INSTITUTO AGRONÔMICO DE CAMPINAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL AVALIAÇÃO DE MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA DOS GENES PR-1RK NA TRANSFORMAÇÃO DE TOMATEIRO MICRO-TOM NATÁLIA DE AGUIAR PRAVATTA Orientador: Prof. Dr. Jorge Mauricio Costa Mondego Co-orientadora: Dra. Renata Moro Baroni Campinas, SP 2021
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AVALIAÇÃO DE MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA DOS GENES PR …
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INSTITUTO AGRONÔMICO DE CAMPINAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO AGRICULTURA TROPICAL
E SUBTROPICAL
AVALIAÇÃO DE MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA
DOS GENES PR-1RK NA TRANSFORMAÇÃO DE
TOMATEIRO MICRO-TOM
NATÁLIA DE AGUIAR PRAVATTA
Orientador: Prof. Dr. Jorge Mauricio Costa Mondego
Co-orientadora: Dra. Renata Moro Baroni
Campinas, SP
2021
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INSTITUTO AGRONÔMICO DE CAMPINAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO AGRICULTURA TROPICAL
E SUBTROPICAL
AVALIAÇÃO DE MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA
DOS GENES PR-1RK NA TRANSFORMAÇÃO DE
TOMATEIRO MICRO-TOM
NATÁLIA DE AGUIAR PRAVATTA
Orientador: Prof. Dr. Jorge Mauricio Costa Mondego
Co-orientadora: Dra. Renata Moro Baroni
Dissertação apresentada como requisito
para a obtenção do título de Mestre em
Agricultura Tropical e Subtropical, Área de
Concentração em Genética, Melhoramento
e Biotecnologia Vegetal.
Campinas, SP
2021
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SECRETARIA DA AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA
PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO AGRONÔMICO
Pós-Graduação Agricultura Tropical e Subtropical Fone: (19) 2137.0659/2137.0601
Avenida Barão de Itapura, 1.481 - Caixa postal 28 13020-902 -
Campinas, SP
Ata da reunião da Comissão Examinadora da defesa de dissertação de mestrado de Natália de Aguiar Pravatta, discente do Programa de Pós-Graduação em Agricultura Tropical e Subtropical do Instituto Agronômico - IAC, sob a presidência do Dr. Jorge Maurício Costa Mondego, realizada em sessão pública por videoconferência, aos 27 do mês de maio de 2021, às 14 horas, visando à obtenção do título de "Mestra". Iniciados os trabalhos, a candidata submeteu-se ao exame de sua dissertação, intitulada “Avaliação de
mutagênese sítio dirigida dos genes PR-1RK na transformação de tomateiro micro-tom”. Terminado o exame, procedeu-se ao julgamento, cujo resultado foi o seguinte: A Comissão Julgadora foi constituída pelos seguintes doutores (as):
Titulares: Dr. Jorge Maurício Costa Mondego (IAC) aprovada (x) reprovada ( )
Drª. Daniela de Argollo Marques (IAC) aprovada ( X ) reprovada ( ) Drª. Mirian Perez Maluf (IAC) aprovada ( X ) reprovada ( )
Apurados os resultados, constatou-se que a candidata foi habilitada, fazendo jus, portanto, ao título de “MESTRA EM AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL”, na área de concentração: GENÉTICA, MELHORAMENTO VEGETAL E BIOTECNOLOGIA , do que, para constar, lavrou-se a presente ata, que após lida e aprovada, foi assinada pelos membros da Comissão Examinadora.
Dr. Jorge Maurício Costa Mondego – IAC
Drª. Daniela de Argollo Marques - IAC
Drª. Mirian Perez Maluf – IAC
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“Lembra-te:
Tudo o que chega, chega sempre por alguma razão.“
Fernando Pessoa
À minha família e amigos queridos,
Dedico.
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AGRADECIMENTOS
À minha família, em especial ao meu pai Marcos, minha mãe Ana, irmã Aninha, pelo
amor, e apoio incondicional em todas as decisões.
Ao meu orientador Prof. Dr. Jorge Mondego, pela oportunidade de orientação à mim
dada, pela confiança e pelos ensinamentos.
À minha co orientadora Dra. Renata Baroni pelos conhecimentos compartilhados.
Ao Instituto Agronômico de Campinas (IAC), pela oportunidade de realização do
mestrado.
Aos Professores do PPG-AIC, que compõem a área de concentração Genética,
Melhoramento Vegetal e Biotecnologia e aos Professores das disciplinas cursadas pelo
conhecimento compartilhado.
Aos colegas da Pós-graduação, Geovani Oliveira, Isabela Laporte, Gustavo Souza, pelo
convívio e aprendizado mútuo ao longo das disciplinas.
Ao Prof. Dr. Antonio Figueira, pela oportunidade de realização dos experimentos de
transformação no Laboratório de Melhoramento de Plantas.
À Dra. Danielle Scotton por todas as dicas, orientações, amizade e horas de bom papo
compartilhadas.
À minha amiga e mestre egressa do programa de Genética, Melhoramento e
Biotecnologia Vegetal, Giullia Forti por todo conhecimento dividido, amizade, carinho
e ajuda essencial para execução deste trabalho.
Ao Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) pela concessão do subsídio e estrutura
cedida para os experimentos iniciais.
À liderança de Agustina Gentile e Thaís Helena Ferreira pelo incentivo.
Aos grandes amigos do CTC, Valter Alessio, Isabela Ascencio, Marcela Notini, Geraldo
Silva, Antonio Kaupert, Ellen Andrade, Bianca Melo, Camila Lopes, Ana Lorandi,
Natália Spagnol, Ana Carolina Zakir, Daiane Silva, Filipe Garcia e Mari Girio pelos
anos de convívio em equipe, pela constante ajuda, sugestões, críticas, encorajamento,
momentos de apoio e conselhos.
Aos amigos de Campinas, em especial, Isabella Iannaconi e Lucas Conde por todas as
estadias cedidas, companheirismo ao longo dessa jornada e por terem se tornado minha
família na nova cidade.
vii
Aos meus queridos amigos de infância, Adriano Pechio, André Pechio, Izabel Magno,
positivo, DNA de Agrobacterium utilizado para transformação genética ..................... 59
Figura 17: Comparação das taxas de regeneração obtidas nos tratamentos. Colunas
seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05) ................. 61
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Famílias de proteínas relacionadas à patogênese já descritas em literatura... 22
Tabela 2: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para mutagênese sítio dirigida dos genes alvo TcPR-1f e TcPR-1g em seus domínios SCP e Quinase. As regiões em cinza
representam os códons no quais foram induzidas as mutações ...................................... 35
Tabela 3: Iniciadores Forward e Reverse utilizados no sequenciamento das mutagêneses
sítio dirigidas dos genes TcPR-1f e TcPR-1g em seus respectivos domínios. SCP:
Tabela 4: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para sequenciamento completo dos
genes TcPR-1f e TcPR-1g. ............................................................................................. 41
Tabela 5: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para amplificação dos genes alvo na PCR de confirmação ....................................................................................................... 45
Tabela 6: Resumo dos resultados obtidos via mutagêneses sítio-dirigida nos domínios SCP, Quinase 1 e Quinase 2 para os genes TcPR1-f e TcPR1-g. ................................... 53
Tabela 7: Resumo das informações dos experimentos de transformação genética em
modelo de Tomateiro Micro-Tom dos genes TcPR-1fL155D, TcPR-1gL107D, TcPR-1f,
TcPR-1g (referência) e controle. .................................................................................... 55
Tabela 8: Resumo das taxas de regeneração obtidas nos experimentos de transformação genética de tomateiro Micro-Tom realizados ................................................................. 60
Tabela 9: Resumo das taxas de transformação obtidas nos experimentos de transformação genética de tomateiro Micro-Tom realizados ......................................... 63
Tabela 10: ANOVA obtida no software SPEED Stat 2.4. utilizando como varíavel a
taxa de regeneração obtida considerando 3 tratamentos (TcPR-1fL155D, TcPR-1gL107D e
pCAMBIA2201). O delineamento utilizado foi inteiramente ao acaso. GL: Graus de
Liberdade. SQ: Soma de Quadrados. QM: Quadrados Médios. F: Teste de variabilidade.
Ns: Não significativo. ..................................................................................................... 66
Tabela 11: Resumo da ANOVA obtida no software SPEED Stat 2.4. utilizando como
varíavel a taxa de regeneração obtida considerando 3 tratamentos (TcPR-1fL155D, TcPR-
1gL107D e pCAMBIA2201). O delineamento utilizado foi inteiramente ao acaso. C.V.:
Coeficiênte de variação. Ns: Não significativo. ............................................................. 66
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LISTA DE ABREVIAÇÕES
ANA: Ácido α-naftaleno acético
Asp: Aminoácido Ácido Aspartico
BAP: Benzilaminopurina
CBM: Do inglês, Caveolin Binding Motif
HR: Reposta Hipersensível
ISR: Resistência Sistêmica Induzida
Kn1: Domínio Quinase 1
Kn2: Domínio Quinase 2
Leu: Aminoácido Leucina
MT: Tomateiro Micro-Tom
PR: Proteínas Relacionadas à patogênese
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
RLK: Receptor do Tipo Quinase
SAR: Resistência Sistêmica Adquirida
SCP: Domínio SCP/TAPS
Tm: Temperatura de ‘Melting’
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Avaliação de mutagênese sítio dirigida dos genes PR-1RK na transformação de
tomateiro micro-tom
RESUMO
As plantas desenvolveram mecanismos de defesa em resposta a estresses bióticos.
Dentre os genes de defesa vegetal mais estudados estão aqueles que codificam proteínas
relacionadas à patogênese do tipo PR (Pathogenesis Related). O estudo do papel dessas
proteínas no ataque por fitopatógenos faz-se importante para uma maior caracterização
dos mecanismos de defesa vegetal. Estudos in vitro demonstram que proteínas da
superfamília de proteínas SCP/TAPS, da qual as proteínas vegetais PR-1 fazem parte,
possuem capacidade de inibir o crescimento de oomicetos e fungos, além de se ligar e
exportar esteróis das células e possivelmente influenciar na sinalização da resposta de
defesa. Em estudos anteriores obtivemos tomateiros Micro-Tom transformados com os
genes TcPR-1f e TcPR-1g; porém com baixa taxa de transformação e regeneração. O
objetivo deste estudo foi obter mutantes dos genes PR-1RK através de mutagênese sítio-
dirigida dos domínios SCP/TAPS (ligação a esterol) e quinase (fosforilação), a fim de
verificar se tais funções desses genes alterariam o desenvolvimento in vitro dos
explantes. Os mutantes SCP/TAPS foram testados quanto a sua capacidade de interferir
nas taxas de transformação e regeneração in vitro de explantes de tomateiro Micro-Tom
transformados via Agrobacterium tumefaciens quando comparados aos genes selvagens
TcPR-1f e TcPR- 1g. A troca de aminoácidos em domínios das proteínas codificadas
foi realizada a fim de permitir a realização de estudos funcionais relacionados à perda
de função em plantas transgênicas no modelo vegetal Micro-Tom. Versões mutadas nos
sítios quinase e SCP/TAPS de cada gene foram obtidas por mutagênese sítio dirigida via
PCR e cada um dos genes mutados foi clonado no vetor binário pCAMBIA2201. Os
vetores finais foram validados por perfil de restrição e sequenciamento e transformados
em A. tumefaciens GV3101. Foram obtidos 4 eventos transgênicos de TcPR-1fL155D , 1
evento de TcPR- 1gL107D, 1 evento de TcPR-1g e 1 evento de pCAMBA2201. Os
fenótipos observados apresentaram lento desenvolvimento e baixa taxa de regeneração
in vitro. Com os dados obtidos, é possível supor que as interações membranares podem
ter sido afetadas com a troca de códons realizada. Porém, se faz necessário a realização
de mais estudos para essa comprovação e para otimização do protocolo de
1/Ag5/PR-1/Sc7) (CANTACESSI, 2009; TEIXEIRA, et.al, 2012) também descrito na
família das CAP proteínas (cysteine-rich secretory proteins (CRISP), antigen 5 (Ag5), and
pathogenesis-related protein 1 (PR-1) (SCHNEITER, 2013; CANTACESSI, 2009). As
proteínas da família CAP apresentam domínio comum de 150 aminoácidos formando uma
estrutura α-β-α exclusiva. A conservação do domínio CAP sugere que as proteínas dessa
família exerçam funções semelhantes. Porém, o modo de ação delas permaneceu por muito
tempo desconhecido (GIBBS, 2008; DARWICHE, et al, 2017). Os membros da família
CAP são majoritariamente proteínas secretadas estáveis em fluidos extracelulares
(CANTACESSI, 2012). Estudos realizados por Darwiche e colaboradores (2017)
demonstraram a capacidade das proteínas CAP de se ligarem a esteróis e ácidos graxos
possibilitando o transporte desses compostos e seu transporte para o meio extracelular.
Os esteróis compõem a classe de lipídios presentes nas membranas celulares de
todos os seres eucariotos sendo responsáveis por regular a permeabilidade e fluidez da
membrana (TANRET, 1889). As células animais apresentam colesterol na membrana
enquanto que as células vegetais apresentam fitoesteróis (MOREAU et al., 2018). A
molécula de esterol também compõe a membrana de muitos fungos patogênicos de plantas
sendo essencial para o crescimento desses microorganismos (KANZAN et al., 2017).
Especula-se que os patógenos auxotróficos de colesterol, como os oomicetos, adquiram
esteróis externamente das membranas do hospedeiro durante a patogênese (GAULIN et
al., 2010; GAMIR et al., 2017).
Nos últimos anos foi verificado que proteínas PR-1 apresentam capacidade de
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ligação a esterol e que esta ligação acontece por aminoácidos hidrofóbicos presentes numa
região proteica chamada ‘Caveolin Binding Motif’ (CBM), (DARWICHE et al., 2017,
DARWICHE et al., 2018; GAMIR et al., 2017). O CBM é caracterizado pela presença de
aminoácidos aromáticos nas posições 1, 3 e 8 do motivo, sendo que a posição 3 seria
crucial para a ligação (DARWICHE et al., 2017; CHOUDHARY et al., 2014). As
proteínas que se ligam a esteróis apresentam CBM conservado e mutações pontuais nesse
motivo caracterizam a perda da função de ligação ao esterol (DARWICHE et al., 2017).
Sugere-se que a defesa contra patógenos desempenhada pelas proteínas PR-1
envolva o mecanismo de ligação e sequestro de moléculas de esteróis (SCHNEITER,
2013). Em busca dessa confirmação, alguns estudos têm sido realizados com proteínas PR-
1 de plantas e de outros organismos. As proteínas Pry1 e Pry2 da levedura Saccharomyces
cerevisiae, pertencentes à superfamília SCP/TAPS, apresentam capacidade de ligação ao
colesterol e a acetato de colesterol conhecidas. Mutações no CBM foram inseridas
alterando um aminoácido hidrofóbico localizado nessa região e se observou que a
função de ligação e exportação de esterol foram bloqueadas (SCHNEITER, 2013; GAMIR
et al., 2017; DARWICHE et al., 2017). Em seguida, foi verificado que a proteína humana
CRISP2 (também da superfamília SCP/TAPS) foi capaz de complementar essa atividade de
exportação de esterol, indicando que a função de ligação e exportação de lipídios das
proteínas Pry é conservada entre os membros desta superfamília (CHOUDHARY et al.,
2012). Além disso, dados indicam que as proteínas Pry apresentam atividade comparável à
de outras proteínas que se ligam a esterol e são capazes de se ligar ao eugenol (composto
antimicrobiano presente no óleo de cravo da Índia). Isso indica mais uma vez que essas
proteínas são possivelmente responsáveis pela ligação e exportação de esteróis, e pelo viés
antimicrobiano que essas funções têm (CHOUDHARY et al., 2012; DARWICHE et al.,
2017).
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2.3.1 Proteínas do tipo PR-1 em Cacaueiro
A partir das evidências apontadas de que as proteínas PR-1 estão relacionados com
a resposta de defesa em plantas, Teixeira e colaboradores buscaram estes genes no genoma
do cacau utilizando a sequência de PR-1 do tomate cereja P14 (FERNÁNDEZ et al., 1997).
Os autores encontraram treze genes com significativa similaridade à sequência que foram
nomeados de TcPR-1a a TcPR-1m (TEIXEIRA et al., 2013). Análises proteicas
identificaram a existência de modelos de peptídeos sinal hidrofóbicos e domínios SCP /
TAPS completos nessas treze proteínas. Duas dessas proteínas, TcPR-1f e TcPR1-g, se
destacaram por apresentar mais de 580 aminoácidos e uma região altamente hidrofóbica
entre o domínio SCP/TAPS e um domínio quinase. Essa arquitetura proteica é
característica de receptores do tipo quinase (RLKs) (TEIXEIRA et al., 2013). Os RLKs são
um grupo de receptores transmembranares que percebem sinais extracelulares e
desencadeiam fosforilação como respostas intracelulares (WALKER, 1994) e que já foram
caracterizados como maquinaria de defesa contra patógenos (GREEFF et al., 2012).
Figura 1: Organização e domínios das proteínas PR-1RK de T. cacao (Tc). O peptideo
sinal é indicado na extrema esquerda da figura, seguido do domínio SCP/TAPS;
seguido da porção transmembranar hidrofóbica e domínio serina/ treonina quinase a
direita. Os números em romano indicam as regiões do domínio quinase envolvidas em
atividade fosforilativa. (TEIXEIRA et al., 2013).
Os RLKs estão envolvidos em processos de desenvolvimento (JINN et al., 2000),
reprodução (ESCOBAR-RESTREPO et al., 2007) ou na imunidade vegetal (JONES et
al.,2006). Quando envolvidos na imunidade do organismo vegetal, são chamados de
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receptores de reconhecimento de padrões (PRRS) e detectam padrões de moléculas
associados a patógenos (PAMPs) iniciando um conjunto de respostas de defesa que
incluem produção de espécies reativas de oxigênio, expressão de genes de defesa,
deposição calosa (JONES et al., 2006; GREEFF et al., 2012; ZIPFEL, 2014). Estudos
demonstraram que a perda da função de RLKs aumenta a suscetibilidade a patógenos
(ZIPFEL et al., 2004).
Baseado em dados de RNAseq da interação do fungo M. perniciosa e T. cacao
foram detectados quatro genes PR-1 (TcPR-1c, d, g e l) expressos durante a infecção.
Todos os outros nove genes não tiveram expressão detectada nesta etapa. Em seguida,
foram avaliados os dados de RNAseq de cinco réplicas biológicas de M. perniciosa e cinco
réplicas de amostras controles (não infectadas), sendo que o TcPR-1f não teve sua
expressão significativamente alterada durante a infecção por M. perniciosa e o gene TcPR-
1g foi mais expresso em vassoura-de-bruxa do que em plantas não infectadas (TEIXEIRA
et al., 2013). TcPR-1g foi induzido durante a doença, no estágio onde o fenótipo das
plantas de cacaueiro é fortemente afetado e onde o fungo está em sua etapa biotrófica
(MEINHARDT et al., 2008). Este dado indica que esse gene possa exercer um papel na
defesa do cacaueiro contra M. perniciosa. Porém vale ressaltar que não houve eliminação
da doença, o que indica que apesar de TcPR-1g ser expresso, essa expressão não foi
determinante na eliminação do patógeno (FORTI, 2018).
Em 2018, Forti (2018) realizou os primeiros experimentos de transformação
genética de tomateiro Micro-Tom com os genes TcPR-1f e TcPR-1g. Dezoito
experimentos de transformação genética de tomateiro foram realizados e somente um
obteve evento transgênico correspondente a cada gene. Para caracterizar os transgênicos
obtidos, estes foram inoculados com patógenos M. perniciosa (Figura 2) e
Phytophthora parasitica (Figura 3) para avaliação dos perfis de dano causado e de
resistência para o melhor entendimento das proteínas PR-1RK.
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Figura 2: Diâmetro médio do caule (mm) no controle e linhas transgênicas inoculado
com o fungo M. perniciosa, 35 dias após a inoculação. Colunas seguidas da
mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Figura 3: Área média da lesão (cm²) no controle e linhas transgênicas inoculados com
P. parasitica, 4 dias após a inoculação. Colunas seguidas da mesma letra não diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Foi observado que TcPR1-f apresentou um aumento de tolerância à infecção de M.
perniciosa (aumento do diâmetro do caule é um indicativo de infecção; Figura 2) e do
oomiceto P. parasitica (Figura 3). Tais resultados permitem inferir a capacidade deste gene
de inibir oomiceto e fungo hemibiotrófico indicando sua propriedade como possível gene
relacionado à resistência contra esses patógenos.
Os dados para TcPR-1g foram estastiticamene iguais ao controle não transgênico.
No entanto, os dados brutos indicam um pouco mais de severidade nas doenças no
transgênico. S endo assim, os dados obtidos não foram plenamente conclusivos para
esse gene. Apesar disso, acredita-se que TcPR-1g pode ser um gene que não atue
conferindo tolerância a patógenos mas talvez sim como um gene que afete o
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desenvolvimento da planta (FORTI, 2018). Forti indica que são necessários mais estudos
desses genes in vitro e in vivo para correlacionar os resultados obtidos, mas que se pode
inferir que pelo menos uma conformação PR-1-RK de cacaueiro, confere tolerância na
interação com patógenos.
Em paralelo, foi avaliado se os domínios quinases das proteínas PR-1RK teriam
capacidade fosforilativa, o que foi confirmado através de experimentos de espectrometira
de massas (TOSARINI, 2018, dados não mostrados). Além disso, experimentos de
complementação de levedura evidenciaram que os domínios extracelulares de TcPR-1f e
TcPR-1g se ligam a colesterol (DARWICHE, 2018, comunicação pessoal). Esses dados
evidenciam que essas proteínas são funcionais, exercendo tanto a atividade PR-1 like de
ligação a esterol quanto a de quinase se autofosforilando.
2.4 Transformação genética
A biotecnologia é utilizada como ferramenta para viabilizar e acelerar programas de
melhoramento de plantas. Envolve técnicas como a cultura de tecidos, clonagem gênica,
uso de marcadores moleculares e transformação genética (SHARMA et al., 2009). A
transformação genética consiste na introdução controlada de um ou mais genes no genoma
de outro organismo e sua posterior expressão possibilitando a obtenção de organismos
geneticamente modificados (OGM). Assim, é possível gerar plantas transgênicas com
caracterísitcas de interesse agronômico, tais como maior produtividade, redução do uso de
agrotóxicos, resistência contra patógenos e melhor qualidade nutricional do fruto
(GAMBINO et al., 2012; SARTORETTO et al., 2008). Plantas transgênicas também são
geradas com o intuito de estudar a função e expressão gênica e o desenvolvimento vegetal
(HANSEN et al., 1999).
Os métodos de transformação genética são dependentes das técnicas de cultura de
tecidos in vitro, uma vez que após a inserção e expressão do transgene em uma célula
vegetal é necessário o adequado manuseio desta célula para que ela se torne competente e
possa se diferenciar e multiplicar dando origem a um indivíduo completo (regeneração in
vitro). A expressão da totipotência da célula vegetal é influenciada por vários fatores tais
como: o genótipo da planta matriz, o estado fisiológico, sanitário e nutricional da planta
matriz, o tipo de explante inicial, os componentes nutricionais e os reguladores de
crescimento adicionados ao meio de cultura, as condições micro e macroambientais
durante a incubação (GAMBINO et al., 2012; GIRI et al., 2004). Assim é necessário o
estabelecimento de um protocolo específico e eficiente de regeneração in vitro para um
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determinado genótipo antes da escolha e aplicação de um método de transformação
genética. O sucesso da transformação genética é medido pela taxa de transformação que
relaciona a quantidade de eventos transgênicos obtidos com o número de explantes
inoculados. Vários fatores podem afetar a eficiência de transformação dentre eles a cepa de
Agrobacterium, a complexidade da construção genética, os genes marcadores de seleção in
vitro e genes repórter utilizados, antibióticos utilizados no meio seletivo, componentes
nutricionais do meio de cultura e tipo de explante (CHETTY et al., 2013)
Os métodos de transformação genética são divididas em duas categorias: o indireto
que utiliza vetor biológico intermediário (bactéria Agrobacterium tumefaciens e A.
rhizogenes) e o direto que dispensa vetor biológico intermediário (ANDRADE, 2003).
Estes últimos são métodos químicos (PEG e PVA) e físicos (Biobalística e Eletroporação)
para a introdução do DNA no interior de uma célula competente (embriões
zigóticos/meristemas) pela quebra da barreira da parede celular e membrana plasmática.
A transferência de DNA pelo método indireto é um dos mais utilizaados na
obtenção de plantas transgênicas dicotiledôneas (CANHOTO, 2010) . A Agrobacterium
tumefaciens é uma bactéria gram-negativa que possui um plasmídeo (DNA
extracromossomal) denominado pTi (indutor de tumor) que apresenta a habilidade de
transferir uma parte de seu DNA para a célula vegetal. Esse DNA é chamado de T-DNA e
contém genes envolvidos na produção de opinas e de reguladores de crescimento vegetais
(LACROIX et al., 2013a). Em condições naturais, quando o T-DNA é transferido para a
célula vegetal, ele é integrado no genoma da planta e passa a ser expresso de forma
estável. Este processo ocasiona a multiplicação celular formando um aglomerado de
células denominado de tumores ou calos (LACROIX et al., 2013b), sintoma este
característico da infecção pela bactéria (doença coroa-de-galha).
2.5 O tomateiro Micro-Tom como planta modelo
As plantas modelo são comumente utilizadas em estudos genéticos e de fisiologia
vegetal visto que auxiliam na compreensão do desenvolvimento das plantas, função gênica,
processos biológicos, determinação do perfil de sinalização, perfil de metabólitos
secundários e investigação no padrão de defesa (RICROCH, et al., 2014; VAN NORMAN
et al., 2009). A versatilidade perante aspectos celulares e em experimentos de cultura de
tecidos também são características importantes das plantas modelo (GANAPATHI, et al.,
2004).
O uso de plantas modelos, como Arabidopsis thaliana e Nicotiana tabacum, foi
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estabelecido inicialmente devido à necessidade de padronização de experimentos e para o
ensino das ferramentas de biologia molecular (KOORNNEEF et al., 2010). As suas
utilizações como plantas modelos perduraram na pesquisa devido ao ciclo de vida curto,
porte pequeno, grande número de descendentes e genoma sequenciado disponível
(KOORNNEEF et al., 2010; XIONG et al., 1999; VAECK et al. 1987).
O tomateiro é uma cultura economicamente importante. Teve seu genoma
sequenciado em 2012 pelo grupo “The Tomato Genome Consortium”. O tomateiro cv.
Micro Tom (Solanum lycopersicum MT) é diplóide, apresenta ciclo de vida curto levando
cerca de 100 dias após transformação genética de cotilédones para a colheita de frutos
transgênicos, permitindo a triagem de até quatro gerações por ano (QIU et al., 2007;
PINO et al., 2010). Apresentando o desenvolvimento de fruto como característica mais
notável, o tomateiro abre espaço para discussões e pesquisas relacionadas a frutos,
amadurecimento, sinalização e perfil de metabólitos secundários (SHIKATA et al., 2016).
O tomateiro Micro-Tom é utilizado como modelo visando compreender a função de genes
de interesse agronômico (VAN ECK et al., 2019) e também no estudo da interação com o
fungo Moniliophtora perniciosa (MARELLI, 2009). Esse fungo possui dois biótipos, C e
S, sendo que o primeiro infecta o cacaueiro e o segundo solanáceas como o tomateiro.
Devido à dificuldade da manipulação genética do cacaueiro (tempo de regeneração,
dificuldade de transformação) para comprovar a função de genes de resistência ou
suscetibilidade do cacaueiro, utiliza-se o Micro-Tom como planta modelo de análise
funcional. Os estudos e pesquisas realizados com plantas modelo geralmente apresentam
correlação positiva entre os resultados obtidos e à espécie alvo, porém, vale ressaltar que
esses estudos podem não garantir o bom desempenho do transgene na espécie alvo
(XIONG et al., 1999).
2.6 Mutagênese sítio dirigida
A técnica de mutagênese sítio dirigida baseada em oligonucleotídeos tornou-se uma
ferramenta fundamental da biologia molecular moderna. É utilizada para estudos de
estrutura e função gênica, já que permite a realização de deleções, inserções ou
substituições de base ao longo da sequência (BARIK,1996; SHENOY, 2003; LI, 2002). Os
ensaios se baseiam na propriedade de hibridização de moléculas de DNA por similaridade
no pareamento de bases que permite que pequenas diferenças na complementaridade do
molde possam ser sintetizadas (WATSON, 2006).
O método de mutagênese sítio dirigida utilizando PCR de duas etapas, anelamento
32
e extensão, permite a obtenção de DNA mutante em curto período partindo-se do desenho
de primers com 25-45 pb contendo as modificações que se deseja incorporar ao gene
alvo (WANG, 1999; LIU, 2008).
O produto da amplificação apresentará a troca de bases desejada, entretanto, o
DNA utilizado como molde permanece com a sequência original, que não contém a
mutagênese. Como o DNA molde é metilado nos organismos e a cadeia mutante não, a
realização do tratamento com endonuclease que cliva os sítios metilados favorece a seleção
do produto mutante da amplificação para clonagem em vetor (Figura 4) (LI et al, 1997;
LIU, 2008).
Figura 4: Esquema de reação para obtenção da troca de bases via mutagênese sítio dirigida
por PCR. Adaptado de ZHENG et al., 2004.
2.7 Propriedades dos aminonácidos Ala, Leu e Asp
Os aminoácidos são moléculas orgânicas que constituem a base elementar dos
peptídeos e proteínas. Estes formam cadeias e estruturalmente apresentam um grupo
funcional ácido carboxílico (-COOH) um grupo amino (-NH2), um átomo de hidrogênio (-
H) e uma cadeia lateral variável (R) (BARRET et al., 2004). Devido à cadeia lateral
variável, os aminoácidos apresentam diferentes tamanhos, carga elétrica e solubilidade em
água (BARRET et al., 2004) A estrutura comum a todos os aminoácidos pode ser
observada na figura 5. A síntese dessas moléculas é controlada por replicação do DNA e
transcrição do RNA (NELSON et al., 2002).
33
Figura 5: Estrutura geral de um aminoácido. Cada aminoácido apresenta um carbono
central (C), um grupo funcional ácido carboxílico (COO-), um grupo amino (-NH2),
um hidrogênio (-H) e cadeira lateral variável (R). Adaptado de NELSON et al., 2002.
Os 20 aminoácidos existentes apresentam um grupo carboxila e um grupo amino
ligados ao mesmo átomo de carbono e diferem entre si apenas pela estrutura da cadeia
lateral. Estes aminoácidos se unem em combinações diversas formando proteínas com
diferentes tamanhos e estruturas. Esta união é do tipo covalente e ocorre entre um grupo
amina de um aminoácido e o grupo carboxila de outro formando as cadeias polipeptídicas
(NELSON et al., 2002). Aos aminoácidos foram atribuidas abreviações de três letras e
símbolos de uma letra como nomenclatura (LEHNINGER, 1976).
De acordo com a composição da cadeia lateral e sua polaridade, os aminoácidos são
agrupados em quatro grupos: aminoácidos com grupamento R apolar ou hidrofóbicos
(grupo 1), aminoácidos com grupamento R polar não carregado (grupo 2), aminoácidos
com grupamento R polar carregado positivamente (grupo 3) e aminoácidos com
grupamento R polar carregado negativamente (grupo 4) (NELSON et al., 2002; WU,
2013). Os aminoácidos Leucina (Leu) e Alanina (Ala) pertencem ao grupo 1, ou seja, não
interagem com a água. Também apresentam localização mais interna na molécula proteíca,
pois as cadeias laterais tendem a se agrupar no interior das proteínas estabilizando a
estrutura por interações hidrofóbicas. Já o Ácido Aspártico (Asp) pertence ao grupo 4 e
apresenta capacidade de interagir com água localizando-se na superfície da molécula
(MARZZOCO & TORRES, 1999). As estruturas desses aminoácidos podem ser
observadas na figura 6.
34
Figura 6: Estrutura dos aminoácidos Alanina, Leucina e Ácido Aspártico. As fórmulas
estruturais mostram o estado das moléculas em pH neutro. A parte sombreada destaca
a cadeia lateal variável (R) de cada um destes aminoácidos. Adaptado de NELSON et
al., 2002.
OBJETIVOS
- Obtenção de mutantes dos genes PR-1RK através de mutagênese sítio dirigida;
-Verificação da alteração das taxas de transformação e regeneração in vitro dos
mutantes obtidos de perda de função.
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Caracterização Molecular do
Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), Piracicaba, SP e Laboratório de Melhoramento de
Plantas do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA/USP), Piracicaba, SP.
3.1 Desenho dos iniciadores para mutagênese sítio dirigida dos genes TcPR-1f e TcPr-
1g
Foram utilizadas as sequências dos genes TcPR-1f e TcPR-1g obtidas através de
biblioteca de RNAseq (TEIXEIRA et al., 2013) como base para o desenho dos iniciadores.
Para cada mutagênese em estudo foram desenhados e sintetizados pares de primers com até
49 bases de oligonucleotídeos auto-complementares contendo a troca de bases desejada no
meio do iniciador. Estes continham cerca de 40% de bases CG, Tm de 75°C e a sequência
reversa oposta complementar descrita na tabela 2. As regiões apresentadas em cinza nas
sequências da tabela representam os códons nos quais foram induzidas as mutações.
Tabela 2: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para mutagênese sítio dirigida dos
genes alvo TcPR-1f e TcPR-1g em seus domínios SCP e Quinase. As regiões em cinza
representam os códons no quais foram induzidas as mutações. (Continua)
Gene
alvo_Domínio
Sequência 5’ – 3’ Orienta-
ção
Nomencla-
tura
TcPR1-f_ SCP CGATGAGAAAACCGATTATGACGACA
AATCTAATACCTGTGCTTCAGGC
Forward TcPR1-
F_L155D_F
TcPR1-f_ SCP
GCCTGAAGCACAGGTATTAGATTTGT
CGTCATAATCGGTTTTCTCATCG
Reverse
TcPR1-
F_L155D_R
TcPR1-f_ Quinase
1
GAGTTGGATACCTATGTTGCTGTTGCG
AGGGTTTCAAAGGCCTCTAAGC
Forward
TcPR1-
F_K337A_F
TcPR1-f_ Quinase
1
GCTTAGAGGCCTTTGAAACCCTCGCA
ACAGCAACATAGGTATCCAACTC
Reverse
TcPR1-
F_K337A_R
TcPR1-f_ Quinase
2
GTGTGCTACACAGGGATATAGCTACT
AGCAACGTTATGTTAGATTC
Forward TcPR1-
F_K434A_F
36
Tabela 2: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para mutagênese sítio dirigida dos genes alvo TcPR-1f e TcPR-1g em seus domínios SCP e Quinase. As regiões em cinza representam os códons no quais foram induzidas as mutações
(Continuação).
TcPR1-f_ Quinase
2
GAATCTAACATAACGTTGCTAGTAGC
TATATCCCTGTGTAGCACAC
Reverse TcPR1-
F_K434A_R
TcPR1-g_ SCP
GAGGAGAAGGCGGATTATGACGACGA
ATCTGGTGTTTGTGCTACAGG
Forward
TcPR1-
G_L107D_F
TcPR1-g_ SCP CCTGTAGCACAAACACCAGATTCGTC
GTCATAATCCGCCTTCTCCTC
Reverse TcPR1-
G_L107D_R
TcPR1-g_
Quinase 1
CGGATACCTACATCGCTGTTGCTAAG
GTTTCAAGGGCATCTAAGC
Forward TcPR1-
G_K298A_F
TcPR1-g_
Quinase 1
GCTTAGATGCCCTTGAAACCTTAGCAACA
GCGATGTAGGTATCCG
Reverse
TcPR1-
G_K298A_R
TcPR1-g_
Quinase 2
CATTGTGTGCTACACAGGGACATCGC
TACTAGCAACATCATGTTGGATTC
Forward TcPR1-
G_K395A_F
TcPR1-g_
Quinase 2
GAATCCAACATGATGTTGCTAGTAGC
GATGTCCCTGTGTAGCACACAATG
Reverse TcPR1-
G_K395A_R
A figura 7 exemplifica a dinâmica. No exemplo, observa-se a sequência nativa do
gene TcPR-1f utilizada como molde para a reação, tendo na posição 155 o códon TTG
(Leucina) que foi substituído, na mesma posição, pelo códon GAC (Ácido Aspártico).
Figura 7: Representação da sequência nativa do gene TcPR-1f e a substituição de códons
realizada na posição 155, via mutagênese sítio - dirigida para obtenção do vetor
mutado, denominado TcPR-1fL155D.
37
As demais reações de mutagênese sítio-dirigida obtidas seguem o mesmo racional
da representação acima.
3.2 Reação de mutagênese sítio dirigida e transformação de células eletrocompetentes
de Escherichia coli
A técnica de PCR 2 steps com enzima de alta fidelidade foi utilizada para a troca de
códon na sequência dos genes TcPR-1f e TcPR-1g clonados no vetor pRT104. A reação foi
realizada no equipamento Veriti (Applied Biosystems) utilizando 10 µL de tampão 5X
Phusion HF, 1 µL de dNTPs (10 mM), 2,5 µL de primer forward e 2,5 µL de primer
reverse (10 µM), 1 µL de DNA molde (25 ng µL-1), 0,5 µL Phusion DNA polimerase
(New England Biolabs) e água MiliQ estéril para completar 50 µL de reação. As
condições da reação foram 98°C por 30 segundos; 35 ciclos de 98°C por 10 segundos,
72°C por 30 segundos e 72°C por 10 minutos, finalizando a 10°C. Após a PCR, as
amostras foram tratadas com 10 U da endonucelase DpnI (Thermo Scientific) que
degradou o DNA plasmidial metilado. A incubação aconteceu a 37°C por 3 horas e 80°C
por 20 minutos para inativação da enzima no equipamento Veriti (Applied Biosystems). As
reações aconteceram conforme o esquema da figura 8.
Figura 8: Esquema da dinâmica de reação de mutagênese dirigida via PCR ao longo
dos ciclos de amplificação na reação de PCR, exemplificando que o DNA utilizado
como molde permanece com a sequência original e que o produto da amplificação
apresentará a troca de bases desejada (adaptado de SHENOY, 2003).
38
Em seguida, foi realizada diálise de 20 minutos em membrana 0.05 µm VMWP
(Merck Millipore - Lot#R5CA7340) de todo produto tratado com endonuclease para
transformação em células competentes One Shot TOP10 Electrocomp E. coli (Invitrogen -
Lot#1637949). Foi adicionado 10 ng de DNA em cada tubo eppendorf de células
competentes, cepa DH5α (descongelada em gelo) e, em outro tubo, 10 pg de pUC19 como
controle positivo. Todo volume de células foi transferido para as cubetas de eletroporação
Gene Pulser/MicroPulser 0.2 cm gap (Bio Rad), previamente resfriadas em gelo. Os
parâmetros de tensão, capacitância, resistência aplicados foram ajustados para 2500 V, 25
µF e 200 Ω, respectivamente e pulsos foram aplicados no equipamento Gene Pulser Xcell
(Bio Rad). Imediamamente após o pulso, foi adicionado 1 mL de meio SOC (2 % triptona;
0,5 % extrato de levedura; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4
filtro-esterilizados; 20 mM glicose filtro esterilizada; pH 7,0). Em seguida, todo volume da
eletroporação foi transferido para um tubo estéril de 15 mL e incubado à 37°C por 1 hora,
sob agitação de 200 rpm em agitador orbital. Em seguida, foi plaqueado todo volume das
células em meio sólido LB (Sigma) contendo ampicilina (100 mg L-1) e as placas foram
incubadas em estufa a 37ºC durante 16 horas para o crescimento de colônias.
3.3 Confirmação da mutagênese sítio dirigida
Todas as colônias obtidas via transformação foram selecionadas e passaram por
extração de DNA plasmidial utilizando o Kit QIAprep Spin MiniPrep (QIAGEN),
quantifidas via Nanodrop (Thermo Scientific ) e foram enviadas para facility de
sequenciamento do Laboratório de Melhoramento de Plantas do Centro de Energia Nuclear
na Agricultura (CENA/USP), para sequenciamento, utilizando o conjunto de primers
descrito na tabela 3.
O sequenciamento foi realizado no equipamento 3500 Genetic Analyzer da Applied
Biosystems com a reação de PCR BigDye v3.1 utilizando: 1 uL de Tampão 5X, 1 µL de
BigDye v3.1, 1 µL do primer específico (5 µM), 500 ng de DNA plasmidial e água para
completar o volume de 10 µL. A ciclagem foi de 95°C por 1 minuto; 35 ciclos de 95°C por
15 segundos, 50°C por 15 segundos e 60°C por 2 minutos, finalizando a 10°C.
Posteriormente as amostras foram precipitadas com EDTA/Acetato de Sódio (1V de
EDTA 0,5 M pH 8,0 + 1V de Acetato de Sódio 3 M pH 9,0) e lavadas com Etanol 100 % e
70 % sucessivamente. Na última etapa, foram adicionados 10 µl de formamida para
incubação a 95°C por 5 minutos em termociclador, e aplicado choque térmico em gelo para
39
provocar a desnaturação das moléculas de DNA a serem sequenciadas.
Os dados de sequenciamento foram analisados alinhando os reads produzidos
contra a sequência de referência utilizando o software CLC Main Workbench (QIAGEN).
O gene TcPR-1f que continha as mutações sítio-dirigidas corretas foram denominados
TcPR-1fL155D, TcPR-1fK337A e TcPR-1fK434A correspondendo ao domínio SCP, Quinase1
(Kn1) e Quinase2 (Kn2), respectivamente. O gene TcPR-1g que apresentou as mutações
sítio-dirigidas esperadas, foram denominados TcPR-1gL107D, TcPR-1gK298A e TcPR-1gK395A
correspondente ao domínio SCP, Quinase1 (Kn1) e Quinase2 (Kn2), respectivamente.
Tabela 3: Iniciadores Forward e Reverse utilizados no sequenciamento das mutagêneses
sítio dirigidas dos genes TcPR-1f e TcPR-1g em seus respectivos domínios. SCP: domínio
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