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AUTOIMUNIDADE Daniela Amaral Tomé R2 da Patologia Clínica
115

Autoimunidade PARTE 1

Aug 03, 2015

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Page 1: Autoimunidade PARTE 1

AUTOIMUNIDADE

Daniela Amaral ToméR2 da Patologia Clínica

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Introdução

• O Sistema Imune normal tem a capacidade de reagir a uma enorme variedade de microorganismos, mas não contra cada antígeno próprio do indivíduo.

• A esta não-responsividade específica a um antígeno induzido pela sua exposição aos linfócitos chamamos de:– Tolerância Imunológica

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TolerânciaImunológica

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• Ocorre através de três mecanismos:

Exposição Antígeno Linfócito

Os antígenos próprios são classificados como tolerogênicos ou não-imunogênicos e essa sua característica é que gera a tolerância imunológica.

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Importância da Tolerância Imunológica

• Primeira: os antígenos próprios normalmente induzem tolerância

• Segunda: aprendermos com ela como induzir tolerância em linfócitos específicos para um antígeno particular, assim podemos ser capazes de usar este conhecimento para prevenir ou controlar as reações imunes indesejáveis.

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Mecanismos de Tolerância Imunológica

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Autoimunidade

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Definida como uma resposta imune contra antígenos próprios.

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Tolerância Central da célula T

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Tolerância Periférica da célula T

• Ocorre através de três mecanismos:– Anergia: é a inativação funcional dos linfócitos T que ocorre

quando células reconhecem antígenos sem níveis adequados de co-estimuladores que são nescessários para a ativação do linfócito T

– Deleção: a ativação repetida dos linfócitos T maduros pelos antígenos próprios, ou o reconhecimentos dos antígenos próprios sem o segundo sinal, estimulam vias de apoptose que resultam na deleção dos linfócitos T auto-reativos

– Supressão Imune: alguns linfócitos auot-reativos, ao se encontrar com linfócitos próprios, podem se desenvolver em células regulatórias cuja função é prevenir ou suprimir a ativação de outros linfócitos auto-reativos potencialmente perigosos

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Anergia

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Deleção

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Tolerância central dos linfócitos B

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Tolerância periférica dos linfócitos B

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Fatores genéticos na Autoimunidade

• Múltiplos genes predispõem a doenças auto-imunes, e os genes mais envolvidos nesse processo são os do MHC

• Lembrando que o MHC é a molécula responsável pela apresentação do antígeno ao linfócito T

• Quando temos a herança de determinados alelos de MHC, que são incapazes de apresentar o antígeno ao linfócito T, apresentamos doenças auto-imunes

• Se herdamos um alelo particular do HLA , aumentamos o risco relativo de apresentarmos uma doença auto-imune.

• Porém esse alelo do HLA por si só não irá causar a doença, como no caso da alteração no loci do MHC.

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Associações de doenças auto-imunes com alelos do locus do MHC

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Genes não-MHC associados a autoimunidade

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Papel das infecções na autoimunidade

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DOENÇAS AUTO-IMUNES

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Orgão Específicas e SistêmicasOrgão Específicas Sistêmicas

Doença de HashimotoDoença de GravesEsclerose Múltipla Artrite ReumatóideMyasthenia Gravis Lúpus Eritematoso Sistêmico

Anemia Hemolítica auto-imune

Esclerose Sistêmica

Púrpura trombocitopênica auto-imune

Doença Mista do Tecido Conjuntivo

Síndrome do anticorpo antifosfolípide

Síndrome de Sjögren

Diabetes Mellitus Tipo 1

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DIAGNÓSTICO: ACHADOS SOROLÓGICOS COMUNS PARA AS

VÁRIAS DOENÇAS AUTO-IMUNES

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Componentes Nucleares Reconhecidos por auto-anticorpos

• Membrana Nuclear• Cromatina• Nucléolo• Proteínas Nucleares• Partículas Ribonucleoproteínas(RNA)• Moléculas de DNA

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Anticorpos Auto-Imunes

• FAN(Fator Anti-Núcleo)Hep-2/ ANA/PAAC• Anti-DNA• ENA (Screening, 4, 6, 8...)• ANCA (C-ANCA ou P-ANCA)• FR (Fator Reumatóide)• Anti-CCP3

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ANA/ FAN /IFI EM CÉLULAS

HEP-2/PAAC

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ANA (Anticorpos Anti-Nucleares)

• Estão presentes em várias doenças auto-imunes como:– LES– Doença Mista do Tecido Conjuntivo– Artrite Reumatóide– Esclerodermia– Esclerose sistêmica progressiva– Vasculites– Polimiosites– Síndrome de SJögren

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ANA

• Pode ser utilizado como indicador :

– Prevendo o aparecimento de doença auto-imune– Diagnóstico– Prognóstico– Para monitorizar efetivamente o tratamento

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Histórico do ANA

• 1948: Hargraves descobre a célula LE em pacientes com LES

• 1948 A 1997: Célula LE é usada como critério diagnóstico para LES

• 1957: Fries utiliza a imunofluorescência indireta para teste de triagem de ANA usando imprinting de fígados de camundongo

• Hoje: Imunofluorescência indireta com células Hep-2 (melhores

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ANA

• Métodos para diagnóstico:– EIA (Enzyme Imune Assay)– ELISA(Enzyme Linked Imunosorbent Assay)– IFI (Imunofluorescência Indireta)

• ANA anteriormente era chamado de FAN quando realizado por IFI

• Hoje chamamos o ANA de PAAC (Pesquisa de Anticorpos contra Antígenos Celulares)

• A nomenclatura FAN não designava corretamente o teste já que nele descrevemos auto-anticorpos não só contra o núcleo, mas também contra nucléolos, actina, miosina, mitocôndria , Complexo de Golgi, citoplasma.

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IFI Hep-2,FAN ou PAAC

• É o teste de escolha na maioria dos laboratórios para triagem e semi-quantificação do ANA

• PAAC é um teste de alta sensibilidade para vários auto-anticorpos

• De acordo com o seu padrão conseguimos determinar os auto-anticorpos envolvidos e a doença auto-imune relacionada

• Várias evidências demonstram que a presença de auto-anticorpos precedem o aparecimento de doenças auto-imunes

• No LES ,o PAAC por IFI em células HEP-2 positivo, pode preceder o aparecimento da doença em até 9 anos

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Princípio do Teste: IFI em células Hep-2

A reação de IFI é baseada na ligação dos auto-anticorpos presentes no soro do paciente aos auto-antígenos expressos presentes nas células de carcinoma de laringe humana que são utilizadas como substrato para a detecção dos possíveis auto-anticorpos e estes são revelados por um anticorpo antiimunoglobulina humana conjugado ao isotiocianato de fluoresceína.

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Por que células Hep-2?

• Por apresentarem antígenos humanos não encontrados em tecidos de roedores

• Antígenos semelhantes estarem presentes em maiores concentrações

• Apresentarem todas as fases de divisão celular( intérfase/prófase, metáfase, anáfase e telófase)

• Apresentarem também uma relação núcleo/citoplasma em favor do núcleo

• E ainda presença de vários nucléolos

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Critérios para Laudar a IFI Hep-2

1. As diluições de triagem são 1/80 e 1/3202. Os critérios morfológicos para a leitura da

lâmina de IFI:a) Aspecto da matriz nuclearb) Aspecto do nucléoloc) Observação de todos os estágios de divisão

celulard) Aspecto do fuso mitóticoe) Aspecto do citoplasma

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Correlação dos critérios gerou as seguintes árvores de decisões

1. Padrões nucleares2. Padrões nucleolares3. Padrões relacionados ao aparelho mitótico4. Padrões citoplasmáticos5. A leitura do título final deve ser feita na última

diluição em que o padrão é observável de forma definida

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PASSOS PARA LEITURA DA LÂMINA DE IFI HEP-2

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1° Passo

• Definição da região celular fluorescente

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2°Passo

• Observação da fase de divisão celular e classificação da placa metafásica cromossômica

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3°Passo• Caracterização do aspecto da fluorescência

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PADRÕES DA IFI HEP-2

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Nuclear tipo membrana nuclear• Auto-anticorpos:

– Antilamina e contra componentes antigênicos do envelope nuclear(lâminas,LAPs,nucleoporina,gp210)

• Padrão caracteriza-se por:– Fluorescência de toda a membrana contínua ou pontilhada, sem

fluorescência em nucléolos e citoplasma, há células em todos os estágios de divisão

• Relevância Clínica:– Pode não apresentar associação clínica específica– Associado a Cirrose Biliar Primária, Hepatites auto-imunes– Raramente associado a: doenças reumáticas e SAAF– Associado a algumas formas de LES e Esclerodermia Linear

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Nuclear Homogêneo

• Auto-anticorpos:– Anti-DNA nativo, Anti-histona e Anticorpo anticromatina

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma fluorescente e nucléolo não visualizado por

sobreposição da coloração– Placa metafásica positiva na anáfase e telófase

• Relevâncias clínicas:– Anti-DNA nativo: marcador de LES– Anti-histona: marcador de LES induzido por drogas e LES

idiopático– Anticorpo anticromatina: LES, AIJ importante na forma

oligoarticular com uveíte,Síndrome de Felty e HAI

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Nuclear pontilhado grosso

• Auto-anticorpos:– Anti-Sm e anti-RNP

• Padrão caracterizado por:– Nucleoplasma com grânulos de aspecto grosseiro e tamanho

heterogêneo– Placa metafásica negativa

• Relevâncias clínicas:– Anti-Sm: marcador para LES– Anti-RNP: critério obrigatório no diagnóstico de doença mista

do tecido conjuntivo, também presente no LES, Esclerose sistêmica e AR.

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Nuclear pontilhado grosso reticulado

• Auto-anticorpos:– Anticorpos contra componentes das

ribonucleoproteinas heterogêneas– Componentes da matriz celular

• Padrão caracteriza-se por: – Nucleoplasma com grânulos grandes e grosseiros que

se organizam linearmente formando redes– Placa metafásica negativa

• Relevâncias clínicas:– Raramente presentes em doença auto-imune, exceto

quando em níveis altos

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Nuclear pontilhado fino

• Auto-anticorpos:– Anti-SS-A/Ro– Anti-SS-B/La

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma com granulação fina e bem distribuída– Placa metafásica negativa

• Relevâncias clínicas:– Anti-SS-A/Ro: Sjögren primária, LES, lúpus neonatal e

cutâneo subagudo,Esclerose sistêmica e cirrose biliar primária

– Anti-SS-B/La: Sjögren primária, LES e lúpus neonatal

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Nuclear pontilhado fino denso

• Auto-anticorpos:– Antiproteína p75 e LEDGF/p75

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma da célula em intérfase apresenta-se como

pontilhado fino denso grosseiro– Placa metafásica positiva com as mesmas carcterísticas do

nucleoplasma• Relevâncias clínicas:– Sem relevância clínica até o momento– Evidenciado em indivíduos normais,processos

inflamatórios específicos e não específicos, doenças alérgicas e auto-imunes

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Nuclear pontilhado pontos isolados

• Auto-anticorpos:– Anti-p80 colina – Anti-Sp100

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma com pontos fluorescentes isolados– Placa metafásica negativa

• Relevâncias clínicas:– Anti-p80 colina: sem associação clínica definida– Anti-Sp100: descrito principalmente em Cirrose

biliar primária e em diversas outras situações.

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Nuclear pontilhado centromérico

• Auto-anticorpos:– Anti-centrômero

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma da célula em intérfase apresentando

pontilhado com um número constante de 46 pontos

– Placa metafásica positiva• Relevâncias clínicas:– Esclerose sistêmica forma CREST e cirrose biliar

primária e Sjögren

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Nuclear pontilhado pleomórfico

• Anticorpo contra núcleo de células em proliferação

• Padrão caracteriza-se por:– Nucleoplasma apresenta-se não fluorescente na

célula em fase S da intérfase, passando a pontilhado com grânulos variando de grosso,fino a fino denso na medida em que a célula evolui para a fase G2

• Encontrado em pacientes com LES

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Padrão Nucleolar

• Auto-anticorpos:– Anti-PM/SCL, To/Th,nucleolína , anti-fibrilarina(U3-RNP), anti-

NOR 90 e anti-RNA polimerase I• Relevâncias Clínicas:

– Anti-PM/SCL, To/Th,nucleolína : Sindrome de superposição da polimiosite com esclerose sistêmica

– Anti-fibrilarina: associado a esclerose sistêmica com comprometimento visceral(hipertensão pulmonar)

– Anti-NOR 90 : sem relevância clínica definida, descrito na esclerose sistêmica

– Anti-RNA polimerase I: esclerose sistêmica com compromentimento visceral

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Citoplasmático fibrilar linear

• Auto-anticorpos:– Antiactina– Antimiosina

• Descrição :– Fibras de estresse que constituem o citoesqueleto

decoradas de forma retilínea, cruzando toda a extensão da célula e não respeitando os limites nucleares

• Relevâncias clínicas:– Antiactina: hepatite auto-imune– Antimiosina: hepatite C, hepato-carcinoma, miastenia

gravis

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Citoplasmático fibrilar filamentar

• Anticorpo antivimentina e antiqueratina

• Descrição do padrão:– Decoração de filamentos com acentuação uni ou

bipolar em relação à membrana nuclear

• Relevância clínicas:– Antiqueratina: doença hepática alcoólica,em várias

doenças inflamatórias e infecciosas

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Citoplasmático fibrilar segmentar

• Auto-anticorpos:– Antialfa-actina, antivinculina e anti-tropomiosina

• Descrição de padrão:– Apenas segmentos curtos das fibras de estresse

se encontram fluorescentes.• Relevâncias clínicas:– Anticorpos encontrados nas miastenia gravis,

doença de crohn e colite ulcerativa

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Citoplasmático pontilhado polar

• Auto-anticorpos:– Antigolginas

• Descrição do padrão:– A decoração é apenas citoplasmática em pontos

agrupados de situação perinuclear, normalmente em apenas um polo nuclear

• Relevâncias clínicas:– Em altos títulos: LES, Sjögren primária e outras

doenças auto-imunes sistêmicas como ataxia cerebelar e infecções virais por EBV e HIV

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Citoplasmático pontilhado pontos isolados

• Anticorpo anti-EEA1, antifosfatidilserina e anticorpo anti-GWB

• Descrição do padrão:– Pontos definidos de número variável por toda a

extensão do citoplasma• Relevâncias clínicas:– Anti-EEA1 e antifosfatidilserina: sem associação

clínica definida– Anti-GWB: associado a Sjögren primário

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Citoplasmático pontilhado fino denso

• Anticorpo antiproteína P-ribossomal e anti-PL7/PL12

• Descrição do padrão:– Fluorescência de finos, densos e confluentes pontos,

chegando quase a homogeneidade• Relevâncias clínicas:– Antiproteína P-ribossomal: específico do LES e pode

estar associado a quadros psiquiátricos– Anti PL7/PL12: raramente encontrados na

polimiosite

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Citoplasmático pontilhado fino

• Anticorpo anti-histidil t RNA sintetase (Jo1)• Descrição de padrão:– Pontos definidos em grande número e

densidade, célula em divisão e nucléolo não fluorescentes

• Relevâncias clínicas:– Marcador de Polimiosite no adulto– Descrito raramente na dermatomiosite

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Citoplasmático pontilhado reticulado

• Anticorpo anti-mitocôndria• Descrição do padrão:– Fluorescência em retículo por todo o citoplasma

• Relevâncias clínicas:– Pode sugerir a presença do anticorpo anti-M2

( antipiruvato desidrogenase), marcador da cirrose biliar primária

– Esclerose sistêmica

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Aparelho mitótico tipo centríolo

• Anticorpo antialfa-enolase

• Descrição do padrão:– Ponto fluorescente isolado na célula em repouso

que se divide em dois e migra ao polo oposto do núcleo à medida que a célula entra em divisão

• Relevância clínica:– Altos títulos sugestivo de esclerose sistêmica

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Aparelho mitótico tipo ponte intercelular

• Anticorpo antibeta-tubulina• Descrição do padrão:– Antígenos que formam a união entre células mãe

e filha ao final da telófase encontram-se fluorescentes

• Relevâncias clínicas:– Encontrado no LES e na Doença Mista do Tecido

Conjuntivo

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Aparelho mitótico tipo fuso mitótico

• Anticorpo anti-HsEg 5• Descrição do padrão:– Há decoração intensa e grosseira nos polos

mitóticos das células em divisão e as pontes intercelulares são positivas em telófase.

• Relevâncias clínicas:– Associado a diversas condições auto-imunes com

baixa especificidade

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Misto do tipo nucleolar homogêneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafásica decorada em anel

( cromossomos negativos)

• Anticorpo anti-KU

• Relevâncias clínicas:– Marcador de superposição de polimiosite e

esclerose sistêmica– Pode ocorrer tb no LES e esclerodermia

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Misto tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafásica positiva

• Anticorpo anti-topoisomerase I (Scl-70)

• Relevância clínica:– Associado a esclerose sistêmica forma difusa– Mais raramente pode ocorrer na síndrome CREST

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Misto tipo citoplasmático pontilhado fino denso a homogêneo e nucleolar homogêneo

• Anticorpo anti-RNP

• Relevância clínica:– Marcador do LES e freqüentemente direcionado

a quadros psiquiátricos.

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Misto tipo nuclear pontilhado fino com fluorescência do aparelho mitótico

• Anticorpo anti-NuMa1

• Relevância clínica:– Associado a Síndrome de Sjögren

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Importância do PAAC no diagnóstico das doenças auto-imunes

• Função para o clínico de teste de triagem na detecção de doença auto-imune

• Conforme seu padrão podemos relacioná-lo a determinados auto-anticorpos e dessa forma o clínico pode direcionar a pesquisa desses auto-anticorpos utilizando outros testes mais específicos

• Lembrando que após a utilização de células Hep-2 aumentamos a sensibilidade do teste

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ANTI-DNA

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Anti-DNA

• Alta correlação com a atividade do LES quando há comprometimento renal

• Os testes Anti-DNA em metodologia de IFI e Colorzyme® utilizando como substrato a Crithidia luciliae baseando-se no princípio de reação contra o cinetoplasto

• Devido a sua alta sensibilidade e especificidade essa metodologia é a mais utilizada mundialmente.

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Crithidia luciliae

• É um parasita flagelado unicelular • Não patogênico ao ser humano• Encontrado no sistema digestivo de insetos tipo

“moscas varejeiras”• Este microorganismo possui uma estrutura

privilegiada o cinetoplasto que é:– Uma mitocôndria gigante rica em ds-DNA

• Portanto é um substrato sensível e específico para detectar anticorpos anti ds-DNA

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Significado Clínico

• A presença de reação positiva para ds-DNA é uma forte evidencia da presença de LES com comprometimento renal

• Este teste faz parte do 10° critério de classificação do LES pelo American College of Rheumatology

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Objetivos do teste

• A pesquisa de anticorpos anti-DNA geralmente é utilizada como prova de segmento e diferenciação de diagnóstico de LES

• Realizado para diferenciação de padrão nuclear homogêneo em IFI com células Hep-2

• Utilizado para avaliação do grau de atividade da doença

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Princípio do teste- IFI

• Lâminas contendo 14 poços com Crithidia luciliae aderidas neles

• Coloca-se as amostras sorológicas em cada poço• Iniciando triagem com titulações de 1/20 para diagnóstico e

após se positivo repetir com mais titulações até 1/1280• Incubar por 30 minutos em camara úmida• Seguir com lavagens com tampão PBS• Após coloca-se o conjugado (anticorpo anti IgG humana ligado

a fluoresceína)• Incubar por 30 minutos em camara úmida• Seguir com lavagens com PBS• Aplicar glicerina e colocar as lamínulas

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IFI Anti-DNA

• Se presença de anti-DNA visualizamos fluorescência do cinetoplasto da Crithidia luciliae

• Lembrar que ele encontra-se posterior ao núcleo na base do flagelo

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ENA SCREENING, ENA 4 E ENA 6

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Ac Específicos-Detecção do ENA (Anticorpos Nucleares Extraíveis)

• Pode ser realizada através das seguintes técnicas:– Imunodifusão Dupla de Outcherlony (IDD) – ELISA ( antígenos específicos e screening )– IFI com substrato específico (Anti-DNA -

Crithidea Lucillae)– Western Blotting

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Método ELISA• Baseia-se na reação antígeno-anticorpo detectáveis através de reações

enzimáticas

• A enzima mais comumente utilizada nestas provas é a peroxidase, que catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2

• Existem vários modelos de testes de ELISA

• Em sua forma mais simples, chamada ELISA indireto, um antígeno aderido a um suporte sólido (placa de ELISA) é preparado;

• A seguir coloca-se sobre a placa os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antígeno.

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Método ELISA• Se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação

antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual é ligada à peroxidase.

• Este anticorpo anti-IgG, ligado à enzima denomina-se conjugado.

• Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto é, H2O2 dissolvida em uma substancia química que dá uma reação colorida quando H2O2 é desdobrada).

• Os orifícios onde ocorreu a reação antígeno-anticorpo apresentam uma coloração (variável dependendo do substrato).

• Por último , é realizada a leitura da placa em um espectofotômetro que faz a medida do comprimento de onda da cor da reação

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Detecção de Ac Específicos(ENA)

• Através do ELISA pode-se usar vários antígenos específicos como substrato para investigar a existência de um auto-anticorpo específico no soro de um paciente (anti-Ro, anti-La, Scl-70, Anti-RNP,Anti-ssDNA, Anti-dsDNA entre outros) ou usar um pool de anticorpos para realizar um screening.

• Os antígenos estão separados por kits, que contém o número de antígenos que cada kit contém: – ENA screening : Possui vários antígenos.– ENA – 4 : Possui 4 tipos de antígeno diferentes– ENA – 6 : Possui 6 tipos de antígeno diferentes– E outros testes com mais antígenos

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ENA

• Screening:– Método utilizado como triagem quando temos a IFI com Hep-2

positiva– Se positivo correlacionar com os dados clínicos e realizar o ENA-4– Consiste em :

1. colocar as amostras na placa de ELISA com vários anticorpos nucleares extraíveis

2. Incubar 30 minutos em temperatura ambiente3. Lavar por 3 vezes com solução de lavagem4. Acrescentar o conjugado e incubar por 15 minutos 5. Lavar por mais três vezes6. Incubar por mais 15 minutos após adição de substrato7. Adicionar solução STOP 8. Ler em 450 nm no espectofotômetro

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ENA

• ENA -4:– Imunoensaio enzimático imunométrico– Microplaca constituída por 3 módulos com 8 poços

cada revestidos com SS-A; SS-B; Sm; RNP-Sm– Teste que determina especificamente os anticorpos

que positivaram o PAAC e o ENA Screening• ENA- 6:– Imunoensaio enzimático imunométrico– Microplaca contendo além dos anticorpos do ENA -4

Jo 1 e Scl-70

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ANCA-AUTOANTICORPOS ANTICITOPLASMA DE NEUTRÓFILOS

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ANCA• São anticorpos direcionados contra constituintes citoplasmáticos de

neutrófilos e monócitos.• Testes para detectar ANCA são utilizados para fazer o diagnóstico e a

monitorização de atividade inflamatória de vasculites autoimunes de pequenos vasos :

– Granulomatose de Wegner – Poliangeíte Microscópica– Glomerulonefrite Necrotizante segmentar pauciimune (forma renal

de PAM)– Síndrome de Churg Strauss

• É melhor demonstrado nessas doenças usando uma combinação de IFI de neutrófilos normais de sangue periférico e ELISA (Enzmyme – linked immunosorbent assays) que detecta ANCA para PR3 (proteinase3) ou MPO (Mieloperoxidase).

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Correlação dos autoanticorpos relacionados ao ANCA e as patologias

• Pacientes com Granulomatose de Wegener produzem anticorpos :– anti-PR3(proteinase 3)

• Pacientes com poliangeíte microscópica, Churg-Strauss, poliarterite nodosa produzem anticorpos:– anti-MPO (mieloperoxidase)

Page 94: Autoimunidade PARTE 1

Quando solicitar ANCA

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Descrição do método de detecção do ANCA e seus Padrões

• Neutrófilos possuem grânulos citoplasmáticos contendo PR3 e MPO .

• Em lâminas com neutrófilos fixadas com etanol ocorre a migração dos grânulos contendo MPO para a Periferia do núcleo , gerando:– padrão P - ANCA

• O mesmo não acontece com os grânulos com PR3, que permanecem no citoplasma, gerando:– padrão C - ANCA

• Quanto fixados com formalina não ocorre distribuição de grânulos, estes sendo PR3 ou MPO continuam no citoplasma, resultando em um padrão C – ANCA em todas as vezes.

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• Neutrófilos contendo anticorpos contra outro antígeno que não o PR3 ou MPO , como por exemplo na RCUI apresentam padrão P – ANCA quando tratados com etanol, por isso são chamados P – ANCA Atípico.

• Tanto o padrão P-ANCA como o P-ANCA Atípico são artefatos e só ocorrem quando os neutrófilos são fixados com o etanol.

• Quando fixados com Formalina os neutrófilos adotam o padrão de fluorescência citoplasmática (C – ANCA ).

• Com exceção do P-ANCA Atípico que continua com padrão P-ANCA mesmo fixado com formalina.

• Quando temos um padrão ANA ao formol ,temos ausência de fluorescência devendo ser realizado IFI com Hep-2 para investigar anticorpos anti-antígenos nucleares

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Doenças que geram P-ANCA Atípico

• Doenças Inflamatórias Intestinal:– Colite Ulcerativa em 80% dos casos– Doença de Crohn

• Colangite Esclerosante Primária em 25% dos casos

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ETANOL

FORMALINA

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FATOR REUMATÓIDE-FR: DOSADO POR NEFELOMETRIA

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Fator Reumatóide - FR

• O termo FR engloba um grupo de autoanticorpos das classes IgG, IgA e IgM que têm em comum a capacidade de reagir com diferentes epítopos da porção Fc da IgG humana

• O FR IgM pode servir como marcador precoce da Artrite Reumatóide(AR

• O risco de desenvolvimento da doença aumenta de forma proporcional ao aumento de FR em indivíduos normais

• Está presente em 90% dos casos de AR clássicos, após seis meses de início da doença

• Pode está aumentado em 15-35% em pacientes com LES • Falso positivos variam de acordo com o método utilizado

para sua detecção

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Métodos para Diagnóstico

• Antigamente era mensurado utilizando-se a prova do látex, mais sensível, associado a técnica Waller-Rose mais específica

• Atualmente o método de pesquisa utilizado para detecção do FR é a nefelometria que é capaz de identificar as três classes :IgG, IgM e IgA, fornecendo valores numéricos em UI/ml.

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Princípio da Técnica

O FR se presente no soro irá promover a aglutinação de partículas de látex revestidas com gama-globulina humana presentes no reagente, promovendo um aumento da turbidez, que é determinado fotometricamente através do nefelômetro contra padrões conhecidos.

• Valor de referência normal < 20 UI/ml

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Nefelometria

• Técnica utilizada para medir concentrações no sangue ,LCR ou urina de várias proteínas como:– Imunoglobulinas : IgG, IgM e IgA– Fator Reumatóide– Complemento : C3, C4

• Mede a difração (desvio) da luz ao passar por uma solução contendo complexos imunológicos formados após reação de imunoprecipitação

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Nefelometria

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Nefelometria

Vantagens• É uma técnica precisa

• Rápida

• Fácil realização

• Totalmente automatizada

Desvantagens• Alto custo do anti-soro

• Podem surgir reações inespecíficas de soros lipêmicos :– Nescessidade de ultracentrifugar

a amostra para clarificá-la

• Necessidade de várias diluições para antígenos muito concentrados

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ANTI-CCP3

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Histórico Anti-CCP3

• Foi demonstrado em diversos trabalhos que anticorpos perinucleares (APF) e anti-queratina (AKA) são muito mais específicos para AR, embora hoje seja conhecido que eles reagem contra a filagrina nativa e passaram a ser tratados como anticorpos anti-filagrina (AFA).

• Em 1995, Sebbag e cols., demostraram que todos esses anticorpos eram direcionados para a citrulina contendo epítopos.

• A citrulina é um aminoácido não padrão, pois não é incorporado em proteínas durante a síntese protéica, sendo gerada via modificação pós-translacional de resíduos de arginina pela enzima arginina-peptidil-deaminase (PAD).

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• Em 1998, Schellekens cols. Descobriram que peptídeos lineares contendo citrulina eram muito específicos para anticorpos anti-AR (aprox.. 96%) em ensaio por método ELISA.

• Um artigo subsequente demonstrou que variantes cíclicas destes peptídeos, chamados peptídeos citrulinados cíclicos (CCP), eram igualmente específicos para AR, mas com maior sensibilidade que dos peptídeos lineares.

• Em 2007, a Liga Européia contra o Reumatismo (EULAR) publicou diretrizes para o diagnóstico precoce de AR, incluindo o Anti-CCP como o principal teste no diagnóstico precoce da Artrite Reumatóide.

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Importância Clínica do Anti-CCP3

• O anticorpo anti-CCP é um novo marcador sorológico para a AR, com utilidade diagnóstica e prognóstica que suplementa o FR.

• A sua importância fica realçada diante da tendência atual de tratar a AR mais cedo e mais agressivamente com agentes que modificam o curso da doença.

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Princípio do Método de detecção do Anti-CCP3

• O antigénio utilizado no teste QUANTA Lite™ CCP 3.1 IgG/IgA ELISA é um péptido sintético cíclico citrulinado que tem uma sensibilidade e especificidade elevada na detecção de anticorpos em doentes com AR.

• Este antigénio está ligado à superfície de uma placa de micropoços.• Os controles pré-diluídos e as amostras diluídas dos doentes são adicionados

aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos CCP IgG presentes se liguem ao antigénio imobilizado.

• A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgG/IgA anti-humano marcado a cada poço.

• Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços.

• Depois da segunda lavagem para retirar o excesso de conjugado, a restante atividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e medindo a intensidade da cor que se desenvolve.

• A intensidade da cor é feita por espectrometria, medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de controle.

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OBRIGADA!

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Referências Bibliográficas• Imunologia Celular e Molecular, ABBAS et al. Edição atual. 2• Pfrimer IAH, Francescantonio PL, Von Mühlen CA, et al. I Consenso Nacional

para a Padronização dos Laudos de FAN em Células HEp-2. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial 2002; 38 (3): 207-216.

• Damoiseaux JG, Tervaert JW. From ANA to ENA: How to proceed? Autoimmunity Reviews 2006; 5: 10-17.

• Dellavance,Alessandra;Júnior,Alexandre Gabriel;Nucciteli,Barbara,et al. 3º Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2 (FAN).Recomendações para padronização do ensaio de pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2,controle de qualidade e associações clínicas. Rev Bras Reumatol 2009;49(2):89-109

• www.alka.com.br/site/hotsite/autoimunidade/auto_antidna.asp• Savige et al.International Consensus Statement on Testing and Reporting of

Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies(ANCA).Imunopathology; Original Article.