SESPI e DIAGNOSI MOLECOLARE Azienda Ospedaliera di Cosenza U.O.C. Microbiologia e Virologia Clinica e Molecolare Direttore Dott.ssa Cristina Giraldi Dr. Maria Vittoria Mauro Corso di formazione teorico-pratico “OTTIMIZZAZIONE DELLA FASE PREANALITICA: QUALITA’ DEL CAMPIONE BIOLOGICO” 15 OTTOBRE 2010
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Azienda Ospedaliera di Cosenza U.O.C. Microbiologia e Virologia … · gold standard per la diagnosi di infezioni del circolo ematico DIAGNOSI DI SEPSI: EMOCOLTURA + DIAGNOSI MOLECOLARE.
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SESPI e DIAGNOSI
MOLECOLARE
Azienda Ospedaliera di CosenzaU.O.C. Microbiologia e Virologia Clinica e Molecolare
Direttore Dott.ssa Cristina Giraldi
Dr. Maria Vittoria Mauro
Corso di formazione teorico-pratico“OTTIMIZZAZIONE DELLA FASE PREANALITICA:
QUALITA’ DEL CAMPIONE BIOLOGICO”15 OTTOBRE 2010
Quali possibili metodi per una
diagnosi rapida nella sepsi?
TECNICHE TRADIZIONALIRIVISITATE
Paziente critico settico
Emocolture: diagramma di flusso
Paziente “settico”
Mediamente 12-36 h>80% entro 24 h
Esecuzione dei prelievi Identificazione ed antibiogramma
Invio al laboratorio Crescita su piastra
Incubazione delle bottiglie Semina su terreno
Emocoltura positiva Colorazione di GramReferto preliminare scritto
Risultato diagnostico60-84 h
Quali possibili metodi per una
diagnosi rapida?
TECNICHE TRADIZIONALIRIVISITATE
NUOVETECNOLOGIE:DIAGNOSTICA MOLECOLARE
Paziente critico settico
campione DNA free
Isolamento DNA
DNA
Test molecolare: Polimerase Chain Reaction
Miliardi di molecole identiche
Specifiche regioni di DNA microbico vengono identificate e
“copiate” numerose volte
Organizzazione del laboratorio per l’esecuzione del test SeptiFast
LightCycler SeptiFast Test
• Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi molecolare di sepsi
• Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante l’utilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence ResonanceEnergy Transfer)”
La procedura del test SeptiFast si basa sui seguenti passaggi :
• LightCycler SeptiFast
Test
1. Lisi meccanica di 1,5 ml di sangue-EDTA
2. Estrazione del DNA
3. Amplificazione in Real-Time PCR del DNA target
attraverso 3 reazioni parallele: G+ G- F
•Analisi di Melting per l’identificazione di specie
• Generazione di un Report mediante SIS (SeptiFast Identification
Software)
La temperatura alla quale le sonde si dissociano dal prodotto di PCR è specifica per la sequenza in esame