Aumentano i rischi di diffusione dei patogeni mediante seme infetto: le piante orticole da foglia come esempio M.L. Gullino, G. Gilardi e A. Garibaldi Centro di Competenza per l’innovazione in campo ambientale (AGROINNOVA) 8 marzo 2012, Incontri Fitoiatrici, Torino
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Aumentano i rischi di diffusione dei patogeni
mediante seme infetto: le piante orticole da foglia
come esempio
M.L. Gullino, G. Gilardi e A. Garibaldi
Centro di Competenza per l’innovazione in campo ambientale (AGROINNOVA)
8 marzo 2012, Incontri Fitoiatrici, Torino
Patogeni trasmessi per seme Molti patogeni si conservano da un ciclo colturale
all’altro per mezzo del seme e vengono definiti “patogeni portati da seme”. Il seme rappresenta per questi patogeni un mezzo di diffusione spesso assai efficiente nell’ambito delle coltivazioni. Basta spesso un seme infetto ogni 10.000 per osservare gravi danni alle piante. Inoltre, il seme stesso, in relazione agli scambi commerciali (e a quelli a scopo di studio e ricerca) di cui è oggetto, può permettere a specie patogene, e alle loro eventuali varianti, di raggiungere aree nuove anche molto lontane da quelle di origine.
Come si è spostata la tracheofusariosi della lattuga
Fusarium wilt of lettuce
Giappone (1967) California U.S.A. (1993) Taiwan (1998) Italia (2002) Arizona U.S.A. (2003) Portogallo (2005)
Fusarium wilt of rocket Alcuni esempi di
patogeni importati
Tracheofusariosi di rucola coltivata e selvatica.
Gli agenti della malattia sono trasmessi per seme.
La malattia è stata osservata a partire dal 2002 in Lombardia.
In campo i primi sintomo sono osservabili su Eruca vesicaria a partire da temperature del terreno di 15°C.
TRACHEOFUSARIOSI DELLA RUCOLA
Sintomi su rucola coltivata (Eruca vesicaria) e selvatica (Diplotaxis sp.).
E’ confermata la trasmissione del patogeno mediante seme.
Basilico: patogeni importati
Peronospora belbharii agente della peronospora
Fusarium oxysporum f.sp. basilici agente della
tracheofusariosi
Alternariosi del basilico causata da Alternaria alternata
Trattamento dei semi Contaminazione da Alternaria
Disinfezione (ipoclorito di sodio 1%) Da 0 al 12% -- Da 0,25 al 26%
Sono stati analizzati undici campioni di semi di basilico della tipologia ‘Genovese gigante’ commerciali. Il saggio è stato effettuato in vitro su PDA impiegando 400 semi per lotto, disinfettati in una soluzione di ipoclorito di sodio (1%) o utilizzati tal quale. Tutti i campioni sono risultati contaminati da funghi del genere Alternaria, risultati patogeni.
In alcuni casi sono sufficienti percentuali assai basse di semi infetti per permettere la rapida diffusione della malattia in aree geografiche diverse. Ad esempio nel caso della Phoma valerianellae percentuali dell’1-2% di semi infetti possono provocare danni elevati. In altri casi, come in quello delle tracheofusariosi i danni evidenti si manifestano dopo 2-3 colture della stessa specie nel terreno che si è infettato utilizzando semi contaminati
Un nuovo servizio per le imprese Nel 2011 è stato avviato un nuovo Laboratorio
che si occupa di sanità del materiale di propagazione.
Le analisi fitosanitarie di funghi fitoparassiti di
materiale di moltiplicazione di piante da frutto e orticole sono accreditate dalla Regione Piemonte.
Perché un nuovo laboratorio?
• Per sfruttare l’esperienza maturata negli ultimi anni con progetti di ricerca europei;
• Per fornire un nuovo servizio alle imprese; • Per restare aggiornati sui nuovi problemi; • Per acquisire nuove risorse; • Per creare opportunità di lavoro ai giovani; …
Le attività del Laboratorio
Il laboratorio, che opera in stretta collaborazione con le imprese, si occupa di diagnosi e di caratterizzazione dei patogeni trasmessi per seme nonché della messa a punto di tecniche di concia dei semi con metodi chimici, fisici e biologici e di assistenza tecnica.
Diagnosi Per quanto riguarda la diagnosi,
il laboratorio è in grado di utilizzare tecniche tradizionali e molecolari, arrivando, nel caso di nuovi patogeni, a caratterizzarli e a definire tecniche diagnostiche che ne consentano non solo il riconoscimento, ma anche la quantificazione.
real time PCR, DNA array,…) Non ci sono metodi molecolari recepiti dalla normativa,
ma la letteratura si sta sempre più arricchendo di applicazioni che, se pur non ancora validate, presto offriranno possibilità applicative rapide e affidabili.
Future applicazioni prevedono l’uso di biosensori, che sfruttano reazioni biologiche per individuare l’organismo target e che sono già utilizzati in diagnostica clinica.
Codice Campione
cv Numero di isolati di P. valerianellae su
1000 semi
Pre-trattamento con ipoclorito di
sodio 1%
47/co Cambrai 61 No 130/co Cambrai 63 No 310 Trophy 150 No 310 Trophy 101 Si 313 Palace 46 No 313 Palace 40 Si 130CR Ljublianski 6 No 130CR Ljublianski 0 Si 353PS Juwallon 18 No 353PS Juwallon 10 Si
Metodi diagnostici: saggio biologico per il riconoscimento di Phoma valerianellae da seme
PDA + S
Contaminazione dei semi da P. valerianellae compresa tra 0,6% e 15%
Metodi diagnostici: primer specifico per il riconoscimento di P. valerianellae da seme
Tr. ipoclorito di Na non trattato
Una coppia di oligonucleotidi, entrambi della lunghezza di 18 bp, è stata disegnata (prodotto di amplificazione 496-bp): Pv-FOR (5’-GGCTTTGCCTGCCATCTC-3’) e Pv-REV (5’-GACGTCGTCGTCTGGTTG-3’).
Una PCR effettuata sul DNA estratto da funghi appartenenti al genere Phoma (P. betae, P. heteromorphospora, P. exigua) ha mostrato che la coppia di primer è altamente specifica quando sono utilizzate specifiche condizioni di temperatura (Tm=59°C).
Rilevate infezioni dei semi dell’ordine dello 0,6%
Le formae speciales di Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum: fungo anamorfo terricolo. Ceppi patogeni raggruppati in formae speciales sulla base della loro specificità d’ospite. Descritte circa 100 formae speciales diverse. Alcune formae speciales sono state ulteriormente suddivise in razze sulla base delle cultivar colpite.
Specie Famiglia Forma specialis Basilico Lamiaceae basilici Lattuga Asteracee lactucae Valerianella Valerianaceae raphani Rucola Brassicaceae raphani Catalogna Asteraceae Indivia Asteraceae
Alcuni ortaggi a foglia
Le formae speciales: le regioni IGS
Formae speciales: saggi di patogenicità su diverse specie di ospiti Razze fisiologiche: saggi di patogenicità su diverse cultivar di una singola specie vegetale Saggi biologici efficaci ma laboriosi e tempi lunghi Spaziatori intergenici – IGS (tra due unità ripetute): 1 - Analisi RFLP 2 - Analisi delle sequenze
Inter retrotransposon amplified polymorphism: IRAP
- Ceppi italiani identici a FOL proveniente da Taiwan (razza 1)
- Trasmissione del fungi attraverso materiale infetto proveniente dall’Asia
Ceppi italiani Ceppi stranieri
Razza 1 di F. oxysporum f.sp. lactucae (FOL)
Fusarium oxysporum f.sp. basilici
Amplificazione ottenuta mediante impiego di primer SCAR specifici per F. oxysporum f.sp. basilici: BIK1 e BIK2, BIK3 e BIK4, BIK1 e BIK4
Profilo RAPD con il primer OPB-08 5 FOB, FO ff.spp. dianthi, canariensis, radicis-lycopersici, gladioli, cyclaminis, lycopersici, melonis, lilii, pisi, tulipae, e isolati non patogeni
PSA1F/PSA2R
PSA3F/PSA4R
13 isolati batterici da kiwi. I primi 7 pozzetti sono gli isolati ottenuti da foglia, gli altri 6 da ramo.
Le amplificazioni con le coppie di primer PsaF1-PsaR2 e Psa3F-Psa4R hanno generato due amplificati di 280 bp e 175 bp in 60 dei 92 campioni analizzati.
Identificazione di Pseudomonas syringae pv actinidiae
Concia Per quanto riguarda la concia,
l’esperienza acquisita nell’ambito di progetti europei e nazionali che hanno riguardato la messa a punto di trattamenti di concia con mezzi chimici, fisici e/o biologici su semi di cereali e orticole consente di sviluppare rapidamente metodologie adeguate e adatte alle diverse situazioni.
Metodi alternativi di concia per il contenimento di Ascochyta pisi su seme di
pisello In prove condotte in ambiente protetto in vaso e su bancale attraverso concia umida o secca di seme naturalmente infetto (tasso di infezione: 20%) sono stati saggiati i seguenti trattamenti, valutando % di emergenza, incidenza e indice di malattia:
• impiego di acqua calda, vapore aerato, elettroni;
• uso di formulati commerciali a base di 4 microorganismi (Bacillus subtilis, Pseudomonas chlororaphis, Fusarium oxysporum e Streptomyces griseoviridis);
• applicazione di isolati di microrganismi selezionati per la loro capacità antagonistica;
• concia con estratto di timo e farina di crucifere;
• impiego di induttori di resistenza.
Metodi alternativi di concia per il contenimento di Ascochyta pisi su seme di
pisello Trattamento fisico Parametri Efficacia
Acqua calda 48 °C 10 min
+
Vapore aerato 74 °C 90 % U.R. 2
min
+
Elettroni 140 kV 12 kGy
+
Efficacia:
+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram)
++ effetto apprezzabile, ma inferiore al trattamento chimico
+ effetto non apprezzabile
Metodi alternativi di concia per il
contenimento di Ascochyta pisi su seme di pisello
Efficacia:
+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram)
++ effetto apprezzabile, ma inferiore al trattamento chimico
+ effetto non apprezzabile
Microrganismo (formulato) Dose/10 g seme Efficacia
Bacillus subtilis (FZB 24) 100 mg +
Streptomyces griseoviridis (Mycostop)
50 mg
+
Fusarium oxysporum 251/2 100 mg +
Bacillus subtilis (MBI 600) 100 mg
+
Bacillus subtilis (Serenade) 100 mg +
Pseudomonas chlororaphis (BA 2552)
300 μl +
Metodi alternativi di concia per il contenimento di Ascochyta pisi su seme di pisello
Efficacia:+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram); ++ effetto apprezzabile, ma inferiore al trattamento chimico; + effetto non apprezzabile
Metodi alternativi di concia per il contenimento di Ascochyta pisi su seme di pisello
Efficacia:+++ paragonabile al trattamento chimico di riferimento (Thiram); ++ effetto apprezzabile, ma inferiore al trattamento chimico; + effetto non apprezzabile
°(±) efficacia rispetto al testimone 0-20%; (+) efficacia rispetto al testimone 21-40%; (++) efficacia rispetto al testimone 41-60%; (+++) efficacia rispetto al testimone 61-80%; (++++) efficacia rispetto al testimone 81-100%;
Assistenza tecnica
Il laboratorio è, inoltre, in grado di svolgere assistenza tecnica sviluppando protocolli per trattamenti di concia di semi e di materiale di moltiplicazione con mezzi fisici, biologici e naturali e svolge, infine, attività di formazione, organizzando corsi di aggiornamento per tecnici e funzionari dei servizi fitosanitari
Conclusioni
Il nuovo laboratorio è stato progettato e
concepito come Centro per condurre ricerche avanzate e come servizio alle imprese. Questo nuovo servizio va ad aggiungersi al Centro di Saggio per la sperimentazione di agrofarmaci e al Laboratorio di Diagnostica fitopatologica.
… ad Agroinnova coltiviamo il futuro!
Finanziamento della Regione Piemonte (P.O.R. - F.E.S.R. 2007/2013 Polo di Innovazione agro-alimentare) - progetto SEVARDIA “Selezione varietale e diagnostica avanzata per la produzione di basilico di qualità in Piemonte e per la valorizzazione del prodotto trasformato (pesto)”.