Aus dem Institut für Anatomie ΙΙ: Experimentelle Morphologie (Direktor: Prof. Dr. med. Udo Schumacher) des Zentrums für Experimentelle Medizin des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf Die Wirkung des Proteasomeninhibitors Bortezomib auf humane Neuroblastomzellen in vitro und in vivo in einem Xenograftmodell Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg vorgelegt von Christina Haane aus Dorsten Hamburg 2007
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Aus dem Institut für Anatomie ΙΙ:
Experimentelle Morphologie
(Direktor: Prof. Dr. med. Udo Schumacher)
des Zentrums für Experimentelle Medizin
des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf
Die Wirkung des Proteasomeninhibitors Bortezomib auf
humane Neuroblastomzellen in vitro und in vivo in einem Xenograftmodell
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg vorgelegt von
Christina Haane
aus Dorsten
Hamburg 2007
Angenommen von der Medizinischen Fakultät
der Universität Hamburg am: 01.12.2008
Veröffentlicht mit Genehmigung der Medizinischen
Fakultät der Universität Hamburg
Prüfungsausschuss, der Vorsitzende: Prof. Dr. U. Schumacher
Prüfungsausschuss: 2. Gutachter: Prof. Dr. H.-E. Laack
Prüfungsausschuss: 3. Gutachterin: PD Dr. S. Klutmann
Meinen Eltern
Abkürzungsverzeichnis
I
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
Alu Arthrobacter luteus
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CASY Cellcounter Analyser System
CLL Chronisch lymphatische Leukämie
CT Computertomographie
°C Grad Celsius
ddH2O double distilled H2O
evtl. eventuell
[18 F]FDG Fluordeoxyglukose
[18F]FLT Fluorothymidin
g Gramm
GPOH Gesellschaft für Pädiatrische Onkologie und Hämatologie
h Stunde
HE Hämatoxylin-Eosin
HPLC High Performance Liquid Chromatography
INSS International Neuroblastoma Staging System
i.v. intravenous
kg Kilogramm
KG Körpergewicht
KV Kilo Volt
nm nanometer
nM nano Mol
Nr. Nummer
n.s. nicht signifikant
min Minuten
MHz Megahertz
MRT Magnetresonanztomographie
µm micrometer
* p < 0,05
** p < 0,01
*** p < 0,001
Abkürzungsverzeichnis
II
PCR Polymerasekettenreaktion
PET Positronenemissionstomographie
s Sekunden
s.c. subcutan
scid Severe combined immune deficiency
SD Standard deviation
SEM Standard error of the mean
Tab. Tabelle
UKE Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
Voxel Volumenenlement (dreidimensionales Pixel)
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
Inhaltsverzeichnis
1
Inhaltsverzeichnis 1
1 Arbeitshypothese und Fragestellung 3
2 Einleitung 4
2.1 Das humane Neuroblastom 4
2.2 Bortezomib 8
3 Material und Methoden 10
3.1 Neuroblastomzelllinien 10
3.2 Bortezomib 10
3.3 Charakterisierung von Bortezomib in vitro 10
3.3.1 Zellproliferationsassay 10
3.3.1.1 Zellkultur 10
3.3.1.2 Detektion von Mykoplasmen in der Zellkultur 11
3.3.1.3 Zellzählung 12
3.3.1.4 Erstellen von Eichkurven 12
3.3.1.5 Zellproliferationsassay mit Zusatz von Bortezomib 13
3.4 Charakterisierung von Bortezomib in vivo 14
3.4.1 Versuchstiere 14
3.4.2 Behandlung der Tiere 15
3.4.3 Histologie 16
3.4.3.1 Primärtumoren 16
3.4.3.1.1 Lichtmikroskopie 16
3.4.3.1.2 Elektronenmikroskopie 17
3.4.3.2 Lungenmetastasierung 17
3.4.4 Disseminierte Tumorzellen im Blut 18
3.4.5 Imaging 19
3.4.5.1 Magnetresonanztomographie 19
Inhaltsverzeichnis
2
3.4.5.2 Positronen-Emissions-Tomographie /
Computer Tomographie 20
3.5 Statistische Auswertung 22
4 Ergebnisse 23
4.1 Wirkung von Bortezomib in vitro 23
4.2 Wirkung von Bortezomib in vivo 28
4.2.1 Primärtumor 28
4.2.1.1 Lichtmikroskopie 29
4.2.1.2 Elektronenmikroskopie 33
4.2.2 Lungenmetastasierung 35
4.2.3 Disseminierte Tumorzellen im Blut 36
4.2.4 Imaging 39
4.2.4.1 MRT 39
4.2.4.2 PET-CT 43
5 Diskussion 47
6 Zusammenfassung 59
7 Literaturverzeichnis 60
Danksagung 67
Lebenslauf 68
Selbstständigkeitserklärung 69
Arbeitshypothese und Fragestellung
3
1 Arbeitshypothese und Fragestellung
Bei Kindern mit der Diagnose Neuroblastom ist die Prognose häufig infaust, so dass ein
großes Interesse für neue Therapieansätze besteht. Besonders bei dem großen Anteil der
Patienten, die sich im Stadium IV befinden, ist die Aussicht auf Heilung äußerst gering. Bei
Einsatz des Proteasomeninhibitors Bortezomib wurden bereits antiproliferative Wirkungen bei
verschiedenen Tumorentitäten nachgewiesen. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit
folgende Fragen zu klären:
• Hat der Proteasomeninhibitor Bortezomib eine wachstumshemmende
Wirkung auf die humanen Neuroblastomzelllinien in vitro?
• Hat das Medikament Bortezomib auch eine antiproliferative Wirkung in vivo,
wenn humane Neuroblastomzellen in scid – Mäuse transplantiert werden?
• Gibt es Unterschiede zwischen der behandelten Bortezomibgruppe und der
Kontrollgruppe in Hinblick auf Apoptosen und Mitosen der Primärtumoren,
sowie der Anzahl der Spontanmetastasen in den Lungen und der Anzahl der
freien Tumorzellen im Blut?
• Können die Imagingverfahren MRT und PET-CT die humanen
Neuroblastome im scid -Mausmodell charakterisieren?
Einleitung
4
2 Einleitung
2.1 Das Neuroblastom
Das Neuroblastom ist mit 7 - 14% aller kindlichen Tumoren der häufigste extrakranielle solide
Tumor des Kindesalters (Morgenstern et al., 2004). In Deutschland liegt die Zahl der
Neuerkrankungen bei 120 - 130 Fällen pro Jahr. Die Inzidenz liegt bei circa 1,3 Erkrankungen
auf 100.000 Kinder, die sich in einem Alter unter 15 Jahren befinden (Hero und Berthold,
2002; Schwab et al., 2003; Simon, 2005). Das Neuroblastom gehört zu den embryonalen
Tumoren, die charakteristischerweise in 90% der Fälle in einem Alter von unter 5 Jahren
diagnostiziert werden (Schwab et al., 2003). Das mittlere Lebensalter der Patienten liegt bei
unter zwei Jahren und 35% der Kinder erkranken bereits in einem Alter von unter einem Jahr
(Morgenstern et al., 2004).
Es handelt sich um eine maligne Erkrankung, die von primitiven sympathischen neuralen
Vorläufern des Nervengewebes ausgeht (Brodeur, 2003). Histologisch findet man zwei
verschiedene Zelltypen, die Neuroblast / Ganglienzelle und die Schwann-Zellen. Letztere sind
vermutlich nicht neoplastisch, werden aber wahrscheinlich als Stromazelle von den
Tumorzellen rekrutiert (Koletzko, 2003).
Aufgrund seiner Histogenese, kann das Neuroblastom überall dort auftreten, wo
sympathisches Nervengewebe zu finden ist. In erster Linie entstehen Neuroblastome deshalb
im Nebennierenmark. Die übrigen Lokalisationen verteilen sich, vom Retroperitonealraum
ausgehend, in den paraspinalen Ganglien von Thorax, Abdomen oder Pelvis (Brodeur, 2003).
Die Ausbreitung des Neuroblastoms erfolgt durch infiltratives Wachstum und durch
lymphogene und hämatogene Metastasierung. Diese erfolgt zumeist in das Knochenmark, in
Fernlymphknoten und in die Leber, seltener in die Haut, ins Gehirn und in die Lunge (Hero
und Berthold, 2002; Simon, 2005). Das Stadium IV-S nimmt eine Sonderstellung ein. Hierbei
ist das Erkrankungsalter auf das erste Lebensjahr begrenzt, es findet sich ein lokalisierter
Primärtumor mit Metastasen, die sich definitionsgemäß allerdings nur im Knochenmark, in der
Haut oder in der Leber befinden dürfen (Hero und Berthold, 2002).
Die betroffenen Kinder leiden sowohl unter Krankheitszeichen, die direkt auf den Tumor
zurückzuführen sind, als auch unter so genannten Allgemeinsymptomen. Entsprechend der
verschiedenen Ursprungsorte kann ein Neuroblastom durch unterschiedliche Symptome
auffallen wie z. B. ein tastbarer Knoten im Bauchraum, Atembeschwerden, Husten und
verdickte Halslymphknoten oder auch Anzeichen einer Querschnittslähmung durch
Einleitung
5
Vorwachsen des Tumors in Richtung Rückenmark. Als Allgemeinsymptome können Blässe,
Gewichtsverlust, Fieber und Durchfall auftreten (Simon et al., 2004; Simon, 2005).
Der Verdacht auf das Vorliegen eines Neuroblastoms ergibt sich aus den typischen
Beschwerden und dem Befund der körperlichen Untersuchung. Häufig wird ein Neuroblastom
aber auch zufällig im Rahmen einer Routineuntersuchung entdeckt. Die Diagnosesicherung
erfolgt durch weiterführende Untersuchungen: Blut- und Urinuntersuchung auf
Katecholaminmetabolite, feingewebliche Beurteilung eines Biopsats, Röntgenuntersuchung
des Brustkorbs, Ultraschalluntersuchung des Bauchraums, Computer- und
Kernspintomographie und Szintigraphie.
Ein System zum Staging des Neuroblastoms stellt das INSS (=International Neuroblastoma
Staging System) dar. Zusätzlich können verschiedene Parameter wie z.B. der Ferritin-Spiegel
bestimmt werden, um die Staging Analyse zu vervollständigen.
Stadium Kriterien I Lokalisierter Tumor mit makroskopisch kompletter Entfernung, repräsentative
ipsi- und contralaterale Lymphknoten histologisch ohne Tumorbefall. Lediglich unmittelbar am Tumor adhärente, chirurgisch entfernte Lymphknoten dürfen positiv sein. Auch bilaterale Tumoren, die makroskopisch komplett exstirpiert werden können und keinen regionalen Lymphknotenbefall aufweisen
IIa Unilateraler Tumor mit makroskopisch inkompletter Resektion, ipsi- und contralaterale Lymphknoten histologisch negativ
IIb Tumor wie bei IIa, jedoch positive regionale ipsilaterale Lymphknoten III Nichtresektabler unilateraler Tumor infiltriert über die Mittellinie mit oder ohne
Lymphknotenbefall oder Nichtresektabler Mittellinientumor mit bilateraler Ausdehnung durch Infiltration oder Lymphknotenbefall (Das Überschreiten der Mittellinie ist definiert durch infiltratives Erreichen / Überschreiten der Wirbelkante der Gegenseite)
IV Tumoraussaat in Lymphknoten, Knochen, Knochenmark, Leber und andere Organe
IV-S Sonderform, nur bei Säuglingen im 1. Lebensjahr, lokalisierter Primärtumor wie bei Stadium I, IIa oder IIb, Tumoraussaat nur in Leber, Haut und/oder Knochenmark
Tab. 1: Internationale Stadieneinteilung des Neuroblastoms nach INSS (Simon, 2005).
Einleitung
6
Die Prognose ist abhängig von verschiedenen Kriterien, wobei das Alter ein ganz
entscheidender prognostischer Faktor darstellt. Die angefügte Tabelle 2. verdeutlicht die
vergleichsweise guten Heilungschancen bei Kindern unter 1 Jahr im Gegensatz zu Kindern,
die bei Diagnosestellung älter als 1 Jahr sind.
Alter
Stadium
Anteil Neuroblastome in der Altersgruppe
(%)
5-Jahresüberlebensrate
(%)
< 1 Jahr I-III 61 95 +/-1 IV 13 53 +/-6 IV-S 26 79 +/-4
> 1 Jahr I-III 45 76 +/-2 IV 55 20 +/-2
Tab. 2: Überlebenswahrscheinlichkeit beim Neuroblastom in Abhängigkeit von Alter und Stadium (GPOH- Gesellschaft für Pädiatrische Onkologie und Hämatologie, Koletzko, 2003). Dabei waren 615 Kinder < 1 Jahr und 1028 Kinder > 1 Jahr.
Das Tumorstadium, das vor allem auch durch das Ausmaß der Metastasierung bestimmt wird,
ist ebenfalls für die prognostische Einschätzung wichtig. Weitere klinische Marker, die mit der
Prognose des Neuroblastoms korrelieren, sind die Serummarker LDH und Ferritin.
Zunehmende Bedeutung als Risikofaktoren erlangen die bereits oben beschriebenen
molekulargenetischen Veränderungen. Der wichtigste relevante Marker ist die Amplifikation
des MYC-N, die mit einer deutlich schlechteren Überlebensrate einhergeht (Hero und
Berthold, 2002). Daneben gibt es weitere zahlreiche molekulare Marker (Status Chromosom
1p, 11q, 3p, Expression des Adhäsionsmolekül CD44, Telomeraseaktivität, Caspase 8 als
mögliches Tumorsuppressorgen, etc.), die in der Zukunft zunehmend an Bedeutung erlangen
könnten, deren klinische Wertigkeit zum Teil aber noch nicht endgültig geklärt werden konnte
(Hero und Berthold, 2002; Schwab et al., 2003; Simon et al., 2004; Simon, 2005).
Die Behandlung des Tumors richtet sich nach den prognostischen Faktoren wie z. B. Stadium,
Alter, molekulargenetische Marker (Interdisziplinäre Leitlinien 2004, Deutsche
Krebsgesellschaft e.V., Frankfurt). Erst nach einem kompletten Staging kann die Operation als
erste therapeutische Maßnahme empfohlen werden. In einem Ersteingriff geht es um
Diagnosesicherung und Resektion des Tumors. Wenn histologisch und molekulargenetisch
die Diagnose gesichert wurde, erfolgt die Einteilung in der Regel in 3 Behandlungsgruppen:
Beobachtungs-, Standardrisiko- und Hochrisikogruppe. In Abhängigkeit von der Risikogruppe
reichen die therapeutischen Interventionen von alleiniger Operation bis hin zur
Einleitung
7
Maximaltherapie (Interdisziplinäre Leitlinien: Deutsche Krebsgesellschaft e.V. Frankfurt,
2004).
Das Therapiekonzept Beobachtungsgruppe besteht nach der Operation aus regelmäßigen
Kontrollen und eventuell einer leichten Chemotherapie. Die Patienten mit einem
Standardrisiko bekommen nach der Operation eine Chemotherapie. Je nach Ansprechen im
Therapieverlauf kann eine sekundäre Tumoroperation oder eine Strahlentherapie notwendig
sein. Hingegen werden Patienten mit einem Hochrisiko - Neuroblastom sowohl primär operiert
als auch adjuvant / palliativ mit Chemotherapie und Strahlentherapie behandelt. Je nach
Ansprechen kann eine Second-Look-Operation erfolgen (Simon, 2005; Hero und Berthold,
2002).
Im Rahmen von Tumorstudien erhalten alle Patienten anschließend eine
Hochdosischemotherapie mit autologer Stammzelltransplantation (Simon, 2005). In der Regel
wird die Behandlung der Hochrisikogruppe durch weitere konsolidierende Therapieverfahren
ergänzt, z. B. Immuntherapie mit Antikörpern. Morgenstern et al., (2004) und Brodeur et al.,
(2003) berichteten von einer biologischen Therapie mit cis-Retinsäure, welche gute Resultate
nach autologer Stammzelltransplantation zeigte. Fang et al., (2006) berichteten von H+linked
monocarboxylate transporter (MCT1 / SLC 16A1), die einen Erfolg versprechenden Einfluss
auf das Tumorwachstum von Hochrisikopatienten haben sollen. Simon (2005) wies weiterhin
auf neue Ansätze der Tumorvakzinierung mit dendritischen Zellen hin. All diese
verschiedenen Therapieansätze sind Gegenstand aktueller klinischer Studien.
Die Behandlung von Patienten mit Neuroblastom im Stadium IV-S nimmt eine Sonderstellung
ein, da Tumor und Metastasen oft spontan regredieren. Beim Auftreten von Lebermetastasen
oder Bedrohung durch Tumormassen kann auch hier eine milde Chemotherapie erforderlich
sein (Interdisziplinäre Leitlinien 2004, Deutsche Krebsgesellschaft, e.V. Frankfurt).
Diese Therapieansätze führen aber noch immer nicht zu einem durchschlagenden Erfolg in
der Behandlung des Neuroblastoms. Insbesondere Hochrisikopatienten im Stadium IV haben
eine Fünfjahresüblerlebensrate von 20 ± 2%. Die hohe Mortalität (je nach Stadium bis zu
80%) dieses kindlichen Tumors (Koletzko 2003, Berthold et al., 2005) macht die Dringlichkeit
der Suche nach weiteren Therapieoptionen deutlich. Ein solcher neuer Ansatzpunkt besteht
möglicherweise in der Beeinflussung der Tumorzellen durch den Proteasomeninhibitor
Bortezomib (Velcade ®).
Einleitung
8
2.2 Bortezomib
Bortezomib ist das erste zugelassene Medikament aus der neuen Wirkstoffklasse der
Proteasomeninhibitoren. Bortezomib hemmt spezifisch die Aktivität des ubiquitär
vorkommenden 26S-Proteasoms in Säugetierzellen. Das Proteasom ist ein essentieller
Enzymkomplex, welches Apoptose, Transkription, Zelladhäsion, Angiogenese,
Antigenpräsentation und den Zellzyklus reguliert (Le Blanc, 2002). In vielfachen Studien
wurde gezeigt, dass durch die Inhibition des Proteasoms die Tumorgröße verringert werden
kann. Beispiele hierfür sind das maligne Myelom (Hidshima et al., 2001; Katayoun et al.,
2004), das Mantelzelllymphom (Pham et al., 2003), das nichtkleinzellige Lungenkarzinom
(Ling et al., 2003), das Ovarialkarzinom (Frankel et al., 2000), das Pankreaskarzinom (Shah
et al., 2001; Bold et al., 2001), das Prostatakarzinom (Adams et al., 1999; Frankel et al.,
2000) und bösartige Tumoren im Kopf – Halsbereich (Sunwoo et al. 2001, van Waes et al.,
2005). Neueste Studien von Michaelis et al. (2006), Brignole et al. (2006) und Hamner et al.
(2007) zeigten erstmals antiproliferative Wirkungen auf humane Neuroblastomzelllinien in
vitro und in vivo. Zudem konnte in einer Phase Ι Studie bei pädiatrischen Patienten mit
refraktären soliden Tumoren (inklusive 2 Patienten mit Neuroblastom) gezeigt werden, dass
Bortezomib ein gut tolerables Medikament ist, welches nur eine geringe Toxizität aufweist
(Blaney et al., 2004).
Der molekulare Mechanismus, mit dem Bortezomib die Apoptose der Tumorzellen induziert, ist
weitestgehend unklar. Vermutet wird eine Veränderung der Balance zwischen pro- und
antiapoptotischen Signalen (Adams, 2003). Ein Molekül, das eine zentrale Rolle in der
Vermittlung vieler Effekte des Bortezomibs darstellt, ist der Transkriptionsfaktor NF-κB (Karin et
al., 2002). NF-κB liegt normalerweise im Zytosol im Komplex mit dem Inhibitormolekül IκB vor.
Durch zellulären Stress wird IκB durch die Proteasomen abgebaut, so dass es zur Aktivierung
von NF-κB kommt. Durch Bortezomib kann die Elimination des IκB reduziert werden und
folglich die Aktivität von NF-κB gehemmt werden. Beim Multiplen Myelom konnte weiter
beobachtet werden, dass Bortezomib die IL-6 induzierten Wachstumsstimulationen durch
Verminderung von gp 130 induziert. Dies wiederum führt zu einer vermehrten Aktivität von
Caspase 3 und somit zu einer verstärkten Apoptoseaktivität (Ludwig, 2004).
Weitere Studien haben gezeigt, dass Tumorzellen empfindlicher gegenüber den Effekten des
Bortezomibs sind als normale Zellen. Durch die Reversibilität der Proteasomeninhibition mit
Bortezomib erholten sich periphere mononukleare Blutzellen sehr schnell. Tumorzellen
hingegen waren dazu nicht in der Lage und gingen in Apoptose (Richardson, 2003). Testungen
Einleitung
9
des Medikamentes an normalen diploiden Zellen, wie z.B. humane Fibroblasten zeigten
wiederholt keine Effekte (Brignole et al., 2006).
Abb. 1: Intrazelluläre Signalkaskade des Transkriptionsfaktor NF-κκκκB (modifiziert nach Adams, 2003). Die Abbildung stellt den Zusammenhang zwischen NF-κB und seinem Inhibitor IκB dar. Weiterhin wird gezeigt, dass bei Einfluss von zellulärem Stress IκB durch Proteasomen abgebaut wird und NF-κB somit aktiv wird. Bortezomib greift in diesen Mechanismus ein und verhindert die Elimination von IκB.
Material und Methoden
10
3 Material und Methoden
3.1 Neuroblastomzelllinien
Es wurden sieben verschiedene humane Neuroblastomzelllinien (Kelly, LS, SH-SY5Y, SK-N-
SH, IMR-32, LAN-1 und LAN-5) untersucht. Die Zelllinien Kelly, LAN-1, LAN-5, SK-N-SH und
IMR-32 wurden uns freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. Erttmann (Abteilung Pädiatrische
Onkologie, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Die
Zelllinien LS und SH-SY5Y wurden uns freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. Hildebrandt
(Abteilung Zelluläre Chemie, Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland) zur
Verfügung gestellt.
3.2 Bortezomib (Velcade®)
Das Medikament Bortezomib wurde von der Firma Janssen Pharmaceutica N.V. (Beerse,
Belgien) über die Apotheke des Universitätsklinikums bezogen und als steriles Pulver in einer
Packungsgröße von 3,5 mg geliefert. Aus diesem Pulver wurde dann durch Zugabe von 3,5
ml PBS eine Stammlösung hergestellt, deren Konzentration 1 mg / ml betrug. Gelagert wurde
die Stammlösung dann bei – 20° C im Gefrierschrank.
Bei jedem Versuch wurde diese Stammlösung erneut aufgetaut und in einer
Verdünnungsreihe wurden die zu untersuchenden Konzentrationen hergestellt (siehe 3.3.1.5).
3.3. Charakterisierung von Bortezomib in vitro
3.3.1 Zellproliferationsassays
3.3.1.1 Zellkultur
Die Arbeiten mit den Zelllinien erfolgten unter einer Hera Safe Sicherheitswerkbank (Heraeus
Instruments, Hanau, Deutschland) unter sterilen Bedingungen. In 50 ml Zellkulturfalschen
(Nunclon®, Nunc, Roskilde, Dänemark) erfolgte die Kultivierung der Zelllinien unter
Standardbedingungen (37° C, 100% Luftfeuchtigkeit, 5% CO2 / 95% Luft) in einem Hera Cell
Brutschrank (Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland). Als Nährmedium wurde RPMI
Medium (Gibco/Life Technologies, Paisley, Scotland) verwendet, welches zusätzlich mit 10%
hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (FCS, Gibco®), 2 mM L-Glutamin (Gibco®), sowie 100
Material und Methoden
11
U / ml Penicillin und 100 µg / ml Streptomycin (Gibco®) versetzt wurde. Dieses Medium wird
im Weiteren als Kulturmedium bezeichnet und wurde 2 – 3 mal pro Woche gewechselt. Wenn
die Zellen konfluent gewachsen waren, wurden sie passagiert. Hierzu wurde das alte
Kulturmedium abgesaugt, die Zellen wurden mit 5 ml PBS (Gibco® Dulbecco´s Phosphate-
Buffered Saline, Invitrogen, Carlsbad, USA) gespült, anschließend für fünf Minuten mit je 5 ml
Trypsin-EDTA (Gibco®) versetzt und darauf folgend bei 37° C und 5% CO2 5 Minuten
inkubiert. Nach dem Ablösen der Zellen vom Flaschenboden, erfolgte die Zugabe von 5 ml
Kulturmedium, um das Trypsin zu inaktivieren und so eine Schädigung der Zellen durch das
Trypsin-EDTA zu verhindern. Abschließend wurden die abgelösten Zellen auf neue
Zellkulturflaschen verteilt, die zuvor mit 15 ml Kulturmedium aufgefüllt waren, oder die Zellen
wurden für die Zellproliferationsexperimente eingesetzt. Da für die Standardisierung und
Reproduktion der Experimente eine hohe Zellzahl erforderlich war, wurden vor Beginn aller
Experimente alle sieben Zelllinien über mehrere Wochen in Zellkulturflaschen vermehrt und
ein Suspensionspool von jeder der sieben Zelllinien erstellt. Die Suspensionen wurden fünf
Minuten bei 1500 U / min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Die entstandenen
Zellpellets wurden mit Gefriermedium (Cryo-safe Ir, c.c. pro GmbH, Neustadt, Deutschland)
resuspendiert und in Einfrierröhrchen (Nunc Cryo Tube Vials, Nalge Nunc International
Naperville, Roskilde, Dänemark) auf identische Aliquots von 1,5 ml verteilt. Über Nacht
wurden die Aliquots auf - 80° C gekühlt und abschließend in flüssigem Stickstoff
kryokonserviert. Für die weiteren beschriebenen Zellproliferationsexperimente wurden jeweils
ein bis zwei Aliquots pro Zelllinie aufgetaut, auf Zellkulturflaschen verteilt und ca. drei bis vier
Wochen kultiviert, bis eine ausreichende Zellzahl herangewachsen war, um die Versuche
durchführen zu können.
3.3.1.2 Detektion von Mykoplasmen-Kontamination in der Zellkultur
Zur Überprüfung der Zellkultur auf Kontamination durch Mykoplasmen wurde das VenorGeM®
Mykoplasmen-Detektionskit (Minerva Biolabs GmbH, Berlin, Deutschland) auf der Basis der
Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. Der Test ist zum Nachweis der typischerweise als
Kontamination in Zellkulturen auftretenden Mykoplasmenspezies geeignet und wurde
entsprechend der Angaben des Herstellers durchgeführt. Bei keiner der Zelllinien konnte eine
Kontamination durch Mykoplasmen nachgewiesen werden.
Material und Methoden
12
3.3.1.3 Zellzählung
Die Bestimmung der Zellzahl wurde mittels des CASY®-Cell Counter Analyser System
(CASY®-Technology, Schärfe System GmbH, Reutlingen, Deutschland) durchgeführt. Dabei
wurden vitale Zellen gezählt. Für die Messung wurden die Zellen in einer speziellen
Elektrolytlösung (CASY®ton) suspendiert und anschließend durch eine Präzisionsmesspore
gesaugt.
3.3.1.4 Erstellen von Eichkurven
In den folgenden Zellproliferationsassays wurde der Einfluss des Proteasomeninhibitors
Bortezomib der Firma Janssen Pharmaceutica N.V., (Beerse, Belgien) mit Hilfe des XTT-
Zellproliferationskit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland) untersucht. Zur
Erstellung der Eichreihen wurde für jede Zelllinie eine Verdünnungsreihe mit sieben (Kelly,
LAN-1, LAN-5, SH-SY5Y, IMR-32, LS) bzw. zehn (SK-N-SH) verschiedenen
Zellkonzentrationen erstellt. Jeweils 80 µl der Zellsuspensionen wurden in die Vertiefungen
einer 96er Mikrotiterplatte (Greiner, Frickenhausen, Deutschland) pipettiert. Als Leerwert für
den ELISA-Reader wurden 80 µl Kulturmedium verwendet. Jeder Ansatz wurde fünffach
getestet. Die Platten wurden im Brutschrank für 24 Stunden unter Standardbedingungen
präinkubiert. Dann wurden 20 µl PBS zu den Testansätzen gegeben, was der Menge der in
den endgültigen Versuchen zugefügten Substanz Bortezomib gelöst in PBS entsprach.
Anschließend wurden die Zellen für 48 Stunden im Brutschrank unter Standardbedingungen
inkubiert. Zur Ermittlung der Zelldichte wurde 72 Stunden nach dem Aussäen der Cell
Proliferation Kit II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) benutzt. Dafür wurde
XTT labeling reagent und electron coupling reagent in einer Konzentration von 50 : 1
gemischt, was einer XTT Endkonzentration von 0,3 mg / ml entspricht. Von dieser
Konzentration wurden jeweils 50 µl in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben und die
Platten wurden zur weiteren Inkubation in den Brutschrank gestellt. Die Extinktion wurde nach
4, 6 und 24 Stunden bei 450 nm im ELISA Reader Dynatch MR3.13 (Dynex Technologies,
Ashford, UK) gemessen. Für die Zelllinien Kelly, LAN-1, LAN- 5, IMR-32, LS und SK-N-SH
stellten sich 6 Stunden und für SH-SY5Y 24 Stunden als eine optimale Inkubationszeit mit
XTT heraus. Die Zellkonzentrationen, die nach 72 Stunden Wachstum im exponentiellen
Bereich der Eichkurve lagen, wurden zum Aussäen der einzelnen Neuroblastomzellreihen
angewandt. Die jeweiligen Zellzahlen / ml sind in der Tabelle 3 zusammengefasst.
Material und Methoden
13
Zelllinie Kelly LAN-1 LAN-5 LS SK-N-SH SH-SY5Y IMR-32
Zellzahl / ml 150.000 150.000 200.000 70.000 60.000 420.000 700.000
Tab. 3: Zellzahlen / ml der Neuroblastomzelllinien, die ein geeignetes Wachstum über die Versuchsdauer von 72 Stunden gezeigt haben.
Exemplarisch ist in Abbildung 2 der Eichkurvenverlauf der Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y
dargestellt. Hierbei ist die unterschiedliche Absorption des XTTs nach 4, 6 und 24 Stunden zu
sehen.
SH-SY5Y
104 105 106
0
1
24h
6h
24h
Zellen / ml
Ab
so
rpti
on
Abb. 2: Eichkurve der Zelllinie SH-SY5Y. Dargestellt ist die unterschiedliche Absorption nach 4, 6 und 24 Stunden. Die optimale Absorption fand nach 24 Stunden statt, aus diesem Grund wurden alle weiteren Ergebnisse der anschließend durchgeführten Versuche der Zelllinie SH-SY5Y nach 24 h abgelesen.
3.3.1.5 Zellproliferationsassay mit Zusatz von Bortezomib (Velcade ®)
Auf den einzelnen Mikrotiterplatten wurde jeder Versuch in einem Fünffachansatz
durchgeführt. Jeder Versuch wurde in mindestens vier unabhängigen Versuchen wiederholt,
dieses Vorgehen galt für alle sieben Zelllinien, die mit Bortezomib getestet wurden. Zu Beginn
wurden 80 µl Medium in die Vertiefungen als Leerwert für den Zellproliferationsassay
pipettiert. Die restlichen Vertiefungen wurden jeweils mit 80 µl der erstellten optimalen
Zellkonzentration gefüllt. Anschließend wurden die pipettierten Mikrotiterplatten für 24
Stunden im Brutschrank (unter Standardbedingungen) inkubiert, um ein ideales Anwachsen
Material und Methoden
14
der Zellen zu gewährleisten. Die Testlösungen wurden hergestellt, indem die Stammlösung
von Bortezomib (1 mg / ml) mit PBS in einer Verdünnungsreihe (1:10) versetzt wurde.
Insgesamt wurden sechs verschiedene Konzentrationen in einer Verdünnungsreihe von 100
µg / ml bis 0,001 µg / ml des Bortezomib hergestellt. 20 µl dieser Verdünnungen wurden
dann jeweils zu den 80 µl Medium in die Vertiefungen gegeben. Dies entsprach dann einer
Endkonzentration von 20 µg / ml bis 0,0002 µg / ml des Medikamentes. Die Mikrotiterplatte
wurde nach Medikamentengabe für weitere 48 Stunden im Brutschrank (unter
Standardbedingungen) inkubiert.
72 Stunden nach dem Aussäen der Zelllinien, wurde zur Auswertung der Cell Proliferation Kit
II (XTT) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) verwendet. Von dieser XTT-Lösung wurden
anschließend 50 µl in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben. Bei den Zelllinien Kelly,
LAN-1, LAN-5, SK-N-SH, LS und IMR-32 wurden nach 6 Stunden und bei der Zelllinie SH-
SY5Y nach 24 Stunden bei einer Testfilter-Wellenlänge von 490 nm und einer Referenzfilter-
Wellenlänge von 630 nm die Messungen durchgeführt. Die Ergebnisse der Kontrolle dienten
dann bei der Auswertung des Proliferationsassays als 100% Zellwachstum, zu denen die
übrigen Werte in Relation gesetzt wurden.
3.4 Charakterisierung von Bortezomib in vivo
3.4.1 Severe combined immuno deficiency Mausmodell
3.4.1.1 Versuchstiere
Die Versuche wurden an männlichen und weiblichen severe combined immuno deficiency
(scid) Mäusen der Firma Charles River durchgeführt. Die Tiere sind in der 48. Kalenderwoche
2005 geboren und waren zu Versuchsbeginn 15 Wochen alt. Die Tiere hatten im Mittel ein
Gewicht von 25 g mit einer Standardabweichung von 3,2 g. Die Haltung erfolgte in Filter-Top
Käfigen in Gruppen zu jeweils 5 Tieren bei einer Raumtemperatur von 19 – 21° C und unter
Beibehaltung des normalen Tag-Nacht-Rhythmus (Dunkelphase von 19 – 7 Uhr). Die Tiere
erhielten steriles Wasser und steriles Standard-Einstreufutter (sniff M-Z Alleindiät extrudiert,
sniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland) ad libitum und wurden mindestens 6 – 8 Tage
vor Versuchsbeginn zur Akklimatisierung und Eingewöhnung im Tierstall des
Universitätsklinikums Hamburg–Eppendorf (Haus Süderfeldstraße) gehalten. Der im Rahmen
dieser Arbeit durchgeführte Tierversuch wurde nach § 8 des Tierschutzgesetzes von 1998 der
Bundesrepublik Deutschland unter der Versuchsnummer: 64 / 05 von der Behörde für Umwelt
und Gesundheit in Hamburg genehmigt.
Material und Methoden
15
Während der Studie ist die scid-Maus Nr. 8.3 (Bortezomibgruppe) aus unbekannter Ursache
verstorben. Es gab keine Anzeichen dafür, dass der Tumor oder die Behandlung mit
Bortezomib Einfluss auf den Gesundheitszustand des Tieres genommen hatten.
3.4.2 Behandlung der Tiere
Für den Tierversuch wurde die Zelllinie SK-N-SH ausgewählt, da diese Zelllinie in bereits
durchgeführten Tierversuchen unseres Institutes ein gutes Tumorwachstum und eine hohe
Freiburg, Deutschland). Von den Primärtumorblöcken wurden zusätzlich Schnitte für die
Immunhistologie gewonnen.
Die HE gefärbten Schnitte der Primärtumoren wurden anschließend mittels Lichtmikroskopie
auf die Anzahl ihrer Apoptosen und Mitosen untersucht. Hierzu wurde ein Okular mit
Gitternetz benutzt, welches aus 10 mal 10 Kästchen bestand. Es wurden die vitalen Areale
des Primärtumors bestimmt und anschließend eine Zählung von 100 Zellen vorgenommen,
die in apoptotische Zellen, mitotische Zellen und normale Zellen eingeteilt wurden. Dieses
wurde an vier weiteren Bereichen des vitalen Primärtumorgewebes durchgeführt, so dass
Material und Methoden
17
insgesamt 500 Zellen ausgewertet wurden. Insgesamt wurde diese Zellzählung drei Mal
durchgeführt.
Zusätzlich wurde eine Bestimmung des Nekroseanteils mittels Lichtmikroskopie durchgeführt.
Dieses wurde durch eine prozentuale Einschätzung des vitalen und nekrotischen
Primärtumorgewebes durchgeführt.
3.4.3.1.2 Elektronenmikroskopie
Für die Elektronenmikroskopie wurden etwa 1 x 1 x 1 mm3 Gewebestücke von den Tumoren
der scid-Mäuse in 3,5% Glutaraldehyd und in 0,1 Phosphatpuffer fixiert. Anschließend erfolgte
eine Nachfixierung mit Osmiumtetroxid (1% Osmiumtetroxidin 0,1 M Phosphat-Saccarose-
Puffer) für zwei Stunden und anschließend wurde das Gewebe in einer aufsteigenden
Ethanolreihe (35% - 100%) dehydriert. Nach Spülung in Propylenoxid wurden die
Gewebestücke in Glycidether (Serva, Heidelberg, Deutschland) eingebettet. Der Primärtumor
wurde unter der Stereolupe aufgeblockt. Jetzt konnten 80 - 100 nm ultradünne Schnitte mit
dem Sorvall Porter-Blum MT2-B ULTRA-MICROTOME (Norwalk, Connecticut, USA) von den
Neuroblastomen angefertigt werden. Nach Kontrastierung mit 1% Uranylacetet und Bleicitrat
wurden die Schnitte mit einem Philips CM100 Transmissions-Elektronenmikroskop untersucht.
3.4.3.2 Lungenmetastasierung
Die vorher eingebetteten Lungen wurden ebenfalls in 5 µm dicke Paraffinschnitte geschnitten.
Die Lungen wurden komplett in Serie aufgeschnitten, wobei jeder zehnte Schnitt in ein
Wärmebad überführt und auf einen beschichteten Objektträger (Histo Bond, Marienfeld,
Deutschland) aufgenommen wurde. Von den Lungenblöcken wurden zusätzlich aus der Mitte
heraus jeweils 2 mal 20 Schnitte für die Immunhistologie gewonnen. Nach 24 Stunden im
Wärmeschrank bei 37° C waren die Schnitte getrocknet, so dass sie dann weiter HE gefärbt
wurden. Dieses wurde nach einem Standardprotokoll in einem Färbeautomaten (Varistain,
Shandon, Frankfurt, Deutschland) durchgeführt.
Die HE gefärbten Schnitte der Lungen wurden lichtmikroskopisch bei 100 facher
Vergrößerung betrachtet und die Anzahl der Metastasen gezählt. Dabei wurde mäanderförmig
über den Objektträger gefahren, um alle Flächen des Schnittes zu erfassen und gleichzeitig
eine fehlerhafte Doppelzählung von Lungenmetastasen auszuschließen. Die
Lungenmetastasen stellen sich in der HE-Färbung unter dem Lichtmikroskop deutlich
Material und Methoden
18
abgegrenzt zum umgebenden Lungengewebe (Parenchym und Stroma) dar. Die Schnitte
wurden jeweils zweimal durchgemustert. Die Metastasen der 10 mittleren HE-gefärbten
Serienschnitte wurden unter dem Lichtmikroskop ausgezählt. Die Anzahl der
Lungenmetastasen der mittleren 10 Schnitte einer Lunge wurden addiert und ein Mittelwert für
die Anzahl an Lungenmetastasen pro Schnitt gebildet. Dieser wurde mit der Gesamtzahl der
Schnitte einer Lunge multipliziert. Anschließend wurden von dem so errechneten Wert 20%
subtrahiert. Das so erhaltene Ergebnis gibt die Anzahl an Lungenmetastasen in der gesamten
Lunge wieder (Jojovic und Schumacher, 2000).
3.4.4 Disseminierte Tumorzellen im Blut
Für die Untersuchung der Anzahl der freien Tumorzellen im Blut der scid-Mäuse wurde eine
Real-time Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Dazu wurde das LightCycler-
System. LightCycler 2.0 der Firma Roche (Mannheim, Deutschland) benutzt.
Zur DNA Extraktion aus dem Blut wurde das QIAampDNA Blood Mini Kit 250 (Qiagen,
Hilden, Deutschland) verwendet. Die Herstellung des LightCycler Master Mixes (LightCycler
Fast Start DNA Master Plus SYBR Green Ι Cat No. 03515885001, Roche, Mannheim,
Deutschland) wurde nach Angaben des Herstellers zubereitet. Dieses QIAampDNA Blood
Mini Kit 250 besteht aus dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green Ι, einer Taq DNA
Polymerase, einem Taq PCR Puffer, einer Nukleotidmixtur und 1 mmol MgCl2. Für eine
Blutprobe wurde ein 8 µl Arbeitsmastermix hergestellt. Dieser beinhaltete 100 pmol des ALU-
Primers forward (TGGCTCACGC CTGTAATCCC A) und 100 pmol des ALU-Primers reverse
(GCCACTACGC CCGGCTAATT T) (freundlicherweise von Frau Dr. Nehmann zur Verfügung
gestellt). Dazu wurde der LightCycler Master Mix und ddH2O gegeben.
Nachdem die Proben für 10 min bei 95° C erhitzt wurden, erfolgte die Denaturierung für 5 s.
Anschließend erfolgte das Annealing für 5 s bei 67° C und danach die Elongation bei 72° C
für 20 s. Nach diesem Zyklus wurde dann die Messung durchgeführt. Es wurden für jede
Probe 45 Zyklen durchgeführt. Durch die mitlaufenden Eichkurvenproben bestehend aus
sieben Proben von 106 Tumorzellen bis zu 100 Tumorzellen, konnte anschließend der
Rückschluss auf die Anzahl der freien Tumorzellen der scid-Mäuse im Blut hergestellt werden.
Zusätzlich liefen immer zwei Negativproben bestehend aus H2O und scid-Kontroll-DNA mit,
um sicherzustellen, dass die Messungen ordnungsgemäß abgelaufen waren.
Material und Methoden
19
Nach der PCR wurde eine Schmelzkurvenanlayse durchgeführt, anhand derer die Spezifität
der Produkte bestimmt wurde. Jede DNA-Probe wurde mindestens drei Mal analysiert. Die
Datenverarbeitung erfolgte mit der gerätespezifischen LightCycler™ Software 3.5 (Roche,
Mannheim, Deutschland).
3.4.5 Imaging
3.4.5.1 Magnetresonanztomographie
Vier Wochen nach der Inokulation der humanen Neuroblastomzellen wurde bei acht scid-
Mäusen ein Imaging mittels der Magnetresonanztomografie (MRT) durchgeführt. Dabei
stammten jeweils vier scid-Mäuse aus der Kontrollgruppe und vier Tiere aus der
Bortezomibgruppe. Für die Untersuchungen wurden die scid-Mäuse gewogen und mit einem
Gemisch aus Rompun-Ketanest anästhesiert (0,8 ml Rompun 2% (Bayer Leverkusen,
Deutschland) und 1,2 ml Ketamin Gräub (100 mg / ml; Albrecht, Aulendorf, Deutschland) in 8
ml 0,9% NaCl). Es wurden 0,1 ml / 10 g Mauskörpergewicht verabreicht. Nach Erreichen der
Narkosetiefe, wurden die scid-Mäuse auf einer speziellen Kunststofftrage fixiert und diese
dann in der MRT-Kleintierspule gelagert.
Die MRT-Untersuchungen erfolgten mit einem 3-Tesla-Ganzkörpergraphen (Intera Philips,
Best, Niederlande). Es wurde eine splenoidförmige Kleintierspule mit einem
Innendurchmesser von 7 cm als Empfangsspule verwendet (Philips Forschungslabor,
Hamburg). Zur Übersicht wurden T1 gewichtete Gradientenechosequenzen in drei Ebenen
angefertigt (Survey). Anschließend erfolgte die Akquisition hochauflösender T1 gewichteter
Gradientenecho- und T2 gewichteter Turbo-Spinecho-Sequenzen in sagittaler, coronaler und
axialer Schichtführung. Es wurden die folgenden Sequenzparameter verwendet: (T1
Gewichtung) TR 424 ms, TE 4,9 ms, Flip 45°; FOV 90 mm, Matrix 400 x 400, Schichtdicke 1
mm, Schichtabstand 0,1 mm, Zeit 5:57,9 min; (T2 Gewichtung) TR 3438,4 ms; TE 90 ms; Flip
90°; FOV 90 mm; Matrix 400 x 400; Schichtdicke 0.6 mm; Schichtabstand 0,06 mm, Zeit
6:04,5 min. Die gesamte Untersuchungszeit pro Maus betrug circa 30 Minuten.
Material und Methoden
20
Abb. 3: MRT (Tesla-Ganzkörpergraphen) mit Kleintierspule und spezieller Auflage zur Mauslagerung. Das Foto wurde freundlicherweise von Herrn Dr. med. Kersten Peldschus zur Verfügung gestellt.
Die Auswertung der Bilddaten zur Bestimmung der Tumorgrößen erfolgte durch Mitarbeiter
der Forschungsgruppe VOXEL-MAN (Institut für Mathematik und Datenverarbeitung in der
Medizin, UKE, Hamburg). Es wurde ein halbautomatisches Segmentationsverfahren
basierend auf der interaktiven Festlegung von Schwellenwertbereichen (verschiedene
Grauabstufungen des Tumors) und der anschließenden, automatischen Erfassung
zusammenhängender Volumenelemente (Voxel) im Bereich der Tumore angewandt. Die
korrespondierenden Tumorvolumina wurden jeweils aus der Anzahl der segmentierten Voxel
Weiterhin wurde ein Imaging mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) / Computer-
Tomographie (CT) bei 36 Versuchstieren durchgeführt. Die scid-Mäuse wurden in zwei
Gruppen eingeteilt. Jede Gruppe bestand aus scid-Mäusen der Behandlungsgruppe und der
Kontrollgruppe. Als Tracer wurden [18F]FDG und [18F]FLT (ABX Advanced Biochemical
Compounds, Radeberg, Deutschland) benutzt. Diese wurden dann in jeweils 18 Mäuse
appliziert. Je 13 MBq von [18F]FDG und [18F]FLT wurden über die Schwanzvene jeder scid-
Maus verabreicht. Nach 60 min wurden die Tiere durch intraperitoneale Injektion bestehend
aus einem Gemisch aus Rompun-Ketanest (0,8 ml Rompun 2% (Bayer Leverkusen,
Material und Methoden
21
Deutschland) und 1,2 ml Ketamin Gräub (100 mg / ml; Albrecht, Aulendorf, Deutschland) in 8
ml 0,9% NaCl) betäubt. Wie auch schon bei vorherigen Betäubungen wurden 0,1 ml / 10 g
Mauskörpergewicht gespritzt. Nach Erreichen der Narkosetiefe wurden die Tiere auf einem
Gerüst platziert und in das PET-CT gefahren. Dynamische PET Aufnahmen wurden für 45 min
unter Verwendung eines konventionellen Vollringes, Ganzkörper PET durchgeführt (Gemini
GXL 10 PET/CT System, Philips Medical Systems, Deutschland).
Abb. 4: Untersuchung der scid-Mäuse im PET-CT mit Tierreck. Hierbei ist es möglich 18 Tiere zeitgleich zu untersuchen. Das Foto wurde freundlicherweise von Herrn Dr. med. Kersten Peldschus zur Verfügung gestellt.
Nach der Durchführung der Untersuchung wurde zunächst durch die CT - Aufnahmen die
anatomische Zuordnung der Strukturen im PET ermöglicht. Anschließend wurden die Bilder
visuell beurteilt und die Stärke der Anreicherung von den radioaktiven Substanzen [18F]FDG
und [18F]FLT beurteilt (freundlicherweise erfolgte dieses durch die Abteilung für
Nuklearmedizin des UKE). Die visuelle Interpretation wurde wie folgt festgelegt: War keine
Anreicherung erkennbar, wurde dieses mit 0 betitelt. Mit 1 wurde ein stärkeres Signal als das
Hintergrundrauschen angegeben. Mit 2 wurde eine Aufnahme der radioaktiven Substanz
betitelt, die stärker war als die des Referenzorgans Leber für [18F]FLT oder die des
Referenzorgans Gehirn für [18F]FDG.
Material und Methoden
22
3.5 Statistische Auswertung
Die Ergebnisse der XTT-Tests sind als Mittelwert ± SD von mindestens vier unabhängigen
Versuchen dargestellt. Die Absorption der unbehandelten Kontrollzellen wurde dabei einer
Zellzahl von 100 % gleichgesetzt, die Absorption der behandelten Zellen entsprach dem
prozentualen Anteil der Kontrolle. Mittels des t-Tests (ungepaart) konnte dann für alle oben
genannten Untersuchungen ermittelt werden, ab welcher Konzentration des Bortezomibs eine
signifikante Hemmung im Vergleich zum Kontrollwert vorhanden war.
Primärtumorgewicht, Anzahl an Apoptosen, Mitosen und nekrotischen Arealen in den
Primärtumoren, sowie die Anzahl an disseminierten Tumorzellen im Blut von Kontroll- und
Bortezomibgruppe wurden verglichen, um auch hier die Wirkung von Bortezomib auf das
Neuroblastomzellwachstum in vivo zu untersuchen.
Die Ergebnisse der in vivo Versuche wurden auf ganze Zahlen auf- bzw. abgerundet.
Für alle statistischen Berechnungen und Graphen wurde die Software Graph Pad Prism
(Graph Pad TM, San Diego, USA) verwendet, wobei p-Werte <0,05 als statistisch signifikant
bewertet wurden.
Ergebnisse
23
4 Ergebnisse
4.1 Wirkung von Bortezomib in vitro
Die Wirkung von Bortezomib wurde an humanen Neuroblastomzellen untersucht. Dafür wurde
der Effekt einzelner Konzentrationen von Bortezomib auf die Zelllinien Kelly, SK-N-SH, SH-
SY5Y, LAN-1, LAN-5, IMR-32 und LS getestet. Wenn eine bestimmte Konzentration von
Bortezomib nur bei drei oder weniger Zelllinien eine Wirkung zeigte, wurden statistisch
signifikante Effekte von weniger als 20% als biologisch nicht relevant eingestuft (Valentiner et
al., 2005). Bortezomib verursachte eine dosisabhängige Wachstumsinhibierung bei allen
untersuchten Neuroblastomzelllinien. Die IC50 Werte der sieben Zelllinien reichten von 1,9 ng /
ml (SH-SY5Y) zu 8,4 ng / ml (LAN-1).
Bei der Zelllinie LS kam es bei einer Konzentration des Bortzomibs von 0,0002 µg / ml und
0,002 µg / ml zu keinerlei Veränderung der Zellproliferation. Erst ab einer Konzentration von
0,02 µg / ml Bortezomiblösung kam es zu einem massiven Abfall der Zellzahl auf 6,9%
(p<0,001) der Kontrolle. Bei einer Konzentration von 2 µg / ml und 20 µg / ml wurde die
Proliferation auf 1,5% der Kontrolle gesenkt.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102
0
25
50
75
100
125
Bortezomib [µg/ml]
Zell
zah
l [%
]
Abb. 5: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie LS. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweilige Konzentration.
Bei der Zelllinie Kelly setzte die inhibitorische Wirkung ebenfalls erst bei einer Konzentration
von 0,02 µg / ml Bortezomib ein. Die Zellzahl erreichte nur noch 7,8% (p<0,001) des
Ergebnisse
24
Kontrollwertes. Bei einer Konzentration von 20 µg / ml und 2 µg / ml wurde die Proliferation
auf 5% der Kontrolle gehemmt.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102
0
25
50
75
100
125
Bortezomib [µg/ml]
Zell
zah
l [%
]
Abb. 6: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie Kelly. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweilige Konzentration.
Bei der Zelllinie SK-N-SH konnten ähnliche Werte wie bei den Zelllinien LS und Kelly erzielt
werden. Hier lag die Zellzahl bei den Konzentrationen von 0,02 µg / ml bis 20 µg / ml
Bortezomib bei ca. 9% (p<0,001). Bei einer Konzentration von 0,002 µg / ml kam es lediglich
zu einem leichten Abfall auf 96% (p< 0,05) des Kontrollwachstums.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102
0
25
50
75
100
125
Bortezomib [µg/ml]
Zell
zah
l [%
]
Abb. 7: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie SK-N-SH. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweiligen Konzentrationen.
Bei der Zelllinie SH-SY5Y zeigte sich bereits ab einer Konzentration des Bortezomibs von
0,002 µg / ml ein massiver Abfall auf 39% (p<0,001) des Kontrollwachstums. Hier lag die
Ergebnisse
25
stärkste Inhibition bei einer Konzentration von 0,02 µg / ml. Hierbei konnte die Proliferation
auf 2,5% der Kontrolle (p<0,001) gehemmt werden.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102
0
50
100
150
Bortezomib [µg/ml]
Zell
zah
l [%
]
Abb. 8: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20)
Bei der Zelllinie IMR-32 zeigte sich eine statistisch signifikante Änderung der Zellzahl ab 0,02
µg / ml Bortezomib (p<0,001). Hierbei wurde die Proliferation auf 23% des Kontrollwertes
gehemmt. Wie bei der Zelllinie SH-SY5Y lag auch hier die stärkste Proliferationshemmung
(16,4% der Kontrolle, p<0,001) bei einer Bortezomibkonzentration von 0,2 µg / ml.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102
0
25
50
75
100
125
Bortezomib [µg/ml]
Zell
zah
l [%
]
Abb. 9: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie IMR-32. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweiligen Konzentrationen.
Ergebnisse
26
Eine signifikante Hemmung konnte auch bei der Zelllinie LAN-1 erreicht werden. Wieder kam
es bei einer Konzentration von 0,002 µg / ml Bortezomib nur zu einer leichten Hemmung auf
93% (p<0,05) des Kontrollwachstums. Jedoch konnte dann ein kontinuierlicher Abfall der
Proliferation auf 30% (p<0,001) bei einer Konzentration von 0,02 µg / ml bis hin zu einer
Hemmung auf 5% (p<0,001) des Kontrollwertes bei einer Konzentration von 2 µg / ml
Bortezomib beobachtet werden.
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102
0
25
50
75
100
125
Bortezomib [µg/ml]
Zell
zah
l [%
]
Abb. 10 Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie LAN-1. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweilige Konzentration.
Bei der Zelllinie LAN-5 konnten ähnliche Ergebnisse erzielt werden wie bei LAN-1. Hier wurde
ebenfalls bei einer Konzentration von 0,002 µg / ml Bortezomib die Proliferation auf 87%
(p<0,01) nur leicht gesenkt. Eine deutliche Hemmung wurde bei einer Konzentration von 0,02
µg / ml auf 27% (p<0,001) des Kontrollwachstums erzielt. Durch die höheren Konzentrationen
konnte dann eine ausgeprägte Wachstumshemmung bei 20 µg / ml Bortezomib auf 3% der
Kontrolle (p<0,001) erzielt werden.
Ergebnisse
27
10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102
0
25
50
75
100
125
Bortezomib [µg/ml]
Zell
zah
l [%
]
Abb. 11: Hemmende Wirkung von Bortezomib auf die humane Neuroblastomzelllinie LAN-5. Dargestellt sind Mittelwert ± SEM (n = 20) für die jeweiligen Konzentrationen.
Bei allen Zelllinien bis auf SK-N-SH traten deutliche Schwankungen der einzelnen Ergebnisse
innerhalb der Versuche, insbesondere bei einer Bortezomibkonzentration von 0,002 µg / ml,
auf.
Substanz Lebende Zellen (% von der Kontrolle) SH-SY5Y SK-N-SH IMR-32 LAN-5 LAN-1 LS Kelly Bortezomib
0.0002 µg / ml
0.002 µg / ml
0.02 µg / ml
0.2 µg / ml
2 µg / ml
20 µg / ml
IC50 (µg / ml)
112 ***
39 ***
2 ***
3 ***
8 ***
11 ***
0.0019
103 n.s.
97 n.s.
9 ***
9 ***
10 ***
9 ***
0.0034
102 n.s.
94 *
23 ***
16 ***
19 ***
20 ***
0.0056
104 *
87 **
28 ***
16 ***
7 ***
3 ***
0.0074
103 n.s.
93 *
31 ***
23 ***
10 ***
5 ***
0.0084
104 n.s.
101 n.s.
7 ***
3 ***
1 ***
2 ***
0.0078
102 n.s.
100 n.s.
8 ***
5 ***
5 ***
5 ***
0.0064
Tab. 4: Effekte von Bortezomib auf die sieben getesteten Neuroblastomzelllinien. Die Zahlen repräsentieren die Anzahl von lebenden Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Der IC50 gibt die Konzentration an, bei der die Hälfte der Gesamtwirkung erreicht wurde. Die statistische Analyse wurde mittels des Student´s t-test (ungepaart) durchgeführt. n.s.= nicht signifikant.* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.
Ergebnisse
28
4.2. Wirkung von Bortezomib in vivo
Um die Wirkung von Bortezomib in vivo zu untersuchen, wurden 40 scid-Mäuse mit humanen
SK-N-SH Neuroblastomzellen beimpft. Diese Zelllinie wurde verwendet, da sie bereits bei
durchgeführten Tierversuchen unseres Institutes ein gutes Tumorwachstum und eine hohe
Metastasierungsrate aufwies (Ursula Valentiner, unveröffentlicht). Weiterhin wurde die
Zellproliferation dieser Zelllinie in vitro durch Bortezomib inhibiert.
Die Tiere wurden in 2 Gruppen eingeteilt, die eine Gruppe erhielt den Proteasomeninhibitor
Bortezomib (Konzentration 1 mg / kg KG) und die Kontrollgruppe erhielt PBS. Am Ende der
Versuchszeit von vier Wochen wurden acht Tiere (vier Tiere aus jeder Gruppe) mittels MRT
und 36 scid-Mäuse (jeweils 18 aus jeder Gruppe) mittels PET / CT untersucht. Zudem wurden
die entnommenen Primärtumore und Organe durch histologische Färbungen und das Blut der
Tiere mit Hilfe der Real-time PCR untersucht.
4.2.1 Primärtumor
Nach der Tötung der scid-Mäuse wurden die Primärtumoren entnommen und gewogen. Es
konnte kein signifikanter Unterschied des Primärtumorgewichtes (p<0,84) zwischen
Kontrollgruppe (0,29 g) und der mit Bortezomib behandelten Gruppe (0,26 g) festgestellt
werden (Abb. 12).
Abb. 12: Tumorgewicht der mit PBS behandelten Kontrollgruppe und der mit Bortezomib behandelten Gruppe. Gezeigt ist der Mittelwert ± SEM.
Kontrolle Bortezomib0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Tu
mo
rgew
ich
t [g
]
Ergebnisse
29
4.2.1.1 Lichtmikroskopie
Die Neuroblastomzellen des Primärtumores präsentierten sich als eher runde, undifferenzierte
Zellen und waren dicht gepackt. Einzig in der Zellperipherie waren die Zellen lockerer gepackt.
Die Primärtumoren enthielten wenig Stroma; in ihrem Zentrum waren ausgeprägte eosinophile
nekrotische Areale zu erkennen. Weiterhin wiesen die malignen Zellen eine zum Kern hin
verschobene Kern-Plasma-Relation auf und zeigten atypische polymorphe und polyzyklische
Zellkerne, prominente Nukleoli und Mitosen. In der HE Färbung wurden die apoptotischen
Zellen durch dunkel gefärbte und kondensierte Chromosomen dargestellt. Mitosen zeigten
sich durch mitotische Figuren von kondensierten Chromosomen.
In der vorliegenden Arbeit wurde bei den entnommenen Primärtumoren die Prozentzahl der
Apoptosen und der Mitosen bestimmt. Sowohl die Anzahl der Apoptosen als auch die Anzahl
der Mitosen wiesen einen hochsignifikanten Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der
mit Bortezomib behandelten Gruppe auf. In der Kontrollgruppe befanden sich 5% der Zellen in
Apoptose, während sich in der Behandlungsgruppe 10% der gezählten Zellen in Apoptose
befanden (p<0,001). Die Mitoserate der Kontrollgruppe betrug im Mittel 6,5% und die der
Bortezomibgruppe 5% (p<0,001). In den folgenden Abbildungen (Abb.13 – 16) sind die
histologischen Präparate und die dazugehörigen Ergebnisse der Anzahl an Apoptosen und
Mitosen graphisch dargestellt. Der Anteil an Nekrose im Primärtumor und das histologische
Präparat eines Kontrollgruppentieres sind in Abb. 17 und 18 dargestellt.
Ergebnisse
30
Abb. 13: Primärtumorareal einer behandelten scid-Maus mit hohem Apoptoseanteil (HE Färbung). Mit � sind einige Apoptosen gekennzeichnet.
Abb. 14: Anzahl der Apoptosen in den Primärtumoren der Kontrollgruppe und der Bortezomibgruppe. Gezeigt ist der Mittelwert ± SEM (n=15). Durch die Bortezomibbehandlung kam es zu einer statistisch signifikanten Steigerung der Apoptose in den Primärtumoren (p< 0,001).
Kontrolle Bortezomib
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
***
An
zah
l d
er
Ap
op
tosen
Ergebnisse
31
Abb. 15: Primärtumorareal mit Mitosen (HE Färbung). Mit � sind einige Mitosen gekennzeichnet.
Abb. 16: Anzahl der Mitosen in den Primärtumoren der Kontrollgruppe und der mit Bortezomib behandelten Gruppe. Gezeigt ist der Mittelwert ± SEM (n=15). Durch die Behandlung mit dem Medikament Bortezomib kam es zu einer Herabsetzung der Mitosenanzahl in den Tumoren (p< 0,001).
Kontrolle Bortezomib
0
1
2
3
4
5
6
7
***
Mit
ose A
nza
hl
Ergebnisse
32
Darüber hinaus wurde der Nekroseanteil der entnommenen Primärtumore bestimmt. Hierbei
zeigte sich kein signifikanter Unterschied in den Nekrosebezirken zwischen der mit
Bortezomib behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe.
Abb. 17: Übersichtsaufnahme eines Primärtumores mit hohem Nekroseanteil (HE Färbung). Das Nekroseareal ist durch � gekennzeichnet.
Abb. 18: Prozentuale Abschätzung des Nekroseanteils der Primärtumoren der Kontrollgruppe versus Bortezomibgruppe. Dargestellt ist der Mittelwert ± SEM (n=15). Es konnte kein signifikanter Unterschied des Nekroseanteiles zwischen den beiden Gruppen festgestellt werden.
Kontrolle Bortezomib0
10
20
30
40
50
60
70
Nekro
sean
teil
[%
]
Ergebnisse
33
4.2.1.2 Elektronenmikroskopie
Die Neuroblastomzellen wuchsen im Randbereich des Tumors invasiv in Blutgefäße und
Muskulatur (Abb. 19). Dabei drängten sie sich zwischen die Skelettmuskelzellen und
proliferierten in diesen Zwischenräumen. Teilweise dellten die Tumorzellen die
Skelettmuskelfasern lokal ein.
Abb. 19: Infiltration des Neuroblastoms in die Skelettmuskulatur. Man erkennt, dass die Tumorzellen infiltrativ zwischen die Skelettmuskelfasern eingewachsen sind. Zwischen den Tumorzellen befinden sich deutlich sichtbare Interzellularräume (Pfeile), ihre Zellkerne enthalten meist einen deutlichen Nukleolus.
Ergebnisse
34
Abb. 20: Zentrale Nekrose des Neuroblastoms. Als Reste der abgestorbenen Tumorzellen findet man leere Plasmalemmvakuolen (mit � gekennzeichnet). In den zentralen Anteilen der Neuroblastome findet sich eine ausgeprägte Nekrose. Die Zellkerne der untergehenden Zellen zeigen randständig viel Heterochromatin (vergleiche mit der Kernstruktur vitaler Tumorzellen in Abb. 19). Einige der apoptotischen Zellen sind mit � gekennzeichnet.
Ergebnisse
35
4.2.2 Lungenmetastasierung
Um den Einfluss des Proteasomeninhibitors Bortezomib auf die Lungenmetastasierung zu
untersuchen, wurden HE gefärbte Schnitte angefertigt und die Anzahl der Metastasen mittels
Lichtmikroskopie bestimmt. Nach Berechnung mittels der Formel von Jojovic und Schumacher
(2000), wurde die Gesamtanzahl der Metastasen in den Lungen bestimmt.
Es wurden keine Metastasen in den Lungen der Bortezomibgruppe gefunden. Hingegen
konnten Lungenmetastasen in 5 Lungen von insgesamt 20 scid-Mäusen der Kontrollgruppe
nachgewiesen werden. Die Anzahl der Lungenmetastasen betrug 42, 168, 192, 24 und 48 in
den jeweiligen Kontrollmäusen.
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.00
50
100
150
200
Tumorgewicht [g]
An
zah
l d
er
Meta
sta
sen
Abb:21: Anzahl der Metastasen in den fünf Lungen der Kontrollgruppe der scid-Mäuse. Die Anzahl der Metastasen wurde nach der Formel von Jojovic und Schumacher (2000) berechnet (Mittelwert 95, SEM 35). Es bestand keine Korrelation zwischen Tumorgewicht und Anzahl der Metastasen.
Die Metastasen waren sowohl in den Lungenarterien als auch in den Alveolarsepten zu
finden. Die malignen Zellen wiesen eine zugunsten des Kernes verschobene Kern-Plasma-
Relation und ovale, z.T. eingedellte Zellkerne mit prominenten Nukleoli auf. Die Metastasen
grenzten sich gut gegen das restliche Lungengewebe ab (Abb. 22).
Ergebnisse
36
Abb. 22: Lunge eines Kontrolltieres mit Metastasen (HE Färbung). Die Pfeile � markieren Metastasen im Lungengewebe. Sie liegen in den Ästen der A. pulmonalis und im periarteriellen Raum. Die malignen Zellen weisen eine verschobene Kern-Plasma-Relation und atypische Zellkerne mit prominenten Nukleoli auf und grenzen sich gut gegen das Lungengewebe ab.
4.2.3 Disseminierte Tumorzellen im Blut
In Abbildung 23 ist ein typischer LightCycler Lauf dargestellt. Bei Zunahme der Anzahl der
Durchgänge kommt es zu einer Amplifikation der DNA. Es besteht eine Abhängigkeit
zwischen der Anzahl der freien Tumorzellen im Blut und der Anzahl der Zyklen die benötigt
werden, um einen Anstieg der Amplifikationskurve auszulösen. Bei wenigen DNA-Zyklen ist
ein Anstieg der Amplifikationskurve nur bei den ersten fünf Proben der Eichreihe zu erkennen
(Abb. 23). Probe 1 der Eichkurve (106Tumorzellen) zeigte eine erkennbare Amplifikation nach
sechs Zyklen, Probe 2 (105 Tumorzellen) nach acht Zyklen, Probe 3 (104 Tumorzellen) nach
zwölf Zyklen, Probe 4 (103 Tumorzellen) nach 15 Zyklen und Probe 5 (102 Tumorzellen) nach
18 Zyklen. Bei Probe 6 der Eichkurve (101 Tumorzellen) zeigte sich ein Anstieg der Kurve erst
nach ca. 21 Amplifikationszyklen. Hierbei gab es schon einzelne DNA-Proben der scid-Mäuse,
bei denen ein Anstieg vor der letzten Eichprobe zu beobachten war. Die danach folgenden
Kurven der DNA-Proben der scid-Mäuse der Kontrollgruppe wiesen demnach nur noch
geringe Anzahlen an freien Tumorzellen auf. Zur besseren Übersicht zeigt Abbildung 24 den
Kurvenverlauf von einigen Blutproben ohne die Eichkurve. Die erste DNA-Probe der scid-
Mäuse verzeichnete nach 22 Zyklen der Amplifikation einen Anstieg. Für die weiteren DNA-
Ergebnisse
37
Proben der Tiere waren weitere Zyklen erforderlich, um einen Nachweis von freien
Tumorzellen zu erzielen.
Mittels der Real-time PCR wurde festgestellt, dass es keine Differenz in der Anzahl der freien
Tumorzellen (15 freie Tumorzellen) zwischen der Kontrollgruppe und der behandelten Gruppe
gab (Abb. 25).
Abb. 23: LightCyclerlauf der Kontrollgruppe. Die vertikale Achse zeigt den Grad an Amplifikationen des SYBR-Green Ι Fluoreszenz und die horizontale Achse repräsentiert die Anzahl an Zyklen der Amplifikation.
Abb. 24: Blutproben der Kontrollgruppe in einem LightCyclerlauf. Nach 22 Zyklen konnte bei der ersten
Probe der scid-Maus aus der Kontrollgruppe ein Anstieg der Kurve verzeichnet werden. Für die anderen DNA-
Proben waren mehr Zyklen notwendig, um den Anstieg der Kurve und somit einen Nachweis von freien
Tumorzellen zu erzielen. Der Pfeil markiert die erste Probe.
Ergebnisse
38
Abb. 25: Anzahl der freien Tumorzellen im Blut. Die Menge der freien Tumorzellen wurde anhand der DNA – Konzentration bestimmt. Gezeigt ist der Vergleich von freien Tumorzellen zwischen der Kontrollgruppe und der Bortezomibgruppe. Dargestellt ist der Mittelwert ± SEM. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten der beiden Gruppen.
Kontrolle (n=20) Bortezomib (n=19)
Tumorgewicht (g) n.s. 0,29 (±0,05) 0,26 (±0,05)
Lungenmetastasen 5 von 18 (28%) Mäusen, Anzahl der Lungenmetastasen: 42; 168; 192; 24; 48.
0
Anzahl von apoptotischen
Zellen im Tumor (%) *** 5,04 (±0,18) 10,00 (±0,25)
Anzahl von mitotischen
Zellen im Tumor (%) *** 6,56 (±0,17) 5,08 (±0,12)
Anzahl von nekrotischen
Anteilen im Tumor (%)
n.s.
62,5 (±4,11) 56,6 (±5,30)
Disseminierte
Tumorzellen im Blut
(Zellen/ml) n.s.
1,36 (±0,12) 1,38 (±0,17) (n=18)
Tab. 5: Effekte von Bortezomib auf das Wachstum der humanen SK-N-SH Neuroblastom Zelllinie in einem scid-Mausmodel. Die Ergebnisse repräsentieren den Mittelwert (±SEM) ausgenommen Anzahl der Lungenmetastasen. Die statistische Analyse wurde mittels des Student´s t-test (ungepaart) durchgeführt. n.s. nicht signifikant; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.
Kontrolle Bortezomib
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Zell
en
/ m
l
Ergebnisse
39
4.2.4 Imaging
4.2.4.1 MRT
Zur Bestimmung der Tumorvolumina wurden MRT-Bilder angefertigt und diese mit dem Voxel
Programm (Voxel Man Gruppe, Hamburg) bearbeitet. Die Aufnahmen wurden im MRT sowohl
in T1 als auch in T2 Gewichtung angefertigt. Die anatomischen Strukturen waren mit der T1
Gewichtung sehr gut zu beurteilen, jedoch waren die Abgrenzung des Neuroblastoms, die
nekrotischen Anteile und die perifokalen Ödeme in den T2 gewichteten Aufnahmen deutlich
besser zu bestimmen. Für alle weiteren Beurteilungen und Berechnungen wurden deswegen
die sagittal oder coronal geschnittenen T2 Bilder benutzt.
Abb. 26: MRT-Aufnahme von scid-Maus Nr. 7.2. In der gezeigten MRT-Aufnahme ist die scid-Maus Nr. 7.2 in sagittaler Schnittrichtung und in T2 Gewichtung gezeigt. � zeigt den Primärtumor.
Danach wurden das Segmentationsverfahren und die automatische Erfassung
zusammenhängender Volumenelemente (Voxel) im Bereich der Tumore angewandt. Die
korrespondierenden Tumorvolumina wurden jeweils aus der Anzahl der segmentierten Voxel
und deren räumlichen Abmessungen berechnet. Gezeigt ist in Abb. 27 ein MRT Bild in
coronaler Schnittführung und die dazugehörigen durch die Voxel-Man Software bearbeiteten
Tumoranteile (rot dargestellt).
Ergebnisse
40
Abb. 27: MRT-Aufnahmen der scid-Maus nativ. Dargestellt ist die MRT-Aufnahme einer scid-Maus in coronaler Schnittführung und eine Bearbeitung des gleichen Bildes durch das Voxelprogramm. Der Tumor ist rot dargestellt.
Ergebnisse
41
Zudem wurde das berechnete Tumorvolumen mit dem tatsächlich am Tötungstag
gemessenen Tumorgewicht verglichen (Abb. 28). Mittels einer Produkt-Moment-Korrelation
(nach Pearson) wurde der Zusammenhang zwischen Tumorgewicht und Tumorvolumen
überprüft. Es ergab sich ein Korrelationskoeffizient von 0,6, der allerdings statistisch nicht
signifikant war.
Abb. 28: Graphische Darstellung der Korrelation zwischen Tumorvolumen und Tumorgewicht. Es besteht eine positive Korrelation zwischen dem durch die Voxel-Man Software bestimmten Tumorvolumen und dem tatsächlichen Tumorgewicht. Korrelationskoeffizient: 0,6.
Weiterhin konnte durch die VOXEL-MAN Arbeitsgruppe Hamburg eine dreidimensionale
Darstellung des Primärtumors der scid-Maus Nr. 7.2 hergestellt werden. Zum Vergleich
wurden Fotos am Tötungstag von dem Tumor der scid-Maus Nr. 7.2 angefertigt, so dass ein
direkter Vergleich möglich ist (Abb. 29).
0.00 0.25 0.50 0.75 1.000
100
200
300
400
500
Tumorgewicht [g]
Tu
mo
rvo
lum
en
[m
m3]
Ergebnisse
42
Abb. 29: Mittels Computerbearbeitung erstelltes 3D Bild eines Tumors sowie Foto desselben Tumors direkt nach Entnahme am Tötungstag. Die Abbildungen ermöglichen den direkten Vergleich zwischen der durch die Voxel-Man Software bearbeiteten MRT Tumordarstellung und dem Foto des resizierten nativen Tumors. Hierbei ist zu sehen, dass die Bearbeitung mittels des Voxel Programms eine gute Methode darstellt, um das Aussehen und die Form eines Tumors in situ nachzubilden.
Ergebnisse
43
4.2.4.2 PET-CT
Durch das PET-CT sollte die Sensitivität und Spezifizität der beiden Tracer [18F]FDG und
[18F]FLT zur Detektion eines Neuroblastoms ermittelt werden. Mit [18F]FDG konnten keine
Tumoren dargestellt werden, da sich dieser Tracer nicht ausreichend im Neuroblastom
anreicherte. Bei den [18F]FLT markierten Tumoren konnte dagegen eine visuelle Interpretation
vorgenommen werden. Die Tumorgewichte in beiden Gruppen unterschieden sich nicht
signifikant (Abb. 30). Es konnte festgestellt werden, dass es einen Zusammenhang zwischen
Tumorgewicht und Anreicherung des [18F]FLT im Tumor gab, wobei Tumoren unter 0,1 g nicht
detektierbar waren (Abb. 31). Zwischen 0,1 g und 0,3 g strahlten die Tumoren ein Signal ab,
dass stärker als das Hintergrundrauschen war. Ab einem Tumorgewicht von 0,4 g, war das
Signal stärker als das Referenzorgan Leber.
Abb.30: Durchschnittliches Tumorgewichte der Neuroblastome in den zufällig eingeteilten Gruppen [18
FDG und [18 F]FLT. Dargestellt ist der Mittelwert ± SEM. Es war kein signifikanter Unterschied in der Höhe des Tumorgewichtes festzustellen.
0 1 2
[18F]FDG 18 0 0
[18F]FLT 4 8 5
Tab. 6: Darstellbarkeit der Neuroblastome im PET-CT mit zwei verschiedenen Tracern. Die visuelle Interpretation von 0 - 2 wurde nach den folgenden Kriterien vorgenommen: 0 = kein Signal, 1 = stärkeres Signal als das Hintergrundrauschen, 2 = stärkeres Signal, als das des Referenzorgan Leber.
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
[18F]FDG [18F]FLT
Tu
mo
rgew
ich
t [g
]
Ergebnisse
44
Abb. 31: Korrelation des Tumorgewichtes mit der Anreicherung des Tracers [18F]FLT. Bei Zunahme des Tumorgewichtes kam es zu einer stärkeren Anreicherung von [18F]FLT in den Neuroblastomen. Ab einem Schwellenwert von ca. 0,1 g Tumorgewicht war eine visuelle Interpretation der Neuroblastome möglich. Die Beurteilung wurde nach den oben genannten Kriterien durchgeführt (siehe Tab. 6).
Abb. 32: Axial geschnittene CT- Aufnahme der scid-Mäuse im Reck des PET-CT. Die CT- Aufnahmen wurden dann zur Zuordnung der anatomischen Strukturen in den PET Aufnahmen benutzt.
[18F]FLT
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0
1
2
Tumorgewicht [g]
vis
uell
e I
nte
rpre
tati
on
Ergebnisse
45
A B
B
T
B
T
Abb. 33: scid-Maus Nr. 4.2 (Bortezomibgruppe) nach Fusion der CT und der PET Aufnahmen. A: Coronal geschnittene Aufnahme der scid-Maus. Die höchste Anreicherung des Tracers ergab sich in dem retrocervical gelegenen Tumor (T) und in der Harnblase (B), aufgrund der renalen Elimination des Tracers. B: Sagittal geschnittene Aufnahme des Tieres. Die Farbkodierung entspricht der unterschiedlichen Anreicherung des radioaktiven Tracers in der scid-Maus. Rot: Areale mit hoher Anreicherung (Tumor, Harnblase); gelb: Areale mit mittlerer Anreicherung; blau: Areal mit geringer Anreicherung.
Abb. 34: Axial geschnittene Aufnahmen der scid-Maus Nr. 4.2. Die Abbildung zeigt axial geschichtete CT- und PET-Aufnahmen des Thorax und des Hals- Kopfbereichs der scid-Maus. Die CT Aufnahmen des Tieres sind in Grauwerten dargestellt; die fusionierten PET-CT Aufnahmen sind farbig dargestellt. Die Farbgliederung zeigt wiederum die Stärke der Anreicherung der radioaktiven Substanz, wie in Abbildung 33 näher beschrieben. In cervicaler Höhe lässt sich der Tumor (T) besonders deutlich abgrenzen. In den dazugehörigen PET Aufnahmen sieht man wiederum die starke Anreicherung des Tumors mit [18 F]FLT. Weiterhin sind in der Abbildung Leber (LE), Lunge (L) und Schädelbasis (S) der scid Maus benannt.
L LE
T
S
Ergebnisse
46
Um eine noch bessere Zuordnung der Organstrukturen zu ermöglichen, wurden die PET-CT-
Bilder mit den vorher erstellten MRT-Bildern fusioniert (durch freundliche Unterstützung der
Nuklearmedizin des UKE). Dieses wird exemplarisch an Maus Nr. 3.3 in Abbildung 35
dargestellt.
Abb. 35: Fusion der MRT Aufnahmen mit den Bildern der PET–CT Untersuchung der Maus Nr. 3.3. in sagittaler Schnittführung (von rechts nach links). Der Tumor (T) ist retrocervical dargestellt. Weiterhin sind Herz (H), Lunge (L) und Harnblase (B) gekennzeichnet.
L
T
HB
rechtsrechts
links
L
T
HB
rechtsrechts
links
Diskussion
47
5 Diskussion
Das Neuroblastom ist bei Kindern der häufigste solide extrakranielle Tumor, dessen Prognose
vom Alter (> ein Jahr = schlechtere Prognose) und vom Ausbreitungsstadium dieses
embryonalen Tumors abhängt. Wird bei einem Kind, das älter als ein Jahr alt ist, ein
Neuroblastom des Stadium IV diagnostiziert, beträgt die mediane
Fünfjahresüberlebenswahrscheinlichkeit 20 % (Koletzko, 2003). Die bisherigen
Therapieansätze, bestehend aus Kombinationen von Operationen, Chemotherapeutika und
homologer Stammzelltherapie, zeigten bisher nicht den erhofften Erfolg (Morgenstern et al.,
2004). Daher ist es dringend erforderlich nach neuen Therapieansätzen zu suchen.
In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst in vitro überprüft, ob der Proteasomeninhibitor
Bortezomib auf die von uns getesteten humanen Neuroblastomzelllinien einen
antiproliferativen Effekt besitzt.
Es konnte gezeigt werden, dass das Medikament auf alle sieben getesteten Zelllinien eine
konzentrationsabhängige inhibitorische Wirkung bezüglich des Tumorzellwachstums hatte.
Alle Zelllinien zeigten einen massiven Abfall der Zellzahl bereits bei einer
Bortezomibkonzentration von 0,02 µg / ml. Bei der Zelllinie LS bewirkte dieses eine
Wachstumshemmung auf 6,9% der Kontrolle, bei der Zelllinie Kelly auf 7,8% der Kontrolle, bei
SK-N-SH auf 9% der Kontrolle. Bei den Zelllinien LAN-1 und LAN-5 zeigte sich eine
Hemmung auf 27% des Kontrollwertes. Bei der Zelllinie IMR-32 konnte das
Tumorzellwachstum auf 23% des Kontrollwertes gehemmt werden. Einzige Ausnahme war die
Zelllinie SH-SY5Y, die bereits bei einer Konzentration von 0,002 µg / ml einen starken Abfall
der Zellproliferation (auf 39% der Kontrolle) bewirkt hatte, welches sich in dem niedrigen IC50
Wert von 1,9 ng / ml widerspiegelt. Im Allgemeinen lagen die IC50 Werte zwischen den sieben
Zelllinien zwischen 1,9 ng / ml (SH-SY5Y) und 8,4 ng / ml (LAN-1). Auffallend ist die hohe
Standardabweichung von SH-SY5Y bei der Konzentration von 0,002 µg / ml von 39,6. Bei
allen anderen Zelllinien lag die höchste Standardabweichung ebenfalls bei dieser
Konzentration.
In der Arbeit von Brignole et al., (2006) konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Bortezomib
eine statistisch signifikante Inhibierung des Zellwachstums bewirkt, welche zeit- und
dosisabhängig war. Der IC50 Wert lag nach 24-stündiger Behandlung (bei zehn getesteten
Neuroblastomzelllinien) im Mittel bei 9,6 nM, nach 48 Stunden bei 7,3 nM und nach 72
Stunden bei 6,1 nM. Bei uns lag der IC50 Wert im Mittel (bei sieben Zelllinien) nach 48
Stunden bei 15,1 nM. Die Forschungsgruppe von Brignole et al., (2006) benutzte in vitro
Diskussion
48
teilweise folgende andere Zelllinien (GIE-N, GI-LI-N, GI-CA-N, HTLA-230, SK-NBE2c und
CAN), wodurch die unterschiedlichen IC50 Werte erklärt werden könnten, wobei die Werte in
der gleichen Größenordnung liegen. Brignole et al., (2006) testeten zusätzlich SH-SY5Y
(Bortezomib sensible Zelllinie) und die Bortezomib resistente Zelllinie HTLA 230 mit kurzen
Behandlungszeiten von einer und vier bzw. acht Stunden mittels wash-out-Assay. Bei der
Zelllinie SH-SY5Y lag der IC50 Wert nach vierstündiger Behandlung bei 60 nM und nach einer
Stunde bei 150 nM. Bei den HTLA 230 Zellen zeigte sich nach einstündiger Behandlung ein
IC50 Wert von 200 nM. Weiterhin zeigte sich, dass es nach einer 72-stündigen Behandlung mit
20 nM Bortezomib zu einer fast 100% igen Inhibierung des Zellwachstums bei der Zelllinie
SH-SY5Y gekommen war. Bei den weiter getesteten Zelllinien (LAN-1, SK-NBE2c, IMR-32
und GI-LI-N) war es zu ähnlichen Resultaten gekommen (Brignole et al., 2007) In der
vorliegenden Studie lag die nahezu 100% ige Wachstumsinhibierung von SH-SY5Y nach 48
Stunden bei 52 nM.
Valentiner et al., (2005) konnten bei der Testung von PPAR-γ Agonisten ebenso bei SH-SY5Y
die stärkste Inhibierung des Neuroblastomzellwachstums in vitro nachweisen. Den
Ergebnissen von Valentiner et al., (2005) und Brignole et al., (2006) zufolge, weist die Zelllinie
SH-SY5Y anscheinend eine gute Chemosensibilität auf. Gründe für die hohe Sensitivität
dieser Neuroblastomzelllinie sind in der Literatur nicht beschrieben.
Hamner et al., (2007) untersuchten die Neuroblastomzelllinien NB-1691, CHLA-255 und SK-
N-AS mittels verschiedener Konzentrationen des Medikamentes Bortezomib und
unterschiedlichen Behandlungszeiten. Hierbei konnte ebenfalls eine zeit- und dosisabhängige
antiproliferierende Wirkung erzielt werden. Nach 24 stündiger Behandlungszeit (1 µmol / l)
konnte eine dosisabhängige Abnahme der Proliferation bei den 3 Zelllinien auf 13% (NB-
1691), 15% (CHLA-255) und 26% (SK-N-AS) bestimmt werden (p<0,1). Bei der geringsten
Dosis (10 nmol / l) wurde eine Zunahme der antiproliferativen Wirkung mit steigender
Behandlungsdauer (24, 48 und 72 Stunden) nachgewiesen (Hamner et al., 2007).
Weiterhin berichtete die Forschungsgruppe von Michaelis et al., (2006), dass Bortezomib bei
den von ihnen getesteten chemosensiblen Neuroblastomzelllinien (IMR-32 und Be(2)-C) und
medikamentenresistenten Zelllinien (UKF-NB-3rVCR10, UKF-NB-3 und UKF NB-3rDox20) bei