BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

4.1.1 Penentuan Suhu Optimum Alkalin Protease

Data rata - rata aktivitas enzim tiap variasi suhu

disajikan pada Tabel 4.1. Data selengkapnya disajikan

pada lampiran 3.

Tabel 4.1 Karakterisasi Suhu Optimum Alkalin Protease

Suhu (oC) Rata-rata Aktivitas (U/ml)30 0,248 ± 1,453 x 10-2 d

0,290 ± 9,04 x 10-3 c

0,359 ± 2,409 x 10-2 b

0,405 ± 1,477 x 10-2 a

0,371 ± 8,860 x 10-3 a b

40506070

Keterangan: Huruf berwarna merah menunjukan grouping databerdasarkan Tukey’s Confidence Interval dengan Pvalue > 0,05.Huruf yang berbeda menandakan perbedaan signifikan.

Hasil analisis statistik data (lampiran 4),

terlihat data rata-rata aktivitas karakterisasi suhu

tersebut berdistribusi normal dan homogen ditandai

nilai Pvalue > 0,05. Karena data normal dan homogen,

analisis dilanjutkan dengan uji statistik one way ANOVA.

Dari hasil uji Tukey’s Confidence Interval, terlihat

perlakuan uji aktivitas pada suhu 60oC memiliki32

33

nilai aktivitas yang berbeda signifikan dengan yang

dilakukan pada suhu 30,40, dan 50oC. Sementara perlakuan

uji pada suhu 70oC tidak berbeda signifikan dengan

suhu 50 mapupun 60oC. Meskipun 60oC tidak berbeda

signifikan dengan 70oC, 60oC tetap berbeda signifikan

dengan suhu-suhu lainnya dan memiliki nilai rata-rata

aktivitas yang paling tinggi sehingga dapat disimpulkan

uji aktivitas optimum dilakukan pada suhu 60oC.

4.1.2 Penentuan pH Optimum Alkalin Protease

Data rata - rata aktivitas enzim tiap variasi pH

disajikan pada Tabel 4.2. Data selengkapnya disajikan

pada lampiran 3.

Tabel 4.2 Karakteriasi pH Optimum Alkalin Protease

pH Rata-rata Aktivitas (U/ml)7 0,305 ± 1,625x 10-2 b

0,349 ± 2,946 x 10-2 a b

0,348 ± 2,044 x 10-2 a b

0,406 ± 2,061 x 10-2 a

0,368 ± 1,982 x 10-2 a

891011

Keterangan: Huruf berwarna merah menunjukan grouping databerdasarkan Tukey’s Confidence Interval dengan Pvalue > 0,05.Huruf yang berbeda menandakan perbedaan signifikan.

Hasil analisis statistik data (lampiran 4),

terlihat data rata-rata aktivitas karakterisasi pH

34

tersebut berdistribusi normal dan homogen ditandai

nilai Pvalue > 0,05. Karena data normal dan homogen,

analisis dilanjutkan dengan uji statistik one way ANOVA.

Dari hasil uji Tukey’s Confidence Interval, terlihat

perlakuan uji aktivitas pada pH 10 memiliki nilai

aktivitas yang berbeda signifikan dengan yang dilakukan

pada pH 7. Sementara perlakuan uji pada pH 10 tidak

berbeda signifikan dengan pH 8, 9,dan 11. Namun, pH 7,

8, 9, dan 11 saling tidak berbeda signifikan satu sama

lain sehingga dapat dikatakan ketiganya berasal dari satu

grup yang sama. Selain itu, pH 10 memiliki nilai rata-

rata aktivitas yang paling tinggi sehingga dapat

disimpulkan uji aktivitas optimum dilakukan pada pH 10.

4.1.3 Pemurnian Dengan Presipitasi dan Dialisis

Data di tiap tahap pemurnian ekstrak kasar enzim

disajikan pada Tabel 4.3

Tabel 4.3 Data Pemurnian Ekstrak Kasar Hingga

Dialisis

35

Tahapan Vsampel

(ml)

Tirosin

(µg/ml)

Protein/ml

ekstrak(µg/ml)

Protein

total(µg)

Aktivitas(µmol/men

it)

Aktivitastotal

Aktivitasspesifik

(µmol/µg.menit)

Yield(%)

Purification

Factor

Awal 120 228.5 186.1 22338.8

0.378 45.4 2,032 x10-3

10% 10 169.2 140.7 1407.9

0.280 2.802 1,990 x 10-3

6.173 0.979

20% 1.5 173 108.9 163.4 0.286 0.429 2,629 x 10-3

0.946 1.293

30% 4 200.2 107.7 431.04

0.331 1.325 3,076 x 10-3

2.920 1.513

40% 4 138.4 103.3 413.5 0.229 0.917 2,218 x10-3

2.020 1.091

50% 4 136.6 113.3 453.3 0.226 0.905 1,996 x10-3

1.993 0.982

60% 4 144.2 89.8 359.4 0.238 0.955 2,657 x 10-3

2.103 1.307

70% 10 312.8 137.6 1376.06

0.518 5.180 3,764 x 10-3

11.408 1.852

80% 5 237.8 121.2 606.4 0.393 1.969 3,246 x 10-3

4.336 1.597

Dialisis

6 292.7 124.07 744.4 0.484 2.907 3,906 x 10-3

6.777 1.759

Keterangan: Data yang ditampilkan merupakan data rata-rata dari ketiga replikasi. Data lengkap disajikan padaLampiran 5 Tabel 5.

4.1.4 Pemurnian Dengan Ion Exchange Chromatography (IEC)

Sampel yang dimurnikan pada tahap IEC adalah sampel hasil

dialisis presipitasi ammonium sulfat 70%. Berikut adalah

data IEC replikasi 1-3 .

Tabel 4.4 Hasil Rata-Rata IEC

Fraksi

ke -

VFraksi(ml)

Tirosin/ml

(µg/ml)

Protein perml

ekstrak

(µg/ml)

Aktivitas(µmol/men

it)

Protein

total(µg)

Aktivitasspesifik

(µmol/µg.menit)

Yield (%) Purification

Factor

0 1 0 0 0 0 - - -1 1 0 0 0 0 - - -

36

2 1 0 0 0 0 - - -3 1 0 0 0 0 - - -4 1 0 0 0 0 - - -5 1 0 0 0 0 - - -6 1 0 0 0 0 - - -7 1 0 0 0 0 - - -8 1 0 0 0 0 - - -9 1

27.458 83.086 0.045

83.08

6 0.54 x 10-30.1286 0.270

10 1 695.908 100 1.152 100 1.160 x 10-2 2.537 5.70811 1

111.906 84.678 0.185

84.67

8 2.131 x 10-30.1906 1.048

Lanjutan Tabel 4.4Fraksi

ke -

VFraksi(ml)

Tirosin/ml

(µg/ml)

Protein perml

ekstrak

(µg/ml)

Aktivitas(µmol/men

it)

Protein

total(µg)

Aktivitasspesifik

(µmol/µg.menit)

Yield (%) Purification

Factor

12 1 47.810 65.577 0.079 65.57

7

1.371574 x

10-3

0.1435427

0.674

13 1 36.113 57.248 0.0532 57.24

8

4.01373 x

10-4

0.1240339

0.197

14 1 0 0 0 0 - - -15 1 0 0 0 0 - - -16 1 0 0 0 0 - - -17 1 0 0 0 0 - - -18 1 0 0 0 0 - - -19 1 0 0 0 0 - - -20 1 0 0 0 0 - - -21 1 0 0 0 0 - - -22 1 0 0 0 0 - - -23 1 0 94 0 94 - - -… … … .. … … - - -40 1 0 0 0 0 - - -

Keterangan : “ – “ berarti tidak dapat dihitung karena 0 / 0 . Yield dan purification

37

factor dihitung terhadap ekstrak kasar enzim. Data yangditampilkan merupakan data rata-rata dari ketigareplikasi. Data lengkap disajikan pada Lampiran 5 Tabel7-9. Fraksi ke-10 dipilih sebagai fraksi yang digunakan untukSDS PAGE karena memiliki nilai yield dan purification factorterbaik.

Peningkatan hasil pemurnian pada setiap tahap, disajikan

pada Tabel 4.5.

Tabel 4.5 Perbandingan Tahap PemurnianTahapan V

sampel(ml)

Tirosin

(µg/ml)

Protein/ml

ekstrak(µg/ml)

Proteintotal(µg)

Aktivitas

(µmol/menit)

Aktivitastotal

Aktivitas

spesifik

(µmol/µg.menit)

Yield(%)

Purification

Factor

Awal 120 228.533

186.156 22338.830

0.378 45.404 2,032x 10-3

100 1

Presipitasi70%

10 312.876

137.606 1376.066

0.518 5.180 3,764x 10-3

11.408

1.852

Dialisis

6 292.735

124.076 744.457 0.484 2.907 3,606x 10-3

6.777 1.759

IECrata-rata

1 695.9

08 100 100 1.152 1.152

1,1603

x 10-3 2.537 5.708

Keterangan: Yield dan purification factor dihitung terhadap

ekstrak kasar enzim.

4.1.5 Penentuan Berat Molekul Protein Enzim dengan SDS

PAGE

Hasil SDS PAGE disajikan pada Gambar 4.1 M CE 70%-1 70%-2 70%-3 D-1 D-2

D3 IEC1 IEC 2

38

Gambar 4.1 SDS PAGE Sampel pada Tiap Tahap Pemurnian

M IEC 3

14

22

29

42 51

62

95130175

10,514

22

29

42

516070

95130175

10,5

protein

target

39

Gambar 4.2 Hasil SDS PAGE pada Tahap IEC Replikasi 3

Gambar 4.3 Hasil SDS PAGE pada Tahap Pemurnian Replikasi

1

Keterangan : M : Marker Vivantis 100 kDA

70%-1,2,3 : Hasil Presipitasi 70% replikasi

1,2, dan 3

D-1,2,3 : Hasil Dialisis pada replikasi 1,

2, dan 3

IEC 1,2,3: Hasil IEC (fraksi 10) pada

replikasi 1,2, dan 3

9,10,11,12,24 : Hasil IEC pada fraksi

tersebut replikasi 1

CE M 70% 1 D 9 10

11 12 24

40

Penentuan berat molekul protein dihitung dari

persamaan regresi linear marker protein, antara jarak

migrasi (sumbu x) dan log berat

molekul (sumbu y). Persamaan yang

didapat adalah y = -0,175 x +

2,130 R² = 0,955 (Lampiran 5).

Hasil perhitungan berat molekul

sampel ditunjukkan pada Lampiran 6

Tabel 10. Didapatkan band protein target sebesar 33,32

kDa.

4.2 Pembahasan

Gambar 4.4 Isolat Bakteri

41

Isolat yang digunakan pada produksi enzim pada

penelitian ini berasal dari limbah cair pemotongan

hewan di Rumah Pemotongan Hewan (RPH) Jalan Pegiriaan,

Surabaya. Limbah cair tersebut memiliki suhu sebesar 30oC

dan pH 8. Dari limbah tersebut, akan diisolasi bakteri

yang akan menghasilkan enzim alkaline protease yang

kemudian akan dimurnikan lebih lanjut. Untuk mendapatkan

enzim alkaline protease tersebut, diperlukan proses

produksi enzim. Produksi enzim dilakukan dengan cara

menginokulasikan isolat bakteri terpilih ke dalam media

susu skim cair yang merupakan media produksi enzim.

Kemudian dilakukan inkubasi pada suhu 30oC selama 45 jam

dengan agitasi 100 rpm. Menurut penelitian Widjaja (belum

dipublikasikan), suhu 30oC dipilih sebagai suhu optimum

untuk produksi enzim alkaline protease dan waktu optimum

produksi enzim alkaline protease ialah 45 jam. Pemanenan

enzim alkaline protease dilakukan dengan cara memisahkan

hasil produksi enzim dengan sel bakteri melalui

sentrifugasi. Sel bakteri yang memiliki densitas lebih

berat akan mengendap sebagai pellet sedangkan enzim akan

larut dalam air sehingga akan bertahan pada supernatant.

Supernatan yang dihasilkan setelah sentrifugasi dianggap

sebagai ekstrak kasar enzim alkaline protease. Pada

penelitian ini, ekstrak kasar enzim yang didapatkan

42

sebesar 360 ml dan akan dibagi untuk tiga replikasi pada

tahap pemurnian.

4.2.1 Penentuan Suhu Optimum

Karakterisasi pH dan suhu optimum enzim dilakukan untuk

mengetahui kondisi suhu dan pH yang paling baik bagi

enzim untuk bekerja. Data ini digunakan untuk menentukan

buffer pH yang digunakan untuk melarutkan pellet

enzim di tahap berikutnya dan suhu yang digunakan

untuk uji aktivitas di tahap pemurnian selanjutnya.

Penentuan suhu optimum ditentukan dari nilai aktivitas

enzim yang tertinggi. Larutan enzim tersebut diuji

aktivitas dan kadar proteinnya, hasil uji tampak pada

Tabel 4.1 dan Gambar 4.5.

0,405

0,371

43

Gambar 4.5 Grafik Karakterisasi Suhu Optimum Alkalin

Protease

Aktivitas tertinggi diperoleh pada uji aktivitas

yang dilakukan pada suhu 60oC, yakni sebesar 0,405 U/ml.

Hasil Tukey’s Confidence Interval (Tabel 4.1) menunjukan suhu

optimum adalah 60oC. Limbah cair yang merupakan sumber

isolat penghasil enzim alkaline protease memiliki suhu

30oC. Hasil penelitian Soeka (2011) menunjukan fenomena

serupa dimana enzim alkaline protease yang berasal dari

beberapa jenis Bacillus seperti Bacillus licheniformis dan Bacillus

cereus yang ditumbuhkan pada suhu 37oC dapat menghasilkan

enzim dengan suhu optimum sebesar 60oC.

4.2.2 Penentuan pH Optimum

Hasil karakterisasi pH optimum enzim alkaline

protease diperoleh aktivitas tertinggi pada pH 10. (Tabel

4.2 dan Gambar 4.6) .

44

Gambar 4.6 Grafik Karakterisasi pH Optimum Alkalin

Protease

Aktivitas tertinggi diperoleh pada uji aktivitas

yang dilakukan pada suhu 60oC dan pH 10, yakni 0,406

U/ml. Hasil Tukey’s Confidence Interval (Tabel 4.2) menunjukan

pH optimum adalah 10. Limbah cair yang merupakan sumber

isolat penghasil enzim alkaline protease memiliki suhu

35oC dan pH sebesar 8. Hasil penelitian Soeka (2011),

mengatakan bahwa enzim alkaline protease yang berasal

dari Bacillus cereus yang ditumbuhkan pada suhu 37oC dapat

menghasilkan enzim dengan suhu optimum sebesar 60oC dan

pH 10.

4.2.3 Presipitasi dan Dialisis

4.2.3.1 Presipitasi Amonium Sulfat

0,305

0,3490,348

0,4060,368

45

Pada proses presipitasi ammonium sulfat, sampel yang

digunakan ialah ekstrak kasar hasil pemanenan enzim

alkaline protease. Presipitasi ammonium sulfat yang

dilakukan memiliki tingkat kejenuhan 10%-80%. Dilakukan

presipitasi secara bertahap dikarenakan protein enzim

alkaline protease belum diketahui pasti mengendap pada

kejenuhan tertentu sehingga diperlukan optimasi untuk

mengetahui di tingkat kejenuhan berapa enzim alkaline

protease akan mengendap. Pelet dengan tingkat kejenuhan

ammonium sulfat 70% memiliki aktivitas spesifik tertinggi

yakni sebesar 3,766 x 10-3 µmol/µg.menit. Adanya kenaikan

nilai aktivitas spesifik dibandingkan ekstrak kasar awal

menunjukkan adanya peningkatan kemurnian enzim. Hal ini

juga didukung dengan kenaikan nilai purification factor sebesar

1,85. Terdapat penurunan nilai yield hingga 11,4%. Hal ini

menunjukan bahwa tidak semua enzim target terndapkan pada

tahap ini. Selain itu, adanya kemungkinan menurunnya

nilai yield diakibatkan adanya aktivitas enzim yang hilang

selama proses akibat denaturasi enzim.

4.2.3.2 Dialisis

Dialisis dilakukan setelah tahap presipitasi

ammonium sulfat. Dialisis dilakukan untuk menghilangkan

sisa garam amonium sulfat dalam proses presipitasi.

Pemisahan protein enzim dengan garam berfungsi agar garam

46

tidak mengganggu proses pemurnian selanjutnya, yakni IEC.

Adanya garam dalam proses IEC akan menghambat proses

penempelan protein enzim bermuatan dengan resin sehingga

enzim tidak dapat terelusi dengan baik. Dalam penelitian

ini dipakai tabung selofan merk Servapor yang memiliki

MWCO 14.000, berarti garam amonium sulfat dapat keluar,

namun protein tetap di dalam tabung selofan.

Pada proses dialisis didapatkan adanya penurunan

nilai yield yang awalnya sebesar 11,4% menjadi 6,77%.

Penurunan nilai yield ini diakibatkan penurunan aktivitas

enzim saat proses dialisis. Penurunan nilai aktivitas

dapat diakibatkan karena adanya aktivator logam yang

kemungkinan juga ikut hilang selama proses dialisis.

Enzim alkaline protease memiliki beberapa aktivator,

yakni Zn2+, Fe2+, dan Ca2+(Murdiyatmo, 2006). Peneliti

menggunakan media susu skim sebagai media produksi enzim.

Susu skim mengandung berbagai mineral, 67% diantaranya

adalah ion kalsium dan beberapa persen ion Fe2+ (Pruitt,

2004). Adanya ion Ca2+ dan Fe2+ pada media produksi

kemungkinan dapat menjadi aktivator bagi enzim alkaline

protease sehingga saat keduanya hilang saat proses

dialisis akan menurunkan aktivitasnya. Sedangkan nilai

purification factor yang didapat cenderung tetap dibandingkan

dengan presipitasi 70%.

47

4.2.4 Pemurnian Alkalin Protease dengan Metode IEC

Sampel yang dimurnikan lebih lanjut dengan metode IEC ini

ialah sampel hasil dialysis. Diketahui pI enzim

alkaline protease dari Bacillus diketahui berkisar antara 9

(Murdiyanto, 2006). Pada penelitian ini, ditemukan bahwa

enzim alkaline protease yang didapatkan memiliki pI

sebesar 8,8. Pada pengujian pH optimum enzim (Tabel 4.2),

didapatkan aktivitas enzim alkalin protease yang paling

optimum berada pada pH 10. Saat enzim berada dalam

larutan dengan pH di atas nilai pInya, enzim tersebut

cenderung berbentuk anion, sehingga dilakukan

pemurnian dengan anion exchanger chromatography.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450123456

Fraksi ke-

Purifi

catio

n Fa

ctor 5,7

08

Gambar 4.7 Hasil Purification Factor Pemurnian Enzim dengan

Metode IEC

48

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Fraksi ke-

Yiel

d (%

)

2,537

Gambar 4.8 Hasil Yield Pemurnian Enzim dengan Metode IEC

Keterangan : Data grafik yield dan purification factor pemurnian

enzim dengan metode IEC di atas merupakan data rata-rata.

Data lengkap dapat dilihat pada Lampiran 5 Tabel 7-9.

Fraksi ke- 10 menunjukan peak terelusinya enzim alkalin

protease.

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.50

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6yield

purification factor

yiel

d (%

)Purification Factor

Gambar 4.9 Grafik Nilai Purification Factor dan Yield pada Tahap

Pemurnian.

Ekstrak kasar 70% Dialisis IEC

49

Hasil purification factor dengan metode IEC (Gambar 4.7),

menunjukan didapatkannya nilai purification factor sebesar

5,708. Fraksi ke 10 merupakan fraksi dengan kenaikan

nilai purification factor terbaik. Kenaikan nilai

purification factor ini menandakan kenaikan kemurnian

enzim. Sedangkan pada Gambar 4.8 disajikan data hasil

yield dengan metode IEC dengan yield akhir sebesar

2,537%. Yield terbaik juga didapatkan pada fraksi ke 10

sehingga dapat disimpulkan fraksi ke 10 merupakan fraksi

saat terelusinya enzim.

Pada Gambar 4.9 didapatkan tren data purification factor

dan yield pada setiap tahap pemurnian. Nilai purification factor

naik sebanyak 1 menjadi 5,708 terhadap ekstrak kasarnya.

Kenaikan nilai purification factor ini menandakan keberhasilan

proses pemurnian enzim. Fenomena lain ditunjukan oleh

nilai yield pada tiap tahap pemurnian. Nilai yield turun

dari 100% menjadi 2,537% terhadap ekstrak kasarnya.

Penurunan nilai yield dikarenakan kemungkinan adanya

aktivitas enzim yang mungkin hilang selama proses.

Beberapa penyebab hilangnya atau turunnya aktivitas

enzim selama pemurnian penelitian ini, antara lain

dikarenakan denaturasi, proteolisis, serta hilangnya

aktivator. Enzim protease akan cenderung mengalami

proteolisis dimana enzim itu sendiri akan mengenali enzim

50

alkaline protease lain sebagai substrat sehingga terjadi

reaksi pemecahan enzim itu sendiri. Hal inilah yang dapat

mengakibatkan kehilangan yield protein dalam suatu proses

pemurnian (Roe, 2001). Sedangkan proses denaturasi

kemungkinan terjadi saat proses pemurnian. Denaturasi

enzim kebanyakan disebabkan karena proses handling enzim

yang kurang tepat seperti enzim terlalu lama di suhu

ruang.

4.2.5 Penentuan Berat Molekul Protein dengan SDS PAGE

Setelah didapatkan enzim melalui proses purifikasi,

kemudian dilakukan penentuan berat molekul protein

dengan metode SDS PAGE. Pada Gambar 4.1, hasil IEC

replikasi 1 dan 2 menunjukan terdapat 1 pita yang diduga

merupakan pita protein enzim alkalin protease. Pita

tersebut berukuran 33,32 kDa. Hal ini ditunjukan pula

pada Gambar 4.2 yang menunjukan hasil IEC replikasi 3

dimana terdapat pula 1 pita protein berukuran 33,32 kDa.

Menurut Soeka (2011), enzim alkaline protease yang

berasal dari Bacillus licheniformis memiliki ukuran protein

sebesar 29,71 kDa. Pada Gambar 4.3, peneliti melakukan

SDS PAGE terhadap beberapa fraksi yang memiliki aktivitas

dan konsentrasi protein pada tahap IEC replikasi 1.

Didapatkan hasil fraksi ke 10 menunjukan 1 pita protein

berukuran 33,32 kDa sedangkan yang lainnya tidak tampak

51

adanya pita protein. Hal ini disebabkan karena

kemungkinan kecilnya konsentrasi protein yang ada. Untuk

mendapatkan hasil pita protein dengan ketebalan yang baik

diperlukan konsentrasi final 2 mg/ml dalam 10µl reaksi