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Aus der III.Medizinischen Klinik, Klinikum Bamberg,
Akademisches Lehrkrankenhaus der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Chefarzt Prof.Dr.Walter Schulz
KfH Nierenzentrum Bamberg
und dem
Institut für Nephrologie und Osteologie Bamberg
Der apo(a)-Polymorphismus und Lipoprotein(a)-
Spezifitäten beim terminal Niereninsuffizienten
Experimentelle Identifizierung neuer Phänotypen
Analyse der 5-Jahres-Mortalität zur Bewertung der klinischen
Relevanz
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
an der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorgelegt von
Holger Cura
aus Ebermannstadt
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Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof.Dr.med.Dr.h.c.Jürgen Schüttler Referent:
Prof.Dr.med..Walter Schulz Korreferent: Prof.Dr.med.Kai-Uwe Eckardt
Tag der mündlichen Prüfung: 24.06.2010
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Gewidmet
Meinem lieben Großvater
Ferdinand Kirchner
Geboren am 11.08.1913 Gestorben am 1.01.2007
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Inhaltsverzeichnis
Seite
Zusammenfassung ………………………………………………….1
Summary……………………………………………….…….……..3
1. Einleitung………………………………………………..5
1.1. Kardiovaskuläres Risiko von Dialysepatienten
...............................................5
1.2. Lipoprotein (a) – ein „neuer“ Risikofaktor…………………………………..
7
1.2.1.
Historie….........................................................................................................7
1.2.2. Genetik von Lipoprotein
(a)….........................................................................7
1.2.3 Struktur von Lipoprotein
(a)….........................................................................9
1.2.4. Mögliche Pathomechanismen………………………………………………..12
1.3. Offene Fragen im klinischen Kontext………………………………………..14
2. Materialien…………………………………………………15
2.1. ELISA………………………………………………………..……………….15
2.2. Phänotypisierung……………………………………………………………..15
2.3. Verwendete Einzelsubstanzen…….. …………………………………………16
2.4. Puffer………………………………………………………………………….16
2.5. Gele……………………………………………………………………………18
2.6. Geräte und Hilfsmittel…………………………………………………………19
2.7. Probengewinnung und –lagerung……………………………………………..20
2.7.1 Patientenkollektiv……………………………………………………………..20
2.7.2 Kontrollgruppe………………………………………………………………..20
2.8. Software……………………………………………………………………… 21
3. Methoden……………………………………………………22
3.1. ELISA………………………………………………………………………….22
3.1.1. Testprinzip..…………………………………………………………………… 22
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3.1.2. Testdurchführung……………………………………………………………….22
3.1.3. Konzentrationsbestimmung mittels
Spline-Approximation……………………24
3.2. Phänotypisierung………………………………………………………………..24
3.2.1. Testprinzip………………………………………………………………………24
3.2.2. Testdurchführung……………………………………………………………….25
3.2.2.1. Probenvorbereitung……………………………………………………………..25
3.2.2.2. SDS-PAGE….……………………………………………………………….….25
3.2.2.3. Diffusionsblot……………………………………………………………….…..28
3.2.2.4. Inkubation mit 1.Antikörper…………………………………………………….28
3.2.2.5. Inkubation mit 2.Antikörper…………………………………………………….29
3.2.2.6. Substratreaktion…………………………………………………………………29
3.2.2.7. Auswertung der
Nitrozellulosemembranen……………………………………..30
3.3. Statistische Verfahren…………………………………………………………..32
4. Ergebnisse…………………………………………………....33
4.1. Statistische Basisdaten…………………………………………………………..33
4.2. Experimentelle Optimierung der
Methodik……………………………………..35
4.3. Bestimmung der Lp(a)-Serumspiegel………………………………………...…37
4.3.1. Vergleich der Dialysepatienten mit den
Kontrollen……………………………..37
4.3.2. Subgruppenanalyse bei den
Dialysepatienten……………………………………41
4.3.3. Lp(a)-Spiegel in Abghängigkeit von Alter und
Geschlecht……………………...43
4.4. Phänotypisierung von apo(a)……………………………………………………..45
4.4.1. Anpassung der Nomenklatur……………………………………………………..45
4.4.2. Isoformenanzahl…………………………………………………………………48
4.4.3. Detektierte Phänotypen………………………………………………………….50
4.4.4 Isoformenfrequenz…………………………………………………………….…52
4.5. Zusammenhänge zwischen apo(a) Phänotyp und Lp(a)
Konzentration…….….54
4.5.1. Einfluß der Isoformenzahl auf die
Lp(a)-Konzentration…………………………55
4.5.2. Lp(a) Spiegel in Abhängigkeit des apo(a)
Molekulargewichts………………….55
4.5.3. Additiver Effekt von Isoformenzahl und
Molekulargewicht
auf die Lp(a)-Konzentration……………………………………………………...58
4.5.4. Risikoabschätzung für erhöhte Lp(a)-Spiegel mit Kenntnis
des Phänotyps……..60
4.6. Lp(a) nach Nierentransplantation unter Berücksichtigung
des apo(a) Phänotyps……………………………………………………………..61
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4.7. Kaplan-Meier-Analyse einer 5-jährigen
Nachbeobachtungsphase…………….63
4.7.1 Absolute Mortalität und kumulatives Überleben an der
Dialyse………………..63
4.7.2 Alter……………………………………………………………………………...6
4
4.7.3 Diabetes mellitus……………………………………………………………...…65
4.7.4 Klinisch apparente
Arteriosklerose…………………………………………...…66
4.7.5 Nikotinkonsum…………………………………………………………………..67
4.7.6 Lp(a)-Konzentration………………………………………………………….….68
4.7.7 Apo(a)-Molekulargewicht……………………………………………………….69
4.7.8 Risikoabschätzung…………………………………………………………….…70
5. Fallbeispiele…………………………………………………..71
6. Diskussion………………………………………………….....74
Literaturverzeichnis…………………………………………………87
Abkürzungsverzeichnis……………………………………………...97
Vorveröffentlichung………………………………………………....98
Anhang………………………………………………………………99
Danksagung………………………………………………………...110
Lebenslauf……………………………………………………….…111
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Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele:
Dialysepatienten unterliegen einem stark erhöhten
kardiovaskulären Risiko. Neben
sogenannten klassischen und dialysespezifischen Risikofaktoren,
sind aus jüngerer Zeit
weitere Parameter in den Blickpunkt gerückt, die möglicherweise
einen Einfluß auf die
Mortalität der Dialysepatienten haben. Einer davon ist
Lipoprotein (a), ein LDL-Partikel,
an den ein dem Plasminogen ähnliches Protein, das Apolipoprotein
(a), kovalent
gebunden ist. Apo(a) unterliegt einem ausgeprägten
Größenpolymorphismus. In
nierengesunden Kollektiven, insbesondere innerhalb
retrospektiver und
epidemiologischer Studien, zeigte sich eine enge Assoziation
zwischen Lp(a)-
Konzentration, apo(a)-Molekulargewicht und Atherosklerose. Der
klinische Stellenwert
von Lp(a) wird unterschiedlich gesehen, zumal es bisher wenige
prospektive Daten gibt
und keine Interventionsstudien mangels effektiver bzw.
praktikabler Therapieoptionen.
Methoden:
Wir untersuchten ein vergleichsweise großes Kollektiv von 251
Dialysepatienten, HD n =
210, PD n = 41, und bestimmten Lp(a) – Spiegel mittels ELISA
(Immuno) unter
Berücksichtigung des apo(a)-Größenpolymorphismus. Für die
apo(a)-Phänotypisierung
kam die SDS-PAGE mit anschließendem Westernblot zur Anwendung,
kein hoch
auflösendes, aber robustes Verfahren zur Bestimmung der
apo(a)-Phänotypen. 82
nierengesunde Patienten aus einer osteologischen Ambulanz
dienten als Kontrollgruppe.
Die 251 Dialysepatienten konnten 5 Jahre nachbeobachtet
werden.
Ergebnsisse:
Die Lipoprotein (a) Spiegel sowohl der Patienten wie auch der
Kontrollen zeigten eine
ausgeprägte Heterogenität mit identischer Varianz und
überwiegend niedrigen Lp(a)-
Konzentrationen im Sinne einer rechtsschiefen Verteilung.
Dialysepatienten zeigten im
Trend zwar höhere Lp(a)-Werte bezogen auf Mittelwert und Median,
jedoch nicht auf
Signifikanzniveau. Die Subgruppenanalyse identifizierte aber
Diabetiker, Patienten mit
manifester Arteriosklerose und postmenopausale Frauen als
Kollektiv mit signifikant
erhöhten Lp(a)-Spiegeln. Der Polymorphismus von apo(a) konnte
durch die
Phänotypisierung sowohl in der Patienten-als auch in der
Kontrollgruppe klar dargesetllt
werden. Es wurden insgesamt 13 verschiedene apo(a) - Isoformen
und in
unterschiedlichen Kombinationen 52 verschiedene Phänotypen in
der Patientengruppe
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identifiziert. Nachvollzogen werden konnte die inverse Beziehung
zwischen apo(a)-
Molekulargewicht und Lipoprotein (a) -Konzentration,
insbesondere in der
Kontrollgruppe. Dialysepatienten mit hochmolekularen apo(a) -
Isoformen sind deutlich
instabiler bezüglich zu erwartender Lp(a)-Spiegel . Hier scheint
es bisher ungeklärte
Einflüsse zu geben, die dialysespezifisch sind.
Bei 21 im Beobachtungszeitraum transplantierten Patienten zeigte
sich langfristig kein
signifikanter Einflüß auf den Lp(a)-Spiegel.
Eine Sonderrolle spielt offensichtlich eine kleine Gruppe (ca. 3
%) mit Phänotypen aus
3 und 4 Isoformen, die exzessiv hohe Lp(a)-Spiegel aufweisen.
Sie müssen als besondere
Risikogruppe eingestuft werden, zeigten sie doch in der
Kaplan-Meier-Analyse über 5
Jahre die geringste Überlebenszeit an der Dialyse. Prognostisch
bedeutsam, das zeichnete
sich hier in in der 5-Jahres-Analyse insbesondere bei
Langzeitdialysepatienten ab, ist das
apo(a)-Molekulargewicht, nicht der absolute Lp(a)-Spiegel.
Schlußfolgerung:
Im Vordergrund der zukünftigen Bemühungen sollte daher die
Identifizierung von
Patienten mit niedermolekularem apo(a) stehen. Mit größeren
Datensätzen könnten
bisherige Vermutungen möglicherweise besser statistisch belegt
werden und zu einem
verbesserten kardiovaskulären Risikomanagement beim
Dialysepatienten beitragen.
Es ist jedoch zu befürchten, daß wegen des relativ aufwändigen
Verfahrens und der
mangelnden spezifischen Therapieoptionen, die Methode
ausschließlich bei klinischen
Studien Anwendung findet. Eine für die breite Anwendung
praktikable Vision wäre ein
qualitativer Schnelltest, der außschließlich zwischen hoch- und
niedermolekularem apo(a)
unterscheiden kann.
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Summary
Background and Aims:
The cardiovascular risk in dialysis patients is increased
enormously. Recent
studies focused on new parameters beyond classical and dialysis
specific factors,
probably having an decisive influence on dialysis
patients´mortality. One of them
is lipoprotein (a), an LDL-particle, covalently bound to a
plasminogen-like
proteine, the apolipoprotein (a). The molecule size of
apolipoprotein (a) shows a
huge heterogenity, genetically determined. In groups with normal
kidney
function, especially within retrospective and epidemiological
studies, a strong
association between lp(a)-concentration, molecular weight of
apolipoprotein (a)
and atherosclerosis could be demonstrated. Based on rare
prospective and
without any interventional data material , the clinical
importance of lipoprotein
(a) especially in patients with renal failure is discussed
controversial.
Methods:
We investigated a comparatively huge collective of 251 dialysis
patients, HD n=
210, PD n = 41, and determined Lp(a) levels in consideration of
apo(a)
polymorphism. Lp(a) levels were measured through ELISA (Immuno),
apo(a)
phenotypes were detected by an SDS PAGE and following
Westernblot, not the
method of highest resolution, but reliable in use. A control
group of 82 patients
without renal disorder were recruited in an osteologic
outpatient department. All
251 dialysis patients were included in a five-year follow-up of
clinical observation
based on file data.
Results:
Lp(a) levels in dialysis patients as well in controls showed
distinctive heterogenity
with comparable variance and predominantly low lp(a)
concentrations, skewed
distribution to the right side. In dialysis patients there was a
trend to higher lp(a)
concentrations but not on a statistically significant level.
Though the analysis of
subgroups identified diabetics, patients with apparent
arteriosclerosis and women
in menopause as dialysis patients with significant elevated
lp(a) levels.
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Polymorphism of apo(a) could be described by phenotyping gene
products both in
patients and controls. 13 different isoforms and in various
combinations 52
different phenotypes were detected. Reproduction of the inverse
relation of
apo(a)-molecular weight and lipoprotein (a) concentration was
easier in control
group. Especially dialysis patients with high molecular weigth
apo(a) are less
reliable with regard to expected lp(a)-level. There might exist
unclear influences,
being specific for renal failure patients.
Obviously outstanding is a small subgroup (approx. 3 %) with
apo(a) phenotypes
consisting of 3 and 4 low molecular weight isoforms, showing
excessive high
lp(a) levels. They have to be classified as a high-risk group
with shortest survival
time under dialysis treatment. In the same Kaplan-Meier
analysis, but also
suspected by other authors, there is indication for the
predominant influence of
apo(a) molecular weigth, less the absolute lp(a) level, on
patients´ outcome.
Conclusion:
Coming efforts should concentrate on identifying dialysis
patients with low
molecular apo(a). Based on larger data files present assumptions
might be proofed
statistically leading to a better cardiovascular risk management
in dialysis
patients. Being a complex and costly method and for lack of
specific therapies,
apo(a) phenotyping is far away from laboratory routine. A
practicable vision
might be a simple qick test distinguishing high and low
molecular weight apo(a).
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1. Einleitung
1.1. Kardiovaskuläres Risiko bei Dialysepatienten
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind in Industrieländern
Todesursache Nummer
eins. Bei terminal niereninsuffizienten Patienten steigt das
relative Risiko an
einem kardiovaskulären Ereignis zu versterben exorbitant an. Die
Angaben in der
Literatur variieren stark von einem 10 – 1000 - fachem Risiko,
je nachdem welche
Größe und insbesondere Alterszusammensetzung das untersuchte
Kollektiv hatte.
[USRDS Annual Report, 2003]
Die Gründe für die hohe kardiovaskuläre Morbidität und
Mortalität sind
facettenreich und sowohl in der Einzel- wie auch Wechselwirkung
untereinander
bei weitem nicht verstanden, was erfolgreiche therapeutische
Bemühungen bis
dato stark limitiert. Hinzu kommt, dass Erkenntnisse und daraus
abgeleitete
Maßnahmen beim Nierengesunden sich nicht ohne weiteres auf
Nierenkranke
übertragen lassen.
Mögliche Ursachen beim Dialysepatienten lassen sich
differenzieren in einerseits
„traditionelle“ Risikofaktoren, die bei Niereninsuffizienten in
erhöhter Prävalenz
vorkommen und andererseits spezifische Risikofaktoren, die sich
aus der
Niereninsuffizienz oder Dialysebehandlung selbst ergeben.
Der Dialysepatient ist meistens alt, häufiger männlich, hatte
oder hat
Bluthochdruck, ist häufig Diabetiker, hat häufig eine
Fettstoffwechselstörung und
bewegt sich relativ wenig oder ist gar immobil. Diese Attribute
treffen für viele
Patienten zu und bestehen bereits als Hypothek, bevor man
sich
dialysespezifischen Faktoren zuwendet. [Wolfe et al.,1999]
Ohne hier ins Detail gehen und eine leicht ausufernde
Abhandlung
dialysespezifischer Risikofaktoren beginnen zu wollen, seien
exemplarisch einige
wesentliche Punkte angeführt.
Einen großen Stellenwert nimmt sicherlich der gestörte
Calcium-Phosphat-
Haushalt ein mit einer relativen Calcium-Überladung und
unzureichender
Phosphatelimination. Ein Charakteristikum ist die resultierende
Mediasklerose,
die zu einer prognostisch ungünstigen Gefäßsteifigkeit
führt.
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Mit der Hyperphospatämie eng vergesellschaftet ist der
Hyperparathyreodismus,
der einer Calcium-Freisetzung aus dem Knochen und den
Calcium-Shift in
Gefäßwand und Weichteilgewebe Vorschub leisten kann.
Häufig besteht eine erhebliche Anämie, die eine
Linksherzhypertrophie mit
entsprechend fatalen Konsequenzen fördert.
Urämietoxine, aber auch Fremdoberflächen von Kathetern,
Schläuchen,
Membranen sowie Pyrogene im Dialysat wirken als Trigger für
entzündliche
Reaktionen und oxidativen Stress, der eine Atherosklerose
begünstigt. [Wolfe et
al., 1999 Schüler A., 2008]
In den letzten Jahren vermehrt in den Mittelpunkt des Interesses
gerückt sind
„neuere“ Riskofaktoren wie Homocystein und das Lipoprotein
(a).
Die Erwartungen, durch medikamentöses Absenken des Homocysteins
das
kardiovaskuläre Risiko zu beeinfluusen, haben sich bisher nicht
erfüllt.
Ebenfalls schwierig gestaltet sich die Einschätzung des
Einflusses von
Lipoprotein (a). Mehrere Arbeiten aus den letzten Jahren mit
prospektiven
epidemiologischen Daten zeigen eine Assoziation zwischen hohen
Lipoprotein
(a)-Spiegeln und kardiovaskulären Erkrankungen und damit
verbundener erhöhter
Mortalität. Es gibt bisher allerdings keine Substanz oder
Methode, mit der man
den Lipoprotein (a)-Spiegel effektiv senken und somit den
Stellenwert des
vermeintlichen Riskofaktors interventionell überprüfen kann.
Die U.S. Preventive Services Task Force konnte sich nach
Sichtung einschlägiger
Literatur der letzten 15 Jahre in den neuesten Empfehlungen
nicht dazu
durchringen, Lipoprotein (a) bei Personen ohne positive
KHK-Anamnese als
relevanten prognostischen Faktor einzustufen. [Calonge et al,
2009]
Es stellt sich allerdings die Frage, ob der in der
Normalbevölkerung fraglich
bedeutsame Risikofaktor beim Dialysepatienten einen besonderen
Stellenwert
einnimmt oder gar, wie manche Untersuchungen suggerieren, ein
übersteigertes,
dialysespezifisches Problem darstellt.
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1.2. Lipoprotein(a) – ein „neuer“ Risikofaktor
1.2.1. Historie
Lipoprotein (a) wurde zum ersten mal von Berg im Jahre 1963 als
eine genetische
Variante des LDL (low density lipoprotein) beschrieben, um
später festzustellen,
daß es sich um ein eigenständiges Lipoprotein handelte. Bald
nach Entdeckung
hatte man durch qualitative Analysen festgestellt, daß erhöhte
Lp(a)-
Plasmakonzentrationen einen unabhängigen Risikofaktor für KHK
und
Myokardinfarkt darstellen. [Morrisett JD et al., 1987]
Im Jahr 1981 stellte Kostner et al. fest, daß bei
normolipidämischen, weißen
Personen eine Lp(a)-Konzentration über 30 mg/dl das relative
Risiko, einen
Herzinfarkt zu erleiden, 1,75 beträgt. Der Grenzwert von 30
mg/dl für Lipoprotein
(a) gilt bis heute und hat in den Befundbögen von Großlabors
weiter Bestand.
[Kostner GM et al.,1981]
1.2.2. Genetik von Lipoprotein (a)
Schon als Lp(a) entdeckt wurde, erkannte Berg, dass es sich um
ein genetisches
Merkmal handelt. Damals stand nur ein einfacher immunologischer
Test zur
Verfügung, der zwischen Lp(a)-positiven und Lp(a)-negativen
Individuen
unterscheiden konnte. Man nahm an, dass es sich bei Lp(a) um ein
qualitatives
Merkmal handelt, das autosomal dominant vererbt wird.
Durch empfindlichere Testmethoden fand man bereits in den 70 er
Jahren heraus,
dass Lp(a)-Plasmakonzentrationen in der kaukasischen
Bevölkerung
kontinuierlich verteilt sind, es also ein qualitatives, nicht
quantitatives Merkmal
sein muß. Die Konzentrationsverteilung ist extrem schief, wobei
ein Großteil der
Bevölkerung sehr niedrige Werte aufweist. Und die
Konzentrationsverteilung ist
im Unterschied zu anderen Lipoproteinen extrem breit. Die
Konzentrationsunterschiede liegen im 1000fachen Bereich (<
1,0 - > 400 mg/dl).
Unterwirft man menschliches Plasma einer reduzierenden
Behandlung, gefolgt
von einer SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese und einem Immunoblot
mit einem
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Anti-Apo(a)-Antikörper, so findet man bei verschiedenen
Personen
unterschiedlich große Formen von Apo(a).
Auf welche Weise die Größe der Apo(a)-Isoformen die
Plasmakonzentrationen
des Lp(a)-Partikels reguliert, ist letztlich ungeklärt. Eine
mögliche Ebene der
Regulation stellt die Transkription dar. Für eine signifikante
Beteiligung dieser
Ebene spricht das Vorhandensein unterschiedlicher Mengen von
Apo(a)-mRNA
in verschiedenen Individuen. Der Genort auf dem Chromosom 6q2.7
ist bekannt
und gekennzeichnet durch eine hohe molekulare Variabiltät, die
den Lp(a)-
Spiegel zum Großteil bestimmt. [Kraft HG et al, 1996]
Lipoprotein (a) gehört zu einer Überfamilie von Proteinen, die
im Laufe der Zeit
durch den Zugewinn beziehungsweise Verlust funktioneller Module
in
Genduplikaten entstanden sind. Etwa ein Dutzend dieser
Proteinfamilie haben mit
der Blutgerinnung zu tun, darunter Gerinnungsfaktoren VII, IX
und X,
Prothrombin und das Plasminogen. Anhand von Mutmaßungen über
die
Häufigkeit von Mutationen in der DNA schätzen einige Forscher,
daß sich die
Sequenzen für Apoliporotein (a) und Plasminogen erst seit etwa
40 Millionen
Jahren auseinanderentwickeln. Als man bei verschiedenen
Tierarten nach Apo(a)
suchte, war es nur zu finden bei Altweltaffen und Menschenaffen,
nicht bei
Nagern. Lediglich bei europäischen Igeln findet sich ein dem
apo(a) ähnliches
Protein. Die Tatsache, daß bei Kleinsäugern kein Lp(a) zu finden
ist, erschwert es
erheblich, Effekte von apo(a) in Tiermodellen zu untersuchen.
[Lawn R.M. et al.,
1992]
Durch Geschwister-Kopplungsanalyse war es möglich, den Einfluß
des Apo(a)-
Genortes auf die Lp(a)-Konzentration zu quantifizieren. Es lässt
sich damit
feststellen, welcher Anteil der Variation der
Lp(a)-Konzentration durch den
Apo(a)-Genort bestimmt und welcher Anteil durch andere Gene oder
durch
Umweltfaktoren reguliert wird. Dabei zeigte sich, dass über 90 %
der Lp(a)-
Konzentration durch das Apo(a)-Gen reguliert werden.
[Kraft HG and Utermann G, 1995]
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1.2.3. Struktur von Lipoprotein (a)
Lipide wie Cholesterol oder Triglyceride sind im Plasma
unlöslich. Sie müssen im
zirkulierenden Blutfluß von sogenannnten Lipoproteinen zu den
verschiedenen
Gewebezellen transportiert werden zur Energiegewinnung,
Fettspeicherung,
Hormonproduktion oder Gallensaftbildung. Lipoproteine bestehen
aus teils
veresterten, teils nicht verestertem Cholesterol, Triglyceriden,
Phospholipiden
und Protein. Der Proteinanteil in einem Lipoprotein wird als
Apolipoprotein oder
auch Apoprotein bezeichnet. Apoproteine dienen meist als
Cofaktor für Enzyme
und als Liganden an Rezeptoren.
Lipoproteine werden in fünf Hauptklassen eingeteilt:
Chylomikronen sind sehr große Partikel, die mit der Nahrung im
Darm
aufgenommene Fette transportieren
VLDL (very low densitiy lipoprotein) transportieren endogene,
also in der
Leber synthetisierte Triglyceride, und zu einem geringeren
Anteil
Cholesterin
IDL (Intermediate density lipoprotein) transportiert
Cholesterolester und
Triglyceride
LDL (low density lipoprotein) transportiert Cholesterinester
HDL (high density lipoprotein) transportiert
Cholesterinester
[Rosenson Robert S, 2009]
Lipoprotein (a) kann als ein LDL-Partikel betrachtet werden, das
zusätzlich zu
Apo B 100 ein weiteres Apolipoprotein, nämlich Apolipoprotein
(a) enthält.
Apo(a) ist über eine Disulfidbrücke an ApoB gebunden.
Apolipoprotein(a) ist ein
Glycoprotein und bestimmt entscheidend die unterschiedlichen
physikochemischen Eigenschaften im Vergleich zum LDL.
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Abb.1: Skizzenhafte Darstellung der Struktur von Lipoprotein
(a). An dem zentral
gelegenen LDL-Partikel sind kovalent gebunden die Apoliporoteine
B 100 und Apo(a),
dessen Kettenlänge durch die Anzahl der Kringle
IV-Wiederholungen bestimmt wird.
(Abbildung aus M.Helmhold, V.W.Armstrong, Risikofaktor Lp(a)
)
Durch cDNA-Sequenzierung konnte Lawn et al. 1987 feststellen,
daß
Apoliprotein (a) zu den sogenannten kringelhaltigen Proteinen
gehört.
Kringel sind Proteinmotive, die durch drei intramolekulare
Disulfidbrücken zu
einer charakteristischen Figur geformt werden, die an ein
dänisches brezelartiges
Gebäck gleichen namens erinnert. Ebenfalls zu den
kringelhaltigen Proteinen
gehört das Plasminogen, zu dem eine ausgeprägte Homologie
besteht. Der vierte
von insgesamt fünf Kringeln des Plasminogens findet sich beim
Apolipoprotein
(a) in vielfachen tandemartigen Wiederholungen. Bei Kringel IV
handelt es sich
um die fibrinbindende Domäne des Plasminogens.
Diese strukturelle Verwandtschaft führte zur Vermutung, beim
Lipoprotein (a)
könnte es sich um das lange gesuchte Bindeglied zwischen
thrombolytischem und
atherogenen System handeln. [Brunner C et al., 1993, Mc Lean JW
et al., 1987]
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Abb. 2 : Strukturvergleich von Apo (a) mit Plasminogen. Kringel
IV des Plasminogens
findet sich homolog im Apo (a) in variabler Wiederholung.
(Abbildung aus M.Helmhold, V.W.Armstrong, Risikofaktor
Lp(a))
Die Aminosäuresequenz von Apolipoprotein (a) bietet einige
verlockende
Deutungsmöglichkeiten für die normale physiologische Rolle des
Proteins. Eine
recht attraktive Spekulation besagt, daß Lipoprotein (a) bei der
Heilung verletzter
Blutgefäße hilft. Wenn ein Gefäß zerrissen oder durchbohrt ist,
stoppen
fibrinreiche Gerinnsel die Blutung zunächst provisorisch. Für
die eigentliche
Heilung müssen jedoch Zellen nachwachsen, die Cholesterin als
Bestandteil ihrer
Membran benötigen. Als plasminogen-ähnliches Protein, das an
cholesterin-
transportierendes LDL gebunden ist, könnte Apo(a) bei der
Wundheilung
förderlich sein. Wenn es die Fähigkeit zur Fibrinbindung
beibehalten hätte, wäre
es imstande , das Cholesterin genau zur rechten Zeit am
richtigen Ort abzuliefern.
Experimentell ist die Affinität von apo(a) zum Fibrin jedoch
deutlich schwächer
als beim Plasminogen.
Die vorteilhaften Eigenschaften standen wahrscheinlich im
Vordergrund, als
unsere Primatenvorfahren weitaus geringere Mengen an Cholesterin
im Blut
hatten als der moderne Mensch und der Tod durch Herzinfarkt
bei
-
Lebenserwartungen unter 40 Jahren keine Rolle gespielt hatte
bezüglich natürliche
Auslese. Neben der unklaren physiologischen Rolle entfacht die
strukturelle
Ähnlichkeit zum Plasminogen weitaus mehr eine Diskussion über
mögliche
Pathomechanismen bei der Entstehung der Arteriosklerose.
[Lawn R.M. et al, 1992, 1997]
1.2.4. Mögliche Pathomechanismen
Die strukturelle Verwandtschaft mit Plasminogen legt eine
Interaktion der
Fibrinolyse nahe mit kompetitiver Hemmung von Plasminogen an
Bindungsstellen von Molekülen und Zelloberflächen
[Loscalzo et al., 1999, Harpel et al.1989]
Lipoprotein (a) hemmt die Thrombolyse und verhindert somit die
Aktivierung von
TGF-ß, einem Hemmstoff der Zellproliferation in der
Gefäßwand.
[Loscalzo et al., 1999, Graininger et al., 1994]
Lp(a) steigert die Expression von interzellulärem
Adhäsions-Molekül 1, was zur
Rekrutierung von Monozyten an der Gefäßwand und Bindung an
Makrophagen
führt. Dies fördert Schaumzellbildung und Einschleusen von Lp(a)
in
atherosklerotischen Plaques.
[Zioncheck et al., 1991, Poon et al., 1997]
Der VLDL-Rezeptor auf den Makrophagen wird in
atherosklerotischen Läsionen
präsentiert, kann Lp(a) binden und den Abbau von Lp(a) durch
Endozytose
beeinflussen. Bei Patienten mit instabiler KHK werden größere
Mengen Lp(a) in
plaque-ständigen Makrophagen gefunden.
[Argraves et al., 2009]
-
Lp(a) bindet an das Endothel und Bestandteilen der
extrazellulären Matrix, hemmt
die vasodilatatorische Kapazität und fördert zumindest teilweise
die endotheliale
Dysfunktion
[Schachinger et al., 1997]
Abb. 3 : Schematische Übersicht beispielhafter möglicher
Pathomechanismen von
Lipoprotein (a). Lp(a) kann theoretisch auf mehrere Weisen
Erkrankungen der Gefäße
fördern. So konkurriert es möglicherweise mit dem Plasminogen um
Bindungsstellen an
Thromben und Plasminogen-Aktivatoren und behindert dadurch die
Thrombolyse. Ferner
können Reste alter Thromben in der Arterienwand und Lipoprotein
(a), das sich an die
extrazelluläre Matrix gebunden hat, den Zellen der Gefäßwand das
Signal zu
übermäßigem Wachstum geben. Schließlich werden Makrophagen , die
zu viel Lp(a)
aufnehmen, zu Schaumzellen, die Wachstumsfaktoren freisetzen und
dadurch das
Fortschreiten der Arteriosklerose fördern.
(Abbildung nach R.M. Lawn, Spektrum der Wissenschaft,
Sonderdruck, 1992)
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1.3. Offene Fragen im klinischen Kontext
Die pathogenetischen Überlegungen basieren zum Großteil auf
theoretischen
Modellen und in vitro-Daten. Die Einschätzung von Lipoprotein
(a) als
kardiovaskulärer Risikofaktor in der Normalbevölkerung beruht
ausschließlich
auf epidemiologischen Daten. Für die spezielle Patientengruppe
der
Dialysepatienten liegen diesbezüglich wenige Untersuchungen vor
mit
vergleichsweise geringen Fallzahlen.
Es gab in einigen Arbeiten lediglich Hinweise, dass
Dialysepatienten zu höheren
Lp(a)-Spiegeln neigen und hier eine mögliche, weitere Ursache
für das hohe
kardiovaskuläre Risiko zu suchen ist. [Kronenberg F. et al,
1995, Kimak E. et al,
2002, Longenecker JC et al, 2005]
Um in der Frage der klinischen Bedeutung von Lipoprotein (a)
weiterzukommen,
müssen Lp(a)-Konzentrationen systematisch gemessen werden, und
darf wegen
des starken genetischen Einflusses der
apo(a)-Größenpolymorphismus nicht
unberücksichtigt bleiben. Dafür ist eine Auftrennung der
Isoformen mittels
Elektophorese notwendig. Die aufwendige, sogenannte
Phänotypisierung mittels
Westernblot ist bis heute keine Routinemethode in
Großlabors.
Um entsprechende Daten zu bekommen, musste zunächst an unserem
Institut für
Nephrologie und Osteologie in Bamberg die Infrastruktur
geschaffen und eine
praktikable Messmethodik entwickelt werden.
Es sollte herausgefunden werden, ob und welche Dialysepatienten
höhere Lp(a)-
Spiegel haben und welche Rolle der Apo(a)-Größenpolymorphismus
dabei spielt.
Ziel sollte es auch sein, einschätzen zu können, welche
klinische Relevanz beim
Dialysepatienten von diesem Risikofaktor ausgeht.
Wenn bedeutsam, sollte die Methode es ermöglichen,
entsprechende
Risikopatienten in Zukunft zu identifizieren.
-
2. Materialien
2.1. ELISA
Immunozym® Test-Kit, hergestellt von Immuno AG, Wien
Bestehend aus:
Puffer-Konzentrat 10fach konzentriert: Tris/HCl, pH 8,
detergenshaltig
mit Stabilisatorprotein
5 Kalibratoren (Standards): lyophilsisiertes Humanserum
Kontrollseren „low level“ und „high level“ zur
Richtigkeitskeitskontrolle,
Lyophilisiertes Humanserum
Konjugat Anti-Apo(a)-Fab-Peroxidase: polyklonale, monovalente
Fab-
Fragmente vom Schaf, lyophilisiert
Substrat (Chromogen): Tetramethylbenzidin (TMB) in
Ethanol/DMSO
Substratpuffer: Acetatpuffer, pH 5,0 mit Wasserstoffperoxid
Stopplösung: Schwefelsäure 2 mol/l
2.2. Phänotypisierung
„Lp(a) Phenotyping“- Reagenziensatz zur Phänotypisierung von
Lp(a), hergestellt
von Immuno AG, Wien
Bestehend aus:
Anti Human Lp(a) Antikörper vom Schaf, lyophilisiert
Lp(a) Isoform Standard vom Menschen, lyophilisiert
Anti Schaf IgG (Fc)-alkalische Phosphatase-Konjugat vom
Kaninchen,
lyophilisiert
Lp(a) Probenpuffer: 0,06 mol TRIS/HCl, pH 8,6, SDS 6%, Glycerin
5%,
Bromphenolblau 0,002%
Phosphataseentwickler 5-Bromo-4-chloro-3-indoxylphosphat,
Nitroblautetrazolium
-
2.3. Verwendete Einzelsubstanzen:
Mercaptoäthanol
TRIS (Trishydroxymethyl-aminomethan)
HCl
Nitroblautetrazolium
5-Bromo-4-chloro-3-indoxylphosphat
alle von Merck, Darmstadt:
Rinderalbumin 99 % , kristallin
von Genaxxon Bioscience, Ulm
Der im Phänotypisierungs-Kit enthaltene Phosphataseentwickler
wurde teilweise
selbst hergestellt.
Zusammensetzung des Phosphataseentwicklers:
45 ml 0,1 mol TRIS-HCl, pH9,5
100 ul 2 mol MgCl2 (x 6 H2O)
5 ml 0,1 mol Nitroblautetrazolium in TRIS/HCl, pH 9,5
500 ul 0,1 mol 5 5-Bromo-4-chloro-3-indoxylphosphat, Na-Salz) in
TRIS-
HCl, pH 9,5
2.4. Puffer
Die elektrophoretische Trennung von Substanzgemischen erfolgt
bei einem genau
eingestellten pH-Wert und bei konstanter Ionenstärke des
Puffers. Die Ionenstärke
des Puffers wird möglichst niedrig gewählt, dann sind der Anteil
der Probeionen
am Gesamtstrom und damit ihre Wanderungsgeschwindigkeit genügend
hoch. Die
Pufferionen werden während der Elektrophorese ebenfalls – wie
die Probeionen-
durch das Gel transportiert: negativ geladenen zur Anode,
positiv geladene zur
Kathode.
-
TBS-Puffer:
20 mmol/l TRIS/HCl 7,5
0,5 mol/l NaCl
Blockierpuffer:
TBS-Puffer + 3% Rinderalbumin
Waschpuffer:
TBS-Puffer + 1 % Rinderalbumin
Diffusionspuffer:
25 mmol/l TRIS
0,2 mol/l Glycin
20 % Methanol
Für die Aufrechterhaltung konstanter pH- und Pufferbedingungen
müssen die
Volumina der Elektrodenpuffer-Vorräte genügend groß sein. Für
die horizontalen
Trennsysteme wurden kommerziell erhältliche Gel-Pufferstreifen
verwendet.
PhastGel® Pufferstreifen, hergestellt von Pharmacia, Uppsala,
Schweden:
Gel Material 3% Agarose IEF, Puffer 0,20 M Tricin, 0,20 M TRIS,
0,55 % SDS,
Maße 10 x 41 x 6 mm
-
2.5. Gele
Gele wurden nicht selbst gegossen, sondern für das
Elektrophoresesystem
PhastSystem® kommerziell erhältliche Mini-Gele mit Porengröße 4
– 15
verwendet:
PhastGel®: Polyacrylamidgel 4-15,
hergestellt von Pharmacia, Uppsala, Schweden
Puffer 112mM Acetat, 112 mM TRIS, pH 6,4, Maße 43 x 50 x 0,45
mm
Abb. 4 : Gele mit je nach Anwendung unterschiedlicher Porengröße
sind kommerziell
erhältlich. Das Gel ist hauchdünn (0,45 mm) auf einer
Kunsstoffplatte aufgetragen,
Luftdicht verpackt und gekühlt ist es mehrere Monate haltbar und
steht im Labor
jederzeit zur Verfügung. Aufwändiges Gießen entfällt, die
Qualität der Auftrennung
bleibt konstant.
-
2.6. Geräte und Hilfsmittel
PhastSystem®, Elektrophoreseeinheit von Pharmacia, Uppsala,
Schweden
Abb. 5 : Elektrophoreseeinheit Phastsystem ®. Links erkennt man
die horizontale
Trennkammer, die Platz für zwei Mikrogele bietet. Die Gele
werden auf die konstant
temperierten weißen Flächen gelegt. Die gewünschten
Untersuchungsbedingungen
können über die Menüsteuerung (in der Mitte) eingegeben werden.
Für automatisierte
Direktfärbungen, die wir nicht benötigten, ist eine Färbekammer
(rechts) vorgesehen.
MicroReader®, ELISA Auswertephotometer von MSE, Münster
pH-Meter, zumTitrieren der Pufferlösungen von PCE, Meschede
Trockenschrank von Thermo Scientific, Karlsruhe
Scanner ScanLide200 von Canon Inc, Japan
Pipetten von Eppendorf, Wesseling-Berzdorf
-
Petrischalen, Messzylinder, Reagenzgläser von Schott, Mainz
Küvetten von Sarstedt, Nürnbrecht
Nitrozellulose von Hofer, USA
Parafilm M von Brand, Wertheim
2.7. Probengewinnung und Lagerung
2.7.1. Patientenkollektiv
Zur Probengewinnung wurden 251 Patienten aus 3 verschiedenen
Dialysezentren
rekrutiert. Das Blut wurde im Dialyezentrum vor Dialysebeginn im
Rahmen der
Routinekontrollen abgenommen, zentrifugiert und das erhaltene
Serum
tiefgefroren. Nach Transport in das Institut für Nephrologie und
Osteologie in
Bamberg wurden die Proben bei – 21 °C gelagert . Die
Rekrutierungsphase
erstreckte sich über 12 Monate.
In der Nachbeobachtungsphase über 5 Jahre wurden darüber hinaus
Serumproben
bei inzwischen transplantierten Patienten gewonnen, die sofort
bearbeitet wurden.
2.7.2. Kontrollgruppe
Als Kontrollgruppe wurden Patienten aus der osteologischen
Ambulanz im
Klinikum Bamberg ausgewählt. Einschlusskriterien waren ein
normales Serum-
Kreatinin sowie das Nicht-Vorhandensein einer diabetischen
Stoffwechsellage.
Im Zeitraum von 12 Monaten konnten 82 Patienten rekrutiert
werden.
Die Seren wurden im gefrorenen Zustand ins Institut für
Nephrologie und
Osteologie transportiert und bei – 21 °C gelagert.
-
2.8. Software
Die Konzentrationsberechnung von Lp(a) erfolgte rechnergestützt
mit
SYNELISA® von Elias Medizintechnik, Freiburg, Deutschland
Datenauswertung sowie sämtliche statistische Testverfahren
wurden durchgeführt
mit SPSS ®, Version 16.0 Advanced von SPSS, Chicago, USA
Literaturrecherche und Archivierung wurde erleichtert durch
REFERENCE MANAGER ®, Professional Edition Version 11, von
Thomson ISI
Research Software, New York, USA
Textverarbeitung erfolgte mit WORD® , Version 2002, von
Microsoft,
Redmond, USA
-
3. Methoden
3.1. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
3.1.1.Testprinzip
Immunozym® Lp(a) ist ein Einschritt-ELISA nach dem
Sandwich-Prinzip.
Vertiefungen der ELISA-Teststreifen sind mit monospezifischen,
polyklonalen
Antikörpern gegen Apo(a) beschichtet. Verdünnte Proben werden
zusammen mit
dem Konjugat inkubiert. Das Konjugat besteht aus einem
monospezifischen,
gegen Apo(a) gerichteten Fab-Fragment, das mit Peroxidase
gekoppelt ist (Anti-
Apo(a)-Peroxidase-Konjugat). Während der Inkubationszeit werden
Lp(a)-
Partikel und freies Apo(a) an die Festphase gebunden und
gleichzeitig durch das
Konjugat markiert. Unspezifische Probenbestandteile und
ungebundenes
Konjugat werden in einem Waschschritt entfernt. Im zweiten
Inkubationsschritt
erfolgt die Substratreaktion, die durch anschließende Zugabe von
Schwefelsäure
gestoppt wird. Die jetzt entstandene Farbentwicklung ist der
Lp(a)-Konzentration
der Probe direkt proportional. Bei einer Wellenlänge von 450 nm
wird die
Extinktion in einem ELISA-Reader (Vertikalphotometer) gemessen.
Über eine
Bezugskurve wird die Lp(a)-Konzentration in der Probe
quantitativ bestimmt.
3.1.2. Testdurchführung
Vor Beginn werden alle Testkomponenten auf Raumtemperatur
gebracht (ca. 23
°C). Aus dem Puffer-Konzentrat wird durch Verdünnung mit Aqua
dest. im
Verhältnis 1:9 der Arbeitspuffer hergestellt. Der Arbeitspuffer
wird anschließend
benötigt, um die mitgelieferten Kalibratoren und Kontrollproben
zu
rekonstituieren. Jeweils 200 ul Pufferlösung wird mit den
Kontroll- und
Kalibrator-Lösungen 15 min. inkubiert und anschließend
vermischt.
Kalibratoren, Kontrollen und Patientenproben müssen jetzt weiter
verdünnt
werden. 5000 ul Arbeitspuffer wird vorgelegt und 10 ul Probe,
Kontrolle und
Kalibrator dazupipettiert (1:500) und gemischt.
-
Als nächstes wird die Konjugat-Stammlösung hergestellt. 1,3 ml
Arbeitspuffer
werden 15 min.mit dem lyophilisierten Konjugat rekonstituiert.
Die im Test
verwendete Konjugatlösung ist eine mit Arbeitspuffer verdünnte
Stammlösung im
Verhältnis 1:10.
Im Testkit enthalten sind Teststreifen mit jeweils 8
Testvertiefungen, die
beschichtet sind mit affinitätsgereinigtem, monospezifischen,
polyklonalen Anti-
Apo(a)-Antikörper vom Schaf.
In diese Testvertiefungen wird nun 100 ul Konjugat-Lösung
vorpipettiert. Pro 8er
Teststreifen werden 100 ul der 2 verdünnten Kalibratoren, der
verdünnten
Kontrollen und verdünnten Patientenproben zügig dazupipettiert.
Die Teststreifen
werden mit der mitgelieferten Klebefolie abgedeckt. Bei
Raumtemperatur
inkubieren die Ansätze 120 min.
Die Vertiefungen werden anschließend mit jeweils 2 x 200 ul
Arbeitspuffer
ausgewaschen. Nach dem letzten Waschvorgang werden die
Vertiefungen
leergesaugt und durch Klopfen auf saugfähigem Papier
getrocknet.
Im nächsten Schritt wird die Substratreaktion eingeleitet durch
Hinzupipettieren
von 200 ul Substratlösung in die Testvertiefungen. Der
Teststreifen wird erneut
mit Folie abgeklebt. Die Inkubationszeit beträgt jetzt bei
Raumtemperatur nur 30
min. Die Komplexbildung wird abgebrochen durch Zugabe von
jeweils 50 ul
Stopplösung (Schwefelsäure 2 mol/l).
Die jetzt entstandene Trübung kann genutzt werden zur
Konzentrationsbestimmung mit einem Photometer. Die Messung
erfolgt innerhalb
von 10 min. nach Stoppen der Reaktion mit einem
Vertikalphotometer
(MicroReader®) bei 450 nm Wellenlänge.
Da die ermittelte optische Dichte direkt proportional zur
Lp(a)-Konzentration der
mitgelaufenen Kalibratoren ist, können die Lp(a)-Serumspiegel
der
Patientenproben über die ermittelte Standardgerade berechnet
werden.
-
3.1.3. Konzentrationsbestimmung mittels Spline-Approximation
Die Konzentrationsbestimungen erfolgen softwaregestützt über
eine sog. Spline-
Approximation. Dabei handelt es sich um ein mathematisches
Verfahren, bei dem
über mindestens 4 bekannte Punkte einer Kurve der
Kurvenverlauf
annäherungsweise bestimmt werden kann. In unserem speziellen
Fall, wird über
bekannte Lp(a) – Konzentrationen in Standardlösungen die
Lp(a)-Konzentration
der Probe ermittelt. Die Messung der Standardlösung dient dabei
auch der
Qualitätskontrolle der Messung insgesamt.
3.2. Phänotypisierung
3.2.1. Testprinzip
Lp(a) ist eine Plasmafraktion, die LDL und eines, möglicherweise
zwei Kopien
eines hoch glykosilierten Antigens Apo(a) enthält, das an Apo B
100 durch
Dislfidbrücken gebunden ist. Nach Reduktion der Plasmaproben und
damit Lösen
der Disulfidbrücke werden die Lp(a)-Isoformen entsprechend
ihrem
Molekulargewicht in einem 4-15 % Polyacrylamidgel
elektrophoretisch getrennt.
Die so getrennten Proteine werden auf Nitrozellulosemembranen
transferiert.
Nach Blockieren der freien Reaktionsstellen wird als
1.Antikörper ein
polyklonaler Anti Lp(a) Antikörper vom Schaf an die jeweiligen
Apo(a)
Isoformen gebunden. Nach Auswaschen des überschüssigen
1.Antikörpers wird
als 2.Antikörper ein Anti Schaf IgG, welches mit alkalischer
Phosphatase
konjugiert ist, an den 1.Antikörper gebunden und anschließend
mit Substrat
behandelt, bis die Banden sichtbar werden.
-
3.2.2. Testdurchführung
3.2.2.1. Probenvorbereitung
Der Lp(a) Probenpuffer wird auf Raumtemperatur gebracht. Durch
gelegentliches
Schütteln wird das SDS aufgelöst. Es wird ein Standardansatz
hergestellt aus 10
ul Serumprobe bzw. Standardlösung, 85 ul Probenpuffer und 5
ul
Mercaptoäthanol. Zur Reduktion der Proben inkubiert man den
Reaktionsansatz in
den verschlossenen Küvetten für 10 min. bei Raumtemeperatur.
3.2.2.2. Elektrophorese
Für die elektrophoretische Auftrennung der Lp(a)-Isoformen steht
die
Elektrophoreseeinheit PhastSystem® von Pharmacia zur Verfügung.
Für dieses
System sind kommerziell erhältliche SDS-Agarose-Gelplatten
erhältlich in
unterschiedlichen Graduierungen, je nach Einsatzgebiet. Für
Lipoprotein (a) wird
der Typ 4-15 benötigt. Die Gele sind auf quadratischen
Kunststoffrägern in einer
45 mm dünnen Schicht aufgetragen und werden luftdicht verpackt,
gekühlt
geliefert.
Die Elektrophorese läuft unter Standarbedingungen ab und am
Gerät über
entsprechende Menüführung eingestellt werden:
Umax = 250 V
Imax = 10 mA
Pmax = 3 W
Temperatur + 15 °C
Laufzeit ca. 70 min., nach Erreichen von 200 VAh
Das Gerät gibt ein akustisches Signal, wenn der Boden der
Trennkammer, auf
den die Gele aufgelegt werden, die erforderlichen 15 °C erreicht
hat . Erst dann
kann die Elektrophorese in Gang gesetzt werden. Eine
versehentliche
Denaturierung der stark thermolabilen Proteine wird so sicher
verhindert.
-
In speziellen Aussparungen an der Kathoden- und Anodenseite
werden die
ebenfalls gekühlten Pufferblöcke eingebracht.
Nach erfolgreicher Gerätevorbereitung müssen die Proben auf das
Gel
aufgetragen werden. Hierfür werden vom Hersteller entsprechende
Utensilien zur
Verfügung gestellt, die den Vorgang vereinfachen und
Fehlerquellen weitgehend
minimieren.
Auf einer Kunststoffschablone mit 8 Vertiefungen wird ein
Paraffinfilm geprägt,
der die Kontur der Schablone annimmt. In die Vertiefungen des
Films werden 2 ul
der in 3.2.2.1. beschriebenen Probenansätze hineinpipettiert. Da
die
Identifizierung der Isoformen später nur über einen
mitgelaufenen Standard
erfolgen kann , läßt man 3 Standards mitlaufen in Nachbarschaft
zu den
Patientenproben. In die 8 Vertiefungen werden die Proben und
Standards nach
folgendem Muster hineinpipettiert:
1 2 3 4 5 6 7 8
Patient Standard Patient Patient Standard Patient Standard
Patient
Für die Übertagung der Proben stehen kleine
Kunsstoffapplikatoren zur
Verfügung, die an der Unterseite Zähnchen haben im Abstand der
mit den Proben
gefüllten Vertiefungen. Der Applikator wird über den Proben
ausgerichtet und die
Oberfläche vorsichtig berührt. Die Kapillaren des
Probenapplikators füllen sich.
Anschließend wird der Applikator an der Elektrophoreseeinheit an
der
Anodenseite über eine Führungschiene vertikal eingeschoben. So
ist ein optimale
Ausrichtung und Kontakt zur Geloberfläche gewährleistet.
-
Abb. 6 : Für den exakten Auftrag der Proben stehen
Kunsstoffapplikatoren zur
Verfügung, deren Zähnchen an der Unterseite in vorpipettierte
Vetriefungen eingetaucht
werden. Eine klar definierte Menge der Probenlösung bleibt
hängen und wird durch
Kapillarkräfte angesaugt. Die Applikatoren können vertikal in
die Trennkammer
eingeschoben werden und haben Kontakt zur Geloberfläche, in die
die Probenlösung
dann diffundieren kann.
Der Deckel der Trennkammer wird geschlossen und der
Elektrophoresevorgang
gestartet.
Nach etwa 70 min. sind die 200 VAh erreicht und kann der Vorgang
beendet
werden.
Was jetzt folgt, ist der diffizilere Schritt der Übertragung auf
eine
Nitrozellulosemembran, das sog. Blotting.
Hier gab es zwei methodische Alternativen: Erstens das sog.
Elektroblotting, bei
dem nach horizontaler Auftrennung die Proteinübertragung auf
die
Nitrozellulosemembran durch eine Plattenelektrode in vertikaler
Richtung erfolgt.
Diese Methode hatten wir zunächst favorisiert, da wir uns eine
höhere
„Proteinausbeute“ und somit qualitativ bessere Ergebnisse
erhofften.
In mehreren Versuchsreihen kam es zu starken Artefaktbildungen
mit verzerrten
und verschobenen Bandenmustern. Die Ergebnisse waren nicht
brauchbar und die
Methode wurde verlassen.
-
Zuverlässiger funktionierte das sogenannte Diffusionsblotting,
bei dem eine
Nitrozellulosemembran auf das Gel aufgelegt und in einer
feuchten Kammer bei
ca. 75 °C inkubiert wird.
3.2.2.3. Diffusionsblot
Nach erfolgter Elektrophorese wird eine Nitrozellulosemembran
kurz in
Diffusionspuffer eingetaucht und auf das Gel aufgelegt. Es
stehen kommerzielle
verschließbare Plastikschachteln zu Verfügung, in die das
„Sandwich“
hineingelegt werden kann. Die Gele bzw. die Membranen trockneten
zu stark und
die Übertragungsergebnisse waren nicht zufriedenstellend.
Bessere Erfahrungen
haben wir mit Petrischalen gemacht, die wir mit handelsüblicher
Frischhaltefolie
luftdicht verschlossen haben. Gibt man noch einige Tropfen
Diffusionspuffer
hinzu, hat man eine perfekte feuchte Kammer und ein Austrocknen
wird sicher
verhindert.
Die Prozedur sollte 45 – 50 Minuten bei 75 °C im Trockenschrank
durchgeführt
werden. Danach muß die Nitrozellulosemembran 1 Stunde mit
Blockierpuffer
behandelt werden.
3.2.2.4. Inkubation mit 1.Antikörper
Das Fläschchen mit dem Antikörper gegen humanes Lp(a) wurde
nach
Anweisung rekonstituiert. Das erhaltene Lyophilsat muß in
Waschpuffer im
Verhältnis 1 : 500 verdünnt werden. Für eine Membran empfiehlt
es sich 40 ul
Antikörperlösung mit 20 ml Waschpuffer in einer Petrischale zu
vermischen. Aus
Kostengründen hatten wir eine Versuchsreihe mit halber
Antikörpermenge
gestartet, die jedoch insbesondere bei Proben mit geringer
Lp(a)-Konzentration zu
unbrauchbaren Ergebnissen führte.
Die Membran wird in die mit Antikörperlösung befüllte
Petrischale gelegt und auf
dem Probenmischer ca. 1 Tag lang inkubiert. Nach
Herstellerangabe liegt die
minmale Inkubatioszeit bei 2 Stunden. Für eine optimale Qualität
lohnt es aber,
sich bei diesem Schritt Zeit zu nehmen.
-
Am Folgetag wird die Membran in einer neuen Petrischale mit je
20 ml
Waschpuffer für 2 mal 10 Minuten gewaschen. Die restlichen
freien Antikörper
sind damit entfernt.
.
3.2.2.5. Inkubation mit 2.Antikörper
Der am Lp(a) haftende 1.Antikörper vom Schaf muß jetzt markiert
werden durch
einen 2.Antikörper. Die rekonstituierte Lösung mit dem Anti
Schaf IgG (Fc), an
den auch die alkalische Phosphatase für die spätere Farbreaktion
gebunden ist,
wird wie im Schritt zuvor zunächst mit Waschpuffer auf 1 : 500
ml verdünnt. Dies
entspricht, wie oben, 40 ul Antikörperlösung in 20 ml
Waschpuffer. In dieser
Lösung wird die Nitrozellulosemembran für 1 Stunde inkubiert. Es
folgt ein
Waschgang über 10 Minuten mit Waschpufferlösung. Bevor die
Membran
entwickelt werden kann, wird sie äqulibriert mit TRIS-Puffer bei
einem pH von
9,5.
3.2.2.6. Substratreaktion
Im Bestimmungs-Kit des Herstellers werden 10 Fläschchen des
Phosphataseentwicklers mitgeliefert. Nach Aufbrauchen der
Entwicklerlösung
war stets Antikörperlösung übrig, die weitere Probenbestimmungen
möglich
machten. Wir gingen dazu über, die Entwicklerlösung auch selbst
herzustellen
(siehe dazu Punkt 2.1.).
Der pulverisierte Phosphataseentwickler wird im Fläschchen nach
Vorschrift mit
2 ml Aqua dest. rekonstituiert und anschließend mit Aqua dest.
auf insgesamt 20
ml verdünnt. Wie bereits beim 1.Antikörper, lohnt es sich auch
hier nicht, aus
Kostengründen Material zu sparen und es mit niedrigeren
Konzentrationen zu
probieren. Mehr Phosphataseentwickler bringt eine bessere
Absättigung der
Bindungsstellen und somit bessere Färbeergebnisse. In der Regel
reichen 15 – 30
min. Bad in der Lösung, bis Banden sichtbar werden. Nach fast
zwei Tagen Arbeit
ist dies der entscheidende Moment, der zeigt, ob man korrekt
gearbeitet hat.
-
Die Membranen werden in reichlich Aqua dest. 3 mal für je 5 – 10
min.
gewaschen und anschließend an der Luft getrocknet. Zum Schutz
und zur
Archivierung werden sie in verglaste Diarähmchen
eingespannt.
3.2.2.7. Auswertung der Nitrozellulosemembranen
Die mitgelieferten Standards sind der Anhaltspunkt für die
qualitative Beurteilung
der entwickelten Nitrozellulosemembran. Alle 5 Standardbanden
müssen sichtbar
sein. Wünschenswert und eine Auswertung erleichtert es, wenn die
Banden
weitgehend parallel ausgerichtet sind. Die ermittelten Banden
können so den
Standards zugeordnet werden. Grundlage für die Auswertung bildet
die
Nomenklatur nach G.Utermann. Banden die in der Position von Apo
B 100 zu
Liegen kommen werden als B bezeichnet.. Formen, die auf Grund
ihres größeren
Molekulargewichts verzögert wandern, liegen kathodenwärts und
werden mit S1,
S2, S3, S4 usw. bezeichnet (S für „slow“). Niedermolekulare
Formen, die leichter
als die der entsprechenden B-Bande sind, kommen anodenwärts zu
liegen und
werden als F1, F2 usw. bezeichnet ( F für „fast“).
-
+
_
Abb. 7: Die Abbildung zeigt den Phänotyp der mitlaufenden
Standardlösung mit den
Isoformen S4, S3, S2, S1 und F. Die langsamste Isoform S 4
(„slow“) kommt
kathodennah (-) zur Darstellung, die schnellste, sog. F-Bande
(„fast“) wandert am
weitesten anodenwärts (+). Die Banden der Standardlösung bilden
die Referenzpunkte für
die Bestimmung der apo(a)-isoformen in den Proben
Die Auswertung erfolgt rein visuell und qualitativ. Ein Problem
ist die kleine
Größe der Membranen von etwa 4 cm und entsprechend kurze
Wanderstrecke der
Banden von max. 8 mm. Abfotografieren und Abscannen der
entwickelten
Bandenmuster mit entsprechenden Vergrößerungs- und
Nachbearbeitungsmöglichkeiten erleichtert die Arbeit.
Neben der rein qualitativen Auswertung versuchten wir eine
quantitative
Bestimmung aus der Dichte bzw. Fläche der Bande abzuleiten.
Hierzu musste die
Nitrozellulosemembran transparent gemacht werden um mit
Durchlicht-Scanning
arbeiten zu können, wie man es von anderen
Elektrophoresemethoden kennt. Die
Nitrozellulosemembran wird dabei mit einigen Tropfen
Polymerlösung zwischen
-
zwei passend geschnittene PVC-Folien gelegt. Dieses Sandwich
wird mit einer
UV-Lampe für wenige Sekunden bestrahlt, was die Polymerisation
einleitet. Die
Membran wurde transparent, allerdings litt die Qualität der
Proteinbanden
deutlich unter dieser Methode, sodaß wir Durchlicht-Scanning
nicht weiter
anwendeten .
3.3. Statistische Verfahren
Die Datenauswertung erfolgte softwaregestützt.
Daten unverbundener Stichproben wurden geprüft mit dem
Mann-Whitney U-test
und Chi-Quadrat-test. Verbundene Stichproben wurden geprüft mit
dem
Wilcoxon-Test. Korrelationen wurden berechnet mit dem bivariaten
Test nach
Pearson. Es wurden Überlebensanalysen nach Kaplan-Meier
durchgeführt sowie
ein multivariates Rechenmodell angewandt mittels Cox -
Regressionsanalyse.
-
4. Ergebnisse
4.1.Statistische Basisdaten
In die Untersuchung eingegangen sind 251 Dialysepatienten aus 2
ambulanten
Dialyseeinrichtungen und 1 Kliniksdialyse. Als Kontrollgruppe
fungierten 82
nierengesunde Nicht-Diabetiker aus einer
osteologisch/rheumatologisch
orientierten Kliniksambulanz.
Die Geschlechterverteilung war in der Kontrollgruppe ausgewogen
(43 Frauen vs.
39 Männer, entsprechend 52,4 % vs. 47,6 %), in der Dialysegruppe
waren die
Männer in der Überzahl (165 Männer vs. 86 Frauen . bzw. 65,7 %
vs. 34,3 % ),
repräsentativ für die Situation bei terminal
Niereninsuffizienten im allgemeinen.
Das mittlere Alter lag in der Patientengruppe bei etwa 57
Jahren, in der
Kontrollgruppe bei etwa 55 Jahren.
In der folgenden Übersicht sind die Daten zu Alters- und
Geschlechtverteilung
nochmals detailliert dargestellt.
Dialysepatienten Kontrollen
165 Männer 86 Frauen 39 Männer 43 Frauen
27 – 89 Jahre 24 – 83 Jahre 18 – 77 Jahre 28 – 77 Jahre
56,71 (57,0)
2 Jahre 57,2 (61,0) Jahre 50,4 (56,0) Jahre 61,4 (64,0)
Jahre
1Mittelwert, 2 Median
Tabelle 1: Basisdaten über Alters- und Geschlechterverteilung in
der Patienten- und
Kontrollgruppe
Die Gruppe der terminal Niereninsuffizienten bestand aus 210
Hämodialyse-
(83,7 %) und 41 Peritonealdialysepatienten (16,3 %). Die Spanne
der
Behandlungsdauer betrug 1 Monat bis etwa 17 Jahre, im Mittel
waren die
Patienten zum Zeitpunkt der Blutentnahme 3 Jahre an der
Dialyse.
-
Bei den zugrunde liegenden Grunderkrankungen machten die
chronischen
Glomerulonephritiden etwa ein Drittel des Patientengutes aus.
Die diabetische
Nephropathie war mit rund 20 % Anteil vergleichsweise gering
vertreten.
Zusammen mit den anderen Erkrankungen ergab sich ein
heterogenes
Patientengut, vergleichbar mit dem anderer
Dialyseeinrichtungen.
Aufgrund des Metabolismus und Struktur von Lipoprotein (a)
spielen
Komorbiditäten möglicherweise eine Rolle. Nach Aktenlage wurden
Diabetiker
und Leberzirrhotiker identifiziert. Von Interesse waren
insbesondere auch
Patienten mit bereits klinisch manifester Arteriosklerose. Als
Kriterium galten
hier ein durchgemachter Herzinfarkt oder Schlaganfall, aber auch
bereits
bestehende, hämodynamisch relevante duplexsonographische und
angiographische Befunde an Carotiden, Coronarien und
Beinarterien.
Behandlungsart:
Hämodialyse 83,7 % (n = 210)
Peritonealdialyse 16,3 % (n = 41)
Mittlere Behandlungsdauer (Spannbreite) 36 Monate (1 – 201)
Grunderkrankungen :
Chronische Glomerulonephritis 34,7 % (n = 87)
Diabetische Nephropathie 19,5 % (n = 49)
Chronisch interstitielle Nephritis 12,0 % (n = 30)
Refluxnephropathie 5,6 % (n = 14)
Zystische Nierendegeneration 7,2 % (n = 18)
Hypertensiv-vaskuläre Genese 6,0 % (n = 15)
Z.n. Akutem Nierenversagen 2,8 % (n = 7)
Malignom 1,6 % (n = 4)
Unklare Ursache 10,8 % (n = 27)
Komorbiditäten: ja nein
Diabetes mellitus 20,3 % (n = 51) 79,7 % (n = 200)
Klinisch manifeste Arteriosklerose1 42,2 % (n = 106) 57,8 % (n =
145)
Leberzirrhose 11,9 % (n = 30) 88,1 % (n = 221)
Tabelle 2: Kinische Basisdaten der Patientengruppe.
1) erfaßt wurden alle durch Akutereignisse oder angiographisch
gesicherten Gefäßschäden wie KHK, pAVK und Carotisstenose
-
4.2. Experimentelle Optimierung der Methodik
Mit zunehemendem Interesse an der Bestimmung von Lipoprotein
(a)-Spiegeln,
stieg auch das Angebot an kommerziell erhältlichen
Untersuchungs-Kits. Am
Institut für Nephrologie und Osteologie verfügten wir bereits
über einen
Nephelometer, mit dem u.a. verschiedene tubuläre Proteine
schnell und einfach
bestimmt werden konnten. Es lag nahe , dieses automatisierte
Verfahren auch für
die Lp(a)-bestimmung zu nutzen.
Die Firma Immuno hatte zum Zeitpunkt unseres
Untersuchungsbeginns zwei
interessante Bestimmungs-Kits auf den Markt gebracht. Einerseits
den
Reagenziensatz Immunoleia® zur nephelometrischen Bestimmung
mittels
Immunpräzipitation und andererseits Immunozym®, ein sogenannter
Einschritt-
ELISA nach dem Sandwich-Prinzip.
In einer Testreihe aus 50 zufällig ausgewählten Dialysepatienten
führten wir
Mehrfachmessungen durch zum Vergleich der Methoden untereinander
und
Überprüfung der Präzision innerhalb der Methode.
Immunozym® ist in der Lage, auch sehr niedrige
Lp(a)-Konzentrationen unter 5
mg/dl zu messen. Die Nachweisgrenze von Immunoleia® lag aufgrund
der
mitgelieferten Standards bereits bei 12,1 mg/dl. 60 % Patienten
lagen unter
diesem Wert, sind einer exakten Bestimmung so nicht mehr
zugänglich.
Es wurden Wiederholungsmessungen durchgeführt, nachdem die
Proben erneut
eingefroren und aufgetaut worden waren. Bei beiden
Untersuchungsmethoden
zeigte sich bedingt durch die Thermolabilität des Lipoproteins
erwartungsgemäß
ein Trend zu niedrigeren Meßwerten im 2.Testlauf. Beim
Immunozym® waren
64 % der Meßwerte niedriger als beim ersten Durchgang, die
maximale
Abweichung betrug 34 %, die durchschnittliche – 12 % . 26 %
lagen beim zweiten
mal höher, die maximale Abweichung betrug 41 %, die mittlere +
14 %. Beim
Immunoleia® konnten in der Wiederholungsmessung Werte unter 12,1
mg/dl
allesamt bestätigt werden. Die 30 Patienten mit höheren
Lp(a)-Spiegeln hatten in
83 % der Fälle niedrigere Meßwerte im 2.Durchgang, maximale
Abweichung –
24 %, mittlere – 11 %.
-
Bei beiden Meßmethoden wird klar, daß es sich nicht um eine
absolute Methode
handelt, da es teils erhebliche Abweichungen in den Meßwerten
gibt. Die
Präzision bei mehrfach verwendeten Proben ist schlecht. Die
Entscheidung, den
ELISA zu verwenden, begründete sich dadurch, häufig auftretende
niedrige
Lp(a)-Spiegel genau zu erfassen. Der ELISA efordert allerdings
mehr manuelles
Arbeiten und unterliegt einer gewissen Lernkurve. Durch
Übungseffekte konnte
die Genauigkeit der Methode aber deutlich verbessert werden, wie
der Abgleich
mit den mitgelieferten Standards später zeigte. Der
Thermolabilität gerecht
wurden wir, indem wir Proben nur quantitativ bestimmten, wenn
sie erstmalig
aufgetaut wurden. Die Abweichungen zum Standard überschritten in
den
Meßreihen nie mehr als 10 %
Aber auch die qualitative Bestimmung (Phänotypisierung) hielt
Fallstricke bereit.
Alternativ zum letztlich verwendeten Diffusionsblot (siehe
3.2.2.3) kam ein
Elektroblotverfahren versuchsweise zum Einsatz, bei dem die
Proteinübertragung
durch Anlegen einer Spannung an Plattenelektroden unterstützt
wird. Von der
Theorie her sollte die Proteinausbeute dadurch verbessert
werden. In unseren
Versuchsreihen zeigten sich jedoch gehäuft Artefakte mit
duplizierten oder
verzogenen Bandenmustern, die eine Auswertung unmöglich
machten.
Problematisch erwies sich auch das hier notwendige Entfernen des
Gels vom
Kunststoffträger mit einem dünnen Draht. Das während der
Elektrophorese
gekühlte Gel wird relativ spröde und reißt leicht ein. Die
Ausfallquote war schon
rein wirtschaftlich nicht zu vertreten, weitere Experimente in
dieser Richtung
wurden nicht fortgeführt.
Mit dem Diffusionsblot umgeht man diese Probleme, da das Gel
selbst auf dem
Kunsstoffträger liegen bleiben kann. Die Blotting-Resultate
waren jedoch nicht
von Anfang an überzeugend. Wir identifizierten mehrere Gründe
und konnten
durch Modifizierung des Verfahrens die Ergebnisse deutlich
verbessern.
Das Milieu in der Blottingkammer darf nicht zu trocken sein. Die
kommerziell
erhältlichen Kunststoffkassetten schließen oft nicht optimal.
Mit herkömmlicher
Cellophan-Haushaltsfolie verschlossene Petrischalen waren die
bessere
Alternative.
-
Um zusätzliche Feuchtigkeit in die Blottingkammer zu bekommen,
gibt man ein
bis zwei Tropfen Diffusionspuffer hinzu. Die
Nitrozellulosemembran sollte dann
auf ein kleines quadratisches Podest gelegt werden, damit es
nicht im Puffer
schwimmt, sonst kann es zu unerwünschten Verdünnungseffekten
kommen.
Bei Verwendung der Reagenzien zahlt sich Großzügigkeit aus.
Ausreichende
Antikörpermenge und eine ausreichende Inkubationszeit ist zu
beachten. Die in
der Literatur vorgeschlagenen 2 Stunden sind als
Minimalanforderung zu sehen,
gemessen an den Resultaten erscheint uns der Zeitraum zu kurz,
besser ist
Inkubieren des 1.Antikörpers über Nacht. Darüberhinaus sollte
reichlich
Phosphataseentwickler verwendet werden, den man in beliebiger
Menge leicht
selbst herstellen kann. Dadurch erfolgt eine bessere
Substratabsätigung. Dies führt
einerseits zu brillianteren Ergebnissen, was die Auswertung
erleichtert, und
bringt eine Verbesserung der Sensitivität des Verfahrens.
Hatten wir anfangs Probleme, Phänotypen bei Patienten mit Lp(a)
< 10 mg/dl
darzustellen, konnten wir durch methodische Optimierung die
Nachweisgrenze
auf etwa 5 mg/dl senken.
4.3. Bestimmung der Lp(a) Serumspiegel
4.3.1. Vergleich der Dialysepatienten mit den Kontrollen
Aus oben erläuterten Gründen wurden zunächst rein quantitativ
die Lipoprotein
(a) – Spiegel aus den 251 Patienten – und 82 Kontrollproben
bestimmt. Zur
Anwendung kam das in Punkt 3.1 beschriebene ELISA-Verfahren. Die
Trübung
der Probenlösung führt zu einer der Lp(a)-Konzentration
proportionalen
Extinktion.
Aus der photometrisch ermittelten Extinktion der
Standardlösungen wurden
softwaregestützt die Lp(a)-Konzentrationen der Patientenproben
berechnet.
Mathematisch geschieht dies über eine sog. Spline-Approximation,
bei der über
bekannte Punkte einer Kurve die restlichen Punkte der Kurve
annäherungsweise
bestimmt werden können.
-
Standardlösungen enthalten bekannte Lp(a)-Konzentrationen. Die
Bestimmung
dieser dient somit auch der Qualitätskontrolle der
Meßmethodik.
Abb. 8 : Datenblatt zur Ermittlung des Zusammehangs zwischen
photometrisch
ermittelter Extinktion (Y-Achse) und Lp(a)- Konzentration
(x-Achse). Aus den
Meßpunkten der Standardlösungen wird der Kurvenverlauf
annäherungsweise bestimmt.
Die Abweichungen der eigenen Messungen lagen bei 3,5 – 10,3
%.
-
Abb. 9 : Datenblatt, das exemplarisch das Resultat einer
Meßreihe mit insgesamt 43
Patienten zeigt. Aus den Extinktionen der Standardlösungen
(gesamte Spalte 1 und Spalte
2 feld A und B) mit bekannter Lp(a)-Konzentration werden die
Lp(a) Konzentrationen
softwaregestützt berechnet und angezeigt (im Feld
Patientennummer, darunter Extinktion,
darunter Lp(a)-Konzentration)
In beiden Gruppen fiel eine hohe Variabilität der
Lp(a)-Konzentrationen auf
ohne Unterschied im erreichbaren Maximum.
In der Patientenprobe lagen die Messwerte zwischen 0 – 118,4
mg/dl, in der
Kontrollgruppe zwischen 0 – 119,5 mg/dl.
Beiden gemeinsam ist die schiefe Verteilung mit starker Tendenz
zu niedrigeren
Lp(a) – Konzentrationen. 75 % der Messwerte in der
Patientengruppe liegen unter
37,0 mg/dl vs. 32,85 mg/dl bei den Kontrollen. Die als Grenzwert
angesehenen
30 mg/dl werden in der Patientengruppe lediglich in 31,5 % der
Fälle überboten,
in der Kontrolle immerhin noch in 25,6 % der Fälle.
-
Der Mittelwert bei den Dialysepatienten lag bei 25,55 mg/dl vs.
22,28 mg/dl, der
Median bei 13,05 mg/dl vs. 8,15 mg/dl. Der Unterschied erreicht
kein
Signifikanzniveau. (p = 0,32).
Dialysepatienten Kontrollen
N 251 82
Mittelwert 25,55 mg/dl 22,28 mg/dl
Median 13,05 mg/dl 8,15 mg/dl
Standardabweichung 27,46 mg/dl 25,05 mg/dl
Varianz 754,18 627,54
Schiefe 1,44 1,559
Kurtosis 1,29 2,01
Minimum 0 mg/dl 0 mg/dl
Maximum 118,4 mg/dl 119,5 mg/dl
Percentile25 5,18 mg/dl 5,88 mg/dl
Percentile 50 13,05 mg/dl 8,15 mg/dl
Percentile 75 37,00 mg/dl 32,85 mg/dl
Tabelle 3: Lp(a)-Konzentrationen bei Dialysepatienten und
Kontrollen: Statistische
Basisdaten. Die Kontrollgruppe unterscheidet sich im Mittelwert
nur wenig von der
Patientengruppe. Auch die Variabilität und Verteilung der
Meßwerte sind im Grundsatz
vergleichbar. Ein Trend zu höheren Lp(a)-Spiegeln in der
Patientengruppe ist dennoch
erkennbar
Graphik 1: Prozentuale Verteilung der Lp(a)-Konzentrationen (in
mg/dl) bei Patienten
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0110,0
Lp(a) Konzentration
0%
5%
10%
15%
20%
25%
Pro
zen
t
-
Graphik 2 : Prozentuale Verteilung der Lp(a)-Konzentrationen (in
mg/dl) bei den
Kontrollen
Bei beiden Kollektiven (Patienten, siehe Graphik 1 und
Kontrollen) zeigt sich die schiefe
Verteilung mit klarer Tendenz zu niedrigeren Lp(a)-Spiegeln.
4.3.2. Subgruppenanalyse
Von besonderem Interesse war die Frage, ob sich innerhalb der
Patientengruppe
Subgruppen herauskristallisieren, die durch erhöhte Lipoprotein
(a) –Spiegel
auffallen.
Vor dem Hintergrund der entsprechenden Grunderkrankung
unterscheiden sich
lediglich die Diabetiker im Niveau des Lp(a) – Spiegels
signifikant vom Rest der
Patienten (Mittelwert 35,33 mg/dl vs. 24,51 mg/dl, p =
0,02*).
Patienten mit anderen nephrologischen Grunderkrankungen,
insbesondere
Glomerulonephritiden, unterscheiden sich nicht wesentlich von
den Kontrollen.
Eine bereits klinisch relevant gewordene Arteriosklerose
korrespondiert mit
erhöhten Lipoprotein (a) –Spiegeln, im Mittel 30,08 mg/dl im
Vergleich zu
22,25 mg/dl bei klinisch unauffälligen Patienten (p = 0,03*
).
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0110,0
Lp(a) - Konzentration
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
Pro
zen
t
-
Betrachtet man Diabetiker ohne dokumentierte Gefäßkomplikationen
(n = 29),
unterscheiden sich diese aber nicht vom Normalkollektiv .
(Mw 22,0 mg/dl vs 22,3 mg/dl)
Patienten mit bestehendem Leberparenchymschaden ( n = 30 ) haben
mit einem
Mittelwert von 18,48 mg/dl tendentiell den niedrigsten
Lipoprotein (a) – Spiegel,
wenn auch nicht auf Signifikanzniveau (p = 0,13) .
Beim Vergleich der Dialyseverfahren zeigen sich tendentiell
höhere Werte bei der
Peritonealdialyse (Mw 31,37 mg/dl) im Vergleich zur Hämodialyse
(24,42 mg/dl),
p = 0,14.
Etwa die Hälfte des Patientenkollektivs dialysierte zum
Zeitpunkt der
Probengewinnung länger als drei Jahre. Veränderungen der
Lipoprotein (a) –
Spiegel in Abhängigkeit der Behandlungsdauer waren nicht
abzuleiten.
Subgruppe Mittelwert SD Median Signifikanzniveau p < 0,05
Kontrolle (n = 82) 22,28 27,46 13,05 Grundkrankheit Chron.
Glomerulonephritis (n = 87) 21,43 24,26 12,10
Diabetes mellitus (n = 49) 35,33* 35,30 21,15 vs. Kontrolle
andere (n = 115) 24,51 25,10 13,05
Dialyseverfahren Hämodialyse (n = 210) 24,42 26,55 11,76 P =
0,11 vs PD.
Peritonealdialyse (n = 41) 31,37 31,44 20,38 P = 0,09 vs
Kontrolle
Behandlungsdauer. ≤ 36 months
(n = 125)
27,91 30,70 13,87
Behandlungsdauer. > 36 months
(n = 126)
23,21 23,72 12,10
Komorbiditäten Apparente Arteriosklerose (n = 106) 30,08 * 29,18
18,09 vs Kontrolle
Leberzirrhose (n = 30) 18,48 20,21 7,27 P = 0,14 vs übrige
Patienten
Tabelle 4: Übersicht über Lp(a)-Spiegel als Subgruppenanalyse.
Lediglich Diabetiker
und Patienten mit manifester Arteriosklerose unterscheiden sich
im Lp(a)-Niveau
signifikant von der Kontrollgruppe. Peritonealdialysepatienten
scheinen im Vergleich zu
HD-Patienten zu höheren Lp(a)-Spiegeln zu tendieren
-
4.3.3. Lp(a) – Spiegel in Abhängigkeit von Alter und
Geschlecht
Im Gesamtkollektiv haben Frauen signifikant höhere Lp(a)
–Spiegel als Männer,
Mittelwert 28,6 mg/dl vs. 22,3 mg/dl, p = 0,03. In der
Patientengruppe sind es die
über 55-jährigen Frauen, die den höchsten Mittelwert aufweisen
(35,07 mg/dl, p <
0,005 vs. männliche Pat.) , und die sich auch deutlich von
jüngeren Patientinnen
unterscheiden. Diese Altersabhängigkeit kann in der
Kontrollgruppe nicht
nachgewiesen werden.
Dialyse Kontrolle
m w m w
Mw Median Mw Median Mw Median Mw median
Gesamt 22,74 11,49 30,95 18,40 20,42 8,4 23,97 8,1
[ n = 165 ] [n = 86 ] [ n = 39 ] [ n = 43 ]
≤ 55 y 24,97 13,68 23,98 12,15 21,76 7,5 29,37 21,95
[ n = 66 ] [ n = 32 ] [ n = 19 ] [ n = 10 ]
> 55 y 21,25 9,9 35,07** 20,79 19,14 9,2 23,97 7,1
[ n = 99 ] [ n = 54 ] [ n = 20 ] [ n = 33 ]
Tabelle 5: Lp (a) – Konzentrationen (Mittelwerte und Mediane) in
Abhängigkeit
von Alter und Geschlecht. Insbesondere Dialysepatientinnen
jenseits der 55 weisen
erhöhte Lp(a)-Werte auf.
-
Graphik 3: Lp(a) in Abhängigkeit von Alter und Geschlecht bei
Dialysepatienten
Graphik 4: Lp(a) in Abhängigkeit von Alter und Geschlecht bei
Kontrollen
5630 10857N =
alt (> 55 J)jung (< 55 J)
Lp
(a)
Ko
nze
ntr
atio
n in
mg
/dl
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
m
w
3310 2019N =
alt (> 55 J)jung (< 55 J)
Lp
(a)
Ko
nze
ntr
atio
n in
mg
/dl
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
m
w
-
4.4. . Phänotypisierung von Apo(a)
4.4.1. Anpassung der Nomenklatur
Nach erfolgreicher elektrophoretischer Auftrennung, Westernblot
und
Farbreaktion erhält man im Idealfall scharf abgegrenzte
Proteinbanden, die sich
leicht den mitgelaufenen Standards zuordnen lassen.
Neben den 5 Standards F, S1, S2, S3 und S4 ließen sich in
unseren Proben und
mit unseren Verfahren noch 7 weitere Zwischenformen
identifizieren. Insgesamt
konnten 12 verschiedene apo(a) - Isoformen detektiert werden.
Patienten- und
Kontrollgruppe zeichneten sich durch eine vergleichbare
Heterogenität aus.
Lediglich die Zwischenform S4-S5 und die schnelle F2 Bande waren
in der
Kontrollgruppe nicht zu finden bei allerdings wesentlich
geringerer Fallzahl.
In der Nomenklatur nach Utermann, welche die Grundlage für die
von uns
verwendeten Standards darstellt, ist eine Bezeichnung für
Zwischenformen nicht
vorgesehen, sodaß man mit Kompromißbezeichnungen wie eben
erwähnt arbeiten
muß. Für statistische Betrachtungen und graphische Darstellungen
bietet sich ein
zumindest ordinalskaliertes System an. Der theoretische
Hintergrund über den
Aufbau von apo(a) kommt einem hier entgegen. Es besteht ein
linearer
Zusammenhang zwischen Anzahl der Kringle IV-Wiederholungen,
dem
Molekulargewicht und der Wanderungsgeschwindigkeit von apo
(a).
In Anlehnung an die Arbeitsgruppe um Kamboh, denen es gelang,
bis zu 26
verschiedene Isoformen zu identifizieren, werden die Isoformen
mit steigender
Wanderungsgeschwindigkeit bzw. abnehmender Masse von 1 – 26
durchnumeriert. [Kamboh et al, 1991]
In dessen Arbeitsgruppe war es Craig, der darauf hinwies, daß
das
Molekulargewicht von apo(a) nicht absolut zu bestimmen ist, da
es Einflußgrößen
wie dem Glycosilierungsgrad, unterliegt.
Unser Versuch, unterschiedliche Nomenklatursysteme kompatibel
darzustellen
basiert auf dieser Arbeit aus dem Jahr 1993. Die theoretische
Masse von apo(a)
liegt mit 12 – 37 Kringle IV repeats bei lediglich 186 – 503
kDa. Über cDNA
Sequenzanalyse war eine theoretische Molekularmasse von 250 kDa
für 17
-
Kringle IV repeats errechnet worden. Ein Kringle IV wird mit
12,7 kD geschätzt,
woraus sich die anderen Isoformen theoretisch errechnen lassen.
Die tatsächliche
Masse liegt aber höher. Dies weiß man durch SDS-PAGE von apo(a)
mit
Haptoglobin 2-2 Polymere als mitlaufenden Standard. Die
Erklärung für diese
Diskrepanz liegt im Glycosilierungsgrad, der etwa 28 % beträgt
und zum
Gesamtgewicht erheblich beiträgt. Die berechnete Molekularmasse
von apo(a)
liegt nach Berücksichtigung dieser Faktoren bei 238 kDa für 12
Kringle IV-
repeats und 643 kDa für 37 kringle IV repeats. [Craig et al,
1993]
Mit diesen Eckdaten versuchten wir unsere eigenen Isoformen auf
Grundlage der
Utermann-Klassifikation in ein praktikablerers lineares System
zu übertragen,
dessen bewußt, daß es Schätzunegn sind und Überlappungen im
Einzelfall auch
Fehlbeurteilungen nach sich ziehen können Die hier
verwendeten
Molekulargewichtsbereiche mögen deshalb nur als Orientierung
dienen, um
Vergleichbarkeit mit anderen Arbeiten zu erzielen.
Im weiteren werden wir auch das lineare System mit Isoformen 1 –
12 verwenden.
Isoformen 1 – 6 sind langsam wandernde Isoformen mit hohem
Molekulargewicht
(high molecular weight, hmw), Isoformen 7 – 12 sind schnell
wandernd und
haben ein niedriges Molekulargewicht (low molecular weight,
lmw).
-
Utermann
(modifiziert)
Kamboh
(modifiziert)
Anzahl Kringle IV
(Schätzung)
Molekulargewicht
(Schätzung)
F3 13 12-13 238,0 kD – 254,2 kD
F2 12 14-15 270,4 kD – 286,6 kD
11 16-17 302,8 kD – 319,0 kD F1
B 10 18-19 335,2 kD – 351,4 kD
S1 9 20-21 367,6 kD – 383,8 kD
S1-2 8 22-23 400,0 kD – 416,2 kD
S2 7 24-25 432,4 kD – 448,6kD
S2-3 6 26-27 464,8 kD – 481,0 kD
S3 5 28-29 497,2 kD – 513,4 kD
S3-4 4 30-31 529,6 kD – 545,8 kD
S4 3 32-33 562,0 kD – 578,2 kD
S4-5 2 34-35 594,4 kD – 610,6 kD
S5 1 36-37 626,8 kD – 643,0 kD
Tabelle 6: Darstellung der Isoformen mit dem Versuch sie in
unterschiedliche
Nomenklaturen einzuordnen. Grundlage stellt die Nomenklatur nach
Utermann aus dem
Jahr 1989 dar (linke Spalte). Eine andere Möglichkeit ist das
chronologische
Durchnummerieren von der langsamsten gefundenen Isoform
kathodennah bis zur
schnellsten (anodennah), wie es Kamboh 1992 publizierte. Die
Anzahl der Kringle IV-
Wiederholungen und die Angaben des Molekulargewichts basieren
auf theoretischen
Überlegungen und stellen Schätzwerte dar. Insbesondere der
unterschiedlich hohe
Glycosilierungsgrad läßt das Molekulargewicht erheblich
variieren.
-
4.4.2. Isoformenanzahl
Wie in Punkt 3.3. beschrieben, erhält man nach Elektrophorese,
Westernblot und
Färbereaktion ein Bandenmuster auf der Nitrozellulosemembran,
das unter
Abgleich mit dem mitgelaufenen Standard manuell ausgewertet
wird.
Es erfolgt eine Zuordnung der auf den Patientenspuren
identifizierbaren Banden
zu den Standardbanden mit bekannter Molekülgröße. Die Zuordnung
ist häufig
nicht eindeutig. In den folgenden Beispielen wird deutlich, dass
Zwischenformen
auftreten, die in ihrer Wandergeschwindigkeit keiner
Standardbande entsprechen.
Man hätte die fraglichen Banden der am nächsten gelegenen
Standardbande
zuordnen können. Uns erschien es aber sinnvoll, Zwischenformen
einzuführen
und entsprechend ihrer Position zu benennen, z.B. S 3-4 für eine
Isoform
zwischen S 3 und S 4.
In den Proben lassen sich in 48,6 % (Patienten) bzw. 50 %
(Kontrollen) eine
Isoform nachweisen, zwei Proteinbanden finden sich in 40,6 bzw.
41,5 % der
Fälle. Patienten und Kontrollen verhalten sich diesbezüglich
identisch.
Bei Lp(a)-Konzentrationen unter 5 mg/dl wurde die Darstellung
von Isoformen
problematisch, in 8,8 % bzw. 7,3 % der Proben gelang kein
Nachweis.
Gemessen an der bisher veröffentlichten Literatur waren wir
überrascht 8
Membranen bei den Patienten und 3 Membranen bei den Kontrollen
zu finden, in
denen deutlich und gut abgrenzbar 3 und 4 Isoformen zur
Darstellung kamen.
Dies hatte sich auch bei Wiederholungsmessungen bestätigt.
-
Beispiel 1:
P S P S
Beispiel 2:
P S P P S P S P
Beispiel 3:
P S P P S P S P
Abb.10: Dargestellt sind entwickelte Nitrozellulosemembranen mit
dektierten Bandenmustern von Patienten (P) - und Standardseren (S).
Man erkennt die
unterschiedliche Zahl von Isoformen, meist eine oder zwei , in
Einzelfällen auch
mehrere, wie auf Spur 3 in Beispiel 1. Die Zuordnung der Banden
ist nicht immer
eindeutig. Eine klare Zwischenform stellt Spur 8 in Beispiel 2
dar. Die Bande liegt
zwischen S3 und S4 und wird dementsprechend als S3-4 bezeichnet.
Inhomogenitäten im
elektrischen Feld während der Elektrophorese sowie Verziehungen
beim Blotting
beeinträchtigen die Qualität der Bandendarstellung wie die
„Wellenform“ auf Spur 1 und
2 im Beispiel 1zeigt.
-
4.4.3.Detektierte Phänotypen
Die Darstellung der Banden entspricht der Expression des
dazugehörigen Gens
und dem daraus synthetisierten Protein. Wir beschreiben hier
Proteinmuster, das
als Phänotyp der dazu korrespondierenden Allele (Genotyp)
bezeichnet wird.
In unserer Untersuchung konnten wir 53 Phänotypvarianten
differenzieren. Diese
Vielfältigkeit war insbesondere in der wesentlich größeren
Patientengruppe zu
sehen. In den Kontrollen waren es immerhin noch 28
verschiedene
Kombinationen aus Isoformen .
Wie oben bereits erwähnt, mißlang eine Phänotypisierung im Sinne
eines
Bandennachweises in 8,8 % der Fälle bei den Patienten und in 7,3
% der Fälle bei
den Kontrollen. Allerdings ist zu berücksichtigen , dass in
diesen Gruppen nur in
5 bzw. 3 Fällen auch in der quantitativen Bestimmung (ELISA)
kein Nachweis
gelang, es sich wahrscheinlich nur bei 2 % bzw. 3,6 % der
Probanden um
„echte“ Nullallele handelt. In den anderen Fällen scheint die
Methode an Grenzen
zu stoßen. Diese Proben ohne Bandennachweis wiesen im ELISA
Lp(a)-
Konzentrationen unter 5 mg/dl auf.
Darüberhinaus traten in einzelnen Fällen Phänotypen mit drei und
vier
Proteinbanden auf. Diese Phänotypen sind gekennzeichnet durch
eine heterogene
Zusammensetzung, in der stets hoch – und niedermolekulare
Isoformen zu finden
sind. Die Hälfte der gefundenen Phänotypen (27 von 54) besteht
aus derartigen
Kombinationen, nur in 12 Fällen liegen rein hochmolekulare und
in 11 rein
niedermolekulare Varianten vor.
Trotz aller Vielfalt und je nach Größe der untersuchten
Population nahezu
unendlich erscheinender Kombinationsmöglichkeiten, lassen sich
schließlich
80 % der Proben auf nur noch 18 verschiedene Phänotypen
reduzieren.
-
Dialysepatienten Kontrollen
Phänotyp Apo(a)Klasse 1 Häufigkeit [%] kumulativ [%] Häufigkeit
[%] kumulativ [%]
5 hmw 9,2 9,2 15,9 15,9
3 hmw 14,7 23,9 12,2 28,1
4 hmw 12,7 36,6 13,4 41,5
N Kein Nachwei