-
Univerzitetni študijski program Kemija
Izbirni sklop analizna in anorganska kemija
Avtomatizirana analiza
Seminar 2012
Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar
Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez
dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza
(30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani
predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in
inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne
izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu
napake ali druge nepravilnosti.
Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma
last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.
Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
-
Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Poučevanje monocelične
digitalne analize z uporabo
»droplet-based« mikrofluidov (Seminarska naloga)
Mentor: Avtor:
Prof. Dr. Boris Pihlar David Milićević
-
2
1. Kazalo
1. Kazalo
..............................................................................................................................................
2
2. Namen študije
.................................................................................................................................
3
3. Prednosti mikrofluidov in digitalne analize
.....................................................................................
3
3.1. Uporaba mikrofluidov in digitalne analize pri preučevanju
celic ............................................. 4
4. Poučevanje digitalne analize na univerzah
.....................................................................................
5
4.1. Teoretična priprava
..................................................................................................................
6
4.2. Laboratorijske vaje
...................................................................................................................
6
4.3. Laboratorijska oprema
.............................................................................................................
7
4.4. Izdelava mikrofluidnih čipov (Vaja 1)
.......................................................................................
7
4.5. Karakterizacija mikrofluidnih čipov (Vaja 2)
.............................................................................
8
4.6. Digitalna kvantifikacija enotnega bakterijskega seva (Vaja
3) ................................................. 9
4.7. Hkratna kvantifikacija dveh bakterijskih sevov v mešani
kulturi (Vaja 4) .............................. 10
5. Zaključek
........................................................................................................................................
10
6. Literatura
.......................................................................................................................................
11
-
3
2. Namen študije
Mikrofluidi omogočajo delo z majhnimi količinami reagentov in so
zato zelo primerni tako za enocelično analizo kot tudi za analize
na različnih področjih, kot so genomika, diagnostika, preučevanje
poteka evolucije in čiščenje zdravilnih učinkovin. Vse večja
zastopanost mikrofluidov v bioloških laboratorijih je avtorje
članka spodbudila, da so razvili študijski program, kjer se
dodiplomski in podiplomski študenti učijo izdelovati
»droplet-based« mikrofluidne naprave, jih opredeliti in na koncu
uporabiti za izvajanje digitalnih analiz bakterijskih vzorcev, ki
temeljijo na fenotipskih označevalcih. [1]
Slika 1: »Droplet-based« mikrofluidna naprava [1]
3. Prednosti mikrofluidov in digitalne analize
Izjemen napredek v elektroniki in računalništvu je omogočil
miniaturizacijo elektronskih komponent. V zadnjih letih se je
podoben pojav začel pojavljati tudi v kemijskih in bioloških
znanostih, z razvojem miniaturiziranih »lab-on-chip« naprav, ki
temeljijo na tehnologiji mikrofluidov. Mikrofluidi omogočajo delo z
zelo majhnimi volumni tekočin (običajno v nL ali pL merilu) in jih
je mogoče opredeliti kot aplikacijo toka tekočin v miniaturnih
napravah, v katerih je vsaj ena dimenzija v mikrometrskem območju.
Tisočkratno do milijonkratno zmanjšanje reakcijskih volumnov je
postalo mogoče z uporabo mikrofluidov, ki so sposobni povečati
pretok tradicionalnih analitskih metod, obenem pa predstavljajo
tudi novo, učinkovito orodje za izvajanje digitalne analize na
celični ali molekulski ravni. [1]
-
4
3.1. Uporaba mikrofluidov in digitalne analize pri preučevanju
celic
Digitalni testi, s katerimi vzporedno preučujemo mnogo
posameznih celic ali molekul, imajo številne prednosti pred več
analognimi, običajnimi testi. Pri analizi celic v analogni obliki,
celotno populacijo celic preučujemo istočasno, kot rezultat pa
uporabimo povprečno vrednost celotne populacije. Vendar pa je
zmožnost, da bi lahko opredelili vsako posamezno celico populacije,
zelo pomembna. Kot primer lahko vzamemo tumorje, ki so zapletene
mešanice celic z različnimi genotipi in fenotipi, zato je za
pravilno razumevanje razvoja in napredovanja rakavih obolenj ter
učinkovito zdravljenje le-teh, bistvenega pomena poznavanje tumorja
na enocelični ravni. Prav tako je postalo jasno, da stohastične
razlike v izražanju genov ustvarijo neenotnost med celicami, tudi
če so le-te gensko povsem enake in iz istega okolja. Ta
raznolikost, ki se pojavlja od celice do celice, igra pomembno
vlogo v bioloških procesih (npr. razvijanje odpornosti na
antibiotike ali kemoterapevtike), vendar pa jih z analognimi
analizami ne moremo zaznati, zato moramo podobne analize opravljati
na enocelični ravni. Ena od možnosti je, da preučujemo posamezne
celice z uporabo fluorescentnih sond, kot so fluorescentno označena
protitelesa ali nukleinske kisline. Izražanje gena na eno samo
celico je mogoče preiskovati tudi z izražanjem genetsko kodiranih
fluorescenčnih označevalcev. Bolj dinamičen pogled pa lahko
dosežemo z uporabo fluorescenčne mikroskopije. Fluorescenčna
mikroskopija celic, imobiliziranih v mikrofluidnih napravah, ki so
lahko enostavne pretočne celice ali pa bolj sofisticirane naprave,
odpira številne nove možnosti za enocelične študije. Posamezne
celice se lahko prav tako preučuje z direktnim merjenjem
fenotipskih označevalcev kot so encimi, ki uporabljajo pretočno
citometrijo. Vendar ta pristop ne omogoča spremljanje izločenih
encimov. Znotrajcelične encime lahko preiskujemo, vendar le če
fluorescenčni substrat lahko vstopi v celico in se preoblikuje v
fluorescenčni produkt, ki potem v celici tudi ostane.
-
5
Slika 2: Pretočna citometrija [6]
Druga možnost je, da analit razdelimo v več manjših paralelk, od
katerih v povprečju vsaka vsebuje manj kot eno celico. Posamezne
celice nato denaturiramo, da se izloči njihova znotrajcelična
vsebina. Majhen volumen posamezne paralelke omogoča, da so
sproščeni fenotipski označevalci v visokih koncentracijah in jih ni
težko zaznati. Če je cilj identificirati in ovrednotiti redke
ciljne celice v določeni populaciji, izberemo digitalno metodo, saj
ima bistveno večjo občutljivost, medtem ko je občutljivost
analognih metod omejena z redčenjem redkih ciljnih celic v celotnem
volumnu. Tudi če so tarčne celice zelo razredčene in jih večina
paralelk sploh ne vsebuje, koncentracija tarčnih celic v določenih
paralelkah še vedno ostane visoka in detekcija le-teh postane
enostavna. [1]
4. Poučevanje digitalne analize na univerzah Digitalni testi
niso omejeni le na analizo celic. Zaradi vse večjega zanimanja za
metode, ki temeljijo na mikrofluidnih osnovah (še posebej za
digitalno karakterizacijo) v bioloških znanostih, so se avtorji
članka odločili, da sestavijo študijski program, po katerem bi
poučevali študente dodiplomskega in podiplomskega študija. Študente
so s pomočjo preprostih, varnih in poceni bioloških sistemov
poučevali, kako se z »droplet-based« mikrofluidnim sistemom opravi
digitalni test za hitro in kvantitativno določitev sevov bakterij,
z uporabo fenotipskih označevalcev. [1]
-
6
4.1. Teoretična priprava
Pred praktičnim delom so študente poučili o teoretičnih osnovah
in aplikacijah mikrofluidov. Razpravljali so o detekcijskih
sistemih in o različnih metodah, ki se uporabljajo za poganjanje
toka v mikrofluidnih sistemih. Posebno pozornost so namenili
razlikovanju med pretokom tekočin v mikrofluidnih kanalih in bolj
znanim pretokom v makro dimenzijah. Pojasnili so tudi dejstvo, da
se v mikrofluidnih sistemih najpogosteje uporablja laminaren tok.
Odsotnost turbulence v mikrofluidnih sistemih povzroči, da lahko
tekočini tečeta ena ob drugi, samo mešanje ki nastane zaradi
difuzije, pa je minimalno. Prav tako so razložili, kako se na
podlagi upoštevanja ravnotežja med različnimi fizikalnimi pojavi
okarakterizira tok tekočin. Da bi lahko to storili, so preučevali
uporabo brezdimenzijskih števil v mikrofluidih. Osredotočili so se
zlasti na Reynoldsovo število (Re), ki povezuje inercialne sile z
viskoznostnimi silami, na Pecletovo število (Pe), ki povezuje
konvekcijo z difuzijo in na Kapilarno število (Ca), ki povezuje
viskoznostne sile s površinsko napetostjo. Pomembnost teh števil se
je izkazala tudi v praksi. Med samim usposabljanjem so študente
poučili tudi o glavnih prednostih, ki jih droplet-based mikrofluidi
nudijo v digitalnih analizah. Analiti visokih koncentracij, ki
zapustijo celico kot pikolitrska kapljica, povzročijo znatno
povečanje občutljivosti digitalnih tehnik v primerjavi z
analognimi. Ta učinek so študenti enostavno spoznali skozi
teoretične vaje, kjer so računali kinetiko encimsko katalizirane
reakcije. [1]
4.2. Laboratorijske vaje
Laboratorijske vaje so zasnovali tako, da so lahko študenti
večino prej teoretsko opisanih osnov spoznali tudi v praksi. Cilj
vaje je bil z uporabo droplet-based mikrofluidnega sistema opraviti
test za hitro, digitalno in kvantitativno določitev sevov bakterije
Escherichia coli z uporabo fenotipskih označevalcev. Escherichia
coli se zelo veliko uporablja v izobraževalne namene, saj je delo z
njo varno in poceni ter še posebej primerno za začetnike. V poskusu
so uporabili dva seva in oba sta
vsebovala encim -glukoronidazo. Vendar pa je ena paralelka
vsebovala tudi encim
-galaktozidazo, medtem ko je druga paralelka ni vsebovala. Da bi
omejili spremembe, ki lahko nastanejo zaradi stohastičnega
izražanja gena v eni paralelki, so oba gena locirali na veliko
število plazmidov pod nadzorom močnega promotorja
T7 RNA polimeraze. -glukoronidaza in -galaktozidaza sta ena
najbolj razširjenih encimskih reporterskih sistemov, ki imata na
voljo celo vrsto kromogenih in fluorescentnih substratov. Zato je
tudi možno paralelno spremljanje obeh procesov. [1]
-
7
Slika 3: Bakterija Escherichia coli [5]
4.3. Laboratorijska oprema
Biokemijski laboratorij je vseboval osnovne laboratorijske
pripomočke (mikropipete, centrifuge, termostatiran inkubator, …).
Opremljen je bil z delovnim mestom za mikrofluide, ki je vsebovalo
invertni mikroskop, povezan s CCD kamero, ki lahko obdela do 58
posnetkov na sekundo. Poleg tega so uporabljali niz dveh brizgnih
črpalk, za injiciranje tekočine v mikrofluidne naprave. Na voljo pa
je bil tudi epi-fluorescenčni mikroskop, ki so ga uporabljali za
fluorescenčno slikanje na emulziji. Poleg samega laboratorija se je
nahajal še dodaten prostor (t. i. »clean room«), kjer so bili
shranjeni osnovni pripomočki za mikrofabrikacijo, kot so »spin
coater«, »mask aligner« in plazemska pečica. Uporabo tega prostora
so priporočali za izdelavo kalupa. [1]
Slika 4: »Spin coater« [2]
4.4. Izdelava mikrofluidnih čipov (Vaja 1)
Tekočino so injicirali v mikrofluidno napravo preko treh
dovodnih odprtin. Prvi dve odprtini sta namenjeni vodnim
raztopinam; ena za vodno raztopino nasičeno z
-
8
bakterijami in druga za reagente. Skozi tretjo so injicirali
oljno fazo, ki so ji dodali površinsko aktivno snov. Vsak vhod je
obdan s krožnim filtrom, ki ima vlogo lovilca prahu in ostalih
delcev ter ščiti kanale pred zamašitvijo. Mikrofluidne čipe so
izdelovali v poli(dimetilsiloksanu) z uporabo mehke litografije.
Najprej so izdelali »masko«, ki so jo uporabili za proizvodnjo
kalupa s fotolitografijo. Izdelane kalupe so nato razdelili
študentom, ki so jih uporabili za izdelavo mikrofluidnih čipov v
poli(dimetilsiloksanu). V ta namen so PDMS mešali s trdilom, ga
razplinili in vlili v kalup. Ko se je ulitek strdil, so ga vzeli iz
kalupa in izvrtali dovode za injiciranje. Na koncu so ulitek po
obdelavi vezali na steklo in vhodne kanale obdelali z raztopino
triklorosilana ter na ta način povečali njihovo hidrofobnost in
lipofobnost. [1]
4.5. Karakterizacija mikrofluidnih čipov (Vaja 2)
Da so razkrojili bakterijske celice so sprostili -glukoronidazo
in -galaktozidazo in po oblikovanju kapljic naredili encimski test.
Laminaren tok je omogočal, da sta tekočini tekli ena ob drugi,
vendar pa vse do formacije kapljice ni prišlo do mešanja. Da bi
neposredno videli tok tekočin in karakterizirali nastanek kapljic v
mikrofluidni napravi, so študenti naredili poskus, pri katerem so
dve vodni fazi injicirali v mikrofluidno napravo. Reagente so dali
v 1 mL plastične brizge, jih povezali s čipom in tekočine
injicirali v napravo. Prikaz vzporednega toka tekočin je lep primer
eksperimentalne predstavitve laminarnega toka z nizkim Reynoldsovim
številom, kjer viskoznostne sile prevladujejo nad vztrajnostnimi.
Neučinkovito mešanje kaže na nizko Pe število, kjer prevladuje
difuzija nad konvekcijo in je samo mešanje počasno. Nato so
študenti analizirali nastale kapljice na mikrofluidnih napravah, ki
so jih izdelali pri prejšnji vaji. Kombinacija tlaka in
viskoznostnega stresa, ki ga povzroča olje, ki prihaja iz obeh
strani, prisili vodno fazo, da prodre v kapljice. Na novo
izoblikovane kapljice so bile stabilizirane s površinsko aktivnimi
snovmi, ki so se nahajale v oljni fazi, ki preprečuje združevanje
večih kapljic. Velikost kapljic so kalibrirali s spreminjanjem
oblike šobe ali s prilagajanjem pretoka. Pri tej vaji so spoznali
tudi posledice padanja števila Ca. Kapilarno število, ki označuje
pomembnost viskoznostnih in kapilarnih sil, je najbolj pomemben
brezdimenzijski parameter, ki vpliva na nastanek kapljic. Opazili
so, da s spreminjanjem pretoka in s padanjem Ca števila, pride do
prehoda iz brizgalnega načina na kapljanje. To se zgodi, ko
površinska napetost prevladuje nad viskoznostnimi silami. Študenti
so morali tudi opredeliti mikrofluidne čipe, ki so jih pripravili
pri prvi vaji. To so storili z nastavitvijo pretoka, ki je omogočal
tvorbo kapljic volumna 18 pL. Pri izvedbi tega poskusa so čip
namestili na enostavno mikrofluidno opazovalno postajo, opremljeno
z invertnim mikroskopom, povezanim s CCD kamero. [1]
-
9
Slika 5: Mikrofluidni čipi [4]
4.6. Digitalna kvantifikacija enotnega bakterijskega seva (Vaja
3)
Študenti so pripravili kulturo E. coli Lac-, seva (Gus+ / Gal-),
ki so jo pustili stati čez noč in jo nato sprali in suspendirali v
PBS. Gostoto bakterij so določili s pomočjo meritev. Dobljene
meritve so uporabili za pripravo razredčine na osnovi Poissonove
porazdelitve. Vsako razredčenje posebej so nato vbrizgali v
mikrofluidno napravo . Kapljice so zbirali v mineralnem olju in
emulzijo eno uro inkubirali pri temperaturi 37°C. Fluorescenco
kapljic so merili s pomočjo epi-fluorescenčnega mikroskopa. Z
uporabo programske opreme JImage so označili posamezne kapljice kot
pozitivne in negativne. Pozitivne kapljice so bile tiste, katerih
fluorescenca je znašala vsaj 25% vrednosti najbolj fluorescentne
kapljice v polju. Kapljice, katerih fluorescenca je bila pod to
mejo, so označili kot negativne. Za vsako bakterijsko raztopino so
testirali razmerje (pozitivne kapljice / vse kapljice) in tako
dobili zastopanost posameznih zvrsti kapljic v treh
reprezentativnih okoljih. [1]
Slika 6: Digitalna kvantifikacija bakterijskega seva [1]
-
10
4.7. Hkratna kvantifikacija dveh bakterijskih sevov v mešani
kulturi (Vaja 4)
Študentom so razdelili kulturo E. coli, ki je vsebovala neznano
razmerje dveh bakterijskih sevov. Po obdelavi obeh sevov so med
njima zlahka razlikovali in na podlagi njihovih ločenih
fluorescenčnih profilov določili razmerje 10:1 med rdečimi in
rumenimi kapljicami. Rezultat so potrdili tudi s tradicionalno
karakterizacijo na agarju kjer so prav tako določili razmerje med
belimi in modrimi kolonijami 10:1. [1]
Slika 7: Gojenje bakterij na agarju [3]
5. Zaključek
Predstavili so kombiniran teoretično-praktičen program, za
poučevanje digitalne analize dodiplomskih in podiplomskih
študentov, ki temelji na mikrofluidnih napravah. Sam postopek so
testirali dobri dve leti na cca 40 študentih. Izkazal se je za
pedagoško zelo koristnega, saj študentom omogoča, da opazujejo in
razumejo osnovna načela, ki podpirajo digitalno analizo in
mikrofluide.
Študenti so izvedli digitalno analizo E. coli na podlagi
fenotipskih označevalcev -
glukoridaze (Gus) in -galaktozidaze (Gal). Avtorji navajajo, da
je ta pedagoški program mogoče zlahka izvajati na večini univerz,
saj je potrebna oprema dostopna, relativno cenovno ugodna, uporaba
le-te pa enostavna. [1]
-
11
6. Literatura
[1] Majdi Najah, Andrew D. Griffiths, Michael Ryckelynck,
Teaching Single-Cell Digital Analysis Using Droplet-Based
Microfluidics. Institut de Science et d`Ingénierie
Supramoléculaires, Université de Strasbourg; American Chemical
Society. Analytical chemistry 2012, 84, 1202-1209 [2]
http://en.wikipedia.org/wiki/Spin_coating/ (dostop 13.07.2012) [3]
http://bepast.org/dataman.pl?c=flib&dir=docs/ (dostop
13.07.2012) [4]
http://www.geekscover.com/2012/03/microfluidic-chip-rapidly-diagnose-flu/
(dostop 13.07.2012) [5]
http://www.pigeonracingpigeon.com/menu/e-coli-infection-in-pigeons/
(dostop 13.07.2012) [6] http://www.rudbeck.uu.se/node47/ (dostop
13.07.2012) [7]
http://www.webbofscience.com/2009/08/26/melodies-divert-droplets/
(dostop 13.07.2012) [naslovnica]