B SEJT DIFFERENCIÁCIÓ A CSONTVELŐBEN
Jan 01, 2016
V D JTCGACGTTATATAGCTGCAATATA
Junctional Diversity
TTTTTTTTTTTTTTT
Germline-encoded nucleotides
Palindromic (P) nucleotides - not in the germline
Non-template (N) encoded nucleotides - not in the germline
Creates an essentially random sequence between the V region, D region and J region in heavy chains and the V region and J region in light chains
How does somatic gene rearrangement(recombination) work?
1. How is an infinite diversity of specificity generated from finite amounts of
DNA?
Combinatorial diversity
2. How do V region find J regions and why don’t they join to C regions?
12-23 rule
3. How does the DNA break and rejoin?
Imprecisely, with the random removal and addition of nucleotides to
generate sequence diversity
Junctional diversity (P- and N- nucleotides, see above)
Coexpression of IgD and IgM is regulated by RNA processing.
Hogyan fejeznek ki az érett B-sejtek sejt felszíni IgM és IgD receptorokat is?
Hogyan működik
Sikeres génátrendeződés gátolja a rekombinációt a másik kromoszómánALLÉL KIZÁRÁS
Csak egyféle H- és L-lánc szintetizálódikA sejtfelszínre 2 H- és 2 L-láncból álló dimerek kerülnek ki
?
Minden B-sejt azonos specificitású immonglobulint termel
A nehéz és a könnyű lánc is 2 példányban van a csíravonalban (anyai és apai kromoszómán)
Mégis csak egy B-sejt receptor (BCR) képződik
The B-sejt monospecifikus antitestet termel
Ez alapvető fontosságú a specifikus ellenanyag válasz szempontjából.
A mechanizmus ami ezt biztosítja:
Allélkizárás…Allelic exclusion
ÜGYES GENETIKAI BIZONYÍTÉK AZ ALLÉL KIZÁRÁSRA
Az Ig allotípusok a B-sejtek felszínén fluoreszcens festékkel kimutathatók
a/a b/b a/b
YBb YBa YBb
Y
YB ab
YBa ÉS
ALLOTÍPUS- a H-lánc C-régió polimorfizmusa (marker)
H-lánc átrendeződés gátlása megakadályozza, hogy egy B-limfocitában
kétféle specificitás alakuljon ki
AZ ALLÉL KIZÁRÁS SZÜKSÉGES A HATÉKONY KLONÁLIS SZELEKCIÓHOZ
Minden utódsejtnek ugyanazzal a specificitással kell rendelkeznie, máskülönben az immunválasz hatásfoka romlik
A H-lánc átrendeződés gátlása az osztódó utódsejtekbenmegakadályozza az új specifitások létrejöttét
S. typhi
Antibody
S. typhi
YY
Y Y
A H-lánc átrendeződés gátlása biztosítja, hogy egy sejtben csak egyféle ellenanyag képződjön
Az allél kizárás megakadályozza a nem kívánatos specifitású ellenanyagok képződését
BSaját antigenpl. májsejt
S. aureusY Y
YYYB
S. aureus
YY
Y
YY
Y
Y
AntiS. aureus
Ab
Y
Y Y
Y Y
YAnti-májsejt
Ab
Egyféle Ag receptor/sejt HA egy sejtben kétféle Ag receptor lenne
Y
Y Y
Y
YY Y
AntiS. aureus
Ab
Ezáltal megakadályozza a nem kívánatos auto-reaktív választ
Az allél kizárás szükséges a repertoire teljességének kialakulásához („lyuk” a készletben)
Anti-agyi fehérje B-sejt kizárása – sajáttal szembeni tolerancia
YYBB
Sejtenként egy Ag specificitás
S. aureus
Anti-agyi fehérje IgAND
anti-S. Aureus IgYYYBB
IF ha sejtenként két specificitás lenne
Anti-agyi fehérje Ig
BB
Deléció Anergia
OR
Anti-S.Aureus B sejtek kizáróknak és hiányoznak a készletből
BUTBUT
YYYBB
1. Az Ig génszegmensek szomatikus átrendeződése ellenőrzött sorrendben, meghatározott program szerint megy végbe
2. Egy egyed különböző B-limfocitáiban a gén szegmensek kombinációja nagy számú, egymástól eltérő nehéz és könnyű lánc variábilis régiót eredményez
3. Egy adott egyed teljes B-sejt készlete eltérő módon átrendezett, eltérő variábilis régióval rendelkező B-limfocitából áll
A B-SEJT KÉSZLET SOKFÉLE ANTIGÉN FELISMERÉSÉRE KÉPES
4. Egy B-sejt az allél kizárás eredményeként csak egyféle nehéz és egyféle könnyű láncot szintetizál
ELKÖTELEZETTÉ VÁLIK EGY ADOTT ANTIGÉN KÖTŐ HELY KIALAKÍTÁSÁÉRT
A CSONTVELŐBEN ZAJLÓ SZOMATIKUS GÉNÁTRENDEZŐDÉS EREDMÉNYE
AZ ANTIGÉN JELENLÉTÉTŐL FÜGGETLEN FOLYAMATOK
A B-SEJT ÉRÉS SORÁN A CSONTVELŐBEN MENNEK VÉGBE
Az allél kizárás lehetőséget ad a limfómák Az allél kizárás lehetőséget ad a limfómák diagnózisáradiagnózisára
Egyetlen egyedi átrendeződéssel rendelkező sejt klonális osztódása alapján a vérben keringő vagy csontvelői tumor sejtek
aránya meghatározható
Felhasználható a kezelést követő reziduális tumor sejtek követésére
Diagnosis and monitoring of the treatment of childhood acute lymphocytic leukemia (C-ALL)
The sequence of the framework regions are well conserved. Step 1: design primers that amplify these regions together with the hypervariable regions
Step 2: sequence the PCR fragments to obtain spec. Sequence info on the actual tumor (monoclonal, majority of amplification product is tumor-derived
Step 3: based on the sequence info, design tumor-specific PCR primers
Step 4: quantitate gene expression by Q-PCR. Follow success of therapy and detect minimal residual disease much earlier then by flow cytometry
Minimális reziduális betegség (MRD)
A gyermekkori akut limfoblasztos A gyermekkori akut limfoblasztos leukémia (ALL) heterogén leukémia (ALL) heterogén
betegségbetegség
Eltérő prognózisú alcsoportokEltérő prognózisú alcsoportok
Személyre szabott kemoterápia kiválasztásaSzemélyre szabott kemoterápia kiválasztása
Terápiára adott válasz
Relapszus korai felismerése
Csontvelőátültetés
Áramlási citometria:Áramlási citometria:- a leukémiás sejtek abberáns protein a leukémiás sejtek abberáns protein
expresszióját detektáljaexpresszióját detektálja- kvantitatív módszer, de mintaigényeskvantitatív módszer, de mintaigényes
Real-time kvantitatív PCRReal-time kvantitatív PCR- a PCR specifikussága és érzékenysége + a PCR specifikussága és érzékenysége +
abszolút kvantitálásabszolút kvantitálás- minimális mennyiségű minta szükségesminimális mennyiségű minta szükséges
Minimális reziduális betegség Minimális reziduális betegség (MRD)(MRD)
- nyomonkövetésére használt módszerek- nyomonkövetésére használt módszerek
1. gDNS izolálás D1 és follow-up csontvelő mintákból
2. Multiplex PCR: IgH, TCRg, TCRd, TCRb, IgK
(BIOMED2 primer-párok)
3. Szekvenálás: Páciens-specifikus szekvencia
4. Primertervezés, real-time kvantitatív PCR assay (QPCR)
optimalizálása és karakterizálása
6. Follow-up csontvelő minták analízise, MRD kvantitálása
(D8, D15, D33,M2,M3,M5,M7,M10,M12, évenként)(D8, D15, D33,M2,M3,M5,M7,M10,M12, évenként)
MRD analízis real-time kvantitatív PCR-ral: Munkafázisok
II. Szekvencia meghatározásaABI Prism - 3100 Avant Genetic Analyzer,
ABI Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit
Result of IMGT junction analysis (http//imgt.cines.fr): IGH rearrangement of patient Q015
IG/TCR génátrendeződések monitorozásareal-time kvantitatív PCR-rel
V N1 D N2 J
Konszenzus próba ésreverz primer
Általunk tervezett,páciens-specifikus
forward primer
BIOMED2 Concerted Action: IgH, TCRg, TCRd, TCRb, IgK
Perifériás
A B sejt fejlődés szakaszai
Őssejt - HSC Korai pro-B sejt Késői pro-B sejt
Kis pre-B sejt Éretlen B sejt érett B sejt
Az egyes érési fázisokat sejtfelszíni markerek megjelenése (vagy eltűnése) jellemzi
Csíravonal DH to JH VH to DHJH VHDHJH
Nagy pre-B sejt
Pre-receptor
Y
ReceptorH+L
CD19, CD10,RAG
Termelt faktorok – CITOKINEKKolónia stimuláló faktorokNövekedési faktorokDifferenciációs faktorok
2. A sztróma sejtek citokineket termelnek
B
A CSONTVELŐI SZTRÓMA SEJTEK TÁPLÁLJÁK/SEGÍTIK A FEJLŐDŐ B- LIMFOCITÁKAT
A citokinek és a közvetlen sejt-sejt kölcsönhatások a differenciáció során változnak
Sztróma sejt
1. Specifikus sejt-sejt kölcsönhatás a sztróma sejtek és a B-sejtek között
Sejt-sejt kölcsönhatás
Koraipro-B
c-KitReceptor Tyrosine
kináz
Stem cell factor (SCF)Sejthez kötött növekedési
faktor
VLA-4(Integrin)
CLP
A fejlődés egyes szakaszaiban a citokinek és sejtkölcsönhatások változnak
Sztróma sejt
Sejt adhéziósmolekulák
VCAM-1(Ig superfamily)
EBF, E2APax5
Interleukin-7receptor
Sztróma sejt
Késői pro-B Pre-B
Interleukin-7Növekedési faktor
Korai pro-B
VLA-4(Integrin)
VCAM-1(Ig superfamily)
A fejlődés egyes szakaszaiban a citokinek és sejtkölcsönhatások változnak
CD19, CD10,RAG és proliferációDJ… VDJ átrendeződés
B sejt receptor
Átmenetileg jelenik meg a membránban produktív VHDHJH CH átrendeződés után
VpreB/5 – pót L-lánc, a membrán kifejeződéshez szükséges
Ig & Ig jelátvivő molekulák
CH
H-láncVHDHJH
V-preB
5
A pre-B sejt receptor liganduma nem ismert
Pre-
The pre B-cell receptor monitors the quality of heavy chain rearrangement
Mutation in λ5– arrest atPro-B cell stage
SÚLYOS IMMUNDEFICIENCIA
Productive µ-lánc átrendeződés---pre-BCR
RAG gének lekapcsolása
µ-lánc átrendeződés leállALLELIC EXCLUSIONEgyféle µ-lánc és specificitás
A pre-B sejt receptor stimulálásának következményei
1. Biztosítja az egyedi specificitást
Nagy Pre-B
Sztróma sejt
Ismeretlen ligand
2. Kiváltja a belépést a sejtciklusba
ALLÉL KIZÁRÁS
1. Gátolja a további H-lánc átrendeződést
2. A keretben leolvasható átrendeződést hordozó pre-B sejtek osztódását eredményezi
LargePre-B
LargePre-B
LargePre-B
LargePre-B Large
Pre-BLargePre-B Large
Pre-BLargePre-B Large
Pre-BLargePre-B
Proliferáció
Y ÉretlenB sejt
L-lánc kifejeződésIgM a membránban
IgM
A pre-B sejt receptor stimulálása sejtosztódást vált ki
Largepre-B
Sok nagy pre-B sejt azonos pre-B receptorokkal
Large pre-B
Intracellular VDJCH chainVL-JL átrendeződés
Osztódás leáll
Pre-B receptor eltűnik
Kis pre-B
A GÉNÁTRENDEZŐDÉS LEHETŐSÉGEI
V-D-J1.allél
V-D-J2.allél
mRNSFehérjereceptor
Átrendeződés gátlása
V-J1.allél
V-J2.allél
V-J1.allél
V-J2.allél
Nem sikeres
Sikeres
mRNS fehérje
Átrendeződés gátlása
mRNS fehérje
Átrendeződés gátlása
A monovalens saját antigéneket felismerő éretlen B sejtek anergiás állapotba A monovalens saját antigéneket felismerő éretlen B sejtek anergiás állapotba kerülnekkerülnek
Rövid élettartam a Rövid élettartam a perifériánperiférián
1. Az immunoglobulin gén szegmensek szigorúan ellenőrzöttszigorúan ellenőrzött átrendeződése
2. Egy adott B-sejt elkötelezetté válik egy egyedi H- és L-láncegy egyedi H- és L-lánc variábilis domén szintézisére, ami meghatározza a specificitást
3. Egy adott egyedben nagy B-sejt készlet (repertoire) alakul ki, ahol az egyes B-sejt klónok különböző H- és L-lánc variábilis doménekkel rendelkeznek
4. Ez a potenciális B-sejt készlet sokféle különböző antigén felismerésére képes
5. A naív éretlen B-sejtek azonos H- és L-lánc variábilis régiókkal rendelkező IgM és IgD felszíni immunoglobulint is kifejeznek
A SZOMATIKUS GÉN ÁTRENDEZŐDÉS ÉS ALLÉL KIZÁRÁS EREDMÉNYE