BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalahetd.repository.ugm.ac.id/downloadfile/89926/potongan/S1-2015... · Buah jambu biji merah mengandung senyawa antioksidan vitamin C, ... sayur

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Penyakit degeneratif sejak beberapa dasawarsa silam telah menjadi

segmentasi permasalahan tersendiri bagi tiap negara di seluruh dunia (Handajani

dkk., 2007). Hingga saat ini penyakit degeneratif telah menjadi penyebab

kematian terbesar di dunia. Hampir 17 juta orang meninggal lebih awal setiap

tahun akibat epidemi global penyakit degeneratif (WHO, 2011). Indonesia

menanggung beban ganda penyakit di bidang kesehatan, yaitu penyakit infeksi

yang masih merajalela dan penyakit-penyakit degeneratif (Handajani dkk., 2007).

Di Indonesia, transisi epidemiologi menyebabkan terjadinya pergeseran pola

penyakit, di mana penyakit degeneratif sudah terjadi peningkatan.

Penyebab terjadinya penyakit degeneratif adalah pola hidup yang tidak sehat

seperti kebiasaan merokok, minum alkohol, pola makan, aktivitas fisik yang

kurang, stres, dan pencemaran lingkungan. Pola hidup tidak sehat dapat

menimbulkan senyawa radikal bebas yang bersifat reaktif terhadap sel dan

jaringan tubuh. Diperkirakan sekitar 10.000-20.000 senyawa radikal bebas

menyerang sel tubuh setiap hari (Valko dkk., 2004). Senyawa radikal bebas yang

menyerang sel tubuh dapat memperantai berbagai kerusakan di dalam tubuh

(Aseervatham dkk., 2013) dan mempercepat proses penuaan (Getoff, 2007).

Penyakit degeneratif yang banyak prevalensinya yaitu penyakit

kardiovaskuler, kanker, penyakit paru obstruksi kronik, dan diabetes (Hunter dan

1

2

Reddy, 2013). Menurut WHO, penyakit kardiovaskuler mempunyai prevalensi

kasus kematian paling tinggi di dunia (Santulli, 2013). Pada tahun 2010, The

Global Burden of Disease menyatakan sebanyak 29,6 % kasus kematian di dunia

dikarenakan oleh penyakit kardiovaskuler, sekitar dua kali jumlah kasus kematian

akibat kanker (Nichols dkk., 2014). Insiden penyakit kanker secara global

diprediksi akan meningkat dari 12,8 juta kasus baru pada tahun 2008 menjadi

22,2 juta pada tahun 2030 (American Association for Cancer Research, 2013). Di

Indonesia, diperkirakan setiap tahun terdapat penderita baru dari setiap seratus

ribu penduduk dan penyakit kanker menduduki peringkat ketiga penyebab

kematian setelah penyakit jantung dan paru (Nugroho dkk., 2000). Penyakit

kanker membutuhkan waktu terapi lama dan biaya yang mahal (Soeksmanto dkk.,

2007).

Konsumsi buah-buahan, sayur, dan makanan dari tumbuhan yang kaya nutrisi

dapat mengurangi risiko penyakit yang terkait dengan senyawa radikal bebas

(Carlsen dkk., 2010), misalnya penyakit kardiovaskuler dan kanker (Genkinger

dkk., 2004). Kandungan senyawa bioaktif alami dapat mencegah kerusakan sel

dan deoxyribonucleic acid (DNA) yang disebabkan oleh radikal bebas dan

oksigen reaktif, dapat meningkatkan aktivitas enzim yang dapat mendetoksifikasi

toksin dan karsinogen, memacu sintesis kolesterol dan metabolisme hormon,

mereduksi agregasi platelet, menurunkan tekanan darah, stimulasi sistem imun,

anti bakteri, dan antivirus (Lampe, 1999). Bukti kuat efek proteksi risiko kanker

dari konsumsi sayur dan buah didapatkan dari case-control studies. Studi

menyatakan sayur yang mentah dan segar menunjukkan proteksi yang konsisten

3

pada selada, dedaunan hijau, bawang putih, tomat, dan buah jeruk, dengan sekitar

70% studi melaporkan adanya efek proteksi (La Vecchia dkk., 2001).

Kemampuan senyawa bioaktif yang terdapat dalam buah dan sayuran dalam

mencegah penyakit degeneratif merupakan peluang dalam mengembangkan

potensinya untuk meningkatkan derajat kesehatan masyarakat (Nugraheni, 2011).

Buah jambu biji merah mengandung senyawa antioksidan vitamin C,

karotenoid, dan flavonoid (Rai dkk., 2009). Senyawa-senyawa tersebut dapat

mencegah timbulnya penyakit-penyakit degeneratif. Buah jambu biji merah

diharapkan dapat digunakan sebagai agen anti penyakit degeneratif.

B. Rumusan Masalah

Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah:

1. Bagaimana profil kromatografi lapis tipis ekstrak etanolik buah jambu biji

merah?

2. Apakah ekstrak etanolik buah jambu biji merah mampu memberikan aktivitas

antioksidan dengan metode penangkapan radikal bebas DPPH dan reducing

power assay?

3. Apakah ekstrak etanolik buah jambu biji merah mampu memberikan aktivitas

sitoprotektif pada sel Vero secara in vitro?

4

C. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah:

1. Mengetahui profil kromatografi lapis tipis ekstrak etanolik buah jambu biji

merah.

2. Mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak etanolik buah jambu biji merah

dengan metode penangkapan radikal bebas DPPH dan reducing power assay.

3. Mengetahui aktivitas sitoprotektif ekstrak etanolik buah jambu biji merah

pada sel Vero secara in vitro.

D. Manfaat Penelitian

1. Memberikan sumbangan dalam upaya pencegahan penyakit degeneratif.

2. Memberikan informasi tentang manfaat buah jambu biji merah dalam

melindungi sel-sel tubuh dari radikal bebas.

3. Memberikan suatu ide dan inspirasi bagi penelitian selanjutnya.

E. Tinjauan Pustaka

1. Penyakit degeneratif

Penyakit degeneratif merupakan penyakit tidak menular (non-communicable

disease) yang berlangsung secara kronis. Beberapa teori yang menunjukkan

proses awal terjadinya penyakit degeneratif di dalam tubuh manusia, yaitu: (1)

adanya hubungan antara transisi demografi, epidemiologi, dan kesehatan, (2)

perubahan metabolisme tubuh yang ditandai penurunan produksi hormon

5

testosteron untuk laki-laki dan estrogen untuk perempuan yang mulai tampak pada

usia 65 tahun ke atas, (3) pergeseran pola penyakit dari penyakit infeksi ke

penyakit non-infeksi (degeneratif) akibat adanya pergeseran baik pola makan

maupun pola hidup, dan (4) kelebihan gizi yang mengakibatkan tingginya

prevalensi penyakit degeneratif sudah dirasakan negara-negara berkembang

termasuk Indonesia (Handajani dkk., 2007).

Faktor resiko penyakit degeneratif dapat berasal dari diri sendiri maupun

lingkungan sekitar. Beberapa faktor risiko penyakit degeneratif menurut WHO

(2009), yaitu: (1) kurangnya aktivitas fisik seperti berolahraga, (2) merokok, (3)

konsumsi alkohol, dan (4) pola makan yang tidak sehat, seperti makan makanan

berlemak secara berlebih serta kurang konsumsi sayur dan buah. Faktor dari

lingkungan seperti polusi dan radiasi juga dapat mempengaruhi timbulnya

penyakit degeneratif.

Penyakit degeneratif berkaitan erat dengan proses penuaan (Ames dkk.,

1993). Proses penuaan dapat berupa penurunan fungsi sistem dalam tubuh.

Penurunan fungsi tersebut dikarenakan beberapa faktor seperti penurunan jumlah

sel dan komponen jaringan. Contoh penyakit ini adalah berbagai penyakit

neurodegeneratif, penyakit kardiovaskular, degenerasi makula pada retina mata,

osteoporosis, dan sarkopenia. Proses penuaan dapat menimbulkan risiko

terjadinya abnormalitas pada sel seperti sel hiperplastik yang dapat berujung pada

kanker (Campisi dkk., 2011). Penyakit degeneratif ini salah satunya disebabkan

karena antioksidan yang ada di dalam tubuh tidak mampu menetralisir

6

peningkatan konsentrasi radikal bebas (Floyd, 1999). Beberapa contoh penyakit

degeneratif, yaitu:

a. Penyakit kardiovaskuler. Senyawa radikal bebas dapat menyebabkan peru-

bahan permeabilitas membran, kerusakan membran lipid bilayer,

mengganggu fungsi berbagai protein seluler apoptosis sel kardiovaskuler,

aritmia, disfungsi denyut jantung, dan infark miokard. Radikal bebas pada

sistem kardiovaskular bersumber dari enzim xanthine oxidoreductase (XOR),

nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oksidase (kompleks

membran multi subunit), nitric oxide synthetase (NOS), dan sitokrom pada

mitokondria. Penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas antara lain:

atherosklerosis, jantung iskemik, hipertensi, kardiomiopati, hipertrofi jantung,

dan gagal jantung kongestif (Valko dkk., 2007).

b. Kanker. Radikal bebas dapat menyerang dan mengoksidasi DNA sel tubuh,

menyebabkan terjadinya mutasi DNA, misalnya mutasi pada p53 yang

digunakan untuk proses apoptosis. Radikal bebas dapat mengganggu proses

signaling sel menyebabkan ketidaknormalan sel di dalam tubuh. Sel kanker

dapat dicirikan oleh adanya ketidaknormalan dari fungsi reseptor tyrosine

kinase, perbedaan level growth factor spesifik, proses transduksi sinyal ke

nukleus, jumlah protein transkripsi dan gen yang terlibat dalam cel cycle dan

pengaturan replikasi DNA (Valko dkk., 2007). Proses fagositosis

menghasilkan radikal bebas untuk mem-bunuh sel asing. Radikal bebas yang

dihasilkan dapat berperan dalam proses pembentukkan tumor. Proses infeksi

7

dan inflamasi yang menghasilkan radikal bebas menyumbang 1 dari 4 kasus

kanker yang terdiagnosis (Sainz dkk., 2012).

c. Alzheimer. Penumpukan peptida ß-amiloid berkaitan dengan penyakit

Alzheimer. Adanya peptida ß-amiloid yang diinisiasi oleh radikal bebas dapat

menyebabkan terjadinya proses oksidasi protein sel, peroksidasi lipid,

pembentukkan radikal bebas baru, dan disfungsi seluler berujung pada

penumpukan ion kalsium (Ca2+

) serta dapat berujung pada kematian sel saraf

(Varadarajan dkk., 2000).

2. Radikal bebas

Radikal bebas adalah molekul yang pada orbit terluarnya mempunyai satu

atau lebih elektron tidak berpasangan (Chen dkk., 1996). Elektron tidak ber-

pasangan pada radikal bebas bersifat tidak stabil dan reaktif (Valko dkk., 2007).

Radikal bebas dapat bersumber dari dalam tubuh (endogen) yang dihasilkan oleh

proses respirasi aerobik sel mitokondria, fagositosis sel asing, sel peroksisom, dan

enzim sitokrom P450 (Ames dkk., 1993). Radikal bebas dapat berupa reactive

oxygen species (ROS) dan reactive nitrogen species (RNS) (Valko dkk., 2007).

a. Reactive oxygen species (ROS). Oksigen yang sangat esensial bagi

kehidupan, ternyata mempunyai peranan dalam kematian sel dan jaringan.

Oksigen dalam bentuk molekul (dioksigen) mempunyai konfigurasi elektron

yang unik dan bersifat radikal. Penambahan satu elektron pada molekul

dioksigen dapat membentuk radikal anion superoksida (Valko dkk., 2004).

Radikal anion superoksida dihasilkan dari proses metabolisme aerobik atau

8

dari radiasi fisik terhadap molekul dioksigen. Superoksida yang dihasilkan

disebut sebagai ROS primer. Senyawa ROS primer yang bersifat reaktif akan

berinteraksi dengan senyawa lain membentuk ROS sekunder (Valko dkk.,

2007).

Di dalam tubuh, radikal bebas sebagian besar dihasilkan oleh

mitokondria melalui proses respirasi aerobik, dimana terjadi proses reduksi

oksigen menjadi air. Pada proses respirasi aerobik terbentuk senyawa

intermediet ROS seperti anion superoksida (Birben dkk., 2012), hidrogen

peroksida, dan hidroksi radikal (Wickens, 2001). Senyawa H2O2 bersifat

relatif permeabel terhadap membran sel, kurang reaktif dan merupakan

radikal lemah dengan waktu paruh yang lama (Ryter dkk., 2007). Dengan

adanya katalis logam seperti Fe, tingkat ketoksikan H2O2 terhadap sel

menjadi lebih tinggi karena diubah menjadi molekul yang lebih reaktif (Mates

dkk., 1999) melalui reaksi Fenton:

H2O2 + Fe2+

Fe3+

+ •OH +

‒OH (1)

b. Reactive nitrogen species (RNS). Senyawa NO. dihasilkan oleh nitric oxide

synthetases (NOSs). Enzim NOSs dapat mengubah L-arginin menjadi L-

sitrulin (Sugamura dan Keany, 2011). NO. berperan sebagai molekul sinyal

dalam berbagai proses fisiologis, seperti neurotransmiter, pengaturan tekanan

darah, mekanisme pertahanan tubuh, relaksasi otot polos, dan regulasi sistem

imun. Waktu paruh senyawa NO. hanya beberapa detik pada media air.

Senyawa NO. lebih stabil pada lingkungan dengan konsentrasi oksigen

9

rendah. Senyawa NO. mudah larut baik dalam air dan lemak, sehingga mudah

berdifusi melalui membran sitoplasma (Valko dkk., 2007).

Senyawa NO. dapat mengalami derivatisasi membentuk senyawa radikal

yang lebih reaktif. Bentuk derivatisasi dari senyawa NO. seperti peroksi nitrit

dapat mengoksidasi senyawa lain yang memberikan kontribusi pada kematian

sel. Produksi RNS berlebih disebut sebagai keadaan stres nitrosatif (Brown

dan Borutaite, 2001).

Selain dari dalam tubuh (endogen), radikal bebas juga dapat bersumber dari

luar tubuh (eksogen). Radikal bebas eksogen berasal dari menghirup asap rokok,

paparan ozon, hiperoksia, radiasi sinar pengion, dan ion logam berat (Birben dkk.,

2012).

Spesies radikal bebas dapat menimbulkan beberapa akibat seperti proses

adaptasi dengan meningkatkan sistem pertahanan antioksidan serta menimbulkan

kerusakan jaringan misalnya kerusakan DNA, lipid, dan protein.

a. Kerusakan DNA. Senyawa radikal dapat merusak basa DNA, memecah rantai

DNA, kesalahan penyandian gen dan dapat mengakibatkan terjadinya

mutagenesis. Radikal bebas seperti •OH dan H

• dapat bereaksi dengan basa

DNA dan atom hidrogen senyawa gula yang terikat pada basa DNA. Atom

C4-C5 basa pirimidin sangat sensitif terhadap serangan radikal bebas. Reaksi

oksidasi basa pirimidin oleh radikal bebas menghasilkan senyawa seperti

timin glikol, residu urea, 5-hidroksideoksiuridin, dan 5-hidroksideoksisitidin.

Reaksi oksidasi basa purin oleh radikal bebas dapat menghasilkan senyawa

seperti 8-hidroksideoksiguanosin (8-OhdG), 8-hidroksideoksiadenisin, dan

10

formamidopirimidin. Senyawa 8-OhdG berhubungan dengan proses karsino-

genesis dan digunakan sebagai marker adanya oksidasi DNA (Nisha dan

Deshwal, 2011). Fragmentasi DNA oleh radikal bebas menyebabkan aktivasi

enzim poli ADP-ribosa sintetase yang berfungsi dalam sistem repair DNA.

Adanya kerusakan yang parah pada DNA membuat sel tidak dapat berfungsi

secara normal dan mati (Sarma dkk., 2010).

b. Peroksidasi membran lipid. Senyawa radikal bebas seperti ROS dan RNS

dapat mengoksidasi membran sel yang terdiri atas fosfolipid. Senyawa

fosfolipid mengandung asam lemak tak jenuh yang peka terhadap serangan

radikal bebas. Proses oksidasi lipid terdiri dari (1) inisiasi, yaitu pembentukan

radikal asam lemak tak jenuh oleh senyawa radikal bebas, (2) propagasi,

radikal asam lemak tak jenuh bereaksi baik dengan oksigen maupun asam

lemak lain membentuk peroksida lipid, dan (3) terminasi, pembentukan asam

lemak non-radikal akibat adanya dua radikal asam lemak yang bereaksi

(Schafer dkk., 2000). Adanya kerusakan membran lipid dapat menyebabkan

fluiditas dan permeabilitas membran terganggu. Kerusakan membran lipid

juga menyebabkan terganggunya fungsi protein yang terikat pada membran

seperti enzim dan reseptor (Sarma dkk., 2010).

c. Kerusakan protein. Senyawa radikal bebas dapat menyerang protein,

membuat protein mengalami fragmentasi, cross-linking dan modifikasi

molekul protein. Reaksi antara protein dan radikal bebas dapat membentuk

protein hidroperoksida yang bersifat reaktif dan dapat menginisiasi

pembentukkan radikal bebas baru (Devasagayam dkk., 2004). Kerusakan

11

pada protein dapat mengganggu fungsi enzimatik dan mengganggu proses

signaling yang diperantarai oleh reseptor protein (Sarma dkk., 2010).

Pengaruh senyawa radikal pada protein kolagen dan elastin menyebabkan

fragmentasi protein kolagen dan elastin, menyebabkan kulit menjadi keriput

dan kasar (Kammeyer dan Luiten, 2015).

Senyawa radikal bebas lebih lanjut dapat menimbulkan kematian sel baik secara

apoptosis maupun secara nekrosis (Halliwell, 2001).

3. Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menetralkan radikal bebas

maupun aksinya (Sies, 1996 cit Sharma, 2014). Menurut Halliwell (2001),

antioksidan merupakan senyawa dengan konsentrasi yang lebih rendah daripada

zat teroksidasi, yang dapat menunda atau mencegah proses oksidasi zat

teroksidasi. Efek antioksidan senyawa dari tanaman terdiri dari dua mekanisme

baik secara langsung yakni dengan (1) penangkapan radikal bebas, maupun tidak

langsung yakni (2) induksi enzim yang berperan sebagai antioksidan, dan (3)

memberikan perlindungan terhadap proses komunikasi antar sel (Yoo dkk., 2008).

Radikal berupa elektron dapat ditangkap oleh senyawa antioksidan. Terdapat tiga

macam antioksidan, yaitu: (1) antioksidan primer yang berfungsi dalam

penangkapan radikal bebas secara langsung, (2) antioksidan sekunder yang

menghambat pembentukan radikal bebas, dan (3) antioksidan tersier yang dapat

memperbaiki molekul teroksidasi lewat asupan makanan yang mengandung

antioksidan (Gutteridge dan Halliwell, 1994 cit Noori, 2012).

12

Terdapat bermacam-macam bentuk pertahanan pada suatu organisme untuk

melindungi diri dari senyawa oksidan reaktif dan dari dampak yang ditimbulkan.

Diantaranya dengan beberapa macam enzim seperti superoxide dismutase (SOD),

ascorbate peroxidase (APX), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX) dan

enzim ascorbate-glutahione (AsA-GSH) cycle seperti ascorbate peroxidase

(APX), monodehydroascorbate reductase (MDHAR), dehydroascorbate

reductase (DHAR), and glutathione reductase (GR) (Noctor dan Foyer, 1998).

SOD merupakan enzim yang terdapat dalam sitoplasma dan mitokondria sel, yang

melakukan dismutasi terhadap senyawa superoksida. Terdapat tiga bentuk enzim

SOD, yaitu: SOD ekstraseluler (EC SOD), SOD tembaga/seng intraseluler (Cu/Zn

SOD), dan SOD mangan (Mn SOD) (Mates dkk., 1999). SOD merupakan

pertahanan pertama melawan oksidan reaktif dengan cara mengubah senyawa

oksidan reaktif menjadi H2O2. Senyawa H2O2 kemudian diubah oleh enzim CAT,

APX dan GPX menjadi H2O (Sharma, 2012). Reaksi penetralan radikal bebas

oleh enzim terdapat pada persamaan (2), (3), dan (4) (Kulbacka dkk., 2003 dalam

El-Missiry, 2012).

SOD

O2 •-

+ O2 •-

+ 2H+

H2O2 + O2 (2)

CAT

2H2O2 2H2O + O2 (3)

GPX

H2O2 + 2GSH 2H2O + GSSG (4)

Bentuk pertahanan diri terhadap oksidan reaktif secara non-enzimatik terdiri

atas senyawa yang memiliki aktivitas menangkap radikal bebas seperti vitamin E,

vitamin C, glutathione (GSH), β-karoten (Fisher, 2010), flavonoid, senyawa

13

polifenol, kurkumin dari kunyit dan kafein dari teh atau kopi (Krimmel dkk.,

2010). Senyawa flavonoid yang penting misalnya katekin, kuersetin dan

kaempferol (Rice-Evans dkk., 1996). Tubuh tidak dapat memproduksi senyawa-

senyawa tersebut sehingga perlu adanya asupan nutrisi yang mengandung

senyawa tersebut (Sarma dkk., 2010).

Senyawa antioksidan yang ideal harus memiliki persyaratan seperti efektif

pada konsentrasi rendah, cukup larut dalam produk yang teroksidasi, tidak toksik,

tidak iritan saat disimpan pada jangka waktu lama, harus tidak berbau, dan tidak

mempunyai rasa. Produk hasil dekomposisi antioksidan harus tidak toksik dan

tidak iritan, stabil pada range pH yang luas, netral dan tidak bereaksi dengan

senyawa kimia lain (Sarma dkk., 2010).

Antioksidan yang terdapat di dalam tubuh terkadang tidak dapat menetralisir

secara optimal senyawa oksidan reaktif yang kemudian akan memunculkan

berbagai penyakit degeneratif (Chen dkk., 1996). Senyawa antioksidan dari luar

seperti vitamin C, vitamin E, dan karotenoid perlu ditambahkan guna membantu

menetralisir oksidan reaktif (Ames dkk., 1993). Uji penentuan kapasitas

antioksidan dapat dilakukan dengan berbagai metode seperti dengan metode

DPPH, lipid peroksidase, nitrit oksida dengan reagen Griess, FRAP ( Ferric

Reducing Ability of Plasma) dan reducing power assay.

4. Flavonoid

Flavonoid merupakan salah satu senyawa antioksidan yang banyak terdapat

dalam tanaman. Flavonoid dapat berbentuk bebas dan dapat terikat dengan

14

senyawa karbohidrat sederhana, seperti glukosa dan rhamnosa. Flavonoid yang

terikat dengan karbohidrat sederhana disebut dengan flavonoid glikosida.

Senyawa flavonoid glikosida terdiri dari dua bagian, yaitu bagian senyawa

flavonoid sendiri (aglikon) dan senyawa karbohidarat sederhana (glikon). Dua

bagian tersebut dihubungkan oleh suatu jembatan glikosidik. Nama flavonoid

berasal dari bahasa Latin flavous yang berarti warna kuning. Struktur flavonoid

terdiri atas kerangka utama C6—C3—C6 dengan cincin piran pada cincin

aromatik C3 disebut sebagai benzopiran.

Gambar 1. Kerangka dasar flavonoid (Oroian dan Escrische, 2015)

Flavonoid memiliki beberapa bentuk, yaitu flavon, flavonon, flavonol,

isoflavon, dan antosianidin (Kar, 2007). Flavonoid memiliki kemampuan untuk

meningkatkan kesehatan melalui kapasitas antioksidan yang tinggi. Aktivitas

biologi dan farmakologi kuersetin dihasilkan dari aktivitas antioksidan yang

dimiliki (Majewska dkk., 2011). Flavonoid memiliki beberapa aktivitas penting

seperti sebagai antioksidan, agen hepatoprotektif, anti bakteri, anti-inflamasi,

antikanker, dan antiviral (Kumar dan Panday, 2013). Flavonoid memiliki bentuk

radikal yang cukup stabil dan kurang reaktif setelah bereaksi dengan radikal

bebas. Stabilisasi bentuk radikal flavonoid terjadi akibat proses konjugasi elektron

pada molekul flavonoid (Han dkk., 2012) dan membentuk struktur kuinon (Amic

15

dkk., 2007). Gugus yang berperan penting pada penangkapan radikal bebas adalah

gugus hidroksi pada cincin B. Semakin banyak gugus hidroksi pada cincin B,

semakin besar pula kapasitas penangkapan radikal bebas yang dimiliki. Minimal

harus terdapat dua gugus hidroksi pada cincin B untuk menghasilkan aktivitas

antioksidan yang baik (Majewska dkk., 2011).

5. Buah jambu biji merah (Psidium guajava L.)

Klasifikasi tanaman jambu biji merah adalah sebagai berikut (Anonim, 2012) :

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Super Divisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub Kelas : Rosidae

Ordo : Myrtales

Famili : Myrtaceae

Genus : Psidium

Spesies : Psidium guajava L.

Buah jambu biji merah selain digunakan sebagai asupan makanan, juga

digunakan dalam pengobatan tradisional. Studi etnofarmakologi terbaru

menunjukkan bahwa buah jambu biji merah digunakan untuk treatment beberapa

penyakit seperti sebagai anti-inflamasi, diabetes, hipertensi, karies, luka jaringan,

meredakan nyeri dan menurunkan panas demam (Gutierrez dkk., 2008).

16

Buah jambu biji merah dikenal memiliki banyak kandungan vitamin dan

mineral yang tinggi. Buah jambu biji merah memiliki kandungan vitamin C

empat kali lebih banyak daripada buah jeruk. Buah jambu biji merah dikenal

sebagai “superfruit” dikarenakan kandungan antioksidan yang tinggi (Hassimotto

dkk., 2005). Buah jambu biji merah banyak mengandung senyawa tanin, fenol,

triterpenoid, flavonoid, minyak atsiri, saponin, karotenoid, lektin, vitamin, serat

dan asam lemak (Vyas dkk., 2010).

6. Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan senyawa dalam

campuran, digunakan untuk mengetahui jumlah komponen senyawa dalam

campuran, mengidentifikasi senyawa, monitoring proses reaksi kimia, mengetahui

kondisi yang sesuai untuk proses kromatografi kolom, dan analisis fraksi

kromatografi kolom (Sherma dan Fried, 2003). Kromatografi lapis tipis

merupakan metode yang murah dan banyak diaplikasikan dalam berbagai bidang

karena mudah, reliabel dan dapat menganalisis secara cepat (Dickson dkk., 2004).

Kromatografi lapis tipis terdiri dari dua fase, yaitu fase gerak (mobile phase) dan

fase diam (stationary phase).

a. Fase gerak. Fase gerak pada kromatografi lapis tipis berupa zat cair. Fase

gerak biasanya dalam bentuk campuran beberapa pelarut. Pemilihan fase

gerak didapatkan baik dari literatur maupun dengan trial and error. Fase

gerak memiliki variasi kepolaran yang berbeda-beda dari yang bersifat non

polar seperti n-heksan sampai polar seperti asam asetat dan air. Kepolaran

17

fase gerak dapat ditentukan dengan menghitung solvent strength (ε0) (Hahn-

Deinstrop, 2007).

b. Fase diam. Fase diam dalam kromatografi lapis tipis bersifat lebih polar

daripada fase gerak, kecuali pada reversed phase. Fase diam pada

kromatografi lapis tipis berupa alumina (Al2O3.xH2O)n atau silika gel (SiO2.

xH2O)n. Alumina dan silika bersifat sangat elektropositif karena berikatan

dengan beberapa atom oksigen (Gocan, 2002). Sifat elektropositif ini

membuat fase diam bersifat sangat polar dan mempunyai afinitas yang tinggi

terhadap senyawa polar (Hahn-Deinstrop, 2007).

Senyawa yang dielusi akan terbawa oleh fase gerak dan akan berinteraksi

dengan fase diam (Spangenberg dkk., 2011). Jarak yang ditempuh senyawa saat

proses elusi disebut sebagai retardation factor (Rf). Nilai Rf dihitung dengan

rumus:

Rf =

(5)

(Dickson dkk., 2004).

Senyawa yang semakin polar akan berinteraksi secara kuat dengan fase diam,

menyebabkan nilai Rf semakin kecil. Metode deteksi senyawa disesuaikan dengan

senyawa yang dianalisis.

7. Metode penangkapan radikal bebas DPPH

Metode penangkapan radikal bebas senyawa DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-

hydrazyl) merupakan metode yang paling umum digunakan dalam pengujian

aktivitas antioksidan (Mailandari, 2012). Metode uji penangkapan radikal bebas

18

DPPH merupakan metode pengukuran aktivitas antioksidan berdasarkan pada

hydrogen atom transfer (HAT) dan electron transfer (ET) (Prior dkk., 2005).

(ungu) (kuning)

Gambar 2. Reaksi antara senyawa DPPH dengan antioksidan (A) (Pisochi dkk., 2009)

DPPH mempunyai elektron phi yang dapat mengalami delokalisasi ke seluruh

bagian molekul, sehingga molekul tidak mengalami dimer seperti kebanyakkan

senyawa radikal bebas lain. Proses delokalisasi ini memberikan warna ungu gelap

yang dikarakterisasi oleh pita absorbansi dalam pelarut etanol pada panjang

gelombang 520 nm. Ketika DPPH direaksikan dengan senyawa yang dapat

mendonasikan atom hidrogen, maka warna ungu tersebut akan memudar yang

menggeser pita seapan menuju panjang gelombang lebih kecil menjadikan warna

DPPH menjadi kuning. Parameter yang dapat digunakan untuk menginterpretasi

hasil uji DPPH diantaranya adalah IC50. Nilai IC50 didefinisikan sebagai

konsentrasi ekstrak yang dapat menyebabkan penurunan aktivitas DPPH sebanyak

50% yang dilihat dari pengurangan intensitas warna ungu (Molyneux, 2004).

Semakin tinggi aktivitas antioksidan, maka nilai parameter IC50 akan semakin

kecil (Blois, 1958).

19

8. Metode reducing power assay

Metode reducing power assay berdasarkan metode Oyaizu (1986). Metode

reducing power assay didasarkan pada electron transfer (ET) dan tidak didasarkan

pada hydrogen atom transfer (HAT). Kebanyakkan senyawa antioksidan

mempunyai kemampuan transfer atom hidrogen. Uji antioksidan lain diperlukan

untuk dapat memberikan hasil dari proses HAT, seperti DPPH dan ORAC assay

(Prior dkk., 2005). Senyawa antioksidan yang memiliki kemampuan mereduksi

akan bereaksi dengan ferisianida membentuk ferosianida. Proses transfer elektron

menjadi aktif dengan medium berupa bufer fosfat (Barzegar, 2012). Ferosianida

kemudian bereaksi dengan feri klorida membentuk kompleks berwarna Perl’s

Prussian Blue yang memiliki absorbansi maksimum pada panjang gelombang 700

nm (Ferreira dkk., 2007). Suasana asam digunakan untuk menjaga kelarutan besi

(Prior dkk., 2005). Reaksi yang terjadi pada uji reducing power terdapat pada

persamaan (6) dan (7) (Matei dkk., 2012).

pH 6,6

[Fe (CN)6]3-

+ e-

[Fe (CN)6]4-

(6)

H+ (suasana asam)

4Fe3+

+ 3[Fe (CN)6]4-

Fe4[Fe (CN)6]3 (7)

kompleks berwarna Perl’s

Prussian Blue

Peningkatan aktivitas dilihat dari adanya peningkatan nilai absorbansi.

Semakin besar aktivitas antioksidan, semakin besar pula absorbansi yang

dihasilkan. Hal ini diakibatkan oleh semakin banyak kompleks yang terbentuk.

Nilai EC50 merupakan konsentrasi senyawa antioksidan yang memberikan nilai

20

absorbansi 0,5 yang dihitung dari grafik antara konsentrasi ekstrak dan absorbansi

pada panjang gelombang 700 nm (Ferreira dkk., 2007).

9. Sel Vero

Sel Vero dihasilkan dari ginjal monyet hijau Afrika (Cercopithecus aethiops)

yang telah dewasa dan normal yang banyak digunakan dalam penelitian

(Ammerman dkk., 2008). Sel Vero telah digunakan untuk memproduksi berbagai

vaksin virus. Sel Vero juga telah digunakan dalam mempelajari proses replikasi

virus dan plaque assay (Kistner dkk., 2007). Sel Vero merupakan sel monolayer

berbentuk poligonal dan pipih. Sel Vero yang dibiakkan secara in vitro

merupakan sel epithelial-like (Ammerman dkk., 2008). Sel ini digunakan sebagai

model sel epitel di kulit seperti sel sebosit yang mengeluarkan lipid dan sel epitel

organ di dalam tubuh.

Proses adhesi yang terjadi antara sel dan permukaan padat polistiren

disebabkan oleh adanya interaksi kation divalen dengan protein basa. Dengan

adanya kondisi yang optimal, sel dapat melekat dan menyebar pada carrier dan

membentuk sel monolayer (Nor dkk., 2010).

Gambar 3. Morfologi sel Vero dengan perbesaran 400x (Athmanathan dkk., 2002)

21

Sel Vero merupakan sel normal yang dapat mengalami kematian saat jumlah

sel terlalu banyak. Proses subkultur sel Vero perlu dimonitor agar menjadi

monolayer dengan jumlah yang cukup. Kultur sel Vero membelah menjadi dua

dalam 24 jam (Nahapetian dkk., 1986). Untuk menjaga sel dari kontaminasi

bakteri, biasanya digunakan antibiotik seperti penicilin/streptomisin dengan dosis

rendah. Antibiotik tidak dapat dipakai jika penelitian menggunakan sel Vero yang

diinfeksi bakteri. Konsentrasi sel dalam suspensi sel dapat dihitung dengan

hemocytometer (Ammerman dkk., 2008).

10. Aktivitas sitoprotektif

Adanya radikal bebas yang terdapat dalam tubuh dapat menimbulkan

berbagai kerusakan baik pada sel maupun jaringan. Tubuh mempunyai sistem

perlindungan endogen terhadap adanya senyawa radikal bebas. Sistem

perlindungan tersebut berupa perlindungan secara enzimatik dan non-enzimatik.

Perlindungan secara enzimatik dapat berupa enzim-enzim dalam tubuh yang dapat

mengubah senyawa radikal bebas menjadi senyawa yang tidak berbahaya bagi

tubuh. Enzim katalase dapat mengubah hidrogen peroksida yang bersifat radikal

menjadi air dan oksigen (Kang dkk., 2006). Perlindungan secara non-enzimatik

berupa senyawa-senyawa yang mempunyai aktivitas dalam menangkap radikal

bebas seperti senyawa polifenol, asam askorbat dan karotenoid (Yoo dkk., 2008).

Senyawa flavonoid seperti kaempferol, kuersetin, dan mirisetin mempunyai

aktivitas melindungi sel hepatosit dari H2O2 dan CCl4 secara in vitro (Zhao dan

Zhang, 2009 cit Minari, 2012). Salah satu mekanisme perlindungan sel yaitu

22

antioksidan dapat melindungi membran sel dari proses oksidasi, mencegah

kerusakan membran, mencegah sel mengalami lisis dan mati (Iwalewa dkk.,

2005) serta meminimalisasi terjadinya proses peroksidasi lipid (Yoshikawa dan

Naito, 2002).

Jika antioksidan dalam tubuh tidak dapat mengimbangi radikal bebas yang

berada dalam tubuh maka dapat terjadi kerusakan pada sel maupun jaringan tubuh

yang dapat memicu penyakit-penyakit degeneratif (Seyfizadeh dkk., 2012).

Senyawa antioksidan tambahan dari luar tubuh diperlukan untuk mengimbangi

kelebihan radikal bebas. Asupan makanan yang banyak mengandung antioksidan

diperlukan untuk menjaga sel-sel tubuh dari kerusakan. Antioksidan yang terdapat

dalam makanan dapat berupa baik alami yang berasal dari buah dan sayur maupun

sintetik seperti butyl hydroxy anilin (BHA), butyl hydroxy toluen (BHT), propyl

gallate (PG), dan tertier-butylhydroquinone (TBHQ) (Susilowati, 2010).

Antioksidan sintesis berpotensi menginduksi proses karsinogenesis (Ito dkk.,

1986). Antioksidan alami menjadi perhatian para peneliti untuk pengembangan

agen antioksidan (Nawaly dkk., 2013).

Kemampuan sitoprotektif dari suatu senyawa diuji menggunakan suatu

stresor penginduksi toksisitas pada sel. Adanya sel yang berhasil hidup

ditentukan dengan MTT assay.

Uji 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT)

didasarkan pada proses reduksi oleh enzim mitokondrial reduktase terhadap

garam tetrazolium yang berwarna kuning. Senyawa yang terlibat dalam proses

reduksi garam tetrazolium adalah nicotinamide adenine dinucleotide (NADH),

23

nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), dan suksinat. Proses

reduksi menghasilkan kristal formazan ungu yang tidak larut. Proses ini dapat

terjadi jika sel masih dapat beraktivitas (Barahuie dkk., 2014). Metode ini dapat

digunakan untuk menentukan jumlah sel yang masih hidup yang ditentukan

dengan viability cell.

Gambar 4. Reaksi reduksi MTT menjadi formazan oleh enzim mitokondrial reduktase

(Barahuie dkk., 2014)

F. Landasan Teori

Radikal bebas dapat menimbulkan kerusakan sel dan jaringan tubuh.

Kerusakan ini dapat mengarah pada timbulnya penuaan dini dan penyakit-

penyakit degeneratif. Konsumsi senyawa antioksidan yang terdapat pada buah dan

sayur dapat mencegah penyakit degeneratif (Carslen dkk., 2010).

Buah jambu biji merah mengandung senyawa fenolik, flavonoid, vitamin C,

karotenoid dan fiber (Chiari dkk., 2012). Senyawa tersebut berperan dalam

berbagai efek farmakologis dalam tubuh termasuk sebagai antioksidan dengan

menetralkan radikal bebas di dalam tubuh. Buah jambu biji merah berpotensi

menangkap radikal bebas dalam tubuh dan melindungi sel-sel tubuh dari

kerusakan akibat radikal bebas.

24

Kapasitas antioksidan senyawa yang terkandung dalam tanaman dapat diuji

menggunakan metode penangkapan radikal bebas seperti DPPH. Dengan uji ini

dapat diketahui seberapa besar kapasitas senyawa antioksidan dalam buah-buahan

yang dapat menangkap radikal bebas. Uji penangkapan radikal bebas DPPH buah

jambu biji merah pernah dilakukan oleh Djanis dan Hanafi. Uji penangkapan

radikal bebas DPPH oleh Djanis dan Hanafi (2009) menggunakan sampel daging

buah jambu biji merah tanpa kulit yang menghasilkan nilai IC50 sebesar 314,96

mg/L. Uji penangkapan radikal bebas DPPH buah jambu biji merah juga

dilakukan oleh Beh dkk. Uji penangkapan radikal bebas DPPH oleh Beh dkk.

(2012) menggunakan buah jambu biji merah segar yang diekstraksi dengan

pelarut metanol menghasilkan nilai IC50 0,156 mg/mL. Bahan yang digunakan

oleh penulis adalah buah jambu biji merah segar utuh yang diekstraksi

menggunakan etanol 70%, sehingga berbeda dengan penelitian Djanis dan Hanafi

serta berbeda dengan penelitian Beh dkk. Aktivitas antioksidan dapat ditentukan

dengan metode reducing power assay (Ferreira dkk., 2007). Metode reducing

power berdasarkan pada transfer elektron, bukan transfer hidrogen seperti metode

DPPH. Reducing power assay dapat digunakan untuk menentukan kapasitas

transfer elektron dari antioksidan. Aktivitas antioksidan dengan reducing power

assay buah jambu biji merah pernah dilakukan oleh Ahmed dkk. (2013)

menghasilkan nilai sebesar 2,39 mg ekuivalen asam askorbat (AA) per gram

ekstrak. Perbedaan uji reducing power yang digunakan Ahmed dkk. dan penulis

adalah sampel buah jambu biji merah yang digunakan oleh Ahmed dkk. tidak

disertai kulit buah, sementara sampel uji penulis disertai kulit buah.

25

Uji sitoprotektif sel dapat memberikan informasi mengenai kapasitas

perlindungan sel-sel tubuh dari radikal bebas oleh senyawa dalam ekstrak. Buah

jambu biji merah memiliki aktivitas sitoprotektif terhadap H2O2 pada sel kanker

hati HepG2 (Chunhabundit dkk., 2012).

G. Hipotesis

1. Ekstrak etanolik buah jambu biji merah mengandung golongan senyawa

flavonoid ditinjau dari profil kromatografi lapis tipis.

2. Ekstrak etanolik buah jambu biji merah memiliki aktivitas antioksidan

dengan metode penangkapan radikal bebas DPPH dan reducing power

assay.

3. Ekstrak etanolik buah jambu biji merah memilki kemampuan dalam

melindungi sel Vero dari paparan senyawa H2O2.