticiales amplios, generando una mejor

residencia del microorganismo, evitándose problemas de presionamiento

entre ellos.

3.2.1.2. Medios de Cultivo

La elección del medio de cultivo con sales minerales y un balance de

fuentes de carbono y nitrógeno adecuado, proporciona la posibilidad al

microorganismo de poner en marcha toda su maquinaria enzimática

responsable del éxito de nuestra biotransformación. Los microorganismos

crecieron en medios de cultivos recomendados por los papers publicados



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del Servicio Industrial de Biotransformaciones del Parque Científico de

Madrid.2,19,25

De donde se extrajo la composición de cada medio, que fue utilizado para el

crecimiento de los microorganismos:

a. Medio de cultivo para Ascomicetos.

o Medio de cultivo HAGGS (Ajustar a pH = 6.5):

Glicina : 2 g/l

Harina de soja : 6 g/l

Almidón : 20 g/l

Solución elementos traza: 10 ml/l.

Solución Traza : 10 ml/l

Composición de la Solución de elementos traza:

FeSO4.7H2O : 1 g/l

MnSO4.4H2O : 1 g/l

CuCl2 : 0,025 g/l

CaCl2 : 0,10 g/l

H3BO3 : 0,056 g/l

ZnSO4.7H2O : 0,2 g/l

(NH4)6Mo7O24.4H2O : 0,019 g/l.

b. Medio de cultivo para Bacterias.

o Medio LB(Frenken y cols, 1992):

Triptona : 10 g/l

Extracto de levadura : 5 g/l

NaCl : 5 g/l

Tampón KH2PO4 pH= 6.5



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c. Medio de cultivo para Levaduras

o Medio YM:

Extracto de levadura : 3 g/l

Extracto de malta : 3 g/l

Bactopeptona : 5 g/l

Bactodextrona(dextrosa): 10 g/l

3.2.1.3. Preparación del medio sólido de cultivo

Para la preparación de medio sólido, se añadió, a la composición descrita

anteriormente, agar tipo Americano 30 g/l. y se disuelve en agua purificada.

3.2.1.4. Esterilización de medios de cultivo.

Todos éstos medios deben se esterilizaron a 121°C y 1 atm de presión por

20 minutos.

3.2.1.5. Reacción test para el screening global catalizada por

células en condiciones de fermentación

Para evaluar la actividad reductasa de las cepas se seleccionó como

reacción test, la reducción de la acetofenona a 1-feniletanol; por ser una

reacción sencilla y de estudio, que nos permite evaluar de una manera

rápida y precisa la actividad de nuestras cepas y que puede ser analizada

por cromatografía líquida con un detector UV, dada la absorbancia de los

electrones pi deslocalizados de los anillos aromáticos frente a radiación

ultravioleta.



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La concentración inicial de sustrato fue de 10mM, que es lo suficientemente

baja como para permitir el crecimiento de los microorganismos y lo

suficientemente alta para permitir un grado de biotransformación del

sustrato suficiente para su extracción y posterior análisis cromatográfico.

Para llevar a cabo esta reacción se dejó crecer cada microorganismo en

erlenmeyers de 100ml con 20ml de medio de cultivo estéril, durante 48

horas para las bacterias y levaduras, y 72 horas para ascomicetos a 30°C y

200rpm. Luego se adicionó el sustrato hasta una concentración de 10mM.

Después de 72 horas de reacción a las mismas condiciones de agitación y

temperatura se tomó una muestra de 3ml, se centrifugó a 4000 rpm por

15min, se separó la biomasa del medio líquido, se tomó 1ml del medio

líquido, se filtró, y se analizó por cromatografía, para determinar en base a

la conversión de substrato, el mejor microorganismo que sea activo a la

reducción de cetonas.

3.2.2. Cualificación de los Equipos de Instrumentación Analítica.

En la siguiente tesis, se realizó una serie de cualificaciones y validaciones

de los equipos de instrumentación analítica más resaltantes que se usaron,

con la finalidad de tener mejor confiabilidad en precisión y en exactitud de

los datos obtenidos. Se cualificaron los equipos y se validaron sus métodos

de cualificación.

3.2.2.1. Cualificación de las Balanzas Analíticas.

Las mediciones de pesos para la siguiente investigación oscilan entre 0 a

100g., es por ello, que se realizó éste análisis en dos rangos de

cualificación:



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- 1er. Rango de Cualificación: 0 a 10g.

- 2da. Rango de Cualificación: 0 a 100g.

Todas las mediciones se realizaron con agua destilada. Y para los

siguientes rangos, se tomaron los siguientes puntos intermedios:

- 1er. Rango de Cualificación: 0 a 10g.: 0g., 0.125g., 0.25g., 0.5g., 0.75g.,

1g. Con 4 repeticiones por cada medición realizada.

- 2da. Rango de Cualificación: 0 a 100g.: 0g., 25g., 50g., 75g., 100g. Con

4 repeticiones por cada medición realizada.

Con las rectas obtenidas de Peso Real vs. Peso Teórico, observamos la

variación de las pendientes al repetir cada cierto tiempo el mismo método

de cualificación, y así llevar un control de la exactitud y precisión de la

balanza analítica.

3.2.2.2. Cualificación del Espectrofotómetro UV.

Se preparó una solución madre de 0.528 mM de Benzoato de Sodio. Luego,

se empezó a medir las absorbancias de las diferentes concentraciones de

las diferentes diluciones, esto se realizó directamente en la celda de cuarzo

del espectrofotómetro con UV-Visible a tres longitudes de onda diferentes

(236nm, 254nm y 270nm). Estas diluciones se realizaron agregando de

manera cuantificada proporciones de Agua MiliQ (Agua Ultrapura), y se

obtuvo un espectro entre las concentraciones de 0 mM (Muestra Blanco)

hasta 0.528mM.



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Una vez tenido el espectro a cada longitud de onda, luego se pasó a

desarrollarse la prueba de linealidad y la prueba de repetitividad, del cual se

obtuvo los límites de detección y cuantificación para cada una de las

longitudes de onda.

Luego, éste método y los resultados obtenidos quedaron registrados, con el

propósito de ver la variación de los límites de detección y cuantificación

cada cierto periodo de tiempo, así se chequeó si los errores sistemáticos en

la medición pueden ser despreciables, los cuáles generaría la necesidad de

cambio de partes o todo el equipo: lámpara UV, etc.

3.2.2.3. Cualificación del HPLC

Antes de realizar cualquier análisis en el HPLC, primero se cualificó las

partes del HPLC, con el objetivo de asegurar la confiabilidad de cualquier

análisis al utilizar dicho equipo.

Se realizaron las cualificaciones de las siguientes partes:

a) Cualificación de la Bomba del HPLC.

Se comprobó el flujo real con el flujo teórico para cada uno de los 4 canales

del equipo cromatográfico. Se hizo pasar agua a través de cada canal y se

realizó la cualificación a los siguientes caudales nominales de: 0.5, 1.0, 1.5

y 2.0 mL/min.

Primero, se desconectó el conducto de desecho que se encuentra a la

salida del detector y se colocó un vaso para evitar caídas del eluyente

sobre el detector. Luego, se enumeró y se pesó 5 tubos eppendorf para el

flujo de 0,50 mL/min, y otra cantidad similar para los flujos de 1,0; 1,50 y



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2,0 mL/min. Se activó el funcionamiento la bomba del equipo. Se estableció

el flujo de 0,500 mL/min para el canal “A” y se dejó pasar agua como fase

móvil durante el tiempo suficiente para que la presión se estabilice y que

por todo el sistema circule el solvente emitido por la bomba a través del

canal “A”.

De manera sincronizada se controló 2 min y se recogió el volumen de

eluyente que sale en ese tiempo. Además, se repetió ésta operación 5

veces (al mismo caudal), de tal manera que se obtuvieron las 5 alícuotas

del caudal. Se repitió los pasos anteriores empleando los flujos de 1,0; 1,50

y 2,0 mL/min.

Posteriormente, se pesó los tubos eppendorf que contienen la fase móvil

recogida(agua). Se determinó el volumen experimental recogido (usando la

densidad del eluyente a la temperatura del laboratorio) de las 05 lecturas

para cada uno de los flujos utilizado, luego se determinó el valor promedio

del volumen experimental recogido para cada caudal utilizado. De ésta

manera se repetió todos los pasos para el canal “B”, “C” y “D”.

b) Cualificación del Sistema de Inyección

Para tener mayor seguridad en los resultados tanto en reproducibilidad y

precisión, la cualificación del sistema de inyección se dividió en 2 partes:

Precisión del inyector y Magnitud del efecto memoria (efecto “carry over”).

- Precisión del inyector

Se realizó tal estudio con la columna Teknokroma Mediterranea Sea

C18 - 5 µm*15*0,46, con una fase movil: Metanol/agua(45/55 v/v), con

un flujo de 1ml/min, a una longitud de onda de 254nm, con una



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temperatura de horno de la columna de 30°C, para un volumen de

inyección programado de 10ul.

Primero, se puso en funcionamiento el equipo. Luego, se seleccionó un

flujo de 1.00 mL/min y se dejó pasar fase móvil durante el tiempo

suficiente para que la presión se estabilice y para que circule el solvente

por todo el sistema de bombeo. Posteriormente, se inyectó 10 µl de la

disolución estándar. Por último, se repitió esta última operación 5 veces

con esas condiciones cromatográficas y se anotó el tiempo de retención

y el área para cada una de las inyecciones de la disolución estándar.

- Magnitud del efecto memoria (efecto “carry over”).

Este efecto de carry over es ocasionado por arrastre o retención del

analito analizado anteriormente. Por lo cual un mal lavado del sistema

de inyección después de un análisis, puede ocasionar falsos resultados

en los posteriores análisis cromatográficos.

Primero se programó a un flujo de 1ml/min la inyección de 10ul.

Posteriormente, se inyectó la disolución estándar y luego se inyecto una

muestra blanco compuesto de la misma fase movil. Se observó en el

cromatograma de este último si aparece señal en el tiempo de retención

de la disolución estándar.

Luego, se realizó la misma evaluación pero ésta vez antes de cada

inyección de la muestra blanco, se realizó un lavado programado del

sistema de inyección. Por último, se analizó si sigue presentándose

señal y se comparó el sistema de lavado.

c) Cualificación del Detector UV-Visble

Se llevó a cabo la evaluación de la linealidad de la detección a una

longitud de onda determinada en un rango de absorbancia. Esta



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evaluación se realizó a 254nm, mediante una secuencia de tres

inyecciones de cinco disoluciones estándar de acetofenona (0.050,

0.150, 0.250, 0.350 y 0.500 mg/ml respectivamente en metanol/agua).

d) Cualificación de la Columna Cromatográfica

La columna cromatográfica puede presentar problemas de sangrado en

su fase estacionaria, por ello se necesita cualificar el equipo. Esta

evaluación se llevó a cabo con una secuencia de 3 inyecciones de una

disolución estándar que contuvo benceno (1 µl/ml), tolueno (1 µl/ml) y

naftaleno (1 µl/ml) en acetonitrilo. Éstos compuestos son similares pero

tienen distinto coeficiente de extensión molar a la longitud de onda de

254nm.

Se seleccionó un flujo de 0.700 ml/min y se dejó pasar la fase móvil

durante el tiempo suficiente para que la presión se estabilice. Se inyectó

20 µl de la disolución estándar. Luego, se repitió esta última operación 3

veces con esas condiciones cromatográficas. Por último, se anotó y

calculó el tiempo de retención, el área de pico, factor de capacidad (k´),

número de platos teóricos (N), número de platos teóricos por metro de

columna (N/m), altura de pico teórico reducido (h) y factor de asimetría

(As) del último pico (naftaleno) para cada una de las inyecciones.

- Número de platos teóricos (N)

Figura 3-1. Picos cromatográficos



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N = tR2/ t2 ó N = 16 tR2/Wb

2 [3-1]

- Factor de capacidad (k’)

k' = ( tR - to ) / to [3-2]

Donde:

tR = tiempo de retención de la muestra

to = tiempo muerto de la columna

- Reducida del Plato Teórico (h o HETP)

h = m /N [3-3]

Donde m es la longitud de la columna y N el número de platos teóricos.

- Factor de Asimetría (As) (“tailing factor”)

As = a/b [3-4]

Se miden los valores de a y b como se indica en la figura. Si la columna

funciona bien este valor debe ser 1 o muy próximo al mismo.

Figura 3-2. Pico cromatográfico



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3.2.3. Validación y Cualificación del Método de Análisis.

Se necesitó desarrollar una metodología particular de análisis para

determinar la relación de las concentraciones de Acetofenona y 1-

Feniletanol en el medio de reacción durante todo el proceso bioreducción.

Se emplearon los equipos cualificados previamente para la validación de un

buen método de análisis en el laboratorio de investigación de ésta tesis de

pregrado.

3.2.3.1. Determinación de la Longitud de Onda Óptima.

Se sabe que los analitos Acetofenona y 1-Feniletanol absorben radiación

UV, debido a la presencia de sus electrones pi deslocalizados en el anillo

aromático de cada uno de éstos. Además, se contó con un detector

ultravioleta en el HPLC. Es por ello, que primero, debido a ésta absorbancia

de cada uno de los analitos, se determinó la longitud de onda óptima en el

espectrofotómetro UV, a la cual se analizaron posteriormente en el detector

UV del HPLC.

Para determinar la longitud de onda óptima de análisis de la acetofenona y

el 1- Feniletanol, se encontró el Punto Isosbéstico entre los dos espectros

de absorbancia de cada uno de ellos.

En todo el rango del espectro ultravioleta, el Punto Isosbéstico fue la

longitud de onda, en donde la Acetofenona y el 1-Feniletanol tuvieron la

misma absorbancia, a la mínima concentración posible para cada uno de

ellos. Se encontraron diferentes cruces para ambos espectros de absorción

ya sea en zonas de cresta o valle.



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Para encontrar el correcto Punto Isosbéstico, se construyó los dos

espectros de absorbancia en un rango de longitudes de onda, apartir de

dos soluciones de 0.1mM de Acetofenona y otra de 0.1mM 1-Fenil Etanol,

con lo cual se observó una serie de valles y crestas para cada uno de los

espectros. Luego, se observó una serie de puntos isosbésticos al

superponer los dos espectros, éstas longitudes de onda a la cual cortan los

espectros, se anotaron para un siguiente estudio en la optimización de la

longitud de onda con cual trabajó el detector UV del HPLC para el análisis

de la relación de las diferentes concentraciones de Acetofenona y 1-

Feniletanol en el medio de reacción.

La búsqueda de la longitud de onda óptima para el análisis de la reacción,

se realizó con la propósito de obtener resultados de las concentraciones de

los analitos de manera exacta y precisa, obteniendo un método de análisis

que reporte límites de detección y cuantificación que aporten con mayor

exactitud y confianza en los análisis.

3.2.3.2. Validación del Método de Análisis Cromatográfico.

Para los análisis cromatográficos en HPLC, se seteó el detector ultravioleta

a la longitud de onda encontrada anteriormente. Para soluciones de 0.1mM

de concentración de Acetofenona y de 1-Feniletanol, se buscó la longitud

de onda óptima, flujo óptimo de fase reversa. Y, con todo ésto se encontró

un método validado para el análisis de éstos dos analitos.



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3.2.3.3. Obtención de las Curvas de Calibración para

Acetofenona y 1-Feniletanol.

Se utilizó el método cromatográfico validado para obtener las dos curvas de

calibración en los rangos de 0mM a 10mM para la Acetofenona y 1-Fenil

etanol, respectivamente. Para ello primero, se seteó todas las condiciones

validadas de análisis en el cromatógrafo HPLC, segundo se prepararon

diferentes concentraciones de los dos analitos en los viales de HPLC, cada

uno identificado con sus concentraciones respectivas, para luego ser

analizadas en el cromatógrafo.

Una vez terminado los análisis para cada concentración de los viales, se

reportaron las áreas, y con estos últimos se pasó a realizar las curvas de

calibración. Se halló una recta entre las áreas halladas vs. las

concentraciones de cada analito contenido en los viales, tanto para la

Acetofenona como el 1-Feniletanol. Las curvas de Calibrado entre Área vs

[Analito, mM], son:

- Para la acetofenona:

[3-5]

- Para el 1-Feniletanol:

[3-6]

Donde:

: Áreas halladas, que corresponden a cada vial.

: Pendiente de las curvas Área vs Concentración.

: Ordenadas de las curvas Área vs Concentración.



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3.2.3.4. Obtención de las Concentraciones de Acetofenona y 1-

Feniletanol durante la Reacción de Reducción

Se realizaron reacciones de 100mL en matraces de 250mL de capacidad, a

las concentraciones de 2.5mM, 5mM, 10mM y 20mM de Acetofenona. De

las cuales, se tomaron muestras del medio de reacción con micropipetas, a

cada periodo de tiempo expresado en horas. Se consideró el siguiente

orden en la toma de muestras:

a) Muestra Blanco: Muestra obtenida del medio de reacción, antes de

agregar la biomasa centrifugada de biocatalizador de los tubos falcons,

y antes de agregar la cantidad medida de Acetofenona. El contenido de

éste matraz es el siguiente: solución buffer de fosfatos y cantidad

medida de co-sustrato.

b) Muestra Cero: Muestra obtenida al inicio de la reacción, es decir a las

cero horas de reacción, inmediatamente después de agregar la biomasa

de catalizador. El contenido de éste matraz antes de tomar la muestra

es el siguiente: solución buffer de fosfatos, cosustrato (Glucosa),

sustrato (Acetofenona), biomasa de biocatalizador (células libres de

Diplogelasinospora grovesii).

c) Muestras durante el proceso de bioreducción: Por motivos de

obtener una buena gráfica de la cinética de reacción, y con ello una

velocidad inicial más exacta y precisa de la reacción, se tomó la mayor

cantidad de muestras que definan bien el inicio de la reacción, es decir

entre muestra y muestra tenían poco tiempo de separación. Es por ello,

que mayormente las tomas de muestras tuvieron la siguiente frecuencia:

0horas, 2horas, 4horas, 5 o 6 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas(1día),

48horas(2días), 72horas(3días), y así sucesivamente hasta obtener

unas asíntotas en la cinética de reducción al llegar a concentraciones



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mínima de sustrato y una concentración máxima de producto en el

tiempo.

El protocolo para trasladar las muestras en viales para su posterior

análisis por cromatografía líquida en el HPLC, fue el siguiente:

Primero, se agitó moderadamente el matraz para homogenizar la

concentración en todo el medio de reacción antes de tomar la muestra.

Luego, se tomó la muestra con una micropipeta y se colocó en un tubo

de vidrio previamente identificado, luego se centrifugó la muestra y se

tomó con una micropipeta la cantidad exacta de muestra del líquido

centrifugado y se trasvasó en un vial de HPLC. Para reacciones que

poseen una concentración inicial de Acetofenona fuera de escala de la

curva de calibración, tal es el caso de 20Mm de Acetofenona, en el vial

HPLC se diluyó a la mitad su concentración con Metanol puro, para así

tener mejores resultados al usar la ecuación de la curva de calibración.

Posteriormente, se empleó una jeringa para succionar todo el contenido

del vial, luego se filtró la muestra usando un microfiltro, y posteriormente

se trasvasó éste contenido a otro vial limpio e identificado. Y finalmente

se prosiguió con los análisis cromatográficos de cada vial identificado.

Así se evitó el paso de sedimentos que podrían dañar los microductos

del HPLC, lo cual también se refleja en la calidad de los cromatogramas.

Para el cálculo de las concentraciones totales de cada uno de los

analitos en el medio de reacción (matraz), se recurrió a las siguientes

ecuaciones, las cuales necesitan como dato: las áreas encontradas de

los cronogramas, pendiente y ordenada de las regresiones.



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La concentración de Acetofenona en el medio de Reacción, se calcula

por medio de la siguiente ecuación:

[3-7]

La concentración de 1-Feniletanol en el medio de Reacción, se calcula

por medio de la siguiente ecuación:

[3-8]

3.2.4. Metodología Experimental para el proceso de biotransformación

con Diplogelasinospora grovesii

3.2.4.1. Asentamiento de la colección

El mejor microorganismo seleccionado para el proceso de reducción del 1-

feniletanol fue el ascomiceto Diplogelasinospora grovesii IMI 171018 y se

almacenó en criotubos en una solución de glicerol-agua al 30%v/v a -5°C.

La taxonomía de esta cepa es la siguiente:

Superreino: Eucariota.

Reino: Hongos.

División: Ascomicota.

Subdivisión: Euascomicotina.

Clase: Pirenomicetos.

Orden: Sordariales.

Familia: Sordariaceae.

Género: Diplogelasinospora.

Especie: grovesi.



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3.2.4.2. Crecimiento del ascomiceto Diplogesinospora grovesii

El proceso de replicación del ascomiceto Diplogesinospora grovesii se

realizó con el fin de purificar, aislar, reproducir y mantener al

microorganismo con su mejor actividad enzimática. Éste proceso de

replicación consistió en una secuencia de etapas que son las siguientes:

a. Crecimiento de ascomicetos en medio sólido

Primero, se esterilizó el material que se necesitó para el trabajo con

microorganismos, así se evitó problemas de contaminación y bajos

rendimientos en los ensayos. Luego, se realizó las mediciones en peso de

los componentes para el medio de cultivo sólido. Y por tratarse de medio

sólido se midió la cantidad de Agar correspondiente al volumen de medio

preparado.

Cada placa PETRI necesitó de 20 ml de medio de cultivo. Por otro lado, se

elaboró la siguiente tabla de pesos necesarios para diferentes volúmenes

de medio de cultivo, manteniendo las concentraciones indicadas para el

medio HAGGS:

Tabla 3-1. Proporciones en peso de insumos para Medio HAGGS a diferentes

volúmenes.

MEDIO DE CULTIVO HAGGS

(Medio de cultivo para hongos: H-79, H-97, H-141)

Componente 20 ml 50 ml 100 ml 250 ml 500 ml 1 litro

1 Glicina 0,04 g 0,1 g 0,2 g 0,5 g 1 g 2 g 2 Almidón 0,4 g 1 g 2 g 5 g 10 g 20 g 3 Harina de Soya 0,12 g 0,3 g 0,6 g 1,5 g 3 g 6 g 4 Solución traza 0,2 ml 0,5 ml 1 ml 2,5 ml 5 ml 10 ml 5 Agar 0,6 g 1,5 g 3 g 7,5 g 15 g 30 g

Medio sólido: 1,2,3,4 y 5 Medio líquido: 1,2,3 y 4



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Todo el trabajo se realizó en presencia de una llama, con el fin de

aprovechar la atmósfera inerte que se genera por el calor liberado.

En un vaso de precipitación se diluyó el medio de cultivo sólido con agua

destilada hasta el volumen de medio cultivo a preparar, la mezcla se

homogenizó con agitación magnética, luego se trasvasó el medio de cultivó

a un frasco para medio de cultivo, y se autoclavó a 121 ºC y 1 atm por 20

min. Después del autoclavado, se llevó el frasco de medio de cultivo a la

zona de cultivo, donde con el mechero encendido y se trasvasó 20ml por

cada placa PETRI, luego se esperó que enfríe y solidifique.

Posteriormente, las placas con medio sólido se sometieron a radiación UV,

con la finalidad de obtener un medio libre de contaminación microbiana

indeseable.

En simultáneo a la esterilización ultravioleta del medio de cultivo sólido, se

tomó uno de los criotubos almacenados en frío como fuente del

microorganismo para la siembra. El criterio que se siguió para la selección

del criotubo apropiado fueron: la coloración de los microorganismos en los

criotubos (color verde vistoso) y la fecha de replicación más actualizada del

microorganismo. Posteriormente a la selección del mejor criotubo, se utilizó

un asa de cultivo esterilizada para extraer cubitos del microorganismo de

los criotubos y se sembró en la parte central de las placas PETRI que

contienen medio de sólido. Toda operación se realizó con el mayor cuidado

posible tanto en limpieza, desinfección y se utilizó el medio estéril generado

por los alrededores de la llama.

Finalmente, el crecimiento se llevó a cabo dentro de una incubadora a

condiciones de 1 atm y 30°C por el lapso de tiempo de 7 días. Estas

condiciones de crecimiento fueron las mismas para el crecimiento en medio

líquido y para las condiciones de la reacción estudiada. Se mantuvo

siempre éstas condiciones de operación invariables, así se evitó problemas



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en el crecimiento del microorganismo como estrés enzimático, inhibición y

alteración de la actividad enzimática.

b. Crecimiento de ascomicetos en medio líquido.

Primero, se desarrolló el crecimiento de ascomicetos en medio sólido.

Pasado los 7 días de crecimiento en medio sólido, se retiraron las placas

PETRI de la incubadora y se seleccionó aquellas donde el microorganismo

creció radialmente de manera uniforme, limpia y vistosa. Las placas que no

tuvieron éste crecimiento se descartaron del proceso y se autoclavaron

antes de ser desechadas.

Segundo, se preparó medio de cultivo líquido siguiendo el mismo

procedimiento de preparación del medio HAGGS, se pesó los insumos para

el correspondiente volumen necesitado, a excepción del Agar. Se preparó el

medio líquido en un vaso de precipitación, se agregó agua destilada hasta

el volumen requerido y se agitó hasta tener una solución uniforme.

Tercero, se trasvasó 50ml del medio de cultivo líquido por cada matraz de

250ml. Se mantuvo siempre ésta proporción de 1 a 5 entre el medio de

cultivo líquido y la capacidad del matraz para abastecer al microorganismo

de suficiente oxígeno en su crecimiento. Luego, se tapó las bocas de los

matraces que contienen el medio líquido con tapones de jebe limpios, y

luego fueron envueltos con papel aluminio. En caso de falta de tapones de

jebe, se utilizó algodón para tapar la boca del matraz y luego se envolvió

con papel aluminio.

Cuarto, se autoclavó a 121 ºC por 20 min,y después de ello, se sometió a

radiación ultravioleta, para una esterilización total del medio líquido.

Quinto, se seleccionó una de las placas PETRI que contiene al

microorganismo crecido para su posterior crecimiento en medio líquido, y

las demás se aprovecharon para guardar el microorganismo en nuevos



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criotubos con glicerol al 30% v/v, y así se obtuvo una nueva colección de

ascomicetos.

Sexto, en un lugar estéril, en presencia de llama y con los cuidados

respectivos, se sembró los microorganismos en el medio líquido. Para eso,

se extrajo de la zona más alejada diametralmente de la placa PETRI cubitos

de medio sólido con microorganismo, esta fue la zona que contiene los

ascomicetos más jóvenes y puros en comparación a la zona central que

fueron los ascomicetos más viejos. Y rápidamente, los cubitos con el

microorganismo crecido se introdujeron dentro del matraz con medio líquido

de cultivo estéril. Para ésta extracción se empleó un sacabocado

previamente esterilizado enel autoclave, junto con los matraces que

contenían el medio de cultivo líquido.

Finalmente, cada matraz se identificó con un sticker, y se pusieron a crecer

en la Incubadora de agitación orbital de temperatura y velocidad de

agitación controlado. El microorganismo creció a 30°C, 1 atm con agitación

orbital controlada de 200 rpm.

3.2.4.3. Replicación del ascomiceto Diplogesinospora grovesii

El proceso de replicación del ascomiceto Diplogesinospora grovesii se

realizó con el fin de purificar, aislar, reproducir y mantener al

microorganismo con su mejor actividad enzimática. Este proceso de

replicación consistió en una secuencia de crecimientos en medio sólido en

placas PETRI. Primero, se sembró el ascomiceto en medio sólido, en 2 a 4

placas PETRI, y se usó el procedimiento de crecimiento en medio sólido.

Luego de alcanzar el total crecimiento de ascomiceto en las placas PETRI

dentro de la incubadora, se seleccionó la placa que tuvo el mejor

crecimiento uniforme radial, mejor coloración y libre de contaminación o de



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algún imperfecto que puedo ser observado. Posteriormente, se volvió a

sembrar en 2 a 4 placas con medio sólido, y como fuente del ascomiceto,

se usó la placa anteriormente seleccionada. Se cuidó que las condiciones

de crecimiento en la incubadora sean constantes. Por último, al finalizar el

crecimiento del ascomiceto en las nuevas placas PETRI, se obtuvo un

ascomiceto listo para los ensayos y pruebas correspondientes, o para un

nuevo banco de ascomicetos, que luego se guardaron en frío, en criotubos

con glicerol al 30%v/v.

3.2.4.4. Curva de Crecimiento del ascomiceto Diplogelasinospora

grovesii

Se determinó la curva de crecimiento con la intención de encontrar el

tiempo adecuado para aprovechar su máximo contenido enzimático en el

proceso de reducción de la acetofenona.

Para ello, se realizó todo el proceso de replicación y crecimiento del

microorganismo, es decir primero se cultivó en medio sólido y luego se

cultivó microorganismo en medio líquido.

De la incubadora con agitación orbital que se encontraba a 30°C, 1 atm y

200 rpm, se empezó a retirar 3 matraces por cada día para el análisis

correspondiente.(Contando como día cero, el día en que se realizó la

siembra y se puso los matraces a crecer en dicha incubadora)

El contenido de cada matraz extraído de la incubadora se trasvasó a un

tubo falcon, y luego se separó por medio de una centrífuga todo el líquido

sobrenadante. La biomasa se colocó en una luna de reloj, se medió su peso

inicial, y luego se puso a secar en una estufa hasta que el peso de la



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biomasa se volvió constante. Se secó la biomasa alrededor de un lapso de

tiempo de 5 horas a 120°C. Y por último, se medió el peso de final.

De ésta manera se realizó la construcción de la curva de crecimiento del

microorganismo, a través de una gráfica que relacionó el peso de biomasa

vs tiempo de crecimiento del ascomiceto.

3.2.4.5. Preparación del Medio de Reacción

a. Preparación de la Solución Buffer

Para la preparación de la solución amortiguadora fue requisito que el pKa

del ácido débil deba tener un valor cercano al valor del pH requerido, así se

aseguró que las concentraciones del ácido y la base conjugada fueran

similares. (Raymond Chang, Química, Pág. 659).

Se tiene:

[3-9]

[3-10]

[3-11]

Partiendo de lo anterior, en ésta investigación se utilizó como medio de

reacción la solución buffer de fosfato. En éste caso, se utilizóel ácido débil

ya que posee un cercano al valor del pH requerido,

igual a 6.5.

Por ello, se escogió la siguiente ecuación para la preparación de la solución

buffer fosfato:

[3-12]

De acuerdo a la ecuación Henderson-Hasselbalch:

[3-13]



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[3-14]

Se utilizó como fuente la base conjugada , sal ácidade di-Sodio

hidrogenofosfato dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O / HNa2O4P.12H2O) de

Peso Molecular igual a 358,14 g/mol y como fuente del ácido, la sal ácida

de Sodio dihidrogenofosfato monohidratado (NaH2PO4.H2O / H2NaO4P.H2O)

con Peso Molecular igual a 137,99 g/mol.

Para un litro de solución buffer fosfato de pH=6.5, y con dato experimental

de

[3-15]

Así para éste sistema amortiguador de fosfatos se disolvió 2.9845 gramos

de Na2HPO4.12H2O y 5.8975 gramos NaH2PO4.H2O en suficiente cantidad

de agua miliQ y se llevó la disolución a un volumen de 1Litro.

b. Preparación de la Solución Reacción

Se sembró el ascomiceto en placas PETRI con medio sólido y luego se

colocaron en una incubadora a 30°C y a presión atmosférica para su

crecimiento por 7 días. Luego, se preparó medio de cultivo líquido en

matraces de 250 mL, y con un asa Henle se extrajo una cantidad de cepas

jóvenes de los ascomicetos de las placas PETRI, especialmente de los

extremos diametrales. Y luego, estos matraces se pusieron en agitación

orbital de 200rpm y a 30°C por 7 días.

En la preparación de la solución reacción, se utilizó acetofenona grado

HPLC, y como medio de reacción se utilizó el buffer de fosfato con pH=6.5



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Además se utilizó un co-sustrato de glucosa al 0.5%(p/v) con el fin de

regenerar la co-enzima (cofactor) del microorganismo.

Se realizaron ensayos a 2.5mM, 10mM y 20mM de Acetofenona en

matraces de 250 mL, con el objetivo de analizar la influencia de la

concentración de sustrato en el comportamiento biocatalítico del ADH-

deshidrogenasa del microorganismo y se analizaron sus cinéticas de

reacción.

Después de agregar en el matraz de 250mL, la cantidad de sustrato y co-

sustrato, se tomó una muestra de 1mL del medio preparado en un vial de

HPLC, y después de un análisis cromatográfico, se obtuvo el dato de

muestra cero.

Posteriormente, teniendo la biomasa crecida del microorganismo en medio

líquido, se centrifugó en tubos falcon todo el contenido de los matraces de

medio líquido con ascomiceto crecido, con el fin de quedarnos con la

biomasa, libre de líquido sobrenadante y se realizó tres lavados de la

biomasa con buffer de fosfatos preparado de pH = 6.5.

Se midió el peso inicial de la biomasa de ascomicetos, y después, esta

biomasa se adicionó a los matraces con medio de reacción. Finalmente se

siguió la cinética de la reacción en agitación constante de 200 RPM en un

agitador orbital a temperatura controlada de 30°C.



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3.2.5. Estudio Cinético de Bioreducción

Cuando se llevan a cabo reacciones con biocatalizadores, no todas las

moléculas que reaccionan se encuentran disponibles para conversión

inmediata.

La reacción tiene lugar únicamente después que los reactantes han sido

transportados al lugar de reacción, por lo que los procesos de transferencia

de materia pueden ejercer una gran influencia sobre la velocidad global de

conversión. Debido a que la velocidad de reacción depende generalmente

de la concentración de sustrato, cuando las concentraciones del sistema

varían, el análisis cinético llega a ser muy complejo. Para biocatalizadores

debe conocerse la concentración de sustrato existente en cada punto del

interior de la pared celular con el fin de calcular la velocidad local de

conversión. En la mayoría de los casos éstas concentraciones no pueden

medirse aunque afortunadamente pueden calcularse utilizando la teoría de

la difusión-reacción.

Debido a que las concentraciones varían en el interior de los

biocatalizadores, las velocidades locales de reacción también varían

dependiendo de la posición. Cada célula responde a la concentración de

sustrato según su posición con una velocidad de reacción determinada por

los parámetros cinéticos del biocatalizador. Esta velocidad local de reacción

se denomina velocidad verdadera o velocidad intrínseca. Las velocidades

de reacción: locales y verdaderas, son difíciles de medir en biocatalizadores

sin alterar las condiciones de reacción. Sin embargo, es posible, medir la

velocidad global de reacción para el catalizador entero. En un sistema

cerrado, la velocidad global de conversión por reacción, hecho que en los

sistemas heterogéneos se denomina velocidad observada. Cuando los

niveles de sustrato cambian lentamente durante la reacción, los datos de

velocidad observada pueden obtenerse recogiendo muestras de la mezcla



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de reacción a diferentes tiempos y analizando la variación de la

concentración de sustrato.

3.2.5.1. Velocidad inicial de reacción observada (Vo)

Las cinéticas de muchas reacciones biológicas son bien de orden cero, de

primer orden o una más compleja denominada cinética de Michaelis-

Menten. Para determinar la velocidad observada de cada biotransformación

se siguió el siguiente procedimiento: a erlenmeyers de 250mL se añadieron

100mL de tampón fosfato potásico pH= 6.5. Luego se añadió un peso

determinado de células libres, el co-sustrato (glucosa), y a continuación el

substrato a la concentración establecida (acetofenona), llevándose a cabo

la biotransformación a 30°C y 200 rpm. A diferentes tiempos de reacción se

sacaron muestras del medio de reacción en un tubo de ensayo, se agitó en

un Agitador Vortex por 10s, se centrifugó a 4500 rpm durante 2 minutos.

Del centrifugado se tomó 1mL en un vial; se añadió a éstas 0.5mL de

metanol, luego se filtró y luego la muestra filtrada se trasvasó a otro vial

para su posterior análisis cromatográfico de líquido en HPLC.

Para el análisis de las concentraciones del sustrato en el medio de

reacción, se empleó la curva de calibración del sustrato a diferentes

concentraciones dependiendo de las áreas obtenidas en el análisis

cromatográfico.

La concentración (milimolar) del producto formado al cabo de un tiempo (t)

de reacción se determinó por medio de la siguiente relación:

[3-16]

Donde:

= Concentración milimolar de producto al cabo de un tiempo t.



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Los datos así obtenidos se representaron en un plano XY, llevándose en

abcisas el tiempo de reacción(t) expresado en horas y en ordenadas la

concentración milimolar del producto al cabo de t horas de reacción.

Luego, dada la tendencia de los puntos graficados (y(t) aumenta

monótonamente desde y = 0 cuando t = 0 hasta una asíntota y = F a

valores elevados de t), con la ayuda del programa EXFIT del paquete

informático SIMFITV v5.5 ed.18, se realizó una regresión por mínimos

cuadrados ponderados, usando una seria de sumas exponenciales en

orden consecutivo (modelo c). Este programa ajusta y(t) a partir de una

serie de sumas como se indica a continuación:

a) A1.exp[-k1t] + A2.exp[-k2t] + ………… An.exp[-knt]

b) A1.exp[-k1t] + A2.exp[-k2t] + ………… An.exp[-knt] + C

c) B1.{ 1 - exp[-k1t] } + B2. {1 - exp[-k2t]} + … Bn. {1 - exp[-knt]}

d) B1.{ 1 - exp[-k1t] } + B2. {1 - exp[-k2t]} +… Bn. {1 - exp[-knt]} + C

El número(n) puede ser fijo o variable si se desean ajustar modelos en

secuencia de orden creciente. Los modelos (a y c) y (b y d) sólo varían en la

forma de los parámetros. A menudo sólo se requieren n = 1 (como en

nuestro caso) pero, si los datos son abundantes y de alta calidad tendría

sentido probar n = 2 ó n = 3. La función que mejor ajusta los datos

experimentales es de la forma.

y(t) =B . [ 1 – exp (-k.t)] [3-17]

La derivada de esta función es la expresión de la velocidad observada y

tiene la siguiente:

dy / dt = B . kexp (-k . t) [3-18]



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La velocidad inicial quedará determinada cuando t tienda a cero, por lo que

la expresión anterior quedaría de la forma:

dy / dt = V0= B . k [3-19]

Donde:

B= Máxima concentración de producto alcanzada.

K = Constante aparente de velocidad.

La máxima conversión alcanzada se determinó por la relación:

Xmax(%)=(B/[S0]).100 [3-20]

El tiempo en que se alcanza la máxima conversión (Tmax), se determinó de

la siguiente manera. Dada la función cinética: y (t) =B. [1 – exp (-k.t)] su

valor asintótico en el límite es B. Si llamamos ɛ a la diferencia entre el valor

de B y el valor de la función por definición de límite se debe cumplir que

dado un: ɛ>0, debemos hallar un Tmax>0 tal que: t>Tmax entonces |y(t)-B|<ɛ.

Lo que indica que el valor absoluto de la diferencia entre la función y la

asíntota debe ser menor que ɛ (error). Resolviendo esta última expresión

tenemos: t > (1/k).ln(B/ɛ), con lo cual queda demostrado el límite para todo t

>Tmax. Por ejemplo, si queremos hallar con un error del 5% el tiempo de

máxima conversión de una reacción donde la máxima concentración de

producto alcanzado es 10Mm y el valor de k=0.28 h-1 tenemos: Tmax

=(1/0.28).ln(10/0.05)=19h.



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3.2.5.2. Orden de reacción (n)

Dadas las tendencias de las cinéticas antes mencionadas, el orden de

reacción se determinó experimentalmente de la siguiente manera. Se

supuso una cinética de pseudo-primer orden de la forma V0 = k.[S0]n. Se

realizó la reacción test con la cepa a dos concentraciones de sustrato

diferentes ([S1]=10Mm y [S1]=5Mm). Se determinó las velocidades iniciales

de ambas reacciones según:

V1= k.[S1]n [3-21]

V2= k.[S2]n [3-22]

Del cociente de ambas expresiones tenemos:

(V1/V2)=([S1]/[S2])n [3-23]

Tomando logaritmos y despejando el orden de reacción, n, tenemos:

n = [ln(V1/V2)]/[ln([S1]/[S2])] [3-24]

Si n=1, la suposición es correcta y la cinética de ésta reacción seria de

pseudo-primer orden.

3.2.5.3. Otras variables de cinética de reacción

a. Conversión: La conversión porcentual del sustrato, X (%) de cada

muestra al cabo de un tiempo (t), se calculó de la siguiente ecuación:

[3-25]



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b. Rendimiento: El rendimiento de la reacción de seudo-primer orden de

reacción se calcula con la siguiente ecuación:

[3-26]

c. Productividad: La productividad se encontró en base a la cantidad de

catalizador(biomasa), que se necesitó para obtener el producto deseado

en el tiempo que demandó la reacción, y se calcula de la siguiente

manera:

[3-27]



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IV.RESULTADOS Y DISCUSIONES



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4.1. CUALIFICACIÓN DE LOS INSTRUMENTOS ANALÍTICOS

En esta tesis se cualificaron equipos e instrumentos utilizados para la

determinación de los parámetros cinéticos de la reacción de reducción de la

acetofenona; así como también se validaron los métodos de análisis, cuyos

procedimientos normalizados de trabajo (PNT) se encuentran en los

anexos. El propósito de cualificar un equipo y validar un método de análisis

es evitar y/o minimizar errores en las mediciones, que pueden afectar la

precisión y exactitud de los análisis. A modo de ejemplo se muestran las

cualificaciones de los principales equipos y sus métodos de análisis:

4.1.1. Cualificación de Balanza Analítica.

Tener una balanza analítica cualificada es importante porque ayuda a

confiar y obtener buenas mediciones de los pesos de las diferentes

sustancias utilizadas en los trabajos de investigación. En esta tesis se

cualificó la balanza Marca: Sartorious AG Germany CPA 224S, a fin de

conocer el estado del equipo y el grado de desviación de las mediciones

debido al uso, con la intención de tomar las medidas correctivas que nos

permitan tener resultados confiables.

La cualificación de la balanza analítica, se realizó en dos rangos de

medición. El primer rango comprendido entre 0 a 1g. útil para la preparación

de soluciones con bajas concentraciones (milimolar); y el segundo rango

comprendido entre 0 y 100g. para la preparación de medios de cultivo de

microorganismos.



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a. Primer Rango de Cualificación: 0 a 1g

La cualificación en este rango se realizó tomando los siguientes puntos: 0g.,

0.125g., 0.250g., 0.500g., 0.750g., 1.000g, con 4 repeticiones por cada una

de las mediciones realizadas. Las mediciones se realizaron midiendo

volúmenes de agua destilada (ρ = 1g/ml) en viales, empleando micropipetas

cualificadas. La regresión lineal se llevó a cabo empleando el método de

mínimos cuadrados del programa SIMFIT (Autor: W. G. Bardsley,

Universidad de Manchester, U. K.)

Figura 4-1. Variación del Peso: Rango 0 a 1g.

Cualificación de la Balanza Sartorius

y = 1.0086x - 0.0002

R2 = 1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Peso Teóricos (g)

Pe

sp

Re

ale

s (

g)

En la Figura 4-1, se observa que la regresión lineal tiene la siguiente

ecuación matemática:

En esta ecuación se puede observar que el valor de la pendiente es

aproximadamente uno (1), lo que nos indica que no existe variación

considerable entre los valores reales y los valores mostrados en la balanza

(teóricos), razón por la cual podemos inferir que la balanza Sartorious AG

Y = (1.0086 ± t.sx) X – (0.0002 ± t.sy)



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Germany CPA 224S se encuentra en buen estado y mostrando valores

fiables.

b. Segundo Rango de Cualificación: 0 a 100g

La cualificación en este rango se realizó tomando los siguientes puntos: 0g.,

25g., 50g., 75g., 100g., con 4 repeticiones por cada una de las mediciones

llevadas a cabo. Al igual que en el caso anterior la regresión lineal fue

llevada a cabo por el método de mínimos cuadrados con repeticiones,

utilizando el programa estadístico SIMFIT (Autor: W. G. Bardsley,

Universidad de Manchester, U. K.) como se muestra en la siguiente

figura:

Figura 4-2. Variación del Peso: Rango 0 a 100g


y = 0.9929x - 0.0341

R2 = 1

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120

Peso Teóricos (g)

Pe

sp

Re

ale

s (

g)

En la Figura 4-2, se observa la regresión lineal tiene la siguiente ecuación

matemática:

En esta ecuación se puede apreciar que la pendiente de la recta sufrió una

pequeña variación respecto a la pendiente del rango 0-1g; sin embargo,

esta variación no afecta la precisión de la balanza la cual puede

Y = (0.9929 ± t.sx) X – (0.0341 ± t.sy)



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considerarse que emite aún valores confiables; los que no podrían ser

considerados como tales cuando el valor de la pendiente fuera inferior a

0,97.

4.1.2. Cualificación de Espetrofotómetro Ultravioleta-Visible

Los analitos que intervienen en la determinación de los parámetros

cinéticos en esta tesis son: sustrato: acetofenona y producto: 1-feniletanol;

los cuales absorben en el rango ultravioleta (UV), debido a la

deslocalización de electrones que presentan ambos compuestos. En ese

sentido el equipo utilizado para determinar la longitud de onda a la cual se

produce la máxima absorción fue el espectrofotómetro UV-VIS Hewlett

Packard Mod 8452 A, Diode array; el cual se cualificó utilizando una

solución de benzoato de sodio como patrón validador del Espectrofotómetro

UV a tres diferentes longitudes de onda: 236nm, 254nm y 270nm. (Espectro

UV: 210nm a 310nm).

La cualificación y la validación del espectrofotómetro UV-Visible, nos ayuda

a determinar de manera confiable la longitud de onda del espectro UV (nm),

a la cual se analizará el sustrato y producto de la reacción, y con ello

programar el detector UV del cromatógrafo HPLC, y así finalmente, realizar

el seguimiento de la reacción y la cuantificación de los analítos.

A partir de una solución madre de benzoato de sodio 0.528 mM, se

determinó las absorbancias de diferentes diluciones con agua ultrapura

(miliQ). Estas diluciones se analizaron haciendo uso de la cubeta de

análisis (cuarzo). Las curvas de absorbancias (Lammbert-Beer) a 236nm,

254nm y 270nm fueron las siguientes:



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a. Curva de Absorbancia de Benzoato de Sodio a 236nm:

Figura 4-3. Cualificación Espetrofotómetro UV-Visible a 236nm

Concentración vs Absorbancia a 236 nm para el Benzoato de Sodio

y = 5.326x - 0.03968

R2 = 0.9969

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

Concentración mM

Ab

so

rban

cia

De la Figura 4-3, se observa que la relación de la absorbancia y la

concentración de benzoato de sodio tienen una regresión lineal, la cual fue

ajustada por mínimos cuadrados en el software estadístico SIMFIT. Y

corresponde a la siguiente ecuación lineal:

Donde:

Y = Absorbancia

X = Concentración, mM

Y = (5.326 ± t.sx) X – (0.03968 ± t.sy)



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b. Curva de Absorbancia de Benzoato de Sodio a 254nm:



y = 0.8252x - 0.02265

R2 = 0.9975

-0.05

0.05

0.15

0.25

0.35

0.45

0.55

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Concentración mM

Ab

so

rban

cia

De la Figura 4-4, se observa que la relación de la absorbancia y la

concentración de benzoato de sodio tiene una regresión lineal, la cual fue

ajustada por mínimos cuadrados en el software estadístico SIMFIT. Y

corresponde a la siguiente ecuación lineal:

Donde:

Y = Absorbancia


Y = (0.8252 ± t.sx) X – (0.02265 ± t.sy)



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c. Curva de Absorbancia de Benzoato de Sodio a 270nm:



y = 0.6307x - 0.0208

R2 = 0.9967

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Concentración mM

Ab

so

rban

cia

De la Figura 4-5, la regresión lineal ajustada por mínimos cuadrados en el

software estadístico SIMFIT, corresponde a la siguiente ecuación lineal:

Donde:

Y = Absorbancia


Y = (0.6307 ± t.sx) X – (0.02080 ± t.sy)



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4.1.3. Cualificación de Cromatógrafo de Líquidos de Alta Performancia

4.1.3.1. Cualificación de la Bomba Cuaternaria

La cualificación de la bomba consiste en la comprobación de la exactitud y

precisión del caudal suministrado por la bomba a través de los 04 canales

del equipo cromatográfico. El procedimiento requiere utilizar la columna

estándar utilizada habitualmente en el equipo, (por ejemplo: C-8 o C-18) ya

que el sistema debe estudiar su funcionamiento como un todo durante un

análisis cromatográfico. La operación consiste en hacer pasar un solvente a

través de uno de los canales (en este caso H2O ultrapura) con caudales

nominales de 0,50; 1,0; 1,5 y 2,0 mL/min, con 5 repeticiones cada caudal,

y realizar la medición del solvente recogido a la salida del sistema.

a. Cualificación del Canal A

Figura 4-6. Cualificación del Canal A

Cualificación del Canal "A"

y = 0.9935x + 0.0101

R2 = 1

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4

Flujo Experimental (mL/min)

Flu

jo T

eó

ric

o (

mL

/min

)

Desviación media (d) = Σdi/n=0.0174/6 = 0.0029

Desviación estándar (Sd) = [Σ(di – d)2/(n – 1)]1/2 = [6,49*10-4 /(6 – 1)]1/2

Sd = 0.0114

“t” de student calculada (tcal) = [d*(n)1/2]/Sd = [0.0029*(6)1/2]/0.0114



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tcal = 0,623

De tablas el valor de “t” de student tabulada al 95% (ttab) y para n=6, se

tiene: T tab = 2,015

Como T cal<T tab, entonces se concluye que los valores obtenidos de

manera experimental son estadísticamente iguales a los valores teóricos

expresados por el instrumento.

b. Cualificación del Canal B

Figura 4-7. Cualificación del Canal B

Cualificación del Canal "B"

y = 0.9986x + 0.0059

R2 = 1

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4


Flu

jo T

eó

ric

o (

mL

/min

)

Desviación media (d) = Σdi /n = 0.0528/6 = 0.0088

Desviación estándar (Sd) = [Σ(di – d)2/(n – 1)]1/2 = [1,506*10-3/(6–1)]1/2

Sd = 0.0174


tcal = 1,2388

De tablas el valor de “t” de student tabulada al 95%(ttab) y para n=6, se




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Como Tcal< T tab, entonces se concluye que los valores obtenidos de



c. Cualificación del Canal C

Figura 4-8. Cualificación del Canal C

Cualificación del Canal "C"

y = 0.9936x + 0.0071

R2 = 1

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4


Flu

jo T

eó

ric

o (

mL

/min

)

Desviación media (d) = Σdi/n = 0.0346/6 = 0.0058

Desviación estándar (Sd) = [Σ(di – d)2/(n – 1)]1/2 = [6,19*10-4/(6 – 1)]1/2

Sd = 0,0111


Tcal = 1,28

De tablas el valor de “t” de student tabulada al 95% ( ttab ) y para n = 6, se


Como T cal < t tab, entonces se concluye que los valores obtenidos de





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d. Cualificación del Canal D

Cualificación del Canal "D"

y = 0.9936x + 0.0071

R2 = 1

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4


Flu

jo T

eó

ric

o (

mL

/min

)

Figura 4-9. Cualificación del Canal D

Desviación media (d) = Σdi/n = 0.0220/6 = 0.0037

Desviación estándar (Sd) = [Σ(di – d)2 /(n – 1)]1/2 = [6.23*10-4 /(6 – 1) ]1/2

Sd = 0.0112


tcal = 0,809

De tablas el valor de “t” de student tabulada al 95%(ttab) y para n = 6, se


Como Tcal < t tab, entonces se concluye que los valores obtenidos de



4.1.3.2. Cualificación del Sistema de Inyección

La cualificación del sistema de inyección implica evaluar dos aspectos

fundamentales del sistema de inyección automático, que nos permite tener

la seguridad sobre los resultados obtenidos en cuanto a su reproducibilidad

y precisión: precisión del inyector y magnitud del efecto memoria (efecto

“carry over”).



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a. Precisión del Inyector

Se llevó a cabo la evaluación de la precisión del sistema de inyección

manual mediante una secuencia de cinco inyecciones de una disolución

estándar de naftaleno (0.100 mg/ml en acetonitrilo) empleando las

siguientes condiciones cromatográficas:

Columna: Teknokroma Mediterranea Sea C18 - 5 µm*15*0,46

Fase móvil : Metanol/agua (45/55 v/v)

Flujo de la fase móvil : 1.00 ml/min.

Longitud de onda del detector : 254 nm.

Volumen de inyección : 10 µl.

Temperatura del horno de columna : 30 ºC.

Presión del equipo : 39 bar.

Tabla 4-1. Inyecciones de una disolución estándar de naftaleno (0.100 mg/ml en acetonitrilo)

De la Tabla 4-1, se observa que las desviaciones del tiempo de retención y

áreas son pequeñas, esto significa que el equipo reporta datos de mayor

precisión y exactitud.

Nº muestra tiempo retención (min) Área

1 4,693 2640,5

2 4,705 2538,8

3 4,703 2630,1

4 4,707 2612,3

5 4,707 2628,7

Promedio 4,703 2610,1

Desv. Estándar 0,0058 41,1055

Limite Superior (95%) 4,710 2661,13

Límite inferior (95%) 4,696 2559,07



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b. Magnitud del efecto memoria (efecto “carry over”)

Este parámetro nos permite determinar la contaminación producida por la

inyección anterior, si no se limpia correctamente el “loop” del inyector

automático después de cada inyección.

Para determinar este parámetro se inyectó la disolución estándar y luego se

realizó una inyección en blanco (como blanco usamos la fase móvil) y se

observó si en el cromatograma aparece señal en el tiempo de retención de

compuesto de la disolución estándar (acetofenona).

A continuación se repitió el ensayo pero realizando la inyección con lavado,

y se verificó si hay algún cambio en la señal.

- Efecto Carry Over (Sin limpiar el sistema)

Tabla 4-2. Análisis cromatográfico de solución de acetofenona

Nº muestra Tiempo

retención (min)

Área (mV)

1 4,708 2460,8

2 4,712 2452,1

3 4,733 2523,8

Promedio 4,718 2478,9


Limite Superior (95%) 4,7513 2576,105

Límite inferior (95%) 4,6847 2381,695



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Tabla 4-3. Efecto carry over sin limpiar el sistema – Blanco: Fase Móvil

Nº blanco Tiempo

retención (min)

Área % Área

1 4,736 24,4 0,99

2 4,754 15,8 0,64

3 4,760 29,3 1,16

Promedio 4,750 23,167 0,93

Desv. Estándar 0,0125 6,8340 0,2634

Limite Superior (95%) 4,7811 40,145 1,7223

Límite Inferior (95%) 4,7190 6,1890 0,1422

De la Tabla 4-2 y 4-3, se observa que después de cada análisis

cromatográfico de la solución de acetofenona, queda pequeñas partículas

del analito en el sistema de inyección, las cuales se detectan en el

cromatograma al analizar una muestra blanco que contenga la misma fase

móvil. Este efecto de carry over, afecta la certeza de los análisis posteriores

si no se realiza un buen lavado interno del sistema de inyección.

- Efecto Carry Over (Con limpieza del sistema)

Tabla 4-4. Efecto carry over con lavado del sistema - Muestra: acetofenona

Nº muestra Tiempo

retención (min)

Área (mV)

1 4,741 2686,8

2 4,741 2688,5

3 4,743 2799,3

Promedio 4,742 2724,87


Límite Superior(95%) 4,7451 2885,03

Límite Inferior(95%) 4,7382 2564,71



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Tabla 4-5. Efecto Carry Over (utilizando opción inyección con lavado)

Nº blanco Tiempo

retención (min)

Área (mV) % Área

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

Promedio - - -

Desv. Estándar - - 0,0000

Limite Superior - - 0,0000

Límite Inferior - - 0,0000

De la Tabla 4-4 y 4-5, se observa que al realizar una lavado interno del

sistema de inyección después de cada análisis cromatográfico del analito,

se eliminan en su totalidad cualquier resto de partículas de analito que

puedan afectar los resultados de los siguientes análisis cromatográficos.

4.1.3.3. Cualificación del Detector UV-Visible

La cualificación del detector tiene como objetivo comprobar la linealidad de

la detección a una longitud de onda determinada (por ejemplo: 254 nm)

dentro de un rango de absorbancia que se considera normal (0.0 - 2.0 D.O).

Se llevó a cabo la evaluación del detector mediante una secuencia de tres

inyecciones de cinco disoluciones estándar de acetofenona (0.050, 0.150,

0.250, 0.350 y 0.500 mg/ml respectivamente en metanol/agua):

Para cada disolución estándar de acetofenona se calculó el valor promedio,

la desviación estándar y el error en la medida (superior e inferior) de las

áreas de los picos.



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Se representó los valores de concentración de acetofenona (mg/L) frente a

los valores de área de pico y se calculó la recta de regresión que pasa por

los puntos experimentales para comprobar la linealidad del detector.

Tabla 4-6. Cualificación del UV-Visible

nº disolución Standard

(mg/L) Acetofenona tR (min) Area (mV)

1 50 4,685 1073,0 1 50 4,688 1085,3 1 50 4,685 1113,4 2 150 4,741 3848,2 2 150 4,740 3730,7 2 150 4,745 3746,2 3 250 4,748 5426,4 3 250 4,747 5609,4 3 250 4,478 5529,7 4 350 4,676 9542,6 4 350 4,677 9316,3 4 350 4,678 9449,9 5 500 4,679 12619,1 5 500 4,680 12624,8 5 500 4,676 12831,2

Figura 4-10. Cualificación del UV-Visible

Cualificación de UV-Visible

y = 26.02x - 245.81

R2 = 1

-5002000450070009500

1200014500

0 100 200 300 400 500Concentración (mg/L)

Are

a (

mV

)



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De la Tabla 4-6 y de la Figura 4-10, se obtiene un coeficiente de

correlación con una buena linealidad entre la concentración estándar de

acetofenona y el área reportada por cromatografía.

4.1.3.4. Cualificación de la Columna

Las columnas envejecen con el tiempo por el sangrado de la fase

estacionaria, mal uso, suciedad, etc. Por ello este ensayo es vital y debería

de realizarse todos los días antes de empezar a trabajar.

La evaluación de la columna se llevó a cabo mediante una secuencia de

tres inyecciones de una disolución estándar que contenga una serie de

compuestos similares pero con distinto valor de coeficiente de extinción

molar a la longitud de onda elegida (v.g. 254 nm).

La disolución estándar preparada fue la siguiente: (1) benceno (1 µl/ml), (2)

tolueno (1 µl/ml) y (3) naftaleno (1 µl/ml) en acetonitrilo. Se inyectan 20 µl y

se debe asegurar que trabaja en condiciones óptimas de limpieza del

mismo.

Al no tener la hoja del fabricante preparamos la disolución estándar

indicada anteriormente y los resultados obtenidos los usaremos como

referencia del estado de la columna en evaluaciones posteriores.

Se emplearon las siguientes condiciones cromatográficas:

Teknokroma Mediterranea Sea C18 - 5 µm*15*0,46

Fase móvil : agua/acetonitrilo (35/65 v/v).







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En la Tabla 4-7, se muestra el tiempo de retención, el área de pico, el factor

de capacidad (k´), el número de platos teóricos (N), el número de platos

teóricos por metro de columna (N/m), la altura de pico teórico reducido (h) y

el factor de asimetría (As) del último pico (naftaleno) para cada una de las

inyecciones.

Tabla 4-7. Cualificación de la columna

Los elevados valores de los platos teóricos y los valores cercanos al uno (1)

del factor de asimetría demuestran el buen funcionamiento de la columna

para nuestros análisis.

Pinchazo tR

(min) Área (mV) K´

Nº platos teóricos

Nºpl.t./m H As

1 6,244 10047,2 5,06 4240 282666,667 0,00000354 0,83 2 6,24 10086,3 5,06 4235 282333,333 0,00000354 0,83 3 6,244 9890,4 5,06 4334 288933,333 0,00000346 0,81

Promedio 6,243 10007,967 5,060 4269,667 284644,444 0,00000351 0,823 Desv.est. 0,002 103,676 0,000 55,770 3718,024 0,00000005 0,012 Lím. Sup. 6,250 10264,566 5,060 4408,219 293881,273 0,00000363 0,853 Lím. Inf. 6,236 9749,434 5,060 4131,115 275407,615 0,00000339 0,793



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4.2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE ANÁLISIS.

4.2.1. Longitud de Onda Óptima de análisis.

En esta tesis la cuantificación de los analitos se llevaron a cabo de manera

simultánea, es decir, se aprovechó la misma muestra para determinar la

concentración de acetofenona y 1-feniletanol. El inconveniente de este

procedimiento consiste en que ambos analitos absorben a diferentes

longitudes de onda, razón por la cual, se procedió a determinar el punto

isosbéstico de estos analitos (punto de máxima absorción de ambos

analitos juntos) a fin de resolver este inconveniente.

Los espectros UV-Visible de la acetofenona y del 1-Feniletanol a bajas

concentraciones (0.1 mM) se superpusieron para encontrar sus puntos

isobésticos con sus respectivas longitudes de onda. Éste estudio se

desarrolló con el propósito de encontrar una longitud de onda adecuada

para el análisis cromatográfico, ya que el Cromatógrafo de Líquidos de Alta

Performancia – HPLC tiene un detector UV. Por lo que se usó el

Espectrofotómetro UV-Visible para encontrar las longitudes de onda en las

cuales ambos espectros se cruzan. Las concentraciones de las soluciones

estándar de los analitos fueron las siguientes:

[Acetofenona]= 0,1008 mM

[1-Fenil Etanol]= 0.09742 mM

En todo el espectro de absorción de las soluciones estandar, se obtuvo los

siguientes cruces de ambos espectros al superponerse uno a otro:

- A 218 nm Absorbancia = 0.588 (Punto Isobéstico)

Tabla 4-8. Coeficientes de Extensión Molecular a 218nm

Coeficiente de Extensión Molecular L/cm.mol

Acetofenona 5833.33 1-Fenil etanol 6035.60



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- A 270 nm Absorbancia = 0.266 Valle

De la Tabla 4-8, la longitud de onda adecuada es una longitud de onda en

la cual los picos cromatográficos detectados de la acetofenona y 1-

feniletanol reportan datos que reproducen las cantidades más exactas del

contenido de Acetofenona y 1-Feniletanol en las muestras tomadas en el

transcurso de las reacciones con células libres de ascomicetos. Por eso se

buscó una longitud de onda alrededor de 218nm que genere una

cromatografía con buena Resolución para la Acetofenona y el 1-Feniletanol.

A una longitud de onda igual a 217nm se obtiene el mejor resultado como

se muestra en la Tabla 4-9:

Tabla 4-9. Coeficientes de Extensión Molecular a 217nm

Coeficiente de Extensión Molecular L/cm.mol

Acetofenona 6789.7 1-Fenil etanol 4461.4

4.2.2. Validación de Método de Análisis Cromatográfico.

En ésta etapa se desarrollaron una serie de pruebas del punto isobéstico y

diferentes concentraciones de la fase móvil. Las mejores condiciones

cromatográficas encontradas para el análisis de la Acetofenona y del 1-

Feniletanol fueron las siguientes:

Columna: Teknokroma Mediterránea Sea C18 (µm * 15 * 0,46)

Fase móvil : Metanol/Agua (45/55).

Caudal fase móvil : 1,0mL/min.

Longitud de onda Detector : 217,4 nm.

Volumen de inyección : 10 µL.

Temperatura termostato : 30 ºC.



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4.2.3. Curvas de Calibración para Acetofenona y 1-Feniletanol.

a. Linealidad:

Una vez determinadas las condiciones adecuadas de análisis por HPLC, se

prosiguió a elaborar las curvas de calibrado; para esto se tuvieron que

preparar diferentes concentraciones de sustrato y producto entre valores de

0 a 10mM obteniendose los siguientes resultados como de muestran a

continuación.

Tabla 4-10. Curvas de Calibración para Sustrato y Producto en HPLC

Analito Curvas de Calibración Regresión

Acetofenona Area = 628.77 [mM] + 25.344 R² = 0.999 1-Feniletanol Area = 1065.2 [mM] + 254.08 R² = 0.999

En la Tabla 4-10, se muestran las ecuaciones correspondientes a las

curvas de calibración, con muy buena correlación lineal, que se utilizaron

para la determinación de las concentraciones de sustrato y producto en el

cromatógrafo HPLC.

b. Repetitividad:

El ensayo de repetitividad sirve para determinar las variaciones de error

sistemático, precisión y exactitud de las curvas de calibrado tanto para el

sustrato como para el producto. Es por ello que se tomó una muestra de

sustrato y producto (con tres repeticiones) y se calculó la desviación

estándar y su coeficiente de variación.

Tabla 4-11. Ensayo de Repetitividad para la Acetofenona (sustrato)

Standard Mm

Replica 1 Replica 2 Replica 3 Area Promedio

s %CV Tr Area Tr Area Tr Area

5.376 8.880 3394.670 8.881 3398.213 8.881 3400.086 3397.65633 2.75 0.08



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Tabla 4-12. Ensayo de Repetitividad para la 1-Feniletanol (producto)

Standard Mm

Replica 1 Replica 2 Replica 3 Area Promedio

s %CV Tr Area Tr Area Tr Area 5.195 7.787 5903.147 7.787 5898.627 7.782 5891.656 5897.81006 5.79 0.10

En la Tabla 4-11 y en la Tabla 4-12, se observa que existen una buena

precisión de las curvas de calibrado ya que las mediciones obtenidas en el

ensayo de repetitividad poseen un coeficiente de variación menor al 2%.

c. Límites de Cuantificación y Detección:

El límite de detección se define como la mínima cantidad de analito en una

muestra que puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada. El

límite de cuantificación es la mínima cantidad de analito en una muestra

que puede ser determinada cuantitativamente con una precisión y exactitud

adecuada. A continuación se muestran los límites de cuantificación y

detección obtenidos en esta tesis para la determinación de los parámetros

cinéticos de la reacción de reducción de la acetofenona.

Tabla 4-13. Límites de Cuantificación y Detección

Analitos Acetofenona 1-Feniletanol Límite de Cuantificación, mM. 0.79 0.60

Límite de Detección, Mm. 0.26 0.20

Los valores mostrados en la Tabla 4-13, son importantes para la

cuantificación de los analitos ya que evitan tener en cuanta en los análisis

falsas señales y/o picos equivocados que no permitirían tener un adecuado

seguimiento a la cinética de la reacción de reducción de la acetofenona.



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4.3. PROCESO DE BIOREDUCCIÓN CON Diplogelasinospora grovesii

4.3.1. Screening Taxonómico

Una vez constituida la colección de partida conformada por 9

microorganismos (3 bacterias, 3 levaduras y 3 hongos filamentosos) y

determinados los medios de cultivo adecuados para el crecimiento de los

microorganismos, se dio inicio al proceso de selección o screening

taxonómico. Tras consultar la bibliografía se seleccionó como reacción test,

para evaluar la actividad reductasa de cada uno de los microorganismos, la

reducción de la acetofenona; por ser una reacción sencilla que puede ser

analizada por HPLC para poder tener un criterio cuantitativo de las

actividades que presentan nuestros microorganismos. El objetivo de este

screening fue determinar qué microorganismos eran capaces de catalizar la

biotransformación de nuestro sustrato (acetofenona) sin que aparecieran

reacciones secundarias.

En la Tabla 4-14 se muestran los resultados del screening; con los

microorganismos de la colección de partida.

Tabla 4-14. Screening de microorganismos de la colección de partida.

Grupo Microorganismo Código Conversión (%)

Bacteria Rhodococcus rhodochrous DSMZ 11097 5

Bacteria Ralstonia eurotropha DSMZ 2839 8

Bacteria Rhodococcus erythropolis DSMZ 8424 10

Levadura Williopsis saturnus NCYC 2313 12

Levadura Williopsis californica CBS 2158 16

Levadura Pachysolen tannophilus NCYC 1597 13

Ascomiceto Phialemonium curvatum CBS 505.82 30

Ascomiceto Coniochaeta velutina CBS 981.68 50

Ascomiceto Diplogelasinospora grovesii IMI 171018 80



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De la tabla anterior se puede deducir que de la colección estudiada, los

ascomicetos son el grupo taxonómico que presentan mayor actividad

reductasa mientras que las bacterias y levaduras son poco activos frente a

la reacción test propuesta.

En biotransformaciones catalizadas por células enteras la principal

limitación viene dada por el crecimiento no reproducible de la biomasa. Así,

para comprobar la reproducibilidad de los resultados obtenidos y evitar

seleccionar biocatalizadores con comportamientos poco reproducibles, se

llevó a cabo la reacción test por triplicado con los microorganismos que

presentan la mejor actividad reductasa.

Tabla 4-15. Reproducibilidad del screening.

Grupo Microorganismo Conversión (%)

s %CV 1º 2º 3º X

Ascomiceto Phialemonium curvatum 28 31 30 30 1,00 3

Ascomiceto Coniochaeta velutina 50 38 41 43 6,24 15

Ascomiceto Diplogelasinospora grovesii 82 80 81 81 1,00 1 X = conversión promedio; s = desviación estándar; %CV = coeficiente de variación.

De la Tabla 4-15, se deduce que los resultados obtenidos con el

ascomiceto Coniochaeta velutina son poco reproducibles al presentar datos

muy dispersos como lo demuestra el elevado valor del coeficiente de

variación (%CV=15). La reproducibilidad de los datos mejora con

Phialemonium curvatum, pero el sustrato presenta baja conversión

(X=30%); sin embargo, con Diplogelasinospora grovesii se obtiene la mejor

conversión de sustrato (X=81%) con el coeficiente de variación más bajo

(%CV=1%), razón por la cual se escogió a Diplogelasinospora grovesii

como el mejor candidato para realizar el estudio cinético de la reducción de

la acetofenona.



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con Diplogelasinospora grovesii se obtiene la mejor conversión de sustrato

(X=81%) con el coeficiente de variación más bajo (%CV=1%),

Diplogelasinospora grovesii IMI 171018 es un microorganismo que

muestra gran actividad como biocatalizador de células enteras para la

reducción de compuestos carbonílicos. Se trata de ascomiceto de

crecimiento muy rápido que desarrolla un color verde oscuro característico

aislado en Japón (Ver Figura 4-11). Existen referencias bibliográficas sobre

su capacidad para producir un compuesto de características

inmunosupresoras (Fujimoto y cols, 1998), pero nunca antes ha sido

descrito por sus características como biocatalizador.

Figura 4-11. D. grovesii en medio sólido HAGGS

4.3.2. Curva de Crecimiento

Es bien conocido que la facilidad de crecimiento de la cepa microbiana es

una de las características que llevan a seleccionar un microorganismo para

su posterior uso en biotransformaciones. Las células aisladas, cultivadas

en un volumen finito de medio de cultivo apropiado (reactor discontinuo),

van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficacia y



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rapidez que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y

dividiéndose en cuanto han podido duplicar su masa y su material genético.

Dado que en esta tesis intentamos llevar a cabo reacciones con células

libres, es importante la determinación del tiempo de crecimiento al cual se

tiene la mayor producción de enzima que interviene en el proceso; según la

bibliografía consultada, esto se logra cuando las células alcanzan la fase

estacionaria de crecimiento, esto se debe probablemente a que mientras

hay nutrientes en el medio el microorganismo crece incrementando la

biomasa y sólo al llegar a la fase estacionaria de crecimiento se inicia la

biotransformación (Cappaert y Larroche, 2004).

En la Tabla 4-16 se muestran los valores numéricos para la curva de

crecimiento del ascomiceto D. grovesii, expresados en peso seco.

Tabla 4-16. Peso Seco de D. grovesii para curva de crecimiento

Tiempo Peso Seco Promedio s %CV Días Gramos gramos

4 0,1860 0,1856 0,1837 0,19 0,0012 0,7% 5 0,2651 0,2639 0,2604 0,26 0,0024 0,9% 6 0,4264 0,4299 0,4242 0,43 0,0029 0,7% 7 0,4550 0,4579 0,4567 0,46 0,0015 0,3% 8 0,4548 0,4577 0,4566 0,46 0,0015 0,3% 9 0,2180 0,2171 0,2203 0,22 0,0017 0,8% 11 0,1809 0,1827 0,1847 0,18 0,0019 1,0% s = desviación estándar; %CV = coeficiente de variación;

Para observar mejor los resultados se construyó un gráfico de barras con

los tiempos de crecimiento del ascomiceto.



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Figura 4-12. Curva de crecimiento de D. grovesii expresado en peso seco

En la Figura 4-12 se puede observar que el ascomiceto D. grovesii alcanza

la fase estacionaria de crecimiento a los 7 días, después de los cuales el

microorganismo inicia la muerte celular. De esta manera quedó establecido

el tiempo de crecimiento de 7 días para llevar a cabo los ensayos cinéticos

para la reducción de la acetofenona toda vez que a este tiempo se obtiene

la mayor cantidad de biomasa y por ende la mayor producción de enzima

necesaria para esta biotransformación.

4.3.3. Estudio Cinético

Cuando se llevan a cabo reacciones con microorganismos, no todas las

moléculas del sustrato se encuentran disponibles para conversión

inmediata; la reacción tiene lugar únicamente después que el sustrato ha

sido transportado al lugar de reacción, por lo que los procesos de

transferencia de materia pueden ejercer una gran influencia sobre la

velocidad global de conversión. Cada célula responde a la concentración de

sustrato según su posición con una velocidad de reacción determinada por

los parámetros cinéticos del biocatalizador. La velocidad local de reacción

se denomina velocidad verdadera o velocidad intrínseca; las cuales son



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difíciles de medir en microorganismos. Sin embargo, es posible, medir la

velocidad global de reacción para el catalizador entero. En un sistema

cerrado, la velocidad de desaparición de sustrato en el seno del líquido

debe ser igual a la velocidad global de conversión por reacción, hecho que

en los sistemas heterogéneos se denomina velocidad observada. Cuando

los niveles de sustrato cambian lentamente durante la reacción, los datos

de velocidad observada pueden obtenerse recogiendo muestras de la

mezcla de reacción a diferentes tiempos y analizando la variación de la

concentración de sustrato. A modo de ejemplo se muestra en la siguiente

tabla la disminución de la concentración inicial de sustrato acetofenona (7.2

mM).

Tabla 4-17. Resultados del análisis por HPLC del consumo de acetofenona.

Tiempo ACETOFENONA Área Promedio

s %CV [mM] vial

[mM] matraz H Area1 area2 area3

0 1537.28000 1536.99889 1537.29876 1537.19255 0.168 0.01% 2.40 7.21 2 1449.38973 1449.36789 1450.00123 1449.58628 0.360 0.02% 2.27 6.80 4 1371.74578 1372.10023 1371.74806 1371.86469 0.204 0.01% 2.14 6.42 8 1238.45886 1239.20012 1238.45788 1238.70562 0.428 0.03% 1.93 5.79 12 1132.85038 1132.87569 1132.85043 1132.85883 0.015 0.00% 1.76 5.28 24 928.21452 928.22568 928.23618 928.22546 0.011 0.00% 1.44 4.31 48 772.30403 772.38762 772.34721 772.34629 0.042 0.01% 1.19 3.56 72 731.39665 732.78765 732.73635 732.30688 0.789 0.11% 1.12 3.37 96 722.18183 722.18765 722.19876 722.18941 0.009 0.00% 1.11 3.32 144 718.89793 718.89876 718.78965 718.86211 0.063 0.01% 1.10 3.31 192 718.68278 718.68753 718.69876 718.68969 0.008 0.00% 1.10 3.31 240 718.66356 718.67543 718.68546 718.67482 0.011 0.00% 1.10 3.31 264 718.66345 718.67876 718.98744 718.77655 0.183 0.03% 1.10 3.31

Pendiente: 628.77; ordenada: 25.344; muestra: 1500 uL; dilución: 3.

En la Tabla 4-17 se puede observar que las áreas del sustrato en los

cromatogramas presentan poca dispersión como lo demuestran los bajos

valores de la desviación estándar y del coeficiente de variación, lo que da

solidez al valor promedio tomado para la determinación de la disminución

de la concentración de la acetofenona en función del tiempo de reacción.

Para observar mejor los resultados obtenidos, en la figura 4-03 se muestra

la cinética de consumo del sustrato acetofenona catalizada por D. grovesii.



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f ( t ) = [ A. exp (- K . t) ] + C

d f(t) / dt = A. exp (-K.t) . -K

Figura 4-13. Cinética de consumo de Acetofenona 7,2 mM, a 30 ºC y 200

rpm catalizada por D. grovesii (26 g de peso húmedo).

En la Figura 4-13 se puede observar que los datos experimentales tienen

una tendencia de decaimiento exponencial, razón por la cual todos los

ensayos de consumo de sustrato fueron ajustados con el programa EXFIT

del paquete estadístico SIMFIT v5.5 ed 18 a un modelo de decaimiento

exponencial de la forma:

Donde:

K = Constante aparente de velocidad de consumo de sustrato. (h-1)

C = Valor asintótico cuando el tiempo decrece indefinidamente. (mM)

A = Gradiente de concentración entre el estado inicial y el tiempo t. (mM)

La derivada de la función f(t) es la expresión de la velocidad observada de

consumo de sustrato y toma la siguiente forma:



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d f(t) / dt = Vo = - A.K

La velocidad inicial del consumo de sustrato quedará determinada cuando t

tienda a cero; por lo que la expresión para calcular la velocidad inicial

observada de consumo de sustrato queda establecida como:

De igual manera cuando los niveles de producto cambian lentamente

durante la reacción, los datos de velocidad observada pueden obtenerse

recogiendo muestras de la mezcla de reacción a diferentes tiempos y

analizando la variación de la concentración de producto. A modo de ejemplo

se muestra en la siguiente tabla el incremento de la concentración de

producto 1-Feniletanol.

Tabla 4-18. Resultados del análisis por HPLC de la obtención del 1-Feniletanol.

Tiempo 1-FENILETANOL Area Promedio

s %CV [mM] vial

[mM] matraz H Area1 area2 area3

0 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 0.000 0.00% 0.00 0.00 2 308.4392 308.43786 308.65464 308.51057 0.125 0.04% 0.05 0.15 8 360.26123 360.26875 360.27893 360.26964 0.009 0.00% 0.10 0.30 12 409.66798 409.67875 409.66785 409.67153 0.006 0.00% 0.15 0.44 24 544.46389 544.46987 544.46785 544.46720 0.003 0.00% 0.27 0.82 48 762.44756 762.45674 762.48776 762.46402 0.021 0.00% 0.48 1.43 72 926.07894 926.87454 926.46373 926.47240 0.398 0.04% 0.63 1.89 96 1048.87654 1048.87567 1048.87645 1048.87622 0.000 0.00% 0.75 2.24 144 1210.56474 1210.67484 1210.98464 1210.74141 0.218 0.02% 0.90 2.69 192 1301.27375 1301.27746 1301.27565 1301.27562 0.002 0.00% 0.98 2.95 240 1352.53847 1352.54783 1352.53748 1352.54126 0.006 0.00% 1.03 3.09 264 1369.03127 1369.03284 1369.03245 1369.03219 0.001 0.00% 1.05 3.14 285 1369.02456 1369.02874 1369.02457 1369.02596 0.002 0.00% 1.05 3.14

Pendiente: 1065.2; ordenada: 254.08; muestra: 1500 uL; dilución: 3.

En la Tabla 4-18 se puede observar nuevamente una buena precisión en

los resultados obtenidos debido a los bajos valores de la desviación

estándar y del coeficiente de variación. Para observar mejor estos

resultados se muestra en forma gráfica la cinética de obtención de producto

1-Feniletanol catalizada por D. grovesii.



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y ( t ) = B . [ 1 - exp (- K . t) ]

d y(t) / dt = B. K. exp (-K.t)

Figura 4-14. Cinética de obtención del producto 1-feniletanol, a 30 ºC y

200 rpm catalizada por D. grovesii (26 g de peso húmedo).

En la Figura 4-14 se puede observar que los datos experimentales tienen

una tendencia de crecimiento exponencial, razón por la cual todos los

ensayos de obtención de producto fueron ajustados con el programa EXFIT

del paquete estadístico SIMFIT v5.5 ed 18 a un modelo de crecimiento

exponencial de la forma:

Donde:

K = Constante aparente de velocidad de aparición de producto. (h-1)

B = Máxima concentración de producto alcanzada. (mM)

La derivada de la función y(t) es la expresión de la velocidad observada de

aparición de producto y toma la siguiente forma:



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d y(t) / dt = Vo = B.K

La velocidad inicial de aparición del producto quedará determinada cuando t

tienda a cero; por lo que la expresión para calcular la velocidad inicial

observada de aparición de producto queda establecida como:

4.3.4. Orden de Reacción

Se define como orden de reacción a la suma de los exponentes a los que

van elevados las concentraciones de substrato en la expresión cinética

global y que suele indicar el número de moléculas implicadas en el paso

limitante de la velocidad de reacción. En nuestro caso sería “n” en la

siguiente expresión: V = k [S]n. Este parámetro se determina o bien

mediante el ajuste de los datos cinéticos a las ecuaciones integradas de

velocidad o bien realizando experimentos con concentraciones múltiplos de

un valor. Se analizó la relación entre la velocidad inicial de reacción y la

concentración inicial de sustrato para llevar a cabo la reducción de la

acetofenona catalizada con células de D. grovesii en estado de no

crecimiento a 200 rpm, pH = 6.5 y a T=30ºC. El análisis de datos cinéticos

de la reacción test se realizó con el programa EXFIT del paquete SIMFIT

v5.5, y en todos los casos se ajustaron con buena correlación (R2) a un

modelo de decaimiento exponencial de la siguiente forma: f(t) = A . exp(-k.t)

+ C; lo que indicaría que la reacción sigue una aparente cinética de primer

orden. Dadas las tendencias antes mencionadas y conocidas las

velocidades iniciales de reacción a dos concentraciones de sustrato se

calculó el orden de reacción según la siguiente ecuación:

n = [ ln ( V1 / V2 ) ] / [ ln ( [ S1 ] / [ S2 ] ) ]



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Los resultados de dos experimentos realizados para la determinar el orden

de reacción se muestran en la siguiente tabla.

Tabla 4-19: Orden de la Reacción de Reducción.

Exp. Cat Sustrato Vo Orden

G mM mM / h

1º 8.4749 2.90 0.03 1.2

9.5288 10.40 0.14

2º 26.0890 7.47 0.22 1.0

26.3571 18.70 0.55

En la Tabla 4-19 se puede observar que en cada uno de los dos

experimentos realizados el orden de la reacción de reducción de la

acetofenona catalizada por D. grovesii es prácticamente de orden uno

(pseudo primer orden), lo que justificaría el ajuste realizado de los datos

experimentales según el modelo de la ecuación de primer orden.

Asimismo se puede observar que la velocidad inicial de reacción en cada

uno de los experimentos realizados aumenta con el incremento de la

concentración de sustrato manteniendo cantidades similares de

biocatalizador, sin embargo, cabe resaltar que la disminución de la

velocidad inicial de reacción al incrementar la concentración inicial de

sustrato de 7.47 mM a 10.40 mM se debe al incremento de la cantidad de

biocatalizador empleada en la primera. Para poder evaluar el efecto del

biocatalizador en la cinética de la reacción de reducción de la acetofenona

se procedió a determinar las constantes específicas de la reacción, como se

indica en el siguiente a continuación.



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4.3.5. Parámetros Cinéticos

a. Parámetros Cinéticos del Sustrato Acetofenona:

En la siguiente tabla se muestran los principales parámetros cinéticos de la

reacción de reducción de la acetofenona catalizada por D. grovesii en

condiciones de no crecimiento. Los valores de las constantes A, K y C

fueron obtenidos con el programa EXFIT del paquete informático SIMFIT

v5.5 con buena correlación (R2=0.999).

Tabla 4-20: Parámetros cinéticos del Sustrato Acetofenona.

ACETOFENONA

Exp. Cat Sustrato A K C kesp Vo

G Mm Mm h-1 mM h-1 / gcat mM / h

1º 8.4749 2.9 2.018 0.01452 0.878 0.0050 0.03 9.5288 10.4 5.995 0.02291 4.386 0.0022 0.14

2º 26.0890 7.2 3.906 0.05678 3.308 0.0079 0.22 26.3571 18.7 7.423 0.07427 10.510 0.0040 0.55

En la Tabla 4-20 se puede observar que en cada uno de los dos

experimentos realizados la constante específica de velocidad kesp disminuye

ligeramente con el incremento de la concentración inicial de sustrato

manteniendo cantidades similares de biocatalizador, lo que puede deberse

a que el incremento de la concentración de sustrato origine toxicidad a la

célula causando inhibición de la enzima que cataliza el proceso de

reducción. Asimismo, podríamos afirmar que el valor de la constante

específica del consumo de acetofenona es del orden de 10-3 y que la

acetofenona inhibe al biocatalizador a concentraciones superiores a 7.2

mM.

b. Parámetros Cinéticos del Producto 1-Feniletanol:

En la siguiente tabla se muestran los principales parámetros cinéticos de la

obtención del 1-Feniletanol en la reacción catalizada por D. grovesii en

condiciones de no crecimiento. Los valores de las constantes B y K fueron



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obtenidos con el programa EXFIT del paquete informático SIMFIT v5.5 con

buena correlación (R2=0.999).

Tabla 4-21. Parámetros cinéticos del Producto de Reacción 1-Feniletanol.

1-FENILETANOL

Exp. Cat Sustrato B K kesp Vo

G Mm Mm h-1 h-1 / gcat mM / h

1º 8.4749 2.9 1.323 0.0039 0.00047 0.005 9.5288 10.4 3.294 0.0039 0.00041 0.013

2º 26.0890 7.2 3.267 0.0120 0.00046 0.039 26.3571 18.7 1.464 0.0105 0.00040 0.015

En la Tabla 4-21 se puede observar que en el primer experimento realizado

para la obtención del 1-Feniletanol la velocidad inicial de reacción aumenta

con el incremento de la concentración de sustrato manteniendo cantidades

similares de biocatalizador, mientras que la constante específica de

velocidad no varía sustancialmente. En el segundo experimento se observa

que la velocidad inicial de la reacción disminuye a medida que incrementa

la concentración de sustrato, lo que podría deberse a que el producto de

reacción también inhiba la enzima que cataliza el proceso; mientras que la

constante específica de velocidad no varía y mantiene el mismo valor que el

primer experimento. Asimismo, podríamos afirmar que el valor de la

constante específica de la obtención del 1-Feniletanol es del orden de 10-4 y

que la enzima se inhibe a concentraciones de sustrato superiores a 7.2 mM

manteniendo casi constante la velocidad global de generación de 1-

Feniletanol.

De la comparación de las Tablas 4-18 y 4-19 podemos afirmar que la

velocidad específica de consumo del sustrato acetofenona es

aproximadamente diez veces mayor que la velocidad específica de

obtención del producto 1-feniletanol.



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4.3.6. Productividad de la Biotransformación

En la siguiente tabla se muestran los resultados obtenidos de productividad

a fin de evaluar la actividad específica del biocatalizador D. grovesii en la

reacción de reducción de la acetofenona

Tabla 4-22. Productividad del 1-Feniletanol

Acetofenona 1-Feniletanol P x 10

4

Exp. Sustrato Cat X T Y T

mM G % H % H mM / gcat . h

1º 2.9 8.4749 70 255 46 827 1.9 10.4 9.5288 58 209 32 1068 3.2

2º 7.2 26.0890 54 77 45 347 3.6 18.7 26.3571 44 67 8 322 1.7

X=conversión; Y=Rendimiento; t=tiempo; P=Productividad.

En la Tabla 4-22 se puede observar que en cada uno de los experimentos

realizados la conversión y el rendimiento disminuyen al incrementar la

concentración de sustrato, lo que reafirma cierto grado de toxicidad para la

célula por parte del sustrato y producto de la reacción. Asimismo se puede

observar que a concentraciones bajas del sustrato acetofenona (2.9mM) y

altas (18.7mM) se obtienen bajas productividades por gramo de catalizador;

mientras que a concentraciones moderadas de sustrato acetofenona

(7.2mM y 10.4mM) las productividades mejoran sustancialmente.

La diferencia porcentual entre la conversión y el rendimiento de la reacción

hace suponer que la célula no sólo utiliza el sustrato acetofenona en la

reacción sino que consume parte de él para su aprovechamiento en el

incremento de la biomasa celular.



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V. CONCLUSIONES

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V. CONCLUSIONES



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V. CONCLUSIONES

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V. CONCLUSIONES

De la labor realizada en esta tesis, sobre la determinación de parámetros

cinéticos en la obtención de 1-Feniletanol empleando Diplogelasinospora

grovesii como biocatalizador en medio acuoso; podemos extraer, a nuestro

juicio, las siguientes conclusiones:

5.1 La cualificación de los equipos e instrumentos de laboratorio y la validación

de los métodos de análisis disminuyen considerablemente los errores en las

mediciones, que pueden afectar la precisión y exactitud de los análisis para

la determinación de los parámetros cinéticos en la obtención del 1-

Feniletanol.

5.2 De la búsqueda jerarquizada (screening) a partir de la colección propuesta,

para la obtención del 1-Feniletanol por reducción biocatalítica de la

acetofenona, las bacterias y levaduras presentan escasa actividad

reductasa, mientras que los ascomicetos tienen la mayor actividad

reductasa; así mismo se encontró un nuevo microorganismo,

Diplogelasinospora grovesii, que es un ascomiceto que lleva a cabo la

reacción con crecimiento reproducible, buenos rendimientos sin obtención

de productos secundarios.

5.3 El sustrato, acetofenona, es biotransformado satisfactoriamente cuando se

añade en la fase estacionaria de su crecimiento (7 dias) lo que indica que

cuando las células dejan de reproducirse son metabólicamente más activas

para llevar a cabo la biosíntesis del 1-Feniletanol.

5.4 La cinética del proceso de obtención del 1-Feniletanol empleando

Diplogelasinospora grovesii como biocatalizador en medio acuoso es de

pseudo primer orden como lo demuestran los resultados de los parámetros

cinéticos obtenidos; asimismo, la enzima se inhibe a concentraciones de



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V. CONCLUSIONES

102

sustrato (acetofenona) superiores a 7.2 mM manteniendo casi constante la

velocidad global de generación de 1-Feniletanol.

5.5 No todo el sustrato consumido por la célula (acetofenona) es utilizado en la

obtención del 1-Feniletanol debido a que parte de él es aprovechado para

incrementar la biomasa celular del ascomiceto.

5.6 El proceso de obtención del 1-feniletanol utilizado en esta tesis es

sostenible debido a que se lleva a cabo en medio acuoso, a temperatura

ambiente y presión atmosférica evitándose la utilización de disolventes

orgánicos contaminantes y catalizadores metálicos como el hidruro de litio y

aluminio y el borohidruro sódico que generan productos concomitantes en

la reacción.



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VI. BIBLIOGRAFÍA

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VI.BIBLIOGRAFÍA



Bibliot

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ía Quím

ica U

NT

VI. BIBLIOGRAFÍA

105

VI. BIBLIOGRAFÍA

1. Domènech, Xavier. “Química Verde”. 2005. 1era Edición. Rubens Editorial.

2. Quezada, M.A. “Reacciones estereoselectivas de reducción de cetonas y

oxidación de alcoholes empleando células enteras inmovilizadas”. Tesis Doctoral. 2006. UCM. España.

3. Alcalde M., Ferrer M., Plou F.J. y Ballesteros A. “Environmental biocatalysis:

from remediation with enzymes to novel green process”. Trends in Biotechnol.,2006. 24, 281-287.

4. Sheldon R.A. y van Rantwijk F. “Biocatalysis for sustainable organic synthesis”. Aust. J. Chem. 2004.57, 281-289

5. Schmid A., Hollmann F., ByungPark J. y Bühler B. “The use of enzymes in

chemical industry in Europe”. Curr. Opin.Biotechnol.2002. 13, 359-366

6. Faber K: “Biotransformations in Organic Chemistry”. 2001. 4º Edición. Springer – Verlag.

7. Faber K, Kroutil W. “New Enzymes for biotransformations”. Cur. .OpinionChem. Biol. 2005. 9, 181-187.

8. Faber K. “Biotransformations in Organic Chemistry”. 5th Edition. Springer-Verlag.2004.

9. Parachin, N.S.; Carlquist, M.; Gorwa-Grauslund, M. F. “Bioreduction” In

Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology., Flickinger, M.C., Ed. John Wiley and sons, Inc.: 2010.

10. Nayori, R. “Asymmetric Catalysis: Science and opportunities” (Nobel lecture). AngewChem. Int Edit2002, 41(12), 2008-2022.

11. Ma, J.-A.; Cahard, D. “Toward Perfect Catalytic Asymmetric Synthesis: Dual

Activation of the Electrophile and the Nucleophile. Angew. Chem. Int. Edit. 2004, 43(35), 4566-4583.

12. Burkhardt, E. R.; Matos, K. “Boron Reagents in Process Chemistry:

Excellent Tools for Selective Reductions” Chem Rev 2006, 106(7), 2617-2650.

13. Anastas, P.T.; Warner, J.C. “Green Chemistry: Theory and Practice”.

OxfordUniversityPress: Oxford, 1998.



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT

VI. BIBLIOGRAFÍA

106

14. Anastas, P.T. “Green Chemistry as applied to solvents” In. Clean Solvents – Alternative Media for Chemical reactions and Processing, Abraham, M.A.; Moens, L., Eds. 2002; Vol. 819, pp 1-9.

15. Tucker, J.L. “Green Chemistry: Cresting and Summit toward Sustainability”.

OrganicProcessResearch&Development, 2010, 14(2), 328-331.

16. Anastas, P.T. “Perspective on Green Chemistry: The most challenging

synthetic transformation. Tetrahedron2010, 66(5), 1026-1027.

17. Anastas, P.; Eghbali, N. “Green Chemistry: Principles and Practice”. Chem. Soc. Rev. 2010, 39(1), 301-312.

18. Anastas, P.T., Lankey R.L.: “Life cycle assessment and green chemistry: the

ying and yang of industrial ecologyGreen”. Green Chemistry 2000; 2 : 289-295.

19. J.V. Sinisterra. Biotransformations. Encyclopedia of Microbiology. (Moselio Schaechter, Editor), pp. 212-[251] Oxford: Elsevier

20. Arnold FH and Georgiou G (2003) Directed Enzyme Evolution: Screening and Selection Methods. Methods in Molecular Biology, vol. 230. USA: Humana Press.

21. May SW, Padgette SR (1983) Biotechnology 677

22. Hummel W, Kula MR (1989) Eur. J. Biochem. 184: 1

23. Willner I, Mandler D (1989) Enzyme Microb. Technol. 11: 467

24. Bj€orkling F, BouteljeJ,GatenbeckS,HultK,Norin T, Szmulik P (1985)

Tetrahedron 41: 1347.

25. Sánchez-Montero, J.M.; Sinisterra Gago, J.V. “Biocatálisis aplicada a la

Química Farmacéutica”. ANAL. REAL ACAD. NAC. FARM. 2007, 73 (4):

1199-1236.

26. Willner I, Mandler D (1989) Enzyme Microb. Technol. 11: 467

27. Chenault HK, Whitesides GM (1987) Appl. Biochem. Biotechnol. 14: 147

28. Wichmann R, Vasic-Racki D (2005) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 92: 225

29. Van der Donk WA, Zhao HM (2003) Curr. OpinionBiotechnol. 14: 421

30. Chen CS, Zhou BN, Girdaukas G, Shieh WR, VanMiddlesworth F, Gopalan AS, Sih CJ (1984) Bioorg. Chem. 12: 98



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT

VI. BIBLIOGRAFÍA

107

31. Shieh WR, Gopalan AS, Sih CJ (1985) J. Am. Chem. Soc. 107: 2993

32. Hoffmann RW, Ladner W, Helbig W (1984) Liebigs Ann. Chem. 1170

33. Nakamura K, Ushio K, Oka S, Ohno A (1984) Tetrahedron Lett. 25: 3979

34. Fuganti C, Grasselli P, Casati P, Carmeno M (1985) TetrahedronLett. 26: 101

35. Nakamura K, Kawai Y, Oka S, Ohno A (1989) Tetrahedron Lett. 30: 2245

36. Christen M, Crout DHG (1987) Bioreactors and Biotransformations, In: Moody GW, BakerPB (eds) Elsevier, London, p 213

37. Sakai T, Nakamura T, Fukuda K, Amano E, Utaka M, Takeda A (1986) Bull. Chem. Soc.Jpn. 59: 3185

38. Buisson D, Azerad R, Sanner C, Larcheveque M (1991) Tetrahedron Asymmetry 2: 987

39. Ushio K, Inoue K, Nakamura K, Oka S, Ohno A (1986) Tetrahedron Lett. 27: 2657

40. Kometani T, Kitatsuji E, Matsuno R (1991) Agric. Biol. Chem. 55: 867

41. Dahl AC, Madsen JO (1998) Tetrahedron Asymmetry 9: 4395

42. Buisson D, Azerad R (1986) Tetrahedron Lett. 27: 2631

43. Seebach D, Z€uger MF, Giovannini F, Sonnleitner B, Fiechter A (1984)

Angew. Chem. Int.Ed. 23: 151

44. Benach, J.; Atrian, S.; Gonzalez-Duarte, R.; Ladenstein, R. J. Mol. Biol. 1999, 289, 335–355.

45. Jornwall, H. Eur. J. Biochem. 1970, 16, 25–40.

46. Vanni, A.; Pessione, E.; Anfossi, L.; Baggiani, C.; Cavaleto, M.; Gulmini, M.; Giunta, C. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2001, 9, 283–291

47. Korkhin, Y.; Kalb, A. J.; Peretz, M.; Bogin, O.; Burstein,Y.; Fromlow, F. J. Mol. Catal. 1998, 278, 967–981.

48. Theorell, H.; Chanwe, B. Acta Chem. Scand. 1951, 5,1127–1144.

49. Svensson, S.; Hoog, J. O.; Schneider, G. Y.; Sandalova, T.J. Mol. Biol. 2000, 302, 441–453.



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VII. ANEXOS

108

VII. ANEXOS



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PROCEDIMIENTO NORMALIZADO

DE TRABAJO

Protocolo Nº: 1 Edición: 1ª

Sustituye a: No procede Edición: no procede

Cualificación de la Balanza Sartorious AG Germany CPA 224S.

Fecha de Emisión: 18 – 08 – 2010

Página: 1 de 9

Realizado por: Grupo de Investigación

Fecha: 10 – 08 – 2010

Comprobado por: Fecha:

Aprobado por: Dr José Vicente Sinisterra Gago Fecha: 16 – 08 – 2010

Otros aprobados: Fecha:

Facultad de Ingeniería Química Departamento de Química

Grupo de Investigación en Biotransformaciones y Productos Naturales

F.I.Q.

Cualificación de la Balanza Sartorious AG Germany CPA 224S



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Sustituye a: No procede Edición: No procede



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INDICE

1. Objetivo 3

2. Definiciones 3

3. Desarrollo 3

3.1. Principios Generales 3

3.2. Materiales y Reactivos 3

3.3. Procedimiento operativo 4

3.4. Datos obtenidos 5

3.5. Cálculos y Resultados 7

4. Bibliografía 9



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Cualificación de la balanza Sartorious AG Germany CPA 224S.

1. Objetivo

El objetivo del presente IT es cualificar la balanza Sartorious AG Germany CPA 224S.

2. Definiciones

Balanza Sartorious AG Germany CPA 224S

3. Desarrollo

4.1. Principios Generales

Es una balanza analítica con la que se cuenta en el laboratorio de

análisis Instrumental, la cual se utiliza en las prácticas de los alumnos de

la carrera de Ingeniería Química, y además en los análisis de

investigación de los diversos trabajos que se quiera realizar.

4.2. Materiales y Reactivos

- Balanza Sartorious AG Germany CPA 224S

- Viales de 3ml de capacidad

- Fiolas de 25ml, 50ml y 100ml

- Vaso de precipitación de 75 ml

- Papel blanco para pesar

- Agua destilada y purificada



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4.3. Procedimiento operativo

1. Lavar y secar las fiolas y los viales.

2. Enchufar la balanza analítica digital.

3. Encender la balanza. Pulsar el botón del lado izquierdo de la

pantalla.

4. Nivelar la balanza con el indicador burbuja que se encuentra

en la parte posterior derecha de la balanza.

5. Tarar la balanza. Pulsar el botón “TARAR”, y mostrara un

formato numérico 0.0000 en la pantalla lo que significa que

esta apta para pesar.

6. Enumerar los viales a utilizar desde 0 hasta 4.

7. Pesar cada vial vacio por cuatro veces, y anotar pesos

correspondientes.

8. Agregar agua destilada a cada vial, en diferentes volúmenes

de : 0.125ml, 0.250 ml, 0.500ml, 0.75ml y 1 ml

9. Cada vial lleno con cierta cantidad de volumen de agua

destilada debe ser pesado por cuatro veces consecutivas,

luego anotar los pesos correspondientes.

10. Pesar las fiolas vacías de 25 ml , 50ml y 100 ml por cuatro

veces cada una.

11. Agregar agua destilada a las fiolas en sus volúmenes

indicados.

12. Cada fiola llena debe ser pesada cuatro veces consecutivas, y

anotar los pesos correspondientes.

13. Apagar la balanza. Pulse el mismo botón que se utilizo para

encender

14. Desenchufar la balanza



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4.4. Datos obtenidos

- Rango de Cualificación de 0 a 1mL (Micropipetas)

Tabla N°1.

Tabla: Variación del peso respecto a un volumen definido.

Volumen (ml)

Peso vacío (g)

Peso lleno (g)

Peso del agua (g)

0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,1250 2,5675 2,6925 0,1250 0,1250 2,5675 2,6924 0,1249 0,1250 2,5675 2,6925 0,1250 0,1250 2,5674 2,6924 0,1250 0,2500 2,5653 2,8186 0,2533 0,2500 2,5653 2,8186 0,2533 0,2500 2,5653 2,8185 0,2532 0,2500 2,5653 2,8185 0,2532 0,5000 2,5212 3,0244 0,5032 0,5000 2,5214 3,0245 0,5031 0,5000 2,5213 3,0246 0,5033 0,5000 2,5214 3,0246 0,5032 0,7500 2,5880 3,3450 0,7570 0,7500 2,5879 3,3451 0,7572 0,7500 2,5879 3,3451 0,7572 0,7500 2,5880 3,3451 0,7571 1,0000 2,6015 3,6095 1,0080 1,0000 2,6015 3,6095 1,0080 1,0000 2,6014 3,6095 1,0081 1,0000 2,6015 3,6095 1,0080

Sustancia empleada: Agua destilada



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- Rango de Qualificación de 0 a 100mL (Fiolas)

Tabla N°2 Tabla: Variación del peso respecto a un volumen definido.

Volumen (ml)

Peso vacío

(g)

Peso lleno (g)

Peso del agua (g)

0 0,0000 0,0000 0,0000 25 32,6210 57,4679 24,8469 25 32,6210 57,4679 24,8469 25 32,6209 57,4680 24,8471 25 32,6209 57,4681 24,8472 50 41,9000 91,5981 49,6981 50 41,8999 91,5981 49,6982 50 41,8999 91,5981 49,6982 50 41,8998 91,5980 49,6982 75 51,1228 125,1712 74,0484 75 51,1228 125,1690 74,0462 75 51,1226 125,1675 74,0449 75 51,1224 125,1663 74,0439 100 58,6811 158,1665 99,4854 100 58,6808 158,1667 99,4859 100 58,6805 158,1666 99,4861 100 58,6806 158,1667 99,4861

Sustancia empleada: Agua destilada



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4.5. Cálculos y Resultados

- Rango de Cualificación de 0 a 1mL (Micropipetas)

PAQUETE : SIMFIT PROGRAMA : LINFIT ACCIÓN : Regresión lineal AUTOR : W. G. Bardsley, Universidad de Manchester, U. K. Línea/Análisis polinomial nº 1 ============================ Resultados para ajuste con pesos (w = 1/s^2) Modelo = Recta ajustada por mínimos cuadrados Parámetro Valor Error Est. Límites confianza 95% p ordenada (c) -2.805E-04 3.465E-04 -1.006E-03 4.448E-04 0.4283 ** pendiente(m) 1.009E+00 5.582E-04 1.007E+00 1.010E+00 0.0000 (R-cuadrado = 1.0000, R = 1.0000, p = 0.0000)

Figura N°1

Y = (1.009 ± t.sx) X – (0.0002805 ± t.sy)


y = 1.0086x - 0.0002

R2 = 1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Peso Teóricos (g)

Pe

sp

Re

ale

s (

g)



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- Rango de Qualificación de 0 a 100mL (Fiolas)

PAQUETE : SIMFIT PROGRAMA : LINFIT ACCIÓN : Regresión lineal AUTOR : W. G. Bardsley, Universidad de Manchester, U. K. Línea/Análisis polinomial nº 1 ============================ Resultados para ajuste con pesos (w = 1/s^2) Modelo = Recta ajustada por mínimos cuadrados Parámetro Valor Error Est. Límites confianza 95% p ordenada (c) -3.844E-02 1.872E-02 -7.834E-02 1.456E-03 0.0579 ** pendiente(m) 9.948E-01 3.767E-04 9.940E-01 9.956E-01 0.0000 (R-cuadrado = 0.9999, R = 1.0000, p = 0.0000)

Figura N°2

Y = (0.9948 ± t.sx) X – (0.03844 ± t.sy)


y = 0.9929x - 0.0341

R2 = 1

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120

Peso Teóricos (g)

Pe

sp

Re

ale

s (

g)



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4. Bibliografía

- Manual de Instrucciones de la Balanza Analítica: “HR Series

Instruction Manual”

- Certificado de la balanza

- Plan de Mantenimiento – Verificación – Calibración

- Certificado de calibración MS 90659, pesas de 10 mg -100 g. Clase

E2



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Cualificación del equipo Espectrofotómetro UV- visible Hewlett Packard Mod 8452 A


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Fecha: 10 – 08 – 2010






F.I.Q.

Cualificación del Equipo Espectrofotómetro UV- visible

Hewlett Packard Mod 8452 A



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INDICE

1. Objetivo 3

2. Definiciones 3

3. Desarrollo 3

3.1. Principios Generales 3

3.2. Máquinas 3

3.3. Reactivos 4

3.4. Procedimiento Operativo 4

3.5. Datos obtenidos 7

3.6. Cálculos y Resultados 9

4. Bibliografía 16



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Cualificación del Equipo Espectrofotómetro UV- visible Hewlett Packard

Mod 8452 A

1. Objetivo

El objetivo del presente PNT es cualificar el espectrofotómetro UV-

visible Hewlett Packard Mod 8452 A, Diode array spectrophotometer

2. Definiciones

Espectrofotómetro UV- visible Hewlett Packard Mod 8452 A, Diode array

spectrophotometer

CPU - VTC

Pantalla Sansung SiMaster 3

Estabilizador Pre Line Voltaje Regulador

3. Desarrollo

3.1. Principios Generales

Es el único instrumento de UV que cuenta el laboratorio de análisis

Instrumental, el cual se utiliza en las practicas de los alumnos de la

carrera de Ingeniería Química, y además en los análisis de investigación

de los diversos trabajos que requiera utilizar técnicas

espectrofotométricas a baja longitud de onda.

3.2. Máquinas

- Espectrofotómetro UV- visible Hewlett Packard Mod 8452 A, Diode

array spectrophotometer

- CPU- VTC

- Pantalla Sansung SiMaster

- Estabilizador Pre Line Voltaje Regulador



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3.3. Reactivos

- Agua destilada y purificada

- Los reactivos han de ser calidad ultravioleta

- Todos los reactivos deben ser guardados en un armario con sus

respectivas

- Indicaciones de seguridad de líquidos inflamables.

- Las Cubetas UV son de cuarzo y se deben lavar después de cada

ensayo con agua destilada. Como disolvente de lavándose

recomiendan disolventes no grasos v.g. EtOH, MeOH o acetona.

- Las cubetas de plástico utilizadas en el visible son desechables y

solo se pueden lavar con agua bidestilada

3.4. Procedimiento operativo

1. Encender el estabilizador

2. Encender el UV. Botón atrás al lado de la toma de corriente. Se inicia el

Test del UV.

3. El aparto inicia el scaneo de las lámparas. Si el test fue correcto, “lamp”

aparecerá en verde.

4. Encender el PC.- aparece la página principal

5. Instrument on line1, aparece la petición de password. No tiene

password, se dá OK.

6. Ir a File. “Load method”. Se carga el método deseado o uno que se

utilizará, una vez modificado para hacer los análisis.

7. En la pantalla principal hay dos cuadros generales a la izquierda. En el

superior hay:

Task.- es la ventana de opción de trabajo: Fixed wavelengths, Spectrum

/Peaks, Ratio/equation y Quantification.

8. El cuadro de abajo se centra en como trabajar: Manual etc, y hacer las

muestras.



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9. Ir a “Instrument”

10. Lamps y seleccionar encender la lámpara “ON”

11. “Set up spectrometer”se pone el intervalo de las longitudes de onda a las

que vamos a trabajar, v.g.: 210 a 310nm (UV) o 340-800nm (visible).

Tambien poner el tiempo de integración, v.g. 0,5sec.

12. En UV inicia el encendido- aparece BUSY en su display y en PC “Lamp

swiching in progress (Abajo)

13. Hacer un espectro.-Seleccionar Método.

14. Ir a Tasks y después a “Spectrum/peaks”

15. Set up.-me permite elegir cuantos picos quiero evaluar vg: 3 y cuantos

valles evaluar vg:2

16. Longitud de onda. Tiene por defecto 180 - 800nm. Poner 210-310 si

queremos trabajar en el UV y 330-800nm si queremos hacer un espectro

en la zona visible. También puedo elegir poner absorbancia o

transmitancia

17. Poner la cubeta de UV en el espectrofotómetro con el medio

(transparente al UV). Ir al cuadro de abajo a izquierda y marcar Blank.

Sale el blanco con un barrido de toda la zona.

18. Se activa ahora “Sample”

19. Meter ahora la cubeta con la sustancia a analizar y hacer el espectro.

Sale el espectro en la pantalla marcándose los picos, la absorbancia y

los valles.

20. Medir a distintas longitudes de onda

Se prepara una solución de benzoato de sodio, que vamos a considerar

como padrón de referencia para el análisis.

21. Ir a Tasks y seleccionar Fixed wavelengths

22. Marcar el set up aparece un cuadro de dialogo y se selecciona las 3

longitudes de onda. vg: 236; 254 y 270nm

23. El date time hay que indicar “absorbancia” .

24. El display spectrum se pone la longitud de onda el de 200 y 210.



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25. Hacer el blanco, usando el disolvente. En este caso concreto se usa

agua bidestilada de calidad Milli-Q

26. Se añaden 2 ml en la cubeta, después con la micropipeta se agregan

100 microlitros y se da en el cuadro de abajo sample apareciendo las

absorbancias a las tres longitudes de onda seleccionadas. Repetir los

ensayos sucesivamente hasta completar el rango de concentraciones.

27. Ir midiendo los valores de absorbancia obtenidos a las distintas

concentraciones en cubeta.

28. Representar la variación de la absorbancia con la concentración y

calcular la linealidad

29. Repetir diez veces la medida de absorbancia de una muestra para

determinar la repetitividad

30. Apagar el espectrómetro UV

31. Cerrar el cuadro principal

32. Guardar el método. OK

33. Crear carpeta JVS1 y mandar guardar

34. Aparece menú principal Windows

35. Inicio, cerrar

36. Ir al botón de encendido (detrás al lado de la toma de corriente del UV) y

cerrar

37. Apagar el ordenador

38. Cerrar el regulador de voltaje



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3.5. Datos obtenidos

Se tomaron los siguientes datos experimentales a partir de una muestra

benzoato de sodio de 0.528 mM, y se tomaron sus absorbancias a tres

longitudes de onda en el UV.

Cuadro N°1

Concentración de Benzoato de

Sodio (mM)

Absorbancia Absorbancia Absorbancia

PROCEDIMIENTO

236 nm 254 nm 270 nm

0.0000 0.0000 0.0000 0.0000

2mL Agua+ 0.1mL Muestra, agregamos continuamente

0.1mL muestra hasta volumen 3mL.

0.0250 0.1098 -0.0008 -0.0042 0.0480 0.2667 0.0231 0.0140 0.0689 0.3440 0.0351 0.0229 0.0880 0.4410 0.0502 0.0344 0.1056 0.5348 0.0655 0.0460 0.1219 0.6249 0.0797 0.0568 0.1389 0.7085 0.0928 0.0668 0.1509 0.7830 0.1051 0.0760 0.1639 0.8509 0.1177 0.0860 0.1760 0.9162 0.1318 0.0971 0.1320 0.6390 0.0831 0.0591

0.5mL Muestra + 1.5mL Agua,

agregamos continuamente 0.1mL Agua

hasta volumen 3mL

0.1257 0.6089 0.0786 0.0561 0.1200 0.5838 0.0777 0.0557 0.1148 0.5557 0.0706 0.0501 0.1100 0.5312 0.0667 0.0469 0.1056 0.5052 0.0625 0.0436 0.1015 0.4896 0.0613 0.0436 0.0978 0.4693 0.0570 0.0396 0.0943 0.4515 0.0553 0.0386 0.0910 0.4390 0.0562 0.0393 0.0880 0.4193 0.0502 0.0351 0.2640 0.2799 0.1157 0.0967

1mL Muestra +1mL Agua, agregamos continuamente

0.1mL Agua hasta volumen 3mL.

0.2514 1.2331 0.1780 0.1308 0.2400 1.1754 0.1684 0.1239 0.2296 1.1759 0.1677 0.1232 0.2200 1.1216 0.1596 0.1170 0.2112 1.0754 0.1527 0.1120 0.2031 1.0309 0.1462 0.1072 0.1956 0.9912 0.1401 0.1027 0.1886 0.9576 0.1398 0.1038 0.1821 0.9159 0.1287 0.0943 0.1760 0.8808 0.1235 0.0906



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Sodio (mM)


PROCEDIMIENTO

236 nm 254 nm 270 nm

0.5280 2.3675 0.4204 0.3188

2mL Muestra y 0.1mL Agua,


hasta volumen 3mL.

0.5029 2.3018 0.3996 0.3026 0.4800 2.2247 0.3768 0.2850 0.4591 2.1499 0.3597 0.2721 0.4400 2.0750 0.3440 0.2605 0.4224 2.0004 0.3294 0.2493 0.4062 1.9383 0.3167 0.2397 0.3911 1.8536 0.2996 0.2266 0.3771 1.8082 0.2918 0.2208 0.3641 1.7519 0.2804 0.2119 0.3520 1.6951 0.2713 0.2050 0.3960 1.8623 0.2929 0.2191

1.5mL Muestra + 0.5mL Agua,


hasta volumen 3mL.

0.3771 1.7823 0.2787 0.2084 0.3600 1.7086 0.2653 0.1987 0.3443 1.6369 0.2523 0.1886 0.3300 1.5711 0.2414 0.1806 0.3168 1.5097 0.2322 0.1740 0.3046 1.4557 0.2257 0.1692 0.2933 1.3992 0.2132 0.1594 0.2829 1.3494 0.2052 0.1533 0.2731 1.3009 0.1973 0.1473 0.2640 1.2577 0.1901 0.1421

Fuente: Módulo Experimental



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3.6. Cálculos y Resultados

Longitud de onda 236 nm:


Sodio (mM)

Absorbancia Concentración

de Benzoato de

Sodio (mM)

Absorbancia Concentración

de Benzoato de

Sodio (mM)

Absorbancia

236 nm 236 nm 236 nm

0.0000 0.0000 0.1389 0.7085 0.3046 1.4557 0.0250 0.1098 0.1509 0.7830 0.3168 1.5097 0.0480 0.2667 0.1639 0.8509 0.3300 1.5711 0.0689 0.3440 0.1760 0.8808 0.3443 1.6369 0.0880 0.4410 0.1760 0.9162 0.3520 1.6951 0.0880 0.4193 0.1821 0.9159 0.3600 1.7086 0.0910 0.4390 0.1886 0.9576 0.3641 1.7519 0.0943 0.4515 0.1956 0.9912 0.3771 1.7823 0.0978 0.4693 0.2031 1.0309 0.3771 1.8082 0.1015 0.4896 0.2112 1.0754 0.3911 1.8536 0.1056 0.5052 0.2200 1.1216 0.3960 1.8623 0.1056 0.5348 0.2296 1.1759 0.4062 1.9383 0.1100 0.5312 0.2400 1.1754 0.4224 2.0004 0.1148 0.5557 0.2514 1.2331 0.4400 2.0750 0.1200 0.5838 0.2640 1.2577 0.4591 2.1499 0.1219 0.6249 0.2731 1.3009 0.4800 2.2247 0.1257 0.6089 0.2829 1.3494 0.5029 2.3018 0.1320 0.6390 0.2933 1.3992 0.5280 2.3675

LINEALIDAD: PAQUETE : SIMFIT PROGRAMA : LINFIT ACCIÓN : Regresión lineal AUTOR : W. G. Bardsley, Universidad de Manchester, U. K.

Línea/Análisis polinomial nº 1

============================ Para una longitud de onda 236 nm : Resultados para ajuste con pesos (w = 1/s^2) Modelo = Recta ajustada por mínimos cuadrados Parámetro Valor Error Est. Límites confianza 95% p ordenada (c) -3.968E-02 8.923E-03 -5.795E-02 -2.140E-02 0.0001 pendiente(m) 5.326E+00 7.745E-02 5.167E+00 5.484E+00 0.0000 (R-cuadrado = 0.9969, R = 0.9985, p = 0.0000)



Bibliot

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Figura N°1.


y = 5.326x - 0.03968

R2 = 0.9969

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

Concentración mM

Ab

so

rban

cia

Y = (5.326 ± t.sx) X – (0.03968 ± t.sy)



Bibliot

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Sodio (mM)

Absorbancia Concentración de Benzoato de

Sodio (mM)

Absorbancia Concentración de Benzoato de

Sodio (mM)

Absorbancia

254 nm 254 nm 254 nm

0.0000 0.0000 0.1389 0.0928 0.3046 0.2257 0.0250 -0.0008 0.1509 0.1051 0.3168 0.2322 0.0480 0.0231 0.1639 0.1177 0.3300 0.2414 0.0689 0.0351 0.1760 0.1318 0.3443 0.2523 0.0880 0.0502 0.1760 0.1235 0.3520 0.2713 0.0880 0.0502 0.1821 0.1287 0.3600 0.2653 0.0910 0.0562 0.1886 0.1398 0.3641 0.2804 0.0943 0.0553 0.1956 0.1401 0.3771 0.2787 0.0978 0.0570 0.2031 0.1462 0.3771 0.2918 0.1015 0.0613 0.2112 0.1527 0.3911 0.2996 0.1056 0.0625 0.2200 0.1596 0.3960 0.2929 0.1056 0.0655 0.2296 0.1677 0.4062 0.3167 0.1100 0.0667 0.2400 0.1684 0.4224 0.3294 0.1148 0.0706 0.2514 0.1780 0.4400 0.3440 0.1200 0.0777 0.2640 0.1901 0.4591 0.3597 0.1219 0.0797 0.2731 0.1973 0.4800 0.3768 0.1257 0.0786 0.2829 0.2052 0.5029 0.3996 0.1320 0.0831 0.2933 0.2132 0.5280 0.4204

LINEALIDAD:

PAQUETE : SIMFIT PROGRAMA : LINFIT ACCIÓN : Regresión lineal AUTOR : W. G. Bardsley, Universidad de Manchester, U. K.


============================ Para una longitud de onda 254 nm : Resultados para ajuste con pesos (w = 1/s^2) Modelo = Recta ajustada por mínimos cuadrados Parámetro Valor Error Est. Límites confianza 95% p ordenada (c) -2.265E-02 9.959E-04 -2.465E-02 -2.065E-02 0.0000 pendiente(m) 8.252E-01 7.196E-03 8.107E-01 8.396E-01 0.0000 (R-cuadrado = 0.9975, R = 0.9987, p = 0.0000)



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Figura N°2


y = 0.8252x - 0.02265

R2 = 0.9975

-0.05

0.05

0.15

0.25

0.35

0.45

0.55

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Concentración mM

Ab

so

rban

cia

Y = (0.8252 ± t.sx) X – (0.02265 ± t.sy)



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Sodio (mM)

Absorbancia Concentración de

Benzoato de Sodio (mM)

Absorbancia Concentración de

Benzoato de Sodio (mM)

Absorbancia

270 nm 270 nm 270 nm

0.0000 0.0000 0.1389 0.0668 0.3046 0.1692 0.0250 -0.0042 0.1509 0.0760 0.3168 0.1740 0.0480 0.0140 0.1639 0.0860 0.3300 0.1806 0.0689 0.0229 0.1760 0.0971 0.3443 0.1886 0.0880 0.0344 0.1760 0.0906 0.3520 0.2050 0.0880 0.0351 0.1821 0.0943 0.3600 0.1987 0.0910 0.0393 0.1886 0.1038 0.3641 0.2119 0.0943 0.0386 0.1956 0.1027 0.3771 0.2084 0.0978 0.0396 0.2031 0.1072 0.3771 0.2208 0.1015 0.0436 0.2112 0.1120 0.3911 0.2266 0.1056 0.0436 0.2200 0.1170 0.3960 0.2191 0.1056 0.0460 0.2296 0.1232 0.4062 0.2397 0.1100 0.0469 0.2400 0.1239 0.4224 0.2493 0.1148 0.0501 0.2514 0.1308 0.4400 0.2605 0.1200 0.0557 0.2640 0.1421 0.4591 0.2721 0.1219 0.0568 0.2731 0.1473 0.4800 0.2850 0.1257 0.0561 0.2829 0.1533 0.5029 0.3026 0.1320 0.0591 0.2933 0.1594 0.5280 0.3188

LINEALIDAD: PAQUETE : SIMFIT PROGRAMA : LINFIT ACCIÓN : Regresión lineal AUTOR : W. G. Bardsley, Universidad de Manchester, U. K.


============================ Para una longitud de onda 270 nm : Resultados para ajuste con pesos (w = 1/s^2) Modelo = Recta ajustada por mínimos cuadrados Parámetro Valor Error Est. Límites confianza 95% p ordenada (c) -2.080E-02 5.793E-04 -2.196E-02 -1.964E-02 0.0000 pendiente(m) 6.307E-01 6.231E-03 6.182E-01 6.432E-01 0.0000 (R-cuadrado = 0.9967, R = 0.9983, p = 0.0000)



Bibliot

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Figura N°3.


y = 0.8252x - 0.02265

R2 = 0.9975

-0.05

0.05

0.15

0.25

0.35

0.45

0.55

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Concentración mM

Ab

so

rban

cia

Y = (0.8252 ± t.sx) X – (0.02265 ± t.sy)



Bibliot

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ENSAYO DE REPETITIVIDAD

Se realizaron diez ensayos de repetitividad a la misma concentración. Los

resultados obtenidos se muestran en la Tabla.

Concentración de Benzoato de Sodio (mM)


236 nm 254 nm 270 nm

0.0780 0.2783 0.076492 0.065033 0.0780 0.27954 0.07225 0.065369 0.0780 0.27879 0.06263 0.064911 0.0780 0.27838 0.075562 0.064163 0.0780 0.28433 0.081802 0.070236 0.0780 0.2834 0.080505 0.06955 0.0780 0.28435 0.080994 0.070007 0.0780 0.28389 0.080582 0.069336 0.0780 0.28281 0.079391 0.068268 0.0780 0.28603 0.082489 0.071075 x(promedio) 0.28199 0.07727 0.06779 S(desviación standard) 0.00291 0.00606 0.00263 CV (%) 1.0 7.8 3.9

Longitud de Onda(nm) 236 254 270

Límeite de Cuantificación(LQ) 0.0055 0.0734 0.0417

Límeite de Detección (LD) 0.0016 0.0220 0.0125



Bibliot

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4. Bibliografía

- User’s Guide HP part nº 08452-90008 2rd ed. Agosto 1993.

- Using Your Software HP8452A Diode Array Spectrophotometer. HP

part nº 89531-90000 Abril 1989.

- General Scanning Software HP part nº 89532-90001 Enero 1992.



Bibliot

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Cualificación del equipo HPLC Agilent 1100 Series Fecha de Emisión: 18 – 08 – 2010

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Fecha: 10 – 08 – 2010






F.I.Q.

Cualificación del Equipo HPLC Agilent 1100 Series



Bibliot

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INDICE

1. Objetivo 3

2. Responsabilidad de aplicación y alcance 3

3. Definiciones 3

4. Descripción del equipo 3

5. Desarrollo 4

5.1. Cualificación de los 04 canales de la

bomba cuaternaria 4

5.2. Cualificación del Sistema de Inyección 24

5.3. Cualificación del Detector UV-Vis

con arreglos de Diodos 29

5.4. Cualificación de la Columna Cromatográfica 31

6. Bibliografía 35



Bibliot

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Cualificación del Equipo HPLC Agilent 1100 Series.

1. Objetivo

Conocer el protocolo a seguir para la cualificación del equipo HPLC

Agilent 1100 Series con inyector automático, de la Facultad de

Ingeniería Química - Departamento de Química.

2. Responsabilidad de aplicación y alcance

El contenido de este protocolo debe ser conocido por todo el personal

del laboratorio involucrado en la cualificación del equipo HPLC Agilent

1100 Series.

3. Definiciones

El presente documento permite conocer el procedimiento a seguir en la

cualificación de cada componente del equipo de Cromatografía Liquida

de Alta Resolución (HPLC), el cual incluye:

- Cualificación de los 04 canales de la bomba cuaternaria

- Cualificación del inyector automático

- Cualificación del termostato para la columna cromatográfica

- Cualificación de la Columna Cromatográfica.

- Cualificación del Detector UV-Vis con arreglos de Diodos.

4. Descripción del equipo

Equipo HPLC gilent 1100 Series con inyector automático, desgasificador,

sistema de bombas cuaternario, detector UV-visible.

Columna: Teknokroma Mediterranea Sea C18 - 15cm * 0,46 * 5 um. Nº

Serie NF 03706

Detector: VWD (Variable Wavelenght Detector)

Software: Agilent ChemStation.



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5. Desarrollo

5.1. Cualificación de la Bomba Cuaternaria

La Cualificación de la bomba, significa realizar la comprobación de la

exactitud y precisión del caudal suministrado por la bomba a través de

los 04 canales del equipo cromatográfico. El procedimiento requiere

utilizar la columna estándar utilizada habitualmente en el equipo, (por

ejemplo: C-8 o C-18) ya que el sistema se debe estudiar su

funcionamiento como un todo durante un análisis cromatográfico.

La operación consiste en hacer pasar un solvente a través de uno de los

canales (por ejemplo: H2O) con caudales nominales de 0,50; 1,0; 1,5 y

2,0 mL/min y realizar la medición del solvente recogido a la salida del

sistema.

a. Procedimiento

1. Desconectar el conducto de desecho que se encuentra a la salida del

detector y colocar un vaso para evitar caídas del eluyente sobre el

detector

2. Numerar y pesar 5 tubos eppendorf para el flujo de 0,50 mL/min, y

otra cantidad similar para los flujos de 1,0 ; 1,50 y 2,0 mLmin .

3. Activar el funcionamiento la bomba del equipo.

4. Establecer el flujo de 0,500 mL/min para el canal “A” y dejar pasar la

fase móvil durante el tiempo suficiente para que la presión se

estabilice y que por todo el sistema circule el solvente emitido por la

bomba a través del canal “A”.

5. De manera sincronizada controlar 2 min y recoger el volumen de

eluyente que sale en ese tiempo.

6. Repetir ésta operación 5 veces (al mismo caudal), de tal manera que

se obtengan las 5 alícuotas del caudal.



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7. Repetir los pasos (5) y (6), pero ahora empleando flujos de 1,0 ; 1,50

y 2,0 mL/min

8. Pesar los tubos eppendorf que contienen la fase móvil recogida.

9. Determinar el volumen experimental recogido (usando la densidad

del eluyente a la temperatura del laboratorio) de las 05 lecturas para

cada uno de los flujos utilizados.

10. Determinar el valor promedio del volumen experimental recogido

para cada caudal utilizado.

11. Repetir todos los pasos para el canal “B”, “C” y “D”.

NOTA.

Este paso es importante porque permite evaluar y predecir posibles

fallos de bombeo, ensuciamiento de los filtros, problemas de las fritas,

presencia de material particulado que impide un libre flujo de la fase

móvil, etc.

b. Presentación de los resultados

Calcular para cada caudal nominal el valor promedio, la desviación

estándar y el error de la medida (superior e inferior). Representar los

valores promedio frente a los valores nominales y calcular la recta de

regresión que pasa por los puntos experimentales.

NOTA:

Si el sistema esta correcto, entonces se obtendrá u a recta de pendiente

igual a 1,0 y una ordenada no significativa.

La Cualificación de la bomba, significa realizar la comprobación de la

exactitud y precisión del caudal suministrado por la bomba a través de



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5.1.1. Cualificación del canal “A”

a. Datos Tomados:

Temperatura: 19 ºC

Densidad (19 ºC) = 0,99688 g/cm3

“t” Student al 99% = 3,747

Tiempo de recepción de agua en todas las pruebas = 2 minutos

Fase Móvil utilizada en todas las mediciones = Agua ultrapura miliQ

W tv = peso tubo vacío

Wtv + H2O = peso tubo vacío + agua recogida

Cuadro N°1.

Nª

Replica Flujo

(mL/min) Wtv (g)

Wtv + H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (mL)

1 0,50 9.5909 10.5933 0.5012 0.5019

2 0,50 9.3325 10.3177 0.4926 0.4933

3 0,50 9.5894 10.574 0.4923 0.4930

4 0,50 9.395 10.3891 0.4971 0.4977

5 0,50 9.3444 10.3405 0.4981 0.4987

Prom 0.4969

Desv Std 0.0038

%C.V. 0.7627

Lim Max 0.5032

Lim Min 0.4910

Cuadro N°2

Nº Replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv + H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (mL)

1 1.0 9.6290 11.6483 1.0097 1.0110

2 1.0 9.5696 11.5709 1.0007 1.0020

3 1.0 9.3236 11.3265 1.0015 1.0028

4 1.0 9.6457 11.6516 1.0030 1.0043

5 1.0 9.6016 11.6091 1.0038 1.0051

Prom 1.0050

Desv Std 0.0036

%C.V. 0.3534

Limite Max 1.0110

Limite Min 0.9995



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Cuadro N°3

Nº Replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv + H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (mL)

1 1.5 9.6523 12.6619 1.5048 1.5068

2 1.5 9.6199 12.6326 1.5064 1.5083

3 1.5 9.5719 12.5775 1.5028 1.5048

4 1.5 9.6392 12.6433 1.5021 1.5040

5 1.5 9.3157 12.3467 1.5155 1.5175

Prom 1.5083

Desv Std 0.0054

%C.V. 0.3594

Lim Max 1.5174

Lim Min 1.4999

Cuadro N°4

Nº Replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv + H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 2.0 9.6517 13.6185 1.9834 1.9860

2 2.0 9.6117 13.648 2.0182 2.0208

3 2.0 9.3242 13.3244 2.0001 2.0027

4 2.0 9.616 13.6202 2.0021 2.0047

5 2.0 9.6787 13.6888 2.0051 2.0077

Prom 2.0044

Desv Std 0.0125

%C.V. 0.6217

Lim Max 2.0253

Lim min 1.9850

Cuadro N°5

Nº Replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv + H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 3.0 9.6172 15.492 2.9374 2.9413

2 3.0 9.4789 15.4659 2.9935 2.9975

3 3.0 9.4795 15.4677 2.9941 2.9981

4 3.0 9.5439 15.5241 2.9901 2.9941

5 3.0 9.5457 15.5432 2.9988 3.0027

Prom 2.9867

Desv Std 0.0256

%C.V. 0.8566



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Lim Max 3.0296

Lim min 2.9470

Cuadro N°6

Nº replica Flujo

(mL/min) Wtv (g)

Wtv + H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 4,0 9.6091 17.5511 3.9710 3.9762

2 4,0 9.597 17.5221 3.9626 3.9678

3 4,0 9.3127 17.2742 3.9808 3.9860

4 4,0 9.6128 17.5759 3.9816 3.9868

5 4,0 9.4117 17.3807 3.9845 3.9898

Prom 3.9813

Desv Std 0.0091

%C.V. 0.2290

Lim Max 3.9966

Lim Min 3.9672

b. Resumen de Cualificación Canal “A” (Comparación por Pares de

Medidas)

Cuadro N°7

Nº Dato

Flujo Teórico (mL/min)

Flujo Exp (mL/min)

1 0.5 0,4969

2 1,0 1,0050

3 1,5 1,5083

4 2,0 2,0044

5 3.0 2,9867

6 4.0 3,9813



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 9 de 35

Figura N°1.

Cualificación del Canal "A"

y = 0.9935x + 0.0101

R2 = 1

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4


Flu

jo T

eó

ric

o (

mL

/min

)

Cuadro N°8.

Nº Flujo Teórico Flujo Exp Desv Individual (di - d)2

Dato (mL/min) (mL/min) (di)

1 0.5 0.4969 0.0031 0.000010

2 1.0 1.005 -0.0050 0.000025

3 1.5 1.5083 -0.0083 0.000069

4 2.0 2.0044 -0.0044 0.000019

5 3.0 2.9867 0.0133 0.000177

6 4.0 3.9813 0.0187 0.000350

Σ 0.0174 0.000649

Desviación media (d) = Σ di /n = 0.0174 / 6 = 0.0029

Desviación estándar (Sd) = [Σ (di – d)2/(n – 1)]1/2 = [6,49*10-4 /(6 – 1)]1/2 =

0.0114

“t” de student calculada (tcal) = [d * (n)1/2]/Sd = [0.0029* (6)1/2]/0.0114

= 0,623



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 10 de 35

De tablas el valor de “t” de student tabulada al 95% ( ttab ) y para n = 6,

se tiene

T tab = 2,015

Como Tcal < t tab , entonces se concluye que experimentalmente los

valores obtenidos son estadísticamente iguales a los valores teóricos


5.1.2. Cualificación del canal “B”

a. Datos Tomados:

Temperatura: 19 ºC ;


“t” Student al 99% = 3,747





Cuadro N°9

No replica Flujo

(mL/min) Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 0.5 9.646 10.6091 0.9631 0.4822

2 0.5 9.3231 10.248 0.9249 0.4630

3 0.5 9.6152 10.5488 0.9336 0.4674

4 0.5 9.5746 10.5077 0.9331 0.4672

5 0.5 9.6003 10.5485 0.9482 0.4747

Prom 0.4709

Desv Std 0.0076

%C.V. 1.6087

Lim Max 0.4836

LimMin 0.4591



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 11 de 35

Cuadro N°10

No replica Flujo

(mL/min) Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 1.0 7.0082 8.9891 1.9809 0.9918

2 1.0 6.92 8.9217 2.0017 1.0022

3 1.0 7.1304 9.1282 1.9978 1.0002

4 1.0 7.0951 9.0948 1.9997 1.0012

5 1.0 7.0859 9.0842 1.9983 1.0005

Prom 0.9992

Desv Std 0.0042

%C.V. 0.4209

Lim Max 1.0062

Lim min 0.9926

Cuadro N°11

No replica Flujo

(mL/min) Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 1.5 6.8941 9.8923 2.9982 1.5011

2 1.5 6.8406 9.845 3.0044 1.5042

3 1.5 6.793 9.7952 3.0022 1.5031

4 1.5 6.9035 9.9212 3.0177 1.5108

5 1.5 6.7591 9.7691 3.01 1.5070

Prom 1.5052

Desv Std 0.0038

%C.V. 0.2519

Lim Max 1.5116

Lim min 1.4993

Cuadro N°12

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 2.0 6.8125 10.8129 4.0004 2.0028

2 2.0 6.8983 10.8955 3.9972 2.0012

3 2.0 6.9239 10.9176 3.9937 1.9995

4 2.0 6.9004 10.8943 3.9939 1.9996

5 2.0 6.9074 10.91 4.0026 2.0039

Prom 2.0014

Desv Std 0.0020

%C.V. 0.0984



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 12 de 35

Lim Max 2.0047

Lim min 1.9984

Cuadro N°13.

No replica Flujo

(mL/min) Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 3.0 6.8174 12.7925 5.9751 2.9915

2 3.0 7.1447 13.1623 6.0176 3.0128

3 3.0 7.0853 13.0444 5.9591 2.9835

4 3.0 7.0948 13.0875 5.9927 3.0003

5 3.0 6.8994 12.8665 5.9671 2.9875

Prom 2.9951

Desv Std 0.0117

%C.V. 0.3898

Lim Max 3.0147

Lim min 2.9770

Cuadro N°14.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 4.0 7.0703 14.9403 7.87 3.9402

2 4.0 7.1118 15.0611 7.9493 3.9799

3 4.0 7.0102 14.9629 7.9527 3.9816

4 4.0 7.0201 15.0146 7.9945 4.0025

5 4.0 6.9176 14.853 7.9354 3.9729

Prom 3.9754

Desv Std 0.0226

%C.V. 0.5681

Lim Max 4.0133

Lim min 3.9404

b. Resumen de Cualificación Canal “B” (Comparación por Pares de

Medidas)



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 13 de 35

Cuadro N°15.

Dato Flujo Teórico

(mL /min) Flujo Exp (mL/min)

1 0.5 0,4709

2 1,0 0,9992

3 1,5 1,5052

4 2,0 2,0014

5 3,0 2,9951

6 4,0 3,9754

Figura N°2.

Cualificación del Canal "B"

y = 0.9986x + 0.0059

R2 = 1

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4


Flu

jo T

eó

ric

o (

mL

/min

)

Cuadro N°16.



1 0.5 0.4709 0.0291 0.000847

2 1.0 0.9992 0.0008 0.000001

3 1.5 1.5052 -0.0052 0.000027

4 2.0 2.0014 -0.0014 0.000002

5 3.0 2.9951 0.0049 0.000024

6 4.0 3.9754 0.0246 0.000605

Σ 0.0528 0.001506



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 14 de 35

Desviación media (d) = Σ di /n = 0.0528 / 6 = 0.0088

Desviación estándar (Sd) = [Σ(di – d)2/(n – 1)]1/2 =[1,506*10-3/(6 – 1)]1/2

= 0.0174

“t” de student calculada ( tcal) =[d*(n)1/2]/Sd = [0.0088*(6)1/2]/0.0174

= 1,2388


se tiene

T tab = 2,015




5.1.3. Cualificación del canal “C”

a. Datos Tomados:



“t” Student al 99% = 3,747







Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 15 de 35

Cuadro N°17.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 0.5 7.0794 8.0811 1.0017 0.5015

2 0.5 7.1741 8.175 1.0009 0.5011

3 0.5 7.2181 8.2179 0.9998 0.5006

4 0.5 7.1144 8.1165 1.0021 0.5017

5 0.5 7.2225 8.2164 0.9939 0.4976

Prom 0.5005

Desv Std 0.0017

%C.V. 0.3350

Lim Max 0.5033

Lim min 0.4979

Cuadro N°18.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 1.0 7.5557 9.5556 1.9999 1.001271679

2 1.0 7.5194 9.5234 2.004 1.003324388

3 1.0 7.5342 9.5314 1.9972 0.999919894

4 1.0 7.4965 9.4875 1.991 0.9968

5 1.0 7.4856 9.4733 1.9877 0.9952

Prom 0.9993

Desv Std 0.0033

%C.V. 0.3309

Lim Max 1.0048

Lim min 0.9942

Cuadro N°19.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 1.5 7.5704 10.5648 2.9944 1.4992

2 1.5 7.5183 10.5054 2.9871 1.4955

3 1.5 7.5241 10.5266 3.0025 1.5032

4 1.5 7.5438 10.5371 2.9933 1.4986

5 1.5 7.5195 10.5128 2.9933 1.4986

Prom 1.4990

Desv Std 0.0028

%C.V. 0.1836



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 16 de 35

Lim Max 1.5037

Lim min 1.4948

Cuadro N°20.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 2.0 7.5023 11.5005 3.9982 2.0017

2 2.0 7.5305 11.5192 3.9887 1.9970

3 2.0 7.4749 11.4638 3.9889 1.9971

4 2.0 7.5455 11.5434 3.9979 2.0016

5 2.0 7.574 11.56 3.986 1.9956

Prom 1.9986

Desv Std 0.0029

%C.V. 0.1427

Lim Max 2.0034

Lim min 1.9942

Cuadro N°21.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 3.0 7.4709 13.4576 5.9867 2.9973

2 3.0 7.5563 13.5225 5.9662 2.9870

3 3.0 7.613 13.5917 5.9787 2.9933

4 3.0 7.518 13.4843 5.9663 2.9871

5 3.0 7.5291 13.5039 5.9748 2.9913

Prom 2.9912

Desv Std 0.0044

%C.V. 0.1456

Lim Max 2.9985

Lim Min 2.9845



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 17 de 35

Cuadro N°22.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 4.0 7.4654 15.4133 7.9479 3.9792

2 4.0 7.5011 15.4529 7.9518 3.9812

3 4.0 7.4843 15.4339 7.9496 3.9800

4 4.0 7.526 15.4686 7.9426 3.9765

5 4.0 7.5144 15.4384 7.924 3.9672

Prom 3.9768

Desv Std 0.0056

%C.V. 0.1416

Lim Max 3.9863

Lim min 3.9681



b. Resumen de Cualificación Canal “C” (Comparación por Pares de

Medidas)

Cuadro N°23.

No Dato


Flujo Exp (mL/min)

1 0,5 0,5005

2 1,0 0,9993

3 1,5 1,4990

4 2,0 1,9986

5 3,0 2,9912

6 4,0 3,9768



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 18 de 35

Figura 3.

Cualificación del Canal "C"

y = 0.9936x + 0.0071

R2 = 1

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4


Flu

jo T

eó

ric

o (

mL

/min

)

Cuadro N°24.



1 0.5 0.5005 -0.0005 0.000000

2 1.0 0.9993 0.0007 0.000000

3 1.5 1.499 0.0010 0.000001

4 2.0 1.9986 0.0014 0.000002

5 3.0 2.9912 0.0088 0.000077

6 4.0 3.9768 0.0232 0.000538

Σ 0.0346 0.000619

Desviación media (d) = Σ di /n = 0.0346/6 = 0.0058

Desviación estándar (Sd) = [Σ (di – d)2 / (n – 1)]1/2 = [6,19*10-4/(6 – 1) ]1/2

= 0,0111

“t” de student calculada ( tcal )= [d*(n)1/2]/Sd = [0.0058*(6)1/2]/0.0111

= 1,28



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 19 de 35

De tablas el valor de “t” de student tabulada al 95% (ttab) y para n = 6, se

tiene:

T tab = 2,015




5.1.4. Cualificación del canal “D”

a. Datos Tomados:



“t” Student al 99% = 3,747





Cuadro N°25

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 0.5 9.6058 10.6054 0.9996 0.5005

2 0.5 9.4025 10.4227 1.0202 0.5108

3 0.5 9.3324 10.3594 1.027 0.5142

4 0.5 9.3525 10.3844 1.0319 0.5166

5 0.5 9.6567 10.6781 1.0214 0.5114

Prom 0.5107

Desv Std 0.0062

%C.V. 1.2094

Lim Max 0.5210

Lim min 0.5011



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 20 de 35

Cuadro N°26.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 1.0 9.3392 11.3496 2.0104 1.0065

2 1.0 9.582 11.5852 2.0032 1.0029

3 1.0 9.6158 11.5929 1.9771 0.9899

4 1.0 9.5867 11.5653 1.9786 0.9906

5 1.0 9.6916 11.6904 1.9988 1.0007

Prom 0.9981

Desv Std 0.0075

%C.V. 0.7519

Lim Max 1.0107

Lim min 0.9865

Cuadro N°27.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 1.5 9.5733 12.5795 3.0062 1.5051

2 1.5 9.5572 12.5569 2.9997 1.5018

3 1.5 9.582 12.5958 3.0138 1.5089

4 1.5 9.6133 12.6186 3.0053 1.5046

5 1.5 9.6095 12.6074 2.9979 1.5009

Prom 1.5043

Desv Std 0.0031

%C.V. 0.2082

Lim Max 1.5095

Lim min 1.4994

Cuadro N°28.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 2.0 9.3697 13.3615 3.9918 1.9985

2 2.0 9.3369 13.3157 3.9788 1.9920

3 2.0 9.6712 13.6595 3.9883 1.9968

4 2.0 9.6503 13.6252 3.9749 1.9901

5 2.0 9.6241 13.6063 3.9822 1.9937

Prom 1.9942

Desv Std 0.0034

%C.V. 0.1727



Bibliot

eca d

e Ing

enier

ía Quím

ica U

NT


DE TRABAJO




Página: 21 de 35

Lim Max 2.0000

Lim min 1.9889

Cuadro N°29.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 3.0 9.6417 15.6063 5.9646 2.9862

2 3.0 9.4181 15.3813 5.9632 2.9855

3 3.0 9.617 15.6021 5.9851 2.9965

4 3.0 9.3298 15.2875 5.9577 2.9828

5 3.0 9.6308 15.6092 5.9784 2.9932

Prom 2.9888

Desv Std 0.0057

%C.V. 0.1919

Lim Max 2.9985

Lim min 2.9799

Cuadro N°30.

No replica

Flujo (mL/min)

Wtv (g)

Wtv+H2O (g)

W H2O (g)

Vol. Real (ml)

1 4.0 9.4933 17.4421 7.9488 3.9797

2 4.0 9.6121 17.555 7.9429 3.9767

3 4.0 9.3297 17.3107 7.981 3.9958

4 4.0 9.6228 17.5707 7.9479 3.9792

5 4.0 9.6284 17.5738 7.9454 3.9780

Prom 3.9819

Desv Std 0.0079

%C.V. 0.1975

Lim Max 3.9950

Lim min 3.9696



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b. Resumen de Cualificación Canal “D” (Comparación por Pares de

Medidas)

Cuadro N°31.

No Dato


Flujo Exp (mL/min)

1 0,5 0.5107

2 1,0 0.9981

3 1,5 1.5043

4 2,0 1.9942

5 3,0 2.9888

6 4,0 3.9819

Figura N°4.

Cualificación del Canal "D"

y = 0.9936x + 0.0071

R2 = 1

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4


Flu

jo T

eó

ric

o (

mL

/min

)



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Cuadro N°32.

Nº Flujo Teórico Flujo Exp Desv individual (di - d)2

Dato (mL/min) (mL/min) Di

1 0.5 0.5107 -0.0107 0.000114

2 1.0 0.9981 0.0019 0.000004

3 1.5 1.5043 -0.0043 0.000018

4 2.0 1.9942 0.0058 0.000034

5 3.0 2.9888 0.0112 0.000125

6 4.0 3.9819 0.0181 0.000328

Σ 0.0220 0.000623

Desviación media (d) = Σ di/n = 0.0220 / 6 = 0.0037

Desviación estándar (Sd) = [Σ(di – d)2/(n – 1)]1/2 = [6.23*10-4/(6 – 1)]1/2

= 0.0112

“t” de student calculada ( tcal ) = [d*(n)1/2]/Sd = [0.0037*(6)1/2]/0.0112

tcal = 0,809


se tiene

T tab = 2,015


valores obtenidos son estadísticamente iguales a los valores teoricos




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5.2. Cualificación del Sistema de Inyección

Implica evaluar dos aspectos fundamentales del sistema de inyección

automático, que nos permitirá tener la seguridad sobre los resultados

obtenidos en cuanto a su reproducibilidad y precisión:

A. Precisión del inyector.

B. Magnitud del efecto memoria (efecto “carry over”).

A. Precisión del inyector

Se llevará a cabo la evaluación de la precisión del sistema de inyección

manual mediante una secuencia de cinco inyecciones de una disolución

estándar de naftaleno (0.100 mg/ml en acetonitrilo) empleando las

siguientes condiciones cromatográficas:


Fase móvil : Metanol/agua (45/55 v/v).




Temperatura del horno de columna: 30 ºC.

Presión del equipo : 39 bar.

a. Procedimiento

1. Poner en funcionamiento el equipo.

2. Seleccionar un flujo de 1.00 mL/min y dejar pasar la fase móvil

durante el tiempo suficiente para que la presión se estabilice y que

por todo el sistema circule el solvente de la bomba.

3. Inyectar 10 µl de la disolución estándar.

4. Repetiremos esta última operación 5 veces con esas condiciones

cromatográficas.



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5. Anotar el tiempo de retención y el área para cada una de las

inyecciones de la disolución estándar.


Calcular el valor promedio, la desviación estándar y el error en la medida

(superior e inferior) de los tiempos de retención y las áreas de pico.

B. Magnitud del efecto memoria (efecto “carry over”)

Este parámetro nos permite determinar la contaminación producida por

la inyección anterior si no se limpia correctamente el “loop” del inyector

automático después de cada inyección.

Para determinar este parámetro se debe inyectar la disolución estándar

y luego se debe inyectar una inyección en blanco (como blanco usamos

la fase móvil) y se observa si en el cromatograma aparece señal en el

tiempo de retención de compuesto de la disolución estándar

(acetofenona).

A continuación se repetirá el ensayo pero realizando la inyección con

lavado, para verificar si hay algún cambio en la señal.

a. Procedimiento


2. Seleccionar un flujo de 1,00 ml/min y dejar pasar la fase móvil



3. Programar el instrumento para que inyecte secuencialmente 10 µl de

la disolución estándar y luego 10 µl del blanco.

4. Repetiremos los pasos c) y d) tres veces cada uno.



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inyecciones de la disolución estándar y del blanco.

6. Repetir el ensayo pero dejando usando la opción “inyección con

lavado”


inyecciones de la disolución estándar y del blanco.


Calcular el valor promedio, la desviación estándar y el error en la medida

(superior e inferior) de los tiempos de retención y de las áreas de pico.

Asimismo se calculará la relación de áreas (en %) entre el pico

encontrado del blanco y el pico de la disolución estándar.

5.2.1. Precisión del inyector:

Cuadro N°33.

Nº muestra tiempo retención (min) Área

1 4,693 2640,5

2 4,705 2538,8

3 4,703 2630,1

4 4,707 2612,3

5 4,707 2628,7

Promedio 4,703 2610,1


Limite Superior (95%) 4,710 2661,13

Límite inferior (95%) 4,696 2559,07



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5.2.2. Magnitud del efecto memoria (efecto “carry over”)

5.2.2.1. Efecto Carry Over (Sin limpiar el sistema)

Cuadro N°34.

Nº muestra tiempo retención (min)

Área (mV)

1 4,708 2460,8

2 4,712 2452,1

3 4,733 2523,8

Promedio 4,718 2478,9


Limite Superior (95%) 4,7513 2576,105

Límite inferior (95%) 4,6847 2381,695

Cuadro N°35.

Nº blanco Tiempo retención (min) Área % Área

1 4,736 24,4 0,99

2 4,754 15,8 0,64

3 4,760 29,3 1,16

Promedio 4,750 23,167 0,93

Desv. Estándar 0,0125 6,8340 0,2634

Limite Superior (95%) 4,7811 40,145 1,7223

Límite Inferior (95%) 4,7190 6,1890 0,1422



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5.2.2.2. Efecto Carry Over (utilizando opción inyección con

lavado)

Cuadro N°36.

Nº muestra Tiempo retención (min)

Área (mV)

1 4,741 2686,8

2 4,741 2688,5

3 4,743 2799,3

Promedio 4,742 2724,87


Límite Superior(95%) 4,7451 2885,03

Límite Inferior(95%) 4,7382 2564,71

Cuadro N°37.

Nº blanco Tiempo retención (min) Área (mV) % Área

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

Promedio - - -

Desv. Estándar - - 0,0000

Limite Superior - - 0,0000

Límite Inferior - - 0,0000

Programando la opción con lavado desde la ventana del inyector

automático, se le deja realizar la serie de pinchazos correspondientes,

con lo cual conseguimos que el “loop” se limpie correctamente no

quedando residuos de muestra de la inyección anterior.



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5.3. Cualificación del Detector UV-Vis

La cualificación del detector tiene como objetivo comprobar la linealidad

de la detección a una longitud de onda determinada (por ejemplo: 254

nm) dentro de un rango de absorbancia que se considera normal (0.0 -

2.0).

Se llevará a cabo la evaluación del detector mediante una secuencia de

tres inyecciones de cinco disoluciones estándar de acetofenona (0.050,

0.150, 0.250, 0.350 y 0.500 mg/ml respectivamente en metanol/agua)

empleando las siguientes condiciones cromatográficas:


Fase móvil: metanol/agua (45/55 v/v).

Flujo de la fase móvil: 1,00 ml/min.

Longitud de onda del detector: 254 nm.

Volumen de inyección: 10 µl.

Temperatura del horno de columna: 30 ºC.

Presión del equipo: 39 bar.

a. Procedimiento


2. Seleccionar un flujo de 1.00 ml/min y dejar pasar la fase móvil



3. Inyectar 10 µl de la disolución estándar nº1.


cromatográficas.

5. Repetir el ensayo con el resto de disoluciones estándar.


inyecciones de las 5 disoluciones estándar.



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Para cada disolución estándar de naftaleno calcular el valor promedio, la

desviación estándar y el error en la medida (superior e inferior) de las

áreas de los picos.

Representar los valores de concentración de acetofenona (mg/L) frente a

los valores de área de pico y calcular la recta de regresión que pasa por

los puntos experimentales para comprobar la linealidad del detector.

5.3.1. Cualificación del Detector

Cuadro N°38.

nº disolución standard

(mg/L) naftaleno

tR (min) Area (mV)

1 50 4,685 1073

1 50 4,688 1085,3

1 50 4,685 1113,4

2 150 4,741 3848,2

2 150 4,74 3730,7

2 150 4,745 3746,2

3 250 4,748 5426,4

3 250 4,747 5609,4

3 250 4,478 5529,7

4 350 4,676 9542,6

4 350 4,677 9316,3

4 350 4,678 9449,9

5 500 4,679 12619,1

5 500 4,68 12624,8

5 500 4,676 12831,2



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Cuadro N°39.

Disol. 1 Disol. 2 Disol. 3 Disol. 4 Disol. 5

Promedio 1090,6 3775,0 5521,8 9436,3 12691,7

Desv. Estándar 20,7 63,8 91,8 113,8 120,8

Error superior 1152,7 3966,5 5797,1 9777,6 13054,2

Error inferior 1028,4 3583,5 5246,6 9095,0 12329,2

Figura N°5.

Cualificación de UV-Visible

y = 26.02x - 245.81

R2 = 1

-5002000450070009500

1200014500

0 100 200 300 400 500Concentración (mg/L)

Are

a (

mV

)

5.4. Cualificación de la Columna

Las columnas envejecen con el tiempo por el sangrado de la fase

estacionaria, mal uso, suciedad,etc. Por ello este ensayo es vital y debe

realizarse todos los días antes de empezar a trabajar.

Se llevará a cabo la evaluación de la columna mediante una secuencia

de tres inyecciones de una disolución estándar que contenga una serie



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de compuestos similares pero con distinto valor de coeficiente de

extinción molar a la longitud de onda elegida (v.g. 254 nm). Debemos

estar seguros que las absorciones se encuentran en la zona lineal

determinada anteriormente.

La disolución estándar preparada es la siguiente: benceno (1 µl/ml),

tolueno (1 µl/ml) y naftaleno (1 µl/ml) en acetonitrilo. Se inyectan 20 µl y

se debe asegurar que trabaja en condiciones óptimas de limpieza del

mismo.

Al no tener la hoja del fabricante preparamos la disolución estándar

indicada anteriormente y los resultados obtenidos los usaremos como

referencia del estado de la columna en evaluaciones posteriores.

Empleando las siguientes condiciones cromatográficas:

Columna : Teknokroma Mediterranea Sea C18 - 5 µm*15*0,46

Fase móvil : agua/acetonitrilo (35/65 v/v).





a. Procedimiento


2. Seleccionar un flujo de 0.700 ml/min y dejar pasar la fase móvil



3. Inyectar 20 µl de la disolución estándar.


cromatográficas.



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5. Anotar el tiempo de retención, el área de pico, factor de capacidad

(k´), número de platos teóricos (N), número de platos teóricos por

metro de columna (N/m), altura de pico teórico reducido (h) y factor

de asimetría (As) del último pico (naftaleno) para cada una de las

inyecciones.


- Factor de capacidad (k’)

k' = ( tR - to ) / to

Donde:

tR = tiempo de retención de la muestra

to = tiempo muerto de la columna

- Número de platos teóricos (N)

N = tR2/ t2 ó N = 16 tR2 / Wb

2

Una columna es tanto más eficaz cuanto más estrecho es el pico.

Como los picos se van ensanchando, para unas mismas

condiciones cromatográficas este análisis se hace con el último

pico.



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- Altura Reducida del Plato Teórico (h o HETP):

h = m /N

Donde m es la longitud de la columna y N el número de platos

teóricos

- Factor de Asimetría (As) (“tailing factor”):

As = a/b

Se miden los valores de a y b como se indica en la figura. Si la

columna funciona bien este valor debe ser 1 o muy próximo al

mismo.



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5.4.1. Cualificación de la columna

Teknokroma Mediterranea Sea C18

5 µm*15*0,46 - Equipo: Agilent 1100 Series

Cuadro N°40.

Pinchazo tR (min) Área (mV) K´ Nº platos teóricos

nºpl.t./m h As

1 6,244 10047,2 5,06 4240 282666,667 0,00000354 0,83

2 6,24 10086,3 5,06 4235 282333,333 0,00000354 0,83

3 6,244 9890,4 5,06 4334 288933,333 0,00000346 0,81

Promedio 6,243 10007,967 5,060 4269,667 284644,444 0,00000351 0,823

Desv.est. 0,002 103,676 0,000 55,770 3718,024 0,00000005 0,012

Lím. Sup. 6,250 10264,566 5,060 4408,219 293881,273 0,00000363 0,853

Lím. Inf. 6,236 9749,434 5,060 4131,115 275407,615 0,00000339 0,793

6. Bibliografía

- Agilent ChemStation – Understanding Your ChemStation. - Agilent 1100 Series – Qualification workbook.

- Protocolo Normalizado de Trabajo nº1 ed. 1ª: “Manual rápido de

manejo del HPLC Agilent 1100 Series y del software Agilent

ChemStation”.



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Bachiller en Ingeniería Química (3.314Mb) - UNIVERSIDAD ...

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