AZOSPERMİK İNFERTİL ERKEKTE GENETİK TESTLERDE YENİLİKLER Yrd.Doç.Dr.Hakan Özveri Acıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı
Jan 29, 2016
AZOSPERMİK İNFERTİL ERKEKTE GENETİK TESTLERDE
YENİLİKLER
AZOSPERMİK İNFERTİL ERKEKTE GENETİK TESTLERDE
YENİLİKLER
Yrd.Doç.Dr.Hakan ÖzveriAcıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi
Üroloji Anabilim Dalı
Genetikte Yaşanan Gelişmeler
• “ERA of GENOMICS”
• “GENETİK ÇAĞI”
• Tüm DNA sekanslarının
sistematik olarak çalışılarak
ortaya konulması
• Human Genome Project(HGP)-
İnsan Genom Projesi
• International Hapmap Project
• Encylopedia of DNA Elements
Project(ENCODE)
• 30-35 bin gen (Tahmin 80-140 bindi)
• Normal spermatogenezde görev alan gen sayısı: 2000 ve üzeri
• 1 no’lu kromozom- 2968 gen
• Y Kromozumu- 231 gen
• Gen az ama ürün çeşitliliği inanılmaz!!!(500 bin-1 milyon protein)
Genetikte Yaşanan Gelişmeler
Microarray Teknolojisi
• Gen çipi
• DNA çipi
• Biyoçip
• Ekprese edilen binlerce genin ekspresyon düzeyini aynı anda izlemek için sıralı bir şekilde oluşturulmuş DNA spotları
Microarray Teknolojisi
•Microarray’de onbinlerce spot
•Yüzeye tutturulan DNA segmentleri (20 ile
100 ya da daha fazla nükleotid uzunluğunda
olabilir) probe olarak tanımlı
Microarray Teknolojisi
• Tüm sekanslama girişimlerinde olduğu gibi
microarray kullanımında da amaç
• Bir organizmanın belirli bir
hücresinde,belirli bir zamanda ve belirli
koşullar altında hangi genler ifade
edilmektedir?
Microarray Teknolojisi
Anormal Hücreler Normal Hücreler
RNA İzolasyonuRNA İzolasyonu
Reverse Transcriptase
İşaretleme
Microarrayde Hibridizasyon
Microarray Teknolojisi-İnfertilite
• Spermiyogramda anomali saptanmayan fertil ve infertil erkeklerde Microarray analizlerinin karşılaştırılması
• Fertil ve infertil erkeklerin Transkriptom’ları arasında
istatistiki fark var. Özellikle erkek gamet formasyonu ve maturasyonu ile ilgili genlerin ekspresyonlarında anlamlı farklar mevcut.
Garrido N ve ark., Fertil Steril; Vol 91, No: 4, Supp Nisan 2009
Erkek Faktörüne Bağlı İnfertilitede Etyoloji
Tanı(n=500) %
Varikosel 34.0Obstrüksiyon 26.0Testiküler Yetmezlik 16.4Idiyopatik 26.0Ejakülatuar 2.4Kriptorşidi 3.0ASA 2.0Genetik nedenler 0.5Gonadotoxinler 2.0Infeksiyonlar 1.0Sistemik hastalıklar 0.2Endokrinopati 1.0Travma 1.0
Çoğunluğunda tam gösterilememiş
olsa da GENETİK PATOLOJİ?
HGP ÖncesiHGP Öncesi
Erkek Faktörüne Bağlı İnfertilitede Etyoloji
1. Genetik (%15-20)A)Kromozomal Bozukluklar Azoospermi- Normospermi ~%5.8Klinefelter Sendromu (XXY) Azoospermi-Şiddetli Oligospermi ~%4.15Diğer Eşey kromozomal değişik. Azoospermi- Normospermi %0.15Robertsonian Translokasyonlar Azoospermi-Şiddetli Oligospermi %0.75Resiprokal Translokasyonlar Azoosopermi-Şiddetli Oligospermi %0.75B)Y Kromozom Delesyonları Azoosopermi-Şiddetli Oligospermi ~%8.2AZFa Azoospermi-SCOS %0.4AZFb Azoospermi-Spermatogenik Arrest %1.3AZFc Azoospermi-Şiddetli Oligospermi %2.7AZFb-c SCOS/Spermatogenik Arrest %0.7AZFa-b Azoospermi-SCOS-Şid. Oligospermi %0.1AZFa+b+c Azoospermi-SCOS %0.3Parsiyel AZFc Azoospermi-Normospermi %2.3AZF dışında %0.5C)Gen Mutasyonları %1-6CFTR(CBAVD hastalarında %60-70)Obstrüktif Azoospermi %5AR Azoospermi-Oligospermi %1.7INSL3-LGR8 Kriptorşidizm <%52.Varikosel (%35)3. İdiyopatik (%25)4. Enfeksiyon (%10)5. Endokrin (<%5)6. İmmünolojik (<%5)7. Kanal Obstrüksiyonları(<%5)
İNFERTİLİTEDE GENETİK
9.766 İnfertil Erkek 94.465 Erkek Yenidoğan
Kromozomal Anomali %5.8 %0.38
Seks Kromozomal Anomali %4.2 %0.14
Otozomal Kromozomal Anomali %1.5 %0.25
Johnson MD, Fertil Steril,1998; 70:397
Van Assche E, Hum Reprod, 1996; Dec; 11 Suppl 4:1-24.
İnfertilite - Azoospermi: % 5-20
0102030405060708090
100
Obstrüksiyon Endokrinopati Genetik Testiküleryetmezlik
%
Azoospermi değerlendirmesinde Amaç –
Ürolog gözüyle
Düzeltilebilir patolojilerin saptanması ve tedavisi
İnfertilite ile görülebilen hayatı tehdit edici hastalıkların tanınması ve tedavisi
Üremeye yardımcı tedavi yöntemlerine gereksinimi azaltmak- maliyetin düşürülmesi
Üremeye yardımcı tedavi yöntemleri ile çocuklara geçebilecek genetik geçişli patolojilerin saptanması ve çiftlerin bilgilendirilmesi
AnamnezFizik muayene
Semen analizi (2x)
Hormonal değerlendirmeGenetik değerlendirme
Radyolojik değerlendirme
TEDAVİ
Azoospermi Değerlendirmesi
Biyopsi/Sitoloji
10
20
AzoospermiEn az 2 semen analizinde, mikroskopik incelemede ejakülatta hiç spermatozoa görülmemesi durumu
GENETİK BOZUKLUKLAR
•Grup I: Kromozoma ait nümerik ya da yapısal anomaliler47 XXYKromozomların yapısal anomalileri(delesyon, duplikasyon, inversiyon, translokasyon)
•Grup II: Epigenetik Mutasyon ya da kırılma olmaksızın oluşan ve gen ekspresyonunu değiştiren biyokimyasal
DNA modifikasyonları (DNA Metilasyonu, Histon Metilasyonu, Histon asetilasyonu, histon fosforilazyonu, kromatin re-modelling)
•Grup III: Tek gen hastalıkları Kistik Fibrozis
•Grup IV: Poligenik/multifaktöryel genetik hastalıklarEn sık görülen ve insanda infertilitede dahil hastalıkların çoğunluğunda etyolojik faktör
•Grup V: Non-Kromozomal DNA Mutasyonları Mitokondriyal Mutasyonlar
Kromozomal Anomaliler(Nümerik)
Klinefelter Sendromu (47 XXY – Non-mozaik Form)
•1/500-1/1000 canlı doğumda•Azospermide en sık kromozomal neden(%14)•Atrofik testisler ( ~ 5 ml)•Azospermi•Jinekomasti•KS’lu hastaların %80-100’ünde normal haploid sex kromozomu
•Sperm elde etme oranları %27-45Denschlag ve ark., Fertil Steril, 2004
Klasik Triad ?
Klinefelter Sendromu Tanı
1. Periferik kandan karyotip analizi Uzun süre, fazla işgücü, pahalı, Mozaik tipte düşük sensitivite
2. Yanak içi mukozasından Barr Body(Cisimcik) Sitolojisi Ucuz ve sensitif
3. FISH
Pahalı, tecrübeli eleman, software
4. X Kromozomu üzerindeki iki genin metilasyon düzeyleri
arasındaki fark – 5 $Familial Mental Retardation Gene 1 (FMR1) ile
X-Chromosome Inactivating Transcript(XCIT)
5. Quantitative Flourescence PCR-
Multipl genetik patoloji
Kantitatif Floresan PCR(QF-PCR)
• Seks kromozom anomalileri
• Mikrodelesyonlar/Duplikasyonlar
• AR CAG tekrarları
• Bütün kromozomal bozuklukların eş zamanlı saptanabilmesi
Y Kromozom Mikrodelesyonları
• Erkek infertilitesi ile Y Kr.Mikrodelesyon ilişkisi :
1976 Tiepolo ve Zuffardi Y Uzun kolunda AZF bölgesi
Gen bölgesi Aday Gen/genler
AZFa USP9Y, DBY(Dead Box on the Y), UTY
AZFb E1F1AY, RBMY
AZFc DAZ, CDY1, BPY2, PRY
AZFd DYS237
• Oligospermi - %6-8
• Azospermi - %3-15
AZF delesyon tiplerinin dağılımı
AZFb16%
AZFa5%
Non-AZF5%
AZFc60%
Kombi14%
AZFc
AZFb
AZFa
Non-AZF
Kombi
Y-Mikrodelesyonlarında Sperm Elde Etme
SpermKomplet AZFa ya da AZFb
-Kombine AZFa+AZFb+AZFc
-Kombine AZFb+AZFc
-Kombine AZFa+AZFc
-Parsiyel AZFa ve AZFb(Tek ya da kombine) +Parsiyel ya da komplet AZFc
+Kombine parsiyel AZFb+AZFc
+
Y-Mikrodelesyonlarında Testis Histolojisi
HistolojiKomplet AZFa Germ Hücre Aplazisi ya da
SCO
Komplet AZFb Matürasyon arresti(Spermatosit ya da
spermatid evresinde)
Komplet AZFc Şiddetli Hipospermatogenez
Şiddetli Oligospermi
Kombine parsiyel AZFa+AZFb
Miks Histoloji
Kombine parsiyel AZFb+AZFc
SCO ya da matürasyon arresti
Gr/gr Delesyonları
• AZFc bölgesinde segmentler arasındaki Homolog Rekombinasyonlar sonucu
• 21 gen delesyona uğrar
• AZFc’de DAZ geninden 2 kopya, CDY1 den 1 kopya ve çeşitli transkripsiyon ünitelerinden de bazı kısımların delesyonu
AZFc
• AZFc delesyonu olan erkeklerde zamana bağlı olarak sperm üretiminde azalma
Simoni ve ark, Fertil Steril, 1997, 67:542-547
• AZFc delesyonu bilinen erkeklerde Kriyoprezervasyon yapılmalıdır.
Krausz C ve ark, Hum Reprod, 1999, 14:1717-1721
AZF Duplikasyonları
• 4 adet DAZ geni oluşumu ile giden duplikasyonlar
Repping 2003, 2004
• AZFc parsiyel duplikasyonu erkek infertilitesinde bir risk faktörüdür.
Lin ve ark., 2007, Hum Mutat
• Azospermik ve Oligospermik hastalarda DAZ gen sayısında artış
Writz ve ark., 2005, Fertil Steril
Y Kromozom MikrodelesyonlarıKlinik Önemi
•Spermatogenezde ciddi bozulma
•İnfertiliteye neden olan genetik hastalıklar arasında en sık tespit edilen bozukluk
•Yardımla üreme teknikleri Üreme için tek şans
•Sperm elde etmenin mümkün olmadığı durumlar(AZFa, AZFb)
•Erkek çocukta da kalıtsal olarak Mikrodelesyon geçişi
•Genetik bilgilendirme çok önemli!
EPİGENETİK
Epigenetik Modifikasyon
Transkripsiyondaki Rolü
DNA Metilasyonu Gen Baskılanması
Histon Metilasyonu Gen baskılanması ve aktivasyonu
Histon Demetilasyonu Gen baskılanması ve aktivasyonu
Histon Asetilasyonu Gen aktivasyonu
Histon Deasetilasyonu Gen baskılanması
Histon Fosforilizasyonu Gen aktivasyonu ve baskılanması
Histon Ubiquitylation Gen baskılanması ve aktivasyonu
Histone sumoylation Gen baskılanması
Gen Mutasyonları Kistik fibroz gen mutasyonları
Konjenital bilateral vaz deferens agenezisi İdiyopatik bilateral epididimal obstrüksiyon
Kallman sendromu (KAL-1)Androjen reseptör gen mutasyonuİmmotil silia sendromuPolikistik böbrek hastalığıOrak hücre anemisi ve talasemi
Kistik Fibrozis-CBAVD
• Otozomal resesif geçiş
• 1/2500 sıklık
• Pulmoner ve pankreatik fonksiyon bozukluğu
• 7q31 üzerinde ”Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Geni”
• CVAD’li hastaların %85’inde en az 1 CF gen mutasyonu
• KF’li hastaların >%95 CBAVD nedeni ile infertil
Kistik Fibrozis-CBAVD
• Klinik
– Kronik pulmoner obstrüksiyon ve
enfeksiyonlar
– Pankreatik yetmezlik
– Neonatal mekonyum ileusu
– İnfertilite
Kistik Fibrozis-CBAVD
•Muayene– Epididim gövde ve kuyruğu yok
– Testis, caput epididim palpabl
Kistik Fibrozis Kromozom 7q.31.2>1200 mutasyonEn sık görülen 24 mutasyon
Mutasyon Sıklık% Mutasyon Sıklık% Mutasyon Sıklık%
ΔF508 66 R117H 0 0.3 A455E 0.1
G542X 2.4 R1162X 0.3 S549N 0.1
G551D 1.6 R347 0.2 R560T 0.1
N1303K 1.3 Dl507 0.2 1898+1G®T 0.1
W1282X 1.2 3849+10kbC®T 0.2 2184delA 0.1
R533X 0.7 G85E 0.2 2789+5G®A 0.1
621+1G®T 0.7 1078delT 0.1 3659delC 0.1
1717- G®T 0.6 R334W 0.1 711+1G®T 0.1
Jarvi K, Chan PTK. In: “Reproductive Medicine Secrets”. 2004.Chan PTK. J Male Sex Reprod Health. 2002;2:161-164.
Kistik Fibrozis-CFTR
• CFTR geni non-coding DNA bölgesinde İntron 8’in splicing alanında Polythymidine yolunda varyasyonlar, azalmalar (5T, 7T, 9T)
• 5T azalması Splicingde azalma
CFTR mRNA’da %50 azalma
Matür ve fonksiyonel CFTR proteininde azalma
CFTR-Fertilite
• Sperm kapasitasyonu için hücre içi pH ve Plazma membran hiperpolarizasyonu• Gerekli olan- Ekstraselüler HCO3-• Adenil siklaz aktivasyonu ve CAMP
üretimi• Sonuç- CFTR spermde azalmış
fertilizasyon kapasitesine neden oluyor. Xu MW ve ark, Proc Natl Acad Sci, June
2007
Kistik Fibrozis-CFTR
• İdiyopatik Obstrüktif Azospermide
ve Palpable Vaz Deferens %50 CFTR gen Mutasyonları
• Öneri : CBAVD, CUAVD ve İdiyopatik Obstrüktif Azospermide CFTR taraması (5T)
Kistik Fibrozis-CBAVD Klinik Önemi
• 1 partnerde CFTR mutasyonu var ise diğer partneri tara!
• Erkekte CBAVD var ise kadın partneri tara!
• CBAVD, CUAVD de renal hipoplazi ya da ageneziyi araştır!
Androjen Reseptör Gen Mutasyonları
• 1/60.000 sıklıkta
• AR’nin olmaması ya da fonksiyonel olarak farklılaşması
• X Kromozomu üzerinde (Xq11-q12)
• 300’den fazla mutasyon
Androjen Reseptör Gen Mutasyonları
• AR – 8 exon
• Exon 1 – CAG Tekrarı
• Normal bireylerde 17-26 tekrar
• Hasta bireylerde 40-52 tekrar
• Tanı – PCR ile AR CAG tekrar bölgesinin incelenmesi
Erkek faktörüne Bağlı İnfertilitede GENETİKHangi hastada hangi test?
Non-obstrüktif azoospermi Karyotip, Y-kromozom mikrodelesyon analizi
Şiddetli oligospermiKaryotip, Y-kromozom mikrodelesyon analizi
CBAVD – obstrüktif azoospermi Kistik Fibrozis taraması– Genişletilmiş panel 5T analizi (Tek ya da çift taraflı vaz deferens
yokluğu tespit edildiğinde)
İnfertilitede genetiğin rolü
• Yanıt bekleyen sorular:• 1-Normal spermatogenezde, sperm maturasyonunda ve
sperm fonksiyonlarında hangi genler rol oynamaktadır?• 2- İnfertiliteye yol açan polimorfizm ya da mutasyonlar
nelerdir, bunları saptayarak hastaları daha iyi tedavi edebilir miyiz?
• 3- Spermatogenez esnasında normal gen ekspresyonunu düzenleyen mekanizmalar nelerdir?
• 4- Erkek infertilitesinde anormal mayotik rekombinasyon ya da ayrışma nasıl rol oynar?
• 5- Embriyogenez üzerinde anormal DNA hasarlarının etkisi nedir?
SONUÇ
•Daha ayrıntılı genetik ve moleküler çalışmalara ihtiyaç var
•Yeni metodlar hızlı, tekrarlanabilir ve maliyeti kabul edilebilir olmalı