Avaliação Quantitativa das Preparações Enzimáticas Grad/EQB483_aula3.pdf · EQB4383 –Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho Avaliação Quantitativa das Preparações Enzimáticas

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Avaliação Quantitativa das Preparações Enzimáticas

Como diferenciar enzimas?

Quando não podemos determinar a concentração de uma enzima devemos diferenciar as enzimas por sua atividade (moléculas não podem ser contadas)

Reproduz-se em laboratório , sob condições controladas a catálise enzimática

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Problemas Clássicos na determinação da atividade de preparações enzimáticas

1- Não se conhece a estrutura completa e, consequentemente, o peso molecular da maioria das enzimas.

2- Nas preparações enzimáticas moléculas distintas podem exercer efeitos semelhantes, por exemplo, formação de grupos redutores.

3- Pode haver enzimas inativas que aumentam o conteúdo proteico na preparação.

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- Para que avaliação seja eficiente, o procedimento deve ser reprodutível.

- Também deve-se saber qual é o substrato natural da enzima.

Exemplo: xilose que por ação da glicose isomerase passa a xilulose (mesmo glicose a

frutose)

Como provar quem é o substrato natural?

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Uso de Substratos não NaturaisAlgumas vezes o substrato não natural pode ser muito mais bem catalisado pela enzima que o substrato natural.

Exemplo: Enzima beta-galactosidase – hidrolisa lactose a galactose

+ glicose que não absorvem no UV visível.

Por esta razão usa-se substrato não natural que pode ser catalisado pela enzima beta galactose ortonitrofenil.

O ortonitrofenilgalactosideo quando hidrolisado forma o ortonitrofenol que em pH alcalino é desprotonado e absorvido no UV-visivel.

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Montagem do Ensaio de Determinação da Atividade Enzimática

Escolha do Substrato:

Pode-se constituir um grande problemaa escolha do melhor e mais adequadosubstrato para o ensaio.

Escolha substrato que garanta areprodutibilidade do método.

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Concentração do Substrato:

Modelo de Henri-Michaelis e Menten - excesso de

substrato em relação a concentração de enzima, de

forma que a hipótese de estado estacionário seja valida

(velocidade de relação linear).

Um excesso de substrato pode proporcionar uma

saturação da enzima reduzindo assim sua atividade.

Determina-se a velocidade em t próximo de zero, de

modo que a concentração de S não se modifique

consideravelmente.

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Tempo de reação:

A unidade do tempo e fundamental na expressão e também na determinação da atividade enzimática.

Deve-se ter formado quantidade mensurável de produto, ou ter desaparecido quantidade significativa de substrato.

A reação P + E ES possa ser negligenciada

Velocidade = consumo de S ou surgimento de P

unidade de tempo

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pH:pH controlado – necessidade de manter grupos críticos do

centro ativo no estado de ionização correto para que a reação ocorra, conduzida em velocidade máxima. pH ótimo e necessário

- Efeito reversível do pH na velocidade máxima de reação.

- Mudança na afinidade enzima/substrato – reflete no valor de Km.

- Mudança na estabilidade da enzima – desnaturação irreversível em um ou em ambos extremos do ponto de pH para a atividade. Este ultimo efeito depende do tempo usado para medir a taxa de reação.

Todos os 3 efeitos podem ocorrer em conjunto.

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Temperatura:

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A limitada estabilidade térmica das enzimas resulta em inativação a elevadas

temperaturas.

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Inibidores:

Modulação positiva – ativação – interação modulador com a enzima favorece a reação.

Modulação negativa – inibição - interação modulador com a enzima envenena a reação.

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Expressão da Atividade EnzimáticaUnidade Internacionalçã UI – quantidade de enzima que catalisa a

transformacao de 1 micromol de substrato por minuto a 25 oC , sob condições otimizadas.

Atividade específica _ número de unidades de atividade de enzima por miligrama de proteína - indicador da pureza de uma enzima –

atividade dividida por unidade de massa proteíca total.

Atividade molar ou molecular ou numero de turnover - número de unidades de atividade por micromol de enzima ou seja , numero de moléculas de substrato transformado por uma única molécula

de enzima em um minuto.

Uma unidade alternativa foi sugerida pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica, mas raramente usada, que é o katal (SI), definida

como a quantidade de enzima capaz de causar a transformação de 1 mmol de substrato por segundo

sob condições específicas.

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Formas específicas de expressar a atividade de uma enzima

ou unidade Soxhlet/ mL, é definida como o número de

mililitros de leite que podem ser coagulados em 40 minutos a 35°C.

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Atividade lipásica: é a quantidade de enzima necessária para produzir certa

quantidade de ácido graxo, determinada por titulação em pH-stat, quer dizer, o

pH é mantido constante por certo período de tempo com a adição de soda. Dois

padrões podem ser utilizados: ésteres solúveis ou óleo de oliva (azeite) em uma

emulsão padronizada.

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Analise Quantitativa da atividade enzimática

A análise quantitativa pode ser conduzida de várias maneiras:

• Ensaios diretos: medida direta da concentração do substrato ou produto em função do tempo.

• Ensaios indiretos: quando a medida da concentração do substrato e do produto são próximas, a geração do produto pode ser acoplada a outra reação não enzimática, que produza um sinal mais conveniente.

• Ensaios acoplados: a reação enzimática de interesse é acoplada a uma segunda reação enzimática, que pode ser convenientemente medida, tendo como exemplo a reação da glicose oxidase

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Determinação da quantidade de proteínas

Realiza por diferentes métodos – os mais precisos são aqueles que determinam as ligações peptídicas existentes nas moléculas proteicas (Lowry, Bradford).

Outros determinam elementos naturais a natureza proteica , tal como nitrogênio orgânico (Keldhjal)

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Relações não-lineares dev versus [E]t

A preparação enzimática estocada sob condições de pH ou forçaiônica significativamente diferentes do ótimo de reação podemlevar ao “carreamento” destes parâmetros para a análise cinética.

De forma semelhante, a presença de certos agentes deestabilização (EDTA, tióis ou cátions específicos) podem inibir areação.

A medida de velocidade pode não ser uma medida verdadeira davelocidade inicial. Isto pode ocorrer quando a concentração desubstrato diminui significativamente (i.e., não segue uma cinéticade primeira ordem) antes da medida do produto formado.

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A preparação enzimática pode conter enzimas que convertam oproduto a outro composto que foge da detecção do métodoempregado.

A enzima pode ser instável sob as condições de análise (pH,temperatura, força iônica, etc.).

A preparação enzimática pode conter enzimas proteolíticas quese encontram inativas sob as condições de estocagem.

O método de análise pode ser impreciso em altas concentraçõesdo produto.

Os reagentes empregados para converter o produto em umaforma mensurável podem estar em condições limitantes.