UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL FISCLINEX Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina Isabel Jereissati Santos Rio de Janeiro 2008
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL
FISCLINEX
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da
leptina
Isabel Jereissati Santos
Rio de Janeiro 2008
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL
FISCLINEX
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da
leptina
Isabel Jereissati Santos
Dissertação de mestrado apresentada à Pós-Graduação
em Fisiopatologia Clínica e Experimental/PG-FISCLINEX
da Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
Orientadores: Profa Dra. Virgínia Genelhu de Abreu
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina / Isabel Jereissati Santos. – Rio de Janeiro - 2008.
xiii,84f. : il. Orientador: Virgínia Genelhu de Abreu. Orientador: Patrícia Cristina Lisboa. Orientador: Márcia Mattos Gonçalves Pimentel. Dissertação (mestrado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade
de Ciências Médicas.
1.Polimorfismo (Genética) – Teses. 2.Proteínas – Teses. 3. Obesidade – Aspectos genéticos – Teses. 4.Tireóide – Metabolismo – Teses. I. Abreu, Virgínia Genelhu de, 1949- II. Lisboa, Patrícia Cristina. III. Pimentel, Márcia Mattos Gonçalves. IV. Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas. V. Título.
CDU 571.1
iii
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL
FISCLINEX
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de
polimorfismo no gene do receptor da leptina
Isabel Jereissati Santos
Orientadores: Dra. Virgínia Genelhu de Abreu (Profa Adjunto do Departamento de Medicina Interna-FCM/UERJ) Dra. Patrícia Cristina Lisboa (Profa Adjunto do Departamento de Ciências Fisiológicas-IBRAG/UERJ) Dra. Márcia Mattos Gonçalves Pimentel (Profa Adjunto do Departamento de Biologia Celular e Genética-IBRAG-UERJ) Banca examinadora: Dr. Pedro Herman Cabello (Pesquisador Titular do Departamento de Genética-FIOCRUZ) Dr. Egberto Gaspar de Moura (Prof Titular do Departamento de Ciências Fisiológicas IBRAG/UERJ) Dr. Emílio Antônio Francischetti (Prof Titular de Medicina Interna -FCM/UERJ) Suplentes: Dra. Magna Cottini de Fonseca Passos (Profa Adjunto do Departamento de Nutrição Aplicada-INU/UERJ) Dra. Carmen Cabanelas Pazos-Moura (Profa Associado do Programa de Biofísica Celular e de Sistemas-IBCCF/UFRJ)
Rio de Janeiro 2008
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DEDICATÓRIA
“Você precisa ser a mudança
que gostaria de ver no mundo"
Mahatma Gandhi
v
AGRADECIMENTOS
À professora Virginia Genelhu de Abreu, pela oportunidade de desenvolver este estudo, pela orientação primorosa e principalmente por usufruir de seus conhecimentos; À professora Patrícia Cristina Lisboa, pela imensurável dedicação ao ensinar e pelo seu apoio através de seus conhecimentos; À professora Márcia Mattos Gonçalves Pimentel, pelos valiosos ensinamentos sobre Genética, os quais contribuíram significativamente para elaboração desta dissertação; Ao professor Emílio Antônio Francischetti, pelas enriquecedoras discussões sobre obesidade, fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho; Ao professor Pedro Herman Cabello, pela paciência e pelos valiosos ensinamentos sobre estatística; A todos os pacientes, muito obrigada pela disponibilidade e paciência durante a coleta de dados e realização do estudo; À nutricionista Elizabete Goes da Silva, pela amizade, e por ter compartilhado conhecimentos, alegrias, dificuldades e ansiedades ao longo de todo o período de realização do mestrado; Ao bolsista de iniciação científica Bruno Celoria, pelo auxílio e participação no desenvolvimento deste estudo; Aos meus pais, Nico e Vera, pelo apoio, incentivo e compreensão; À secretária da pós-graduação Amélia Gomes, por toda ajuda e eficiência profissional; Às biólogas Maria de Lourdes Guimarães e Débora Valença, às nutricionistas Márcia Simas, Lívia Nogueira e Marcela Knibel e à bolsista de iniciação científica Renata Pina, pelos momentos de descontração, amizade e convivência agradável; Aos secretários Silvana, Fátima, Solange, Rubens e Eliane, pela disposição em ajudar e colaborar direta e indiretamente para a realização de algumas etapas desta pesquisa; Ao biólogo Vagner Ismerim Lobão, por ter gentilmente auxiliado e contribuído para a realização de exames bioquímicos no Laboratório Central do Hospital Pedro Ernesto.
vi
SUMÁRIO
Páginas
LISTA DE TABELAS……………………………………………………………….................viii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES................................................................................................ix
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS.............................................................................x
Tabela 1. Neuropeptídeos orexigênicos e anorexigênicos regulados pela leptina.........10 Tabela 2. Valores de normalidade das concentrações circulantes de TSH e hormônios tireoideanos livres............................................................................................................34 Tabela 3. Características antropométricas, metabólicas e hemodinâmicas de todos participantes do estudo...................................................................................................38 Tabela 4. Correlações de Pearson entre as variáveis antropométricas, metabólicas e hemodinâmicas avaliadas nos pacientes eutróficos (n= 32)...........................................40 Tabela 5. Correlações de Pearson entre as variáveis antropométricas, metabólicas e hemodinâmicas avaliadas nos pacientes obesos (n= 115).............................................41 Tabela 6. Parâmetros antropométricos, metabólicos e hemodinâmicos dos indivíduos obesos de acordo com o genótipo..................................................................................43 Tabela 7. Parâmetros antropométricos, metabólicos e hemodinâmicos dos indivíduos obesos de acordo com a presença do alelo G................................................................45
ix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Ação central da leptina ...................................................................................12 Figura 2. Mecanismo de ação da leptina via JAK2/STAT3............................................14 Figura 3. Representação esquemática dos padrões de bandas obtidas por gel de poliacrilamida...................................................................................................................30 Figura 4. Exemplo de gel de poliacrilamida com o resultado da análise do polimorfismo c.668A>G (Q223R) no gene LEPR.................................................................................42 Figura 5. Comparação entre as concentrações plasmáticas de TSH nos grupos de acordo com o genótipo....................................................................................................44 Figura 6. Comparação entre as concentrações plasmáticas de T4L nos grupos de
acordo com o genótipo....................................................................................................44
Figura 7: Comparação entre as concentrações plasmáticas de TSH nos grupos de
genótipo AA e genótipo AG + GG...................................................................................47
Figura 8: Comparação entre as concentrações plasmáticas de T4L nos grupos de
genótipo AA e genótipo AG + GG ..................................................................................47
x
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
α-MSH- α-Melanocyte stimulating hormone (hormônio estimulador da melanocortina)
AgRP- Agouti related protein (peptídeo relacionado à proteína agouti)
HOMA-IR - Homeostasis model assessment – Insulin resistance (modelo de avaliação
homeostática – resistência à insulina)
HDL-C- High density lipoprotein cholesterol (lipoproteína de alta densidade)
HTs- Hormônios tireoideanos
IMC- Índice de massa corporal
JAK2- Janus quinase 2
JNC 7- Seventh report of the Joint National Committee on Prevention, Detection,
Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure
LDL-C- Low density lipoprotein cholesterol (lipoproteína de baixa densidade)
LEPR – Leptin receptor gene (gene do receptor da leptina em seres humanos)
lepr- Leptin receptor gene (gene do receptor da leptina em roedores)
MC4R- Melanocortin receptor 4 (receptor de melanocortina 4)
NCEP- ATPIII- National Cholesterol Education Program- Adult Treatment Panel III NHANES- National Health and Nutrition Survey (Pesquisa Nacional de Saúde e
Nutrição)
NPY- Neuropeptide Y (neuropeptídeo Y)
NYHA - New York Heart Association (Associação do Coração de Nova York)
WHO- World Health Organization (Organização Mundial da Saúde)
ObR- Leptin receptor (receptor da leptina)
xi
PAD- Pressão arterial diastólica
PAI-1- Plasminogen activator inhibitor-1 (inibidor do ativador de plasminogênio-1)
PAM- Pressão arterial média
PAS- Pressão arterial sistólica
PCR- Polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)
SOCS-3- Supressor of cytokine signaling-3 (supressora da sinalização de citocina 3).
STAT3- Signal transducer and activator of transcription 3 (transdutor do sinal e ativador
da transcrição 3)
T3- Triiodotironina
T4- Tiroxina
TG- Triglicerídeo
TNF-α- Tumoral necrosis factor (fator de necrose tumoral)
TRH- Thyrotropin-releasing hormone (hormônio liberador de tireotrofina)
TSH- Thyroid-stimulating Hormone (hormônio estimulador da tireóide)
xii
RESUMO
Santos, IJ. Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina. Rio de Janeiro, 2008. 84p. Dissertação (Mestrado) – Curso de Pós-graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental – Fisclinex. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. 1. Contexto: Estudos experimentais e clínicos evidenciam relação importante entre leptina e função tireoideana. Contudo, os resultados são conflitantes. 2. Objetivo: avaliar em indivíduos obesos de origem multiétnica, se a presença do polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no gene do receptor de leptina (LEPR) poderia repercutir sobre a função tireoideana. 3. Casuística: participaram deste estudo transversal 115 indivíduos obesos (idade 45,73±12,04 anos) e 32 eutróficos (idade 42,56±6,59 anos), de ambos os sexos. 4. Métodos: medidas antropométricas, hemodinâmicas e bioquímicas foram avaliadas. O T3 e T4 livres plasmáticos foram dosados por RIE e o TSH plasmático por IRMA. O DNA genômico foi isolado e amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR). O produto da PCR foi digerido por enzima específica e resolvido por eletroforese. 5. Resultados: os indivíduos obesos apresentaram maior TSH (2,56±1,39 vs. 1,89±1,42mU/L, p=0,006) e menor T4L (1,03±0,22 vs. 1,22±0,39 ng/dl, p=0,001) quando comparados aos indivíduos eutróficos. A leptinemia apresentou maiores concentrações nos indivíduos obesos comparados aos eutróficos (43,94±29,14 vs. 10,36±5,93ng/ml, p=0,000). No grupo de 115 obesos, observamos que os indivíduos portadores do alelo G (genótipo AG e GG; n=83) apresentaram menor TSH (2,29±1,14 vs. 3,25±1,72 mU/L, p=0,002) e maior T4L (1,07±0,22 vs. 0,94±0,19 ng/dl, p=0,003), embora dentro dos limites de normalidade, comparados aos não portadores do alelo G (n=32). As concentrações de T3L encontravam-se abaixo dos limites de normalidade, não havendo diferenças estatisticamente significativas entre os grupos. A leptina sérica não apresentou diferenças entre os grupos (44,0±29,06 vs. 43,78±29,80 ng/ml; p = 0,879). Além disso, os portadores do alelo G apresentaram menor razão cintura quadril (RCQ) (0,93±0,10 vs. 0,97±0,10; p=0,026), maior HDL-C (47,05±10,67 vs. 42,5±7,50mg/dl; p=0,012) e menor concentração sérica de ácido úrico (5,34±1,54 vs. 6,2±1,76mg/dl; p=0,019). 6. Conclusões: (1) Os obesos exibiram leptinemia quatro vezes maior à observada em indivíduos eutróficos, bem como maiores concentrações de TSH e menores de T4L, embora dentro do limite de normalidade; (2) O polimorfismo p.Q223R no gene LEPR não alterou a leptinemia; (3) Portadores do alelo G apresentam menor TSH, maior T4L, menor RCQ, maior HDL-C e menor ácido úrico sérico, quando comparados aos não portadores do alelo G; (4) sugerindo que o polimorfismo p.Q223R no gene LEPR estaria associado à regulação da função tireoideana e também à redução do risco cardiometabólico relacionado à obesidade.
xiii
ABSTRACT Santos, IJ. Thyroid function evaluation in obese individuals carriers of leptin receptor gene polymorphism. Rio de Janeiro, 2008. 84p. Dissertação (Mestrado) – Curso de Pós-graduação em Fisiopatologia Clínica e Experimental – Fisclinex. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. 1. Context: experimental and clinical studies demonstrate the relationship of leptin and thyroid function. However, there is conflicting results. 2. Aim: to investigate in multiethnic obese individuals whether the presence of LEPR c.668A>G (p.Q223R) gene polymorphism has an effect on thyroid function. 3. Casuistic: in this cross-sectional study participated 115 obese (aged 45,73±12,04 years) and 32 lean individuals (aged 42,56±6,59 years), of both sex. 4. Methods: anthropometric, hemodynamic and biochemical variables were studied. Plasma free triiodothyronine (FT3) and thyroxine (FT4) were measured by RIA and plasma TSH was determined by IRMA. Genomic DNA was extracted and amplified by polymerase chain reaction (PCR). PCR products were digested with specific restriction enzymes and separated by electrophoresis. 4. Results: the obese individuals showed higher TSH (2,56±1,39 vs. 1,89±1,42mU/L, p=0,006) and lower FT4 (1,03±0,22 vs. 1,22±0,39 ng/dl, p=0,001), inside the reference range, as verified in lean individuals. Leptinemia was higher in obese compared to lean individuals (43,94±29,14 vs. 10,36±5,93ng/ml, p=0,000). In the 115 obese group, carriers of the G allele (genotype AG and GG; n=83) showed lower TSH (2,29±1,14 vs. 3,25±1,72 mU/L, p=0,002) and higher FT4 (1,07±0,22 vs. 0,94±0,19 ng/dl, p=0,003), despite all these values were in normal range, compared to allele G non-carriers (n=32). However, FT3 levels were slightly under the normal limit, and showed no differences between the groups. Serum leptin did not show differences between the groups (44,0±29,06 vs. 43,78±29,80 ng/ml; p = 0,879). Additionally, carriers of the G allele showed lower waist-to-hip ratio (WHR) (0,93±0,10 vs. 0,97±0,10; p=0,026), higher HDL-C (47,05±10,67 vs. 42,5±7,50mg/dl; p=0,012) and lower serum uric acid (5,34±1,54 vs. 6,2±1,76mg/dl; p=0,019). 6. Conclusions: (1) Obese individuals showed leptinemia four times higher than lean individuals, as well as higher TSH and lower FT4 concentrations, despite these values were in normal range; (2) The presence of LEPR p.Q223R gene polymorphism did not change the leptinemia; (3) Allele G carriers had lower TSH, higher FT4, lower WHR, higher HDL-C and lower serum uric acid, compared to allele G non-carriers; (4) suggesting that LEPR p.Q223R gene polymorphism could be associated with thyroid function regulation and lower risk to cardiometabolic changes related to obesity.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
INTRODUÇÃO
1
1. INTRODUÇÃO
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
INTRODUÇÃO
2
1. INTRODUÇÃO
A obesidade é uma doença heterogênea e multifatorial, sendo considerada um grande
problema de saúde pública. O aumento mundial da prevalência da obesidade está
associado a fatores ambientais como o sedentarismo e o aumento da disponibilidade de
alimentos hipercalóricos, ricos em lipídeos e carboidratos refinados (Drewnowsk &
Popkin,1997). Fatores genéticos, metabólicos e comportamentais também estão
envolvidos na fisiopatologia da obesidade, através de seus efeitos na ingestão
alimentar, no gasto energético e no acúmulo de tecido adiposo. O sinergismo entre
genes e meio ambiente, ou seja, a presença de um ambiente “obesogênico”, parece ser
necessária para a expressão do fenótipo da obesidade (Loos & Bouchard, 2003).
Estudos evidenciam a presença de variações genéticas em indivíduos com
sobrepeso e obesidade (Rankinen et al., 2006). O gene da leptina (LEP) e de seu
receptor (LEPR) têm sido extensamente estudados nos últimos anos na procura
de variantes que possam ser importantes na fisiopatologia da obesidade (Mattevi
et al., 2002). A leptina é um hormônio produzido no tecido adiposo, que atua
controlando o peso corporal e o consumo energético. Este hormônio também está
associado a outros processos endócrino-metabólicos, dentre eles destaca-se a função
tireoideana (Zimmermann-Belsing et al., 1998). Os resultados de estudos experimentais
e clínicos avaliando a relação entre leptina e função tireoideana são bastante
conflitantes. Sabe-se que a leptina tem efeito estimulatório sobre a função tireoideana,
aumentando o hormônio liberador de tireotrofina (TRH) e o hormônio estimulador da
tireóide (TSH) (Legradi et al., 1997, Nillni et al., 2000, Ortiga-Carvalho et al., 2002). A
presença de polimorfismos no gene LEPR pode afetar o funcionamento normal do
receptor causando uma alteração na sinalização da leptina (Yiannakouris et al., 2001).
Neste contexto, o presente estudo avaliou se o polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no
gene LEPR pode causar alterações na sinalização da leptina, e consequentemente,
repercutir sobre a função tireoideana.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
INTRODUÇÃO
3
1.1. Epidemia mundial de obesidade
A epidemia global de obesidade requer atenção especial dos serviços de saúde.
A WHO (World Health Organization) estima que, atualmente no mundo, 1 bilhão e 600
mil indivíduos (idade > 15 anos) estejam com sobrepeso e pelo menos 400 milhões,
obesos. Até 2015, aproximadamente 2 bilhões e 300 mil indivíduos apresentarão
sobrepeso e mais de 700 milhões, obesidade (WHO 2006).
As taxas de obesidade para homens e mulheres estão aumentando tanto nos
países desenvolvidos, como naqueles em desenvolvimento como o Brasil. Os Estados
Unidos da América (EUA) possuem os dados mais completos sobre as
tendências nacionais de obesidade, pois se baseiam nas comparações dos
estudos populacionais do National Health Examination Survey (NHES I (1960-
1962) e do National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES I (1971-
1974), II (1976-1980), III (1988-1994) e NHANES 2003-2004 (Odgen et al., 2007).
Entre 1960-1962, aproximadamente 45% dos americanos adultos estavam acima
do peso (IMC≥25 Kg/m2). Já em 2003-2004 estes valores chegavam a 66%,
sendo que 33% da população eram obesos (IMC≥30 Kg/m2) e 5% apresentavam
obesidade extrema (IMC≥40 Kg/m2). As análises mostram que a prevalência da
obesidade teve um aumento modesto entre 1960 e 1980, e que, entre os
períodos de 1976-1980 e 1988-1994 houve um aumento considerável, de 15%
para 23% dos americanos com obesidade. Em 1999-2000, os EUA
apresentavam 31% de sua população com obesidade (Ogden et al., 2006).
A prevalência da obesidade difere muito entre os países da Europa. Na
Inglaterra, a prevalência de adultos obesos quase triplicou desde 1980. Em 2002,
cerca de 23% dos homens e 25% das mulheres inglesas estavam acima do peso
(Rennie & Jebb, 2005). Em Portugal, a prevalência de obesidade em 2005 era de
14,2% e a de sobrepeso chegava a 39,4%. Entre 1995–1998, 49,6% dos portugueses
estavam acima do peso, já em 2003-2005 este percentual passou para 53,6% (Carmo
et al., 2007).
No Brasil, o desafio que o déficit nutricional representava há três décadas
está sendo rapidamente substituído pelo excesso de consumo energético. Dados
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
INTRODUÇÃO
4
da Pesquisa de Orçamento Familiar (POF), realizada entre 2002- 2003 demonstraram
que 40% dos adultos do país apresentavam excesso de peso. O problema da
prevalência do excesso de peso alcança grande expressão em todas as regiões
do país, no meio urbano e no meio rural (IBGE 2004).
Quando se compara os dados de 2002-2003 com pesquisas brasileiras
anteriores (1974-1989), observa-se que na década de 70 a prevalência de
sobrepeso para os homens era de 18,6% e de obesidade de 2,8%, e em 2002-
2003, esses percentuais passaram para 41% (mais que o dobro) e 8,8% (mais
que o triplo), respectivamente. Entre as mulheres também ocorreu aumento na
prevalência de excesso de peso, porém de menor magnitude que nos homens.
Entre 1974-1975, a taxa de sobrepeso era de 28,6% e a de obesidade 7,8%,
passando para 40,7% e 12,8% em 1989, respectivamente. Entre 1989 e 2002-
2003, a prevalência de sobrepeso e obesidade se manteve relativamente estável
entre as mulheres (IBGE 2004).
Segundo a OMS, o excesso de peso causa alterações metabólicas adversas à
saúde, quando associado a outros fatores como o sedentarismo e inadequação
alimentar, sendo considerado um dos principais determinantes da alta prevalência de
doenças crônicas, tais como as doenças cardiovasculares, a hipertensão e o diabetes
mellitus tipo 2 (WHO 2000).
A obesidade está associada ao aumento do risco de mortalidade. Alguns estudos
sugerem que a expectativa de vida dos obesos é menor quando comparada aos
indivíduos eutróficos. No Framingham Heart Study, observou-se que adultos obesos
com idade média de 40 anos apresentaram uma espectativa de vida de 6 a 7 anos
menor que adultos com mesma idade e eutróficos (Peeters et al., 2002). Fontaine et al.,
(2003) observaram que os anos de vida perdidos para homens brancos com obesidade
severa, com idades entre 20 e 30 anos, é de 13 anos a menos e para as mulheres é de
8 anos, quando comparados a adultos de mesma faixa etária e peso adequado.
Segundo a OMS, aproximadamente, 220.000 indivíduos nos EUA e Canadá estão
morrendo por ano em decorrência de doenças vinculadas à obesidade. Em 20 países
do Leste Europeu, cerca de 320.000 indivíduos têm as suas vidas interrompidas em
decorrência do excesso de peso (WHO 2002).
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
INTRODUÇÃO
5
A principal causa da alta mortalidade vinculada à obesidade são as doenças
cardiovasculares (DCV). Dorn et al. (1997) observaram que o IMC está fortemente
associado à mortalidade por DCV em mulheres e homens. A prevalência de
hipertensão arterial (Huang et al.,1998; Thomas et al., 2005; Francischetti & Genelhu,
2007), diabetes mellitus tipo 2 (Chan et al.,1994; Colditz et al.,1995), e dislipidemias
(Després et al., 1990; Groop et al., 1992) encontram-se particularmente aumentadas
quando associadas ao excesso de peso.
Mais importante que a gordura corporal total é a região em que o tecido adiposo
se encontra em maior quantidade. O acúmulo de gordura na região do tronco ou central
indica excesso de tecido adiposo visceral e apresenta relação causal, mais significativa
que o IMC, com a maioria das complicações associadas à obesidade (Dagenais et al.,
2005). Clinicamente pode-se obter uma medida simples que apresenta excelente
correlação com a gordura visceral através da circunferência abdominal (Deprés et al.,
2001). Estudos mostram que a gordura na região abdominal, medida através da
circunferência abdominal, é um importante fator de risco para DCV (Pouliot et al., 1994;
Han et al., 1996) e diabetes mellitus tipo 2 (Ohlson et al., 1985; Chan et al., 1994). A obesidade abdominal é o principal fator determinante da chamada Síndrome
Metabólica (SM) (Carr et al., 2004) . As alterações hemodinâmicas, metabólicas e
neuroendócrinas freqüentemente relacionadas à obesidade, como intolerância à
glicose, resistência à insulina, dislipidemia aterogênica, hipertensão arterial, estados
pró-inflamatório e pró-trombótico constituem a base desta síndrome (Grundy, 2004).
Ford et al., (2002) demonstraram que aproximadamente 1/3 dos americanos com
sobrepeso e obesidade manifestam SM de acordo com os critérios de diagnóstico da
National Cholesterol Education Program- Adult Treatment Panel III (NCEP- ATP III). Em
meta-análise obtida a partir da avaliação de 21 estudos prospectivos, observou-se que
indivíduos portadores de SM quando comparados aos que não apresentavam a
síndrome, caracterizaram-se maior mortalidade por DCV (RR 1,74; 95% CI, 1,29-2,35),
alem de maior incidência de acidente vascular cerebral (RR 1,76; 95% CI, 1,37-2,25) e
• metabolismo glicídico (glicemia, insulina sérica e HOMA-IR);
• concentrações plasmáticas de hormônios tireoideanos livres e TSH;
• concentração plasmática de adiponectina e concentração sérica de leptina.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
CASUÍSTICA
22
3. CASUÍSTICA
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
CASUÍSTICA
23
3. CASUÍSTICA
Pacientes
Foram convidados a participar do estudo, através de carta ou telefonema, 200
pacientes obesos que constituíram a casuística de um estudo prévio sobre freqüência
de polimorfismos em genes associados à obesidade. Estes pacientes (60 homens e
140 mulheres) foram identificados através de avaliação clínica realizada na Clínica de
Hipertensão e Obesidade do Hospital Universitário Pedro Ernesto
(CLINEX/HUPE/UERJ).
Para formar o grupo de comparação, selecionamos indivíduos saudáveis com
IMC entre 18,5 e 25 kg/m², entre os funcionários do Hospital Universitário Pedro
Ernesto, bem como contatos indicados pelos próprios pacientes.
Este trabalho teve início somente após aprovação do Comitê de Ética em
Pesquisa (CEP) do Hospital Universitário Pedro Ernesto da Universidade do Estado do
Rio de Janeiro (número do processo no CEP: 517-CEP/HUPE). Todos os participantes
foram esclarecidos quanto ao projeto e concordaram com a realização da avaliação
molecular e com os demais dados coletados mediante a assinatura de um termo de
consentimento (Anexo 2).
Elegibilidade dos Pacientes
Os pacientes de ambos os sexos, que foram efetivamente incluídos no grupo de
estudo preencheram os seguintes critérios:
• idade mínima de 18 anos;
• obesos, apresentando IMC igual ou superior a 30 Kg/m² (WHO, 2003);
• terem assinado o termo de consentimento livre e esclarecido.
Foram excluídos do estudo os pacientes com: familiares participando do estudo;
modificações nos últimos três meses no peso corporal ou na intensidade ou na
frequência de exercícios físicos; níveis de creatinina sérica > 1,3 mg/dl ou clearance de
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
CASUÍSTICA
24
creatinina ≤ 60 ml/mim; doenças hepáticas; doenças psiquiátricas; alcoolismo; uso de
insulina; infarto do miocárdio ou acidente vascular encefálico; insuficiência cardíaca
classe III ou IV NYHA; hipertensão arterial estágio II, definida pela presença de valores
de pressão sistólica ≥ 160 mm Hg ou pressão diastólica ≥ 100 mm Hg de acordo com o
JNC 7 Report (Chobanian et al., 2003).
Os indivíduos incluídos no estudo foram divididos em:
• Grupo de comparação – indivíduos saudáveis com IMC entre 18,5 e 25
kg/m²;
• Grupo portador do polimorfismo p.Q223R no gene LEPR – indivíduos
obesos com IMC igual ou superior a 30 Kg/m² portadores do alelo G;
• Grupo não portador do polimorfismo p.Q223R no gene LEPR - indivíduos
obesos com IMC igual ou superior a 30 Kg/m² não portadores do alelo G.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina
DESENHO DO ESTUDO E PLANO DE TRABALHO
25
4. DESENHO DO ESTUDO E PLANO DE TRABALHO Trata-se de um estudo observacional e transversal. Na primeira visita (V1) os
indivíduos obesos e eutróficos foram submetidos à anamnese e avaliação clínica, para
a seleção dos pacientes de acordo com os critérios de inclusão e exclusão
estabelecidos pelo protocolo. Os pacientes que faziam uso de medicação foram
avaliados clinicamente pela médica pesquisadora responsável, para avaliar a
possibilidade de suspensão da droga por um período de duas semanas.
Todos os participantes considerados elegíveis, incluindo os indivíduos que
suspenderam a medicação, foram orientados a comparecer à segunda visita (V2) no
Laboratório do CLINEX às 07h30min para coleta de sangue, após terem realizado jejum
de 12 horas. Além da avaliação laboratorial, na V2 os pacientes também foram
submetidos à avaliação nutricional, para determinação das medidas antropométricas e
aferição das pressões arteriais sistólicas e diastólicas e freqüência cardíaca.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
MÉTODOS
26
5. MÉTODOS
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
MÉTODOS
27
5.1. Avaliação molecular Extração de DNA
Foram coletados 10 mL de sangue periférico dos indivíduos obesos, utilizando-se
tubos vacutainer com anticoagulante EDTA, seguindo normas de plena assepsia. A extração do DNA foi realizada a partir de leucócitos do sangue periférico por
salting-out, segundo adaptações do método descrito por Miller et al. (1988). O sangue foi homogeneizado vagarosamente e em seguida transferido para um
tubo cônico de 50 mL, ao qual se adicionou 3,5 vezes o volume inicial de tampão de lise
de hemácias (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3,1 mM EDTA – Ph 7,4). O material foi
incubado no gelo por 30 minutos e centrifugado (centrífuga Excelsa Baby 11/206-R) por
15 minutos a uma velocidade de 1500 rpm / rotor 206109300. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi descartado e ao sedimento foram acrescentados 5 mL de tampão de
lise de hemácias. O material foi novamente homogeneizado e ressuspenso através de
agitador de tubos do tipo vortex. Adicionou-se, então, 100 µL de Proteinase K a 20
mg/mL e 150 µL de SDS 20%. A amostra foi homogeneizada e deixada em banho de
aquecimento a 37º C por 20 horas.
Após a incubação foi acrescentado 1 mL de cloreto de sódio 6M, sendo o tubo
vigorosamente agitado por 15 segundos. O material foi então centrifugado
(Ultracentrífuga Himac CR21 – Hitachi) por 30 minutos a uma velocidade de 6000 rpm /
rotor 27. Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo cônico
de 50 mL e o sedimento foi descartado. Foram adicionados ao sobrenadante 2 volumes
de álcool etílico absoluto gelado para a precipitação do DNA. O precipitado foi lavado
com álcool etílico 70% por duas vezes e em seguida transferido com o auxilio de uma
alça de vidro para um microtubo, sendo deixado secar à temperatura ambiente. O DNA
foi ressuspenso em 1 mL de TE (10 mM Tris, HCl, 1 mM EDTA- pH 7,4) e deixado
solubilizar em banho de aquecimento a 37ºC. Após a solubilização, o DNA foi
armazenado a 4ºC.
Paralelamente, também foi realizada a extração de DNA genômico utilizando-se
um kit comercial (BIOSYSTEMS), seguindo as orientações do fabricante.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
MÉTODOS
28
Estimativa da concentração do DNA
Para a quantificação do DNA foi realizada a eletroforese em gel de agarose 0,8%
em tampão TBE 1X (89 mM Tris, 89 mM H3BO3, 2 mM EDTA). A corrida eletroforética
foi realizada em cuba horizontal por 1 hora a 60 V utilizando-se TBE 1X como tampão
de corrida.
As amostras aplicadas no gel consistiram de 1 µL de DNA, 4 µL de água milliQ e
1 µL de corante de corrida (0,25% azul de bromofenol; 0,25% xileno cianol; 40%
glicerol). Após a corrida eletroforética, o gel de agarose foi corado com brometo de
etídio (0,5 µL/mL) por 5 a 10 minutos. A estimativa de concentração das amostras de
DNA foi realizada comparando-se estas com padrão de 100 µg do DNA do bacteriófago
λ, visualizada através de um transluminador de luz ultravioleta. Após a quantificação,
uma alíquota do DNA foi diluída a uma concentração de uso de 50 µg/µL e o restante
do material foi armazenado a 4ºC.
Caracterização do polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no gene LEPR
Para a identificação do polimorfismo c.668A>G no gene LEPR foi utilizada a
técnica de PCR-RFLP. Nesta técnica o DNA é amplificado através da reação em cadeia
de polimerase (PCR) seguida da digestão dos fragmentos amplificados com enzima de
restrição específica.
As amostras de DNA foram amplificadas em um termociclador PTC 100
utilizando os primers descritos por Gotoda et al. (1997) sendo estes: 5´
AAACTCAACGACTCTCCTT 3´ (SENSO) e 5´ TGAACTGACATTAGAGGTGAC 3´
(ANTISENSO). As reações de PCR incluíram 100 µg de DNA genômico, tampão de
reação 1X (10 mM Tris–HCl, 50 mM KCl, pH 8,0), 2,0 mM MgCl2, 0,2 mM de dNTP (1
mM de dATP, 1 mM de dCTP, 1 mM de dTTP e 1 mM de dGTP), 2,5 pmol de cada um
dos oligonucleotídeos e 0,5 U Tth DNA polimerase em um volume final de 25 µL.
As condições de ciclagem utilizadas incluíram desnaturação inicial a 95º por 5
minutos, seguida de 40 ciclos com três etapas: desnaturação a 95ºC por 30 segundos,
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
MÉTODOS
29
pareamento a 52ºC por 45 segundos e extensão a 72ºC por 45 segundos, seguindo-se
uma etapa final de extensão a 72ºC por 10 minutos.
Uma alíquota de 10 µL do produto da PCR foi digerida com 2,5 U da enzima de
restrição MspI por 3h a 37ºC. Os produtos resultantes da digestão foram resolvidos por
géis de poliacrilamida 8% não-desnaturantes. A corrida eletroforética transcorreu à
temperatura ambiente por 45 minutos a 110 V.
Após a eletroforese, os géis foram corados por prata (Santos et al., 1993).
Primeiramente, o gel foi incubado sob agitação moderada em uma solução fixadora
contendo 10% de etanol e 0,5% de ácido acético a 40ºC por 3 minutos e, em seguida,
em uma solução de 10% etanol, 0,5% de ácido acético e 0,2% de nitrato de prata a
40ºC por 10 minutos. Após a coloração, foi realizada uma lavagem de 20 segundos com
água MilliQ à temperatura ambiente. O gel foi revelado em solução contendo 3% de
hidróxido de sódio e 150 µL de formaldeído à temperatura ambiente por 15 minutos.
Para intensificar a coloração das bandas, o gel foi submetido a uma solução de 10% de
etanol e 0,5% de ácido acético a 40ºC por 3 minutos.
O padrão obtido a partir da digestão do produto amplificado com a enzima MspI,
está esquematizado na Figura 3. A presença da variante alélica G cria um sítio de
clivagem da enzima de restrição MspI, sendo assim, nos indivíduos homozigotos GG o
fragmento de 80 pb gerado pela PCR é clivado em dois fragmentos, com 58 e 22 pb.
Os indivíduos heterozigotos AG apresentam, além desses dois fragmentos, um
fragmento de 80 pb resultante do alelo A não clivado pela enzima. Os indivíduos
homozigotos AA, o fragmento amplificado não é clivado e, nestes, só observamos um
fragmento com 80 pb.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
MÉTODOS
30
Figura 3: Representação esquemática dos padrões de bandas obtidas por gel de
poliacrilamida, após a digestão do fragmento amplificado pela enzima MspI. Linha 1:
fragmento gerado pela PCR; linha 2: padrão obtido para indivíduos homozigotos (AA);
linha 3: padrão para indivíduos heterozigotos (AG); linha 4: padrão obtido para os
indivíduos homozigotos (GG).
5.2. Avaliação antropométrica Índice de massa corporal (IMC)
Este índice foi calculado através da divisão do peso (em kg) pela estatura
elevada ao quadrado (em m²) (WHO, 2000).
O peso foi estimado através do uso de uma balança antropométrica da marca
Filizola (precisão de 0,1 kg), e a estatura foi aferida através do uso de um estadiômetro
(precisão 0,5 cm), com os pacientes sem sapatos.
Circunferência da cintura (CC), de quadril (CQ) e razão cintura-quadril (RCQ)
As circunferências da cintura (CC) e de quadril (CQ) foram mensuradas com o
auxílio de uma fita métrica inextensível, graduada em centímetros, com o paciente em
pé. A CC foi determinada no ponto médio entre a crista ilíaca e a borda inferior do
último arco costal. A CQ foi medida na maior circunferência na extensão posterior das
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
MÉTODOS
31
nádegas. A RCQ foi obtida a partir da divisão da circunferência da cintura pela
circunferência do quadril.
5.3. Avaliação hemodinâmica
A pressão arterial e a freqüência cardíaca foram aferidas pelo método
oscilométrico através do uso do Dinamap (1846, Critikon), com manguito de tamanho
apropriado, no membro superior não dominante com o paciente sentado. Após 5
minutos de repouso, foram consideradas 3 medidas seqüenciais de pressão arterial
com intervalos de 3 minutos, que não se diferenciassem mais do que 10 mm Hg nos
valores de pressão arterial sistólica e 5 mm Hg nos valores de pressão arterial
diastólica. A pressão arterial média foi obtida pelo cálculo do dobro da média da
pressão arterial diastólica, somado à média da pressão arterial sistólica, sendo este
resultado dividido por três. A freqüência cardíaca foi determinada a partir do cálculo da
média aritmética dos valores obtidos nos três momentos de aferição da pressão arterial.
5.4. Avaliação metabólica e hormonal
Todo o processamento das amostras de sangue coletadas após jejum de 12
horas foi realizado atendendo as especificações próprias de cada variável. Alíquotas de
plasma e soro foram estocadas a – 20ºC ou a – 80ºC, conforme apropriado, para as
determinações laboratoriais.
5.4.1. Metabolismo glicídico
As amostras de sangue para dosagem de glicose foram coletadas após 12 horas
de jejum, em tubo sem anticoagulante, com centrifugação após 30 minutos e dosadas
por método enzimático-hexoquinase, no mesmo dia da coleta. Os valores foram
expressos em mg/dl.
A insulina sérica de jejum foi determinada por radioimunoensaio (RIE) usando
reagentes da LINCO Research, St Louis, USA, específicos para insulina humana.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
MÉTODOS
32
Neste ensaio a reatividade cruzada com a pro-insulina humana é inferior a 0,2%
(Morgan & Lazarow, 1963). Os valores foram expressos em µU/ml.
O índice de resistência à insulina foi estimado através da Fórmula da Avaliação
do Modelo Homeostático (HOMA), em que a resistência é determinada pelo produto da
insulinemia de jejum (µU/ml) e da glicemia de jejum (mmol/l) dividido por 22,5. Este
índice possui alta correlação com o clamping euglicêmico hiperinsulinêmico (Matthews
et al., 1985; Avignon et al.,1999).
5.4.2. Metabolismo lipídico O colesterol total foi dosado pelo método de Huang modificado, o HDL-colesterol
pelo sistema enzimático COD-ANA, Lab Test e os triglicerídeos, após saponificação,
pela reação de Hantzch, usando o método de Soloni modificado.
O LDL-colesterol foi estimado através da fórmula de Friedwald et al. (1972),
válida quando os valores de triglicerídeos são inferiores a 400 mg/dl: Colesterol total –
(HDL-colesterol + triglicerídeos / 5). Os valores foram expressos em mg/dl.
5.4.3. Ácido úrico
O ácido úrico foi dosado pelo método enzimático (uricase) através do Kit BT 3000
(Winer) e seus valores foram expressos em mg/ dl.
5.4.4. Uréia
A uréia foi dosada pelo método cinético (urease-GLUDH) através do Kit BT 3000
(Winer) e seus valores foram expressos em mg/ dl.
5.4.5. Creatinina
A creatinina foi dosada pelo método cinético (reação de Jaffé) através do Kit BT
3000 (Winer) e seus valores foram expressos em mg/ dl.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
MÉTODOS
33
5.4.6. Leptina sérica
As concentrações séricas de leptina de jejum foram determinadas por RIE
usando reagentes da LINCO Research, St Louis, USA, específicos para leptina
humana.
Alíquotas de 500 µl de soro foram armazenadas em freezer com a temperatura
mantida a -20º C.
O coeficiente de variação intra-ensaio foi de 3,4%. Os valores foram expressos
em ng/ml.
5.4.7. Adiponectina plasmática As amostras foram coletadas após jejum de 12 horas, em tubo com
anticoagulante EDTA. Depois foram centrifugadas e armazenadas em alíquotas no
freezer a -80ºC, até o momento do ensaio. A concentração de adiponectina plasmática foi determinada por RIE usando
reagentes da LINCO Research, St Louis, USA, específicos para adiponectina humana.
O coeficiente de variação intra-ensaio foi de 3,59%. Os valores obtidos foram
divididos por 1.000, sendo expressos em µg/ml.
5.4.8. Hormônio estimulador da tireóide (TSH)
O TSH plasmático foi determinado por ensaio imunorradiométrico (IRMA) usando
reagentes da ICN Pharmaceuticals Inc., CA, EUA, específicos para TSH humano.
Alíquotas de 500 µl de plasma foram coletadas em jejum de pelo menos 12
horas e armazenadas em freezer em temperatura mantida a -20º C.
O coeficiente de variação intra-ensaio foi de 4,1%.
Os valores obtidos de TSH foram expressos em mU/L e os níveis de
normalidade estão apresentados na Tabela 2.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
MÉTODOS
34
5.4.9. Hormônios tireoideanos livres
As concentrações plasmáticas de triiodotironia (T3) e a tiroxina (T4) livres foram
quantificadas por RIE comercial usando reagentes da MP Biomedicals Inc., NY, EUA,
específico para humanos.
Alíquotas de 500 µl de plasma foram coletadas em jejum de pelo menos 12 horas
e armazenadas em freezer a temperatura de -20º C.
O coeficiente de variação intra-ensaio para o T3 e T4 livres foram 5,3% e 3,9%,
respectivamente.
Os valores obtidos de T3 e T4 Livres foram expressos em pg/mL e ng/dL
respectivamente.
Tabela 2: Valores de normalidade das concentrações circulantes de TSH e hormônios tireoideanos livres.
TSH 0,30 – 6,50 mU/L
T4 Livre 0,7 – 1,7 ng/dL
T3 Livre 2,97 – 5,19 pg/mL
5.5. Análise estatística dos dados
Os dados foram armazenados no programa Excel para Windows e as análises
estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS 12 (SPSS Lead Technologies
Station, Chicago, USA). As variáveis que não passaram no teste de normalidade, foram
logaritmizadas: adiponectina, leptina, insulina, HOMA-IR e TSH. Utilizaram-se para a
descrição das variáveis contínuas, as médias aritméticas com seus respectivos desvios
padrões. As comparações entre as distribuições das variáveis de indivíduos eutróficos e
obesos foram feitas através do teste t de Student não pareado; para comparação das
médias das variáveis dos grupos de obesos de acordo com o genótipo, AA, AG e GG
utilizou-se a análise de variância (ANOVA), seguida do pós-teste de Tukey para
determinação das diferenças entre os grupos. Procedeu-se à análise de regressão
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
MÉTODOS
35
linear com a finalidade de verificar fatores de confundimento, como sexo e idade. A
apreciação estatística da comparação de proporções foi baseada no teste Qui-
quadrado. O nível de significância estatística considerado foi p<0,05.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
RESULTADOS
36
6. RESULTADOS
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
(r=0,370;p=0,000), TSH (r=0,185;p=0,047) e leptina (r=0,629;p=0,000). A RCQ
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
RESULTADOS
40
apresentou associação positiva com a pressão arterial média (r=0,241;p=0,010),
triglicerídeos (r=0,253;p=0,006), glicose (r=0,185;p=0,048), insulina (r=0,363;p=0,000) e
HOMA-IR (r=0,379;p=0,000).
Tabela 4. Correlações de Pearson entre as variáveis antropométricas, metabólicas e hemodinâmicas avaliadas nos pacientes eutróficos (n= 32). Índice de massa
corporal (kg/m²) Circunferência de
cintura (cm) Razão cintura-
quadril Variáveis* r p valor r p valor r p valor PAS (mmHg) 0,057 0,766 0,120 0,534 0,184 0,338 PAD (mmHg) 0,056 0,767 0,112 0,562 0,141 0,465 Pressão arterial média (mmHg) 0,197 0,296 0,282 0,139 0,311 0,101 Freqüência cardíaca (bpm) -0,011 0,955 0,348 0,064 0,372 0,047 Colesterol Total (mg/dl) -0,149 0,423 0,084 0,666 0,195 0,310 Triglicerídeos (mg/dl) 0,216 0,244 0,234 0,223 0,364 0,053 HDL-colesterol (mg/dl) -0,246 0,183 -0,209 0,276 -0,104 0,591 LDL-colesterol (mg/dl) -0,080 0,670 0,159 0,410 0,219 0,255 Glicose (mg/dl) 0,256 0,165 0,057 0,769 -0,033 0,867 Insulina (µU/ml) -0,046 0,808 0,016 0,936 -0,053 0,786 HOMA-IR -0,045 0,811 0,015 0,938 -0,058 0,766 TSH (mU/L) -0,008 0,966 -0,062 0,748 0,001 0,998 T4 Livre (ng/dl) 0,121 0,517 0,091 0,640 0,171 0,374 T3 Livre (pg/ml) -0,076 0,684 -0,021 0,913 0,104 0,592 Leptina (ng/ml) 0,468 0,008 0,479 0,009 0,360 0,055 Adiponectina (µg/ml) 0,117 0,530 -0,193 0,315 -0,190 0,323 *ajustadas para sexo e idade. PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; HDL: lipoproteína de alta densidade; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HOMA-IR: índice de resistência à insulina; TSH: hormônio estimulante da tiróide; T4 Livre: tiroxina livre; T3 Livre: triiodotironina livre.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
RESULTADOS
41
Tabela 5. Correlações de Pearson entre as variáveis antropométricas, metabólicas e hemodinâmicas avaliadas nos pacientes obesos (n= 115). Índice de massa
corporal (kg/m²) Circunferência de cintura (cm)
Razão cintura- quadril
Variáveis* r p valor r p valor r p valor PAS (mmHg) 0,164 0,079 0,163 0,081 0,094 0,318 PAD (mmHg) 0,174 0,062 0,155 0,099 0,072 0,446 Pressão arterial média (mmHg) 0,126 0,179 0,192 0,040 0,241 0,010 Freqüência cardíaca (bpm) 0,197 0,035 0,240 0,010 0,136 0,147 Colesterol Total (mg/dl) 0,024 0,797 0,027 0,778 0,114 0,223 Triglicerídeos (mg/dl) -0,024 0,796 0,064 0,499 0,253 0,006 HDL-colesterol (mg/dl) -0,059 0,529 -0,048 0,610 -0,084 0,371 LDL-colesterol (mg/dl) 0,061 0,518 0,054 0,563 0,103 0,272 Glicose (mg/dl) 0,125 0,184 0,244 0,008 0,185 0,048 Insulina (µU/ml) 0,310 0,001 0,419 0,000 0,363 0,000 HOMA-IR 0,250 0,007 0,370 0,000 0,379 0,000 TSH (mU/L) 0,133 0,156 0,185 0,047 0,175 0,061 T4 Livre (ng/dl) -0,046 0,628 -0,063 0,502 -0,029 0,762 T3 Livre (pg/ml) -0,010 0,915 -0,065 0,495 -0,044 0,645 Leptina (ng/ml) 0,651 0,000 0,629 0,000 0,099 0,295 Adiponectina (µg/ml) 0,090 0,338 0,036 0,699 -0,130 0,166 *ajustadas para sexo e idade. PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; HDL: lipoproteína de alta densidade; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HOMA-IR: índice de resistência à insulina; TSH: hormônio estimulante da tiróide; T4 Livre: tiroxina livre; T3 Livre: triiodotironina livre.
6.2. Análise Molecular do polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no gene LEPR
No grupo de 115 indivíduos obesos analisados para o polimorfismo c.668A>G
(p.Q223R), observamos a seguinte distribuição genotípica: 32 (27,8%) genótipo AA, 64
(55,7%) genótipo AG e 19 (16,5%) genótipo GG. A análise deste polimorfismo no gene
LEPR realizada em nossa amostra está ilustrada em figura 4.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
RESULTADOS
42
Figura 4: Exemplo de gel de poliacrilamida com o resultado da análise do polimorfismo
c.668A>G (p.Q223R) no gene LEPR através da técnica de PCR-RFLP em quatro
individuos obesos. Linha 1:marcador de peso molecular PstI; linhas 02 e 05: indivíduos
heterozigotos (AG); linha 03: indivíduo homozigoto (GG) para o polimorfismo
(p.Q223R); linha 04: indivíduo homozigoto (AA).
Os indivíduos obesos foram divididos em grupos de acordo com o genótipo. As
características antropométricas, metabólicas e hemodinâmicas dos grupos, são
apresentadas na Tabela 6.
Comparando os indivíduos com genótipo AA, AG e GG observamos que não
houve diferenças entre eles em relação a sexo e medidas antropométricas (Tabela 6).
Quanto aos parâmetros hemodinâmicos e metabólicos, conforme observado na
Tabela 6 houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos apenas com
relação à função tireoideana. Observamos que as concentrações de TSH (p=0,002) e
T4L (p=0,016) apresentaram valor de p significativo entre os grupos de acordo com o
genótipo (Figuras 5 e 6). Na análise de pós-teste (teste de Tukey) demonstrou-se que o
TSH estava significativamente menor nos indivíduos de genótipo AG quando
comparado ao grupo de genótipo AA (p=0,001). Em relação ao T4L, observamos
concentrações estatisticamente maiores no grupo de genótipo AG quando comparado
aos indivíduos de genótipo AA (p=0,011). Quanto às concentrações de T3L, não
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
RESULTADOS
43
exibiram diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (p=0,273). Não
observamos diferenças entre os grupos AG e GG.
Tabela 6: Parâmetros antropométricos, metabólicos e hemodinâmicos dos indivíduos obesos de acordo com o genótipo. AA
(n=32) AG
(n=64) GG
(n=19)
Variáveis* Média±DP Média±DP Média±DP p valor Sexo masculino, n (%) 11(34,4%) 21(32,8%) 3(15,8%) 0,312 Peso (kg) 110,14±32,76 104,081±24,54 95,31±22,71 0,165 Índice de massa corporal (kg/m²) 40,11±9,98 38,51±7,69 37,71±8,26 0,564 Circunferência de cintura (cm) 117,48±17,57 111,24±13,90 109,24±16,57 0,105 Circunferência de quadril (cm) 121,06±16,47 121,01±17,33 119,05±14,09 0,894 Razão cintura- quadril 0,97±0,10 0,93±0,11 0,92±0,10 0,082 PAS (mmHg) 134,17±17,08 129,05±17,29 131,51±18,82 0,399 PAD (mmHg) 85,51±11,44 81,89±12,96 85,17±11,20 0,320 Pressão arterial média (mmHg) 101,73±12,55 97,61±13,56 100,62±12,88 0,316 Freqüência cardíaca (bpm) 74,24±10,20 72,76±9,28 73,72±14,39 0,799 Uréia (mg/dl) 30,5±11,25 30,01±8,94 30,58±8,42 0,959 Creatinina (mg/dl) 0,86±0,24 0,83±0,19 0,77±0,17 0,332 Ácido úrico (mg/dl) 6,2±1,76 5,39±1,58 5,16±1,42 0,034 Colesterol Total (mg/dl) 198,97±37,15 203,29±44,12 213±37,68 0,501 Triglicerídeos (mg/dl) 166,06±72,35 152,53±88,99 161,16±74,61 0,736 HDL-colesterol (mg/dl) 42,5±7,5 46,86±11,03 47,68±9,61 0,089 LDL-colesterol (mg/dl) 123,26±33,29 125,34±37,53 133,08±32,67 0,620 Glicose (mg/dl) 108,12±24,27 105,86±21,35 113,21±41,51 0,565 Insulina (µU/ml) 22,45±11,25 24,43±13,29 22,37±10,50 0,890 HOMA-IR 5,92±3,30 6,52±4,20 6,58±4,84 0,972 TSH (mU/L) 3,25±1,72 2,23±1,11‡ 2,49±1,25 0,002 T4 Livre (ng/dl) 0,94±0,19 1,08±0,22§ 1,04±0,22 0,016 T3 Livre (pg/ml) 2,60±0,71 2,86±0,75 2,77±0,63 0,273 Leptina (ng/ml) 43,78±29,80 43,52±29,56 45,62±28 0,907 Adiponectina (µg/ml) 7,31±3,34 7,41±5,66 7,49±2,22 0,593 *ajustadas para sexo e idade.Valores são expressos como média ± desvio padrão da média. PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; HDL: lipoproteína de alta densidade; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HOMA-IR: índice de resistência à insulina;TSH: hormônio estimulante da tiróide; T4 Livre: tiroxina livre; T3 Livre: triiodotironina livre. Análise pós-teste (teste de Tukey): ‡ p= 0,001 AG vs. AA; § p=0,011 AG vs. AA.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
RESULTADOS
44
Figura 5: Comparação entre as concentrações plasmáticas de TSH nos grupos
de acordo com o genótipo. * p= 0,001 AG vs. AA.
Figura 6: Comparação entre as concentrações plasmáticas de T4L nos grupos
de acordo com o genótipo. * p= 0,011 AG vs. AA.
Esses achados sinalizam a existência de um efeito do alelo G na função
tireoideana. Como as concentrações circulantes de HTs e TSH não diferiram entre os
indivíduos heterozigotos e homozigotos para o polimorfismo no gene LEPR, mas sim
entre os indivíduos selvagens (AA) e os indivíduos de genótipo AG, outras análises
estatísticas foram realizadas agrupando os indivíduos portadores do alelo G. Na Tabela
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
RESULTADOS
45
7 encontram-se as características antropométricas, hemodinâmicas e metabólicas dos
grupos AA e AG + GG.
Tabela 7: Parâmetros antropométricos, metabólicos e hemodinâmicos dos indivíduos obesos de acordo com a presença do alelo G. AA
(n=32) AG + GG
(n=83)
Variáveis* Média±DP Média±DP p valor Idade (anos) 47,91±12,93 44,89±11,65 0,053 Sexo masculino, n (%) 11 (34,4%) 24 (28,9%) 0,569 Peso (kg) 110,14±32,76 102,07±24,28 0,152 Índice de massa corporal (kg/m²) 40,11±9,98 38,33±7,78 0,369 Circunferência de cintura (cm) 117,48±17,57 110,78±14,47 0,061 Circunferência de quadril (cm) 121,06±16,47 120,57±16,59 0,886 Razão cintura- quadril 0,97±0,10 0,93±0,10 0,026 PAS (mmHg) 134,16±17,08 129,61±17,57 0,209 PAD (mmHg) 85,51±11,44 82,65±12,59 0,247 Pressão arterial média (mmHg) 101,73±12,55 98,30±13,39 0,203 Freqüência cardíaca (bpm) 74,24±10,20 72,98±10,57 0,561 Uréia (mg/dl) 30,5±11,25 30,14±8,77 0,873 Creatinina (mg/dl) 0,86±0,24 0,82±0,19 0,365 Ácido úrico (mg/dl) 6,2±1,76 5,34±1,54 0,019 Colesterol Total (mg/dl) 198,97±37,15 205,52±42,71 0,420 Triglicerídeos (mg/dl) 166,06±72,35 154,51±85,56 0,469 HDL-colesterol (mg/dl) 42,5±7,50 47,05±10,67 0,012 LDL-colesterol (mg/dl) 123,26±33,29 127,12±36,43 0,589 Glicose (mg/dl) 108,12±24,27 107,54±27,17 0,912 Insulina (µU/ml) 22,45±11,25 23,96±12,67 0,717 HOMA-IR 5,92±3,30 6,54±4,32 0,800 TSH (mU/L) 3,25±1,72 2,29±1,14 0,002 T4 Livre (ng/dl) 0,94±0,19 1,07±0,22 0,003 T3 Livre (pg/ml) 2,60±0,71 2,84±0,72 0,121 Leptina (ng/ml) 43,78±29,80 44,0±29,06 0,879 Adiponectina (µg/ml) 7,31±3,34 7,43±5,07 0,841 *ajustadas para sexo e idade. Valores são expressos como média ± desvio padrão da média. PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; HDL: lipoproteína de alta densidade; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HOMA-IR: índice de resistência à insulina;TSH: hormônio estimulante da tiróide; T4 Livre: tiroxina livre; T3 Livre: triiodotironina livre.
Comparando o grupo de indivíduos de genótipo AA com o grupo de genótipo AG
+ GG, observamos que não houve diferença entre eles em relação a sexo e idade. Em
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
RESULTADOS
46
relação às medidas antropométricas, os resultados das análises não foram
estatisticamente significativos, mas podemos observar que o grupo de indivíduos
portadores do alelo G apresentou menor peso, IMC e circunferência de cintura quando
comparado aos indivíduos AA (Tabela 7). Apenas a RCQ apresentou valor de p
significativo (p=0,026), com menor valor entre os indivíduos de genótipo AG e GG.
A concentração de ácido úrico estava significativamente menor no grupo de
indivíduos portadores do alelo G quando comparados aos indivíduos de genótipo AA.
Com relação aos parâmetros hemodinâmicos, observamos que os indivíduos
portadores do alelo G apresentaram menor PAS, com diferença aproximadamente de
5mmHg, apesar de não exibir um p significativo (p=0,209). Quando comparamos a
proporção de indivíduos em uso de medicação anti-hipertensiva entre os indivíduos de
genótipo AA (65,6%; n=21) e os indivíduos portadores do alelo G (60,2%; n=50),
observamos que não houve diferença estatisticamente significativa (χ2=0,283;p=0,594).
Quanto ao metabolismo glicídico, não observamos diferenças significantes entre
os grupos. Quando comparamos a proporção de indivíduos com intolerância à glicose
entre os indivíduos de genótipo AA (40,6%; n=13) e os indivíduos portadores do alelo G
(32,5%; n=27), observamos que não houve diferença estatisticamente significativa
(χ2=0,667;p=0,414). O mesmo foi observado com relação à proporção de diabetes
mellitus tipo 2 no grupo de indivíduos de genótipo AA (31,2%; n=10) e o grupo de
indivíduos de genótipo AG e GG (26,5%; n=22) (χ2=0,259; p=0,611). A proporção de
indivíduos em uso de hipoglicemiante oral também não diferiu entre os indivíduos de
genótipo AA (18,8%;n=6) e os de genótipo AG e GG (15,7%;n=13) (χ2=0,160;p=0,690).
Quanto ao metabolismo lipídico, observamos que o HDL-colesterol apresentou
níveis significativamente maiores no grupo de indivíduos de genótipo AG + GG quando
comparado ao grupo de genótipo AA.
Quanto à função tireoideana, observamos que o TSH (p=0,002) apresentou
menor média, embora dentro da faixa de normalidade, no grupo de indivíduos de
genótipo AG e GG, quando comparado ao grupo de indivíduos de genótipo AA (Figura
7). Enquanto que o T4L exibiu concentração significativamente maior, embora dentro do
limite de normalidade, no grupo de genótipo AG e GG (p=0,003) (Figura 8). Já o T3L
não apresentou relevância estatística.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
RESULTADOS
47
Figura 7: Comparação entre as concentrações plasmáticas de TSH nos grupos
de genótipo AA e genótipo AG + GG.
* p= 0,002
Figura 8: Comparação entre as concentrações plasmáticas de T4L nos grupos
de genótipo AA e genótipo AG + GG
* p= 0,003
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
DISCUSSÃO
48
7. DISCUSSÃO
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
DISCUSSÃO
49
7. DISCUSSÃO
7.1. Casuística
Com a finalidade de caracterizar o perfil metabólico e hemodinâmico da nossa
amostra de pacientes obesos, indivíduos saudáveis com IMC entre 18,5 e 25 kg/m²
foram recrutados. Apesar de 48 dos 115 pacientes obesos fazerem uso de medicação
anti-hipertensiva e/ou hipoglicemiantes orais, e não terem sido submetidos a um
período de suspensão da medicação, os resultados das análises estatísticas permitiram
constatar que indivíduos eutróficos e obesos apresentam diferenças marcantes tanto
nos parâmetros antropométricos quanto metabólicos e hemodinâmicos.
Estudos prévios, com diferentes grupos étnicos, demonstraram que o aumento
no peso corporal caracteriza-se pela elevação concomitante nos valores de pressão
arterial tanto em mulheres quanto em homens (Must et al., 1999; Brown et al., 2000;
Doll et al., 2002). Embora no presente estudo, parte dos pacientes obesos estivesse em
uso de medicação anti-hipertensiva (n=43), este grupo apresentou, como média,
valores de pressão arterial condizentes com a classificação de pré-hipertensos segundo
The JNC 7 Report (Chobanian et al., 2003). Quando comparados aos indivíduos
eutróficos, observamos que os obesos apresentaram maiores níveis de pressão arterial,
com uma diferença de aproximadamente 23 mmHg na pressão arterial sistólica e cerca
de 17 mmHg na diastólica. Brown et al. (2000) utilizaram os dados do NHANES III, e
verificaram que nesta população a média da pressão arterial sistólica foi 9 mmHg
superior em homens e 11 mmHg em mulheres que apresentavam IMC superior a 30
kg/m² comparados aos indivíduos de mesmo sexo com IMC entre 18,5 e 25 kg/m².
Existem controversias na literatura a respeito de qual parâmetro de distribuição
de gordura corporal é o mais apropriado para identificação de indivíduos com elevado
risco cardiometabólico (Després et al., 2001; Yusuf et al., 2005). Resultados recentes
de uma meta-análise (Koning et al., 2007) demonstraram que a circunferência de
cintura (CC) e a razão cintura/quadril (RCQ) constituem medidas capazes de evidenciar
os efeitos do acúmulo de tecido adiposo na região central. Koning et al. (2007)
observaram que, em ambos os sexos, o aumento em 1 cm na CC, eleva em 2% o risco
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
DISCUSSÃO
50
relativo para DCV (95% IC: 1–3%), e que um aumento em 0,01 U na RCQ, o risco
relativo para DCV aumenta 5% (95% CI: 4–7%). No presente estudo, além do IMC,
foram medidas a CC e a RCQ, as quais foram significativamente maiores nos indivíduos
obesos e associaram-se de forma positiva com a pressão arterial média (CC e RCQ),
freqüência cardíaca (CC), triglicerídeos (RCQ), glicemia e insulinemia de jejum, e
HOMA-IR (CC e RCQ). O que enfatiza a necessidade de valorizar ambas as medidas
antropométricas, juntamente com o IMC, na prática clínica.
Os indivíduos obesos, em concordância com achados prévios de que o excesso
de peso corporal associa-se a alterações no metabolismo glicídico (Dalton et al., 2003),
apresentaram glicemia de jejum em média acima do limite superior de normalidade
estabelecido pela ADA (2007). Entre os indivíduos obesos, 26,7% (n=40) apresentavam
intolerância à glicose e 21,3% (n=32) diabetes mellitus tipo 2. Além disso, a insulina
plasmática estava acima da faixa de normalidade e juntamente com o HOMA-IR,
apresentou valores mais que o dobro dos que foram encontrados nos indivíduos
eutróficos. Hu et al. (2001) analisaram dados de mais de 84.000 mulheres que
participaram do Nurses’ Health Study, e demonstraram que a obesidade constitui o fator
de risco mais importante para o desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2. Ao analisar
dados do NHANES III, Must et al. (1999) observaram que o risco para diabetes mellitus
tipo 2 aumenta proporcionalmente ao grau de obesidade, em ambos os sexos.
Estudos demonstraram associação positiva entre IMC e concentração sérica de
ácido úrico sérico (Lee et al., 1995; Ishizaka et al., 2005). Além disso, o aumento de
ácido úrico sérico é um fator independente de risco de DCV (Bengtsson et al., 1988;
Ishizaka et al., 2005). No presente estudo observamos concentrações
significativamente maiores de ácido úrico nos indivíduos obesos comparados aos
eutróficos.
Apesar de evidências obtidas a partir do The Framingham Offspring Study
(Lamon-Fava et al., 1996) o qual demonstrou que a elevação do IMC encontra-se
associada a um aumento nos níveis séricos de colesterol total e de LDL-C, o presente
estudo não constatou diferença significativa com relação a estes parâmetros entre os
dois grupos. Possivelmente estes achados foram, em parte, devido ao fato da maioria
dos indivíduos eutróficos (n=19) apresentarem colesterol total acima de 200 mg/dl.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
DISCUSSÃO
51
Também observamos que as concentrações de HDL-C, estavam dentro do limite de
normalidade, embora significativamente menores nos indivíduos obesos comparados
aos eutróficos. Quanto aos triglicerídeos, estes apresentaram valores em média,
significativamente maiores nos indivíduos obesos, além de estarem acima da faixa
considerada desejável pelo Third Report of the National Cholesterol Education Program
(NCEP, 2002). Corroborando nossos resultados, Cercato et al. (2004), observaram
hipertrigliceridemia, menor HDL-C e concentrações similares de colesterol total ao
comparar indivíduos obesos e eutróficos, de ambos os sexos.
Vários estudos demostram que na obesidade humana ocorre hiperleptinemia
(Considine et al., 1996a; Maffei et al., 1996; Zimmet et al., 1996; Adami et al., 2002;
Kobayashi et al., 2004; Kettaneh et al., 2007). Em nossa amostra de obesos a média
dos valores de leptina sérica estava aproximadamente quatro vezes maior comparada
aos valores encontrados nos indivíduos eutróficos. Este achado foi também observado
por Considine et al. (1996a), que compararam 139 obesos e 136 eutróficos, e
observaram leptinemia quatro vezes maior em obesos. Maffei et al. (1996) analisaram
amostra de 87 individuos eutróficos e obesos, e observaram aumento de leptina
circulante em indivíduos com IMC elevado. No presente estudo, também observamos
que a leptinemia tanto nos indivíduos obesos quanto nos eutróficos correlacionou-se
positivamente com o IMC e CC, corroborando o estudo de Zimmet et al. (1996), que
demonstraram correlação da leptinemia com o IMC e a CC em adultos com peso
adequado e obesos. Adami et al. (2002) verificaram associação positiva entre as
concentrações de leptina e IMC em indivíduos obesos. Outro estudo (Kobayashi et al.,
2004) avaliou 52 indivíduos com sobrepeso e obesidade observou associação entre
leptina sérica, IMC e adiposidade abdominal, através de tomografia computadorizada.
Em contraste com a leptina, as concentrações plasmáticas de adiponectina
encontram-se reduzidas na obesidade (Arita et al., 1999; Weyer et al., 2001; Côté et al.,
2005). No entanto, apesar do presente estudo constatar que obesos apresentaram
menor concentração plasmática de adiponectina do que indivíduos eutróficos, a
diferença entre os grupos não alcançou significância estatística. Observamos nos
obesos valores médios de adiponectina de 7,4 µg/ml, similares aos encontrados na
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
DISCUSSÃO
52
literatura. Lindsay et al. (2002) observaram adiponectinemia de 5,3 µg/ml individuos
obesos, e Weyer et al. (2001) encontraram adiponectinemia de 7,2 µg/ml.
Os estudos avaliando a função tireoideana na obesidade são controversos.
Resultados na literatura demonstram que as concentrações de TSH e HTs podem
apresentar-se aumentadas, diminuídos ou similares em obesos comparados a
indivíduos eutróficos (Knudsen et al., 2005; Manji et al., 2006). No presente estudo,
observamos que a concentração circulante de TSH foi significativamente mais elevada,
embora dentro da faixa de normalidade, nos indivíduos obesos em comparação aos
eutróficos. Os obesos exibiram valor médio de T4L dentro do limite de normalidade e
significativamente menor, aos encontrados no grupo de indivíduos eutróficos. Enquanto
o T3L apresentou concentrações, abaixo do limite de normalidade e similares entre os
grupos. Corroborando estes achados, Knuden et al. (2005) analisaram amostra de mais
de 4.000 indivíduos eutireoideos, e demonstraram que quanto maior o grau de
obesidade maior o TSH e menor o T4L, enquanto que o T3L não se aterou. Sari et al.
(2003) observaram que mulheres na pré-menopausa com IMC ≥ 30 kg/m² apresentaram
maior TSH e menor HTs livres, embora dentro da faixa de normalidade, quando
comparadas a mulheres de mesma faixa etária e IMC entre 18,5 e 25 kg/m². Estudo
realizado na Turquia, com amostra de 226 mulheres eutireoidéas, demonstrou que na
presença de sobrepeso/obesidade ocorria aumento de TSH (Bastemir et al., 2007). No
presente estudo, também observamos no grupo de indivíduos obesos, associação
positiva entre CC e TSH. O mesmo foi observado por de Pergola et al. (2007) que
avaliaram 201 mulheres italianas com sobrepeso/obesidade, observaram que o TSH
correlacionou-se positivamente com a CC. Sorisky et al. (2000) e Valyasevi et al.
(2002), que demonstaram a presença de receptores de TSH em adipócitos e pré-
adipócitos de seres humanos, relatam que o TSH ao se ligar ao seu receptor no tecido
adiposo, induz a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos, expandindo o tecido
adiposo (adipogênese).
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
DISCUSSÃO
53
7.2. Análise dos indivíduos obesos quanto à presença do polimorfismo p.Q223R no gene LEPR
As pesquisas avaliando a associação entre obesidade e o polimorfismo p.Q223R
no gene LEPR, apresentam resultados conflitantes. Alguns estudos demonstaram não
haver associação entre IMC e o polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no gene LEPR
(Echwald et al., 1997; Gotoda et al., 1997; Mergen et al., 2007) enquanto outros
observam associação positiva entre este polimorfismo e a obesidade (Chagnon et al.,
2000; Yiannakouris et al. 2001; Mattevi et al., 2002). No presente estudo, no grupo de
115 indivíduos obesos analisados para o polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no gene
LEPR, observamos que os indivíduos portadores do alelo G (genótipos AG e GG)
apresentaram menor RCQ, tendência a apresentar menor CC e nenhuma diferença
quanto ao IMC, comparados aos indivíduos de genótipo AA. Quinton et al. (2001)
analisaram amostra de mulheres caucasianas na pós-menopausa e observaram que
indivíduos com genótipo GG apresentaram menor IMC e massa adiposa comparados
aos indivíduos de genótipo AA e AG. Wauters et al. (2001) analisaram amostra de 280
mulheres caucasianas e demonstraram que indivíduos portadores do alelo G
apresentaram menor adiposidade abdominal, avaliada pela tomografia
computadorizada, quando comparados aos indivíduos de genótipo AA. Rosmond et al.
(2000) analisaram amostra de 269 homens e não observaram nenhuma associação
entre este polimorfismo e IMC, RCQ e CC, enquanto que outros estudos observaram
maior IMC e gordura corporal em portadores do alelo G (Chagnon et al., 2000), ou em
indivíduos de genótipo GG (Yiannakouris et al., 2001; Mattevi et al., 2002).
Em relação à leptina sérica, não observamos diferenças entre os grupos.
Corroborando este achado, Rosmond et al. (2000), e Crabbe et al. (2006) não
identificaram diferenças nas concentrações de leptina sérica em indivíduos analizados
para o polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no gene LEPR. Já Quinton et al. (2001)
observaram maior leptinemia em indivíduos portadores do alelo A, enquanto Chagnon
et al. (2000) demonstraram o oposto, maior concentração de leptina circulante em
portadores do alelo G.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
DISCUSSÃO
54
7.3. Função tireoideana e o polimorfismo p.Q223R no gene LEPR
Os resultados do presente estudo mostram pela primeira vez, ao nosso
conhecimento, uma associação de um polimorfismo no gene LEPR e a função
tireoideana em seres humanos obesos. Nossos principais achados mostram que os
indivíduos portadores do alelo G (genótipos AG e GG) apresentaram maior T4L e menor
TSH, embora dentro do limite de normalidade, comparados aos indivíduos de genótipo
AA. As concentrações de T3L não exibiram diferenças significativas entre os grupos.
Considerando que os valores de leptina foram semelhantes nos três genótipos
(p=0,9), poderíamos admitir que as diferenças observadas na função tireoideana
ocorreram em decorrência de sinalização mais apropriada da leptina nos indivíduos
portadores do alelo G. A troca de glutamina, um aminoácido de carga neutra, pela
arginina que apresenta carga positiva, pode alterar a funcionalidade do receptor
causando, portanto, mudanças na sinalização da proteína (Considine et al., 1996b;
Chung et al., 1997; Chagnon et al., 1999; Chagnon et al., 2000; Yiannakouris et al.,
2001). Construiu-se, então, a hipótese de que as diferenças significativas na função
tireoideana ocorreram em decorrência da melhor sinalização da leptina nos indivíduos
portadores do alelo G, modulando mais adequadamente o efeito da leptina na glândula
tireóide. Assim, o polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no gene LEPR aumentaria a
síntese e secreção de T4, que por sua vez exerceria um feedback negativo, inibindo a
secreção de TSH, reduzindo, assim, as concentrações circulantes deste hormônio.
Além disso, não sendo possível dosar TRH humano, poderíamos supor que o aumento
de T4 estaria suprimindo a produção de TRH, e consequentemente, a de TSH.
O hipotálamo (Tartaglia 1997, Toste et al., 2006), a hipófise (Vicente et al., 2004)
e a glândula tireóide (Nowak et al., 2002) expressam receptores de leptina. Sugere-se
que a principal ação da leptina no eixo hipotálamo-hipófise-tireóide, ocorre no núcleo
paraventricular do hipotálamo, através de seu efeito estimulador na secreção de TRH
em roedores (Legradi et al., 1997; Nillni et al., 2000). Além disso, tanto em roedores
(Ortiga-Carvalho et al., 2002) quanto em seres humanos (Chan et al., 2003) a leptina
estimula a secreção de TSH na hipófise. Por outro lado, De Oliveira et al. (2007)
demonstraram em roedores que a leptina, através de seu efeito direto na tireóide,
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
DISCUSSÃO
55
estimula a secreção de T4. Nowak et al. (2002) observaram, também, que após a
administração crônica de leptina, ocorre aumento de HTs e, conseqüente redução de
TSH.
Nossos dados mostraram que os obesos portadores do alelo G apresentaram
concentração média de TSH (2,29 mU/L) dentro de valores encontrados em 95% de
voluntários eutireoideos rigorosamente avaliados pela Academia Americana de
Bioquímica Clínica (0,4 a 2,5 mU/L) (Baloch et al., 2003). Em contrapartida, os obesos
homozigotos para o alelo A, exibiram concentrações médias de TSH (3,25 mU/L)
equivalentes aos encontrados nos 5% da distribuição de valores para eutireoidismo,
portanto mais próximos ao hipotireoidismo.
Assim, o conjunto destes resultados sugere que indivíduos obesos com genótipo
não polimórfico apresentariam tendência à redução da função tireoideana quando
comparados aos indivíduos portadores da variante no gene do LEPR. Caso esta
interpretação esteja correta, a presença do polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no gene
LEPR exerceria em indivíduos obesos um papel protetor quanto à preservação de uma
função tireoideana mais adequada, visto que este grupo apresentou maior TSH e
menor T4L, quando comparados aos eutróficos.
Quanto aos níveis de pressão arterial, observamos na tabela 7 que nos
indivíduos portadores do alelo G, os valores de PAS, PAD e PAM eram, em média,
numericamente menores, quando comparados aos indivíduos não portadores do alelo
G. Corroborando este achado, Rosmond et al. (2000) demonstraram menor PAS e PAD
em indivíduos portadores do alelo G para o polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) quando
comparados aos indivíduos homozigotos para o alelo A.
Além de mais apropriadamente eutireóideos, os indivíduos portadores do alelo G,
apresentaram RCQ significativamente menor. Em vários estudos epidemiológicos a
RCQ é um importante fator preditivo de risco cardiovascular (Yusuf et al., 2005; Koning
et al., 2007). Indivíduos portadores do alelo G apresentaram concentrações
significativamente maiores de HDL-C, um importante fator de proteção para DCV
(NCEP, 2002). Corroborando nosssos achados Rosmond et al. (2000) observaram que
indivíduos portadores do alelo G apresentaram maior HDL-C comparados aos
indivíduos homozigotos para o alelo A.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
DISCUSSÃO
56
Os obesos apresentaram, também, maiores concentrações séricas de ácido
úrico comparados aos eutróficos, sendo que naqueles portadores do alelo G a uricemia
estava significativamente menor comparada à encontrada em obesos homozigotos para
o alelo A. A hiperuricemia é um fator de risco independente de DCV (Ishizaka et al.,
2005).
São necessários novos estudos para testar adequadamente a hipótese de uma
modulação seletiva e favorável do polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no gene LEPR na
função tireoideana.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
CONCLUSÕES
57
8. CONCLUSÕES
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
CONCLUSÕES
58
8. CONCLUSÕES
A avaliação da função tireoideana mostrou que os indivíduos obesos,
comparados aos eutróficos, tiveram concentrações maiores de TSH e menores de T4L,
embora estejam dentro dos limites da normalidade, em ambos os grupos.
Nos indivíduos obesos, a presença do polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no
gene LEPR não alterou a leptina circulante, cujas concentrações foram quatro vezes
superiores às observadas nos eutróficos.
Os genótipos AG e GG se associaram a concentrações significativamente
menores de TSH e maiores de T4L, quando comparados aos indivíduos de genótipo
AA, sugerindo influência do alelo G na regulação seletiva das ações da leptina sobre
seu receptor tireoideano.
Os portadores do alelo G, além de mais apropriadamente eutireoideos,
apresentaram, menor RCQ, maior HDL-C e menor ácido úrico sérico, sugerindo que o
polimorfismo c.668A>G (p.Q223R) no gene LEPR estaria, também, associado à
redução do risco cardiometabólico relacionado à obesidade.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
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Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
ANEXOS
79
ANEXOS
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
ANEXOS
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Anexo 1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO - FCM Programa de Pós-graduação em Fisiopatologia
Clínica e Experimental - PG-FISCLINEX
Ficha de Identificação
Paciente:______________________________________________________________ Reg. HUPE: ______________________ Endereço:______________________________________________________________ Bairro:_________________________________Município:_______________________ CEP: _____________ - ______ Telefones: ( ) próprio ( ) outro ________________________ DDD: ___ ___ ___ TEL: ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ CEL: ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ Data de Nascimento: ___ / ___ / _______ Idade: _______ anos Nacionalidade: ( ) Brasileira ( ) outra ________________________ Naturalidade: ( ) Rio de Janeiro ( ) outra ________________________ Cor (especifique): ( ) branco ( ) não-branco, _______________________ Sexo: ( ) masculino ( ) feminino - Profissão: _______________________ Grau de Instrução: ( ) 1º grau incompleto ( ) 2º grau incompleto ( ) 3º grau incompleto ( ) 1º grau completo ( ) 2º grau completo ( ) 3º grau completo Estado civil: ( ) solteiro(a) ( ) casado(a) ( ) divorciado(a) ( ) viúvo(a) Freqüência de atividade física: ( ) raramente / nunca ( ) < uma vez por semana ( ) uma vez por semana ( ) 2-3 vezes por semana ( ) 4-6 vezes por semana diariamente: ____________________ Fumante: ( ) sim ( ) não Uso de álcool no ultimo ano: (quatro drinks por mês, por semana ou por dia): ___________________ Exame Físico (se houver qualquer anormalidade especifique): ____________________________________________________________________________________________________________________________________________
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
ANEXOS
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Ficha de Avaliação Clínica
Nome do paciente:_______________________________________________________ Reg. HUPE: ______________________ Grupo sanguíneo: ( ) A ( ) B ( ) AB ( ) O RH: ( ) + ( ) - Medidas antropométricas: Peso: __________ Kg Altura: __________ IMC: __________ Grau de obesidade: ( ) OB1 ( ) OB2 ( ) OB3 Circunferência de Cintura: __________ Circunferência de Quadril: __________ Razão cintura / quadril: __________ Pressão arterial (sentado): 1ª ________ / ________ mm Hg Braço 2ª ________ / ________ mm Hg Braço ______ 3ª ________ / ________ mm Hg Braço ______ Média das 3 leituras: ________ / ________ mm Hg Pressão arterial média: ________ mm Hg Frequancia cardíaca: ________ bpm Pressão arterial (leitura em pé): ________ / _______mm Hg Peso ao nascer: ________ Kg Altura: ________ Anamnese e história pregressa: (S) sim (N) não (D) desconhece ( ) DM ( ) intolerância à glicose ( ) dislipidemia ( ) HAS – estágio: _______ ( ) ICC ( ) angina ( ) AVE ou IAM recente ( ) tabagismo ( ) alcoolismo ( ) endocrinopatia ( ) nefropatia ( ) hepatopatia ( ) doença psiquiátrica ( ) hiperuricemia / gota ( ) queixas osteoarticulares – citar: _________________________________________ ( ) sintomas respiratórios – citar: __________________________________________ ( ) outras doenças – citar: ________________________________________________ ( ) uso regular de medicação: _____________________________________________
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
ANEXOS
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Ficha de Avaliação Clínica História familiar: (S) sim (N) não - especificar parentesco e idade ( ) obesidade: _________________________________________________________ ( ) dislipidemia: ________________________________________________________ ( ) DM: _______________________________________________________________ ( ) HAS: ______________________________________________________________ ( ) AVE: ______________________________________________________________ ( ) IAM: _______________________________________________________________ Comentários relevantes: ____________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Data: ______________________ Assinatura e Carimbo: _______________
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
ANEXOS
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Anexo 2 TERMO DE CONSENTIMENTO
Título do estudo: ESTUDO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS ASSOCIADOS À OBESIDADE - PPARγ, LepR, Lep e β3R. AVALIAÇÃO DA FREQUÊNCIA E REPERCUSSÕES NEUROENDÓCRINAS (LEPTINA, ADIPONECTINA, T3, T4, TSH), METABÓLICAS (GLICOSE, INSULINA, LIPÍDIOS) E HEMODINÂMICAS (PRESSÃO ARTERIAL E DENSIDADE CAPILAR CUTÂNEA) EM UMA AMOSTRA POPULACIONAL DO RIO DE JANEIRO. Instituição: Universidade do Estado do Rio de Janeiro Pesquisadores: Stênio Fernando Pimentel Duarte Márcia Mattos Gonçalves Pimentel Emílio Antônio Francischetti Virgínia Genelhu de Abreu Nome do paciente:___________________________________________________ Data de nascimento:______________ Número:____________ Eu, ____________________________________________________ identidade nº _________________________, estou ciente e concordo livremente em participar na pesquisa do Serviço de Genética Humana (SERVGEN) e da Clínica de Hipertensão (CKINEX) da Universidade do Estado do Rio de Janeiro visando, investigação de genes associados à obesidade, utilizando técnicas de biologia molecular através de amostra de sangue. Além disso, me foi informado que serão feitas avaliações metabólicas e hemodinâmicas através de dosagens de leptina, adiponectina, glicose, insulina e lipídios, T3, T4, TSH e avaliação da pressão arterial e da densidade capilar cutânea. Declaro que entendi que este trabalho tem como objetivo a implementação de novas técnicas laboratoriais, na investigação de doenças genéticas a partir de indivíduos com sintomas de obesidade. De acordo com o que me foi informado este estudo beneficiará os pacientes através dos diagnósticos encontrados e também suas famílias com relação ao aconselhamento genético mais apropriado. Para a realização dos exames serão extraídos 10 mL de sangue periférico. Esta quantidade é suficiente para as análises em questão, mas, caso não haja obtenção de células necessárias para a análise, o paciente poderá ser solicitado, futuramente, para nova coleta de sangue. O material a ser examinado será somente para fins deste projeto. Declaro que me foi informado, que o referido exame não apresenta risco ao paciente, sendo realizado com material descartável e acompanhado pelo pesquisador responsável.
Avaliação da função tireoideana em indivíduos obesos portadores de polimorfismo no gene do receptor da leptina.
ANEXOS
84
A participação do paciente neste estudo é voluntária e o responsável poderá recusar-se a participar ou se afastar dele a qualquer momento. O sigilo e a confidencialidade das informações coletadas serão preservadas, assim como suas identidades não serão reveladas. Cada amostra de material biológico fará parte de um banco de dados identificados por códigos específicos. Os resultados, tanto positivos como negativos, serão entregues a cada família participante e também serão utilizados com fins científicos, podendo ser publicados em revistas científicas, estando os registros disponíveis para uso da pesquisa. O responsável terá todo e qualquer esclarecimento sobre este estudo durante e após a duração da pesquisa. Declaro que li e entendi o que me foi explicado.
Rio de Janeiro, _____de ___________________________de _____________.
Universidade do Estado do Rio de Janeiro Assinatura do responsável/ paciente: _______________________________________________
Assinatura do pesquisador:
_______________________________________________
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