PCR Polymerase Chain Reaction Adila Trubat
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PCR Polymerase Chain ReactionAdila Trubat
Síntese de DNA
Síntese de DNA
Ligações químicas que mantêm a estrutura do DNA
Ligações covalentes – unem os átomos; Forças hidrofóbicas – forçam as bases a se
esconderem dentro da dupla hélice; Forças de Van der Walls – entre os anéis
aromáticos de bases adjacentes (ao lado); Pontes de hidrogênio – entre as bases
adjacentes.
Síntese de DNA
Duplicação do DNA
A informação genética é estocada no DNA por meio de um código (o código genético) no qual a seqüência de bases adjacentes determina a seqüência de aminoácidos no polipeptídeo codificado.
Síntese de DNA O empacotamento do DNA acontece entorno das histonas
Origens de duplicação
Síntese de DNA
A síntese do DNA ocorre no sentido 5' → 3'
Síntese de DNA – enzimas de duplicação
Síntese de DNA – enzimas de duplicação
Síntese de DNA – enzimas de duplicação
DNA Polimerase III Sentido 5’ → 3’ Nucleotídeos 3P
são adicionados Liberação de
Pirofosfato
Síntese de DNA – enzimas de duplicação
DNA RNA
Duplicação do DNA
Duplicação do DNA
Duplicação do DNA
Duplicação do DNA
Duplicação do DNA
Duplicação do DNA
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR – primer • Sintetizados quimicamente;• 15 a 25 bases ;• Define limites alvo a amplificar – marcadores genéticos• Serve como ponto de início para a replicação;• Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas
direções (para frente e para trás);• Banco de Dados International Nucleotide Sequence Database
(www.insdc.org)• GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology Laborstory
(EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ)
Marcador Molecular
Um marcador genético é qualquer variação na sequência do DNA de um ser vivo que o diferencie de outro indivíduo - ou grupo de indivíduos - ou que permita a identificação de uma característica específica inerente a ele. Podem ser utilizados com diversas aplicabilidades, como a caracterização de doenças genéticas e novos medicamentos, e também para a identificação de indivíduos, com grande utilidade para a genética forense e testes de paternidade.
Marcador Molecular
A matéria-prima da variabilidade genética é a ocorrência de mutações. Estas, ao se perpetuarem com frequência acima de 1% na população, passam a ser reconhecidas como polimorfismos genéticos. Alguns polimorfismos podem ser utilizados como marcadores e os STR (short tandem repeat), ou microssatélites, são os mais comumente aplicados em testes de paternidade por DNA
Marcador Molecular
Os STR são formados por pequenos motivos (de 1 a 8 nucleotídeos) repetidos sequencialmente e são encontrados em regiões não codificantes por todo o genoma. Estes marcadores apresentam alta variabilidade, determinada tanto pelo motivo a ser repetido quanto pela quantidade de vezes em que aparece.
Marcador Molecular
Como cada indivíduo recebe um alelo do pai e o outro da mãe, a comparação entre loci hipervariáveis da pessoa analisada com os do suposto pai e confirmados com os herdados da mãe, é uma forma altamente discriminatória de determinar se há vínculo genético entre eles ou não.
Marcador Molecular
Marcador Molecular
Centenas de loci STR já foram identificados e, atualmente, utilizam-se sistemas comerciais formados por conjuntos de marcadores (CODIS, NGM, IDENTIFILER, entre outros) específicos para identificação humana que apresentam um alto grau de certeza.
Marcador Molecular
Uso de primers para regiões flanqueantes
PCR
PCR
Duplicação do DNA
PCR
Duplicação do DNA
PCR
PCR em tempo real
PCR em tempo real
PCR em tempo real
PCR em tempo real
PCR em tempo real
PCR em tempo real
Permite a quantificação de DNA presente na amostra – proporcional ao número de ciclos no qual aparece a fluorescência
PCR tradicional X PCR em tempo real
Teste de Paternidade
Marcador Molecular
Cálculo do IPC
Para alcançar um resultado confiável, é necessário realizar uma análise estatística. O índice de paternidade (IP) resume a informação fornecida pelo exame. Nesse índice, é calculada a probabilidade do suposto pai ser o pai biológico da criança, contra a probabilidade de qualquer outro indivíduo ser o pai.
O cálculo do IP deve ser realizado para cada um dos loci utilizados individualmente. O produto dos IPs estudados irá gerar o Índice de Paternidade Cumulativo (IPC). O IPC indica se a hipótese de que o suposto pai é o pai biológico está mais próxima de ser verdade do que a hipótese de que qualquer outro homem o seja.
Cromossomo Y
Os STRs do cromossomo Y também são bastante utilizados em identificação humana por DNA, pois têm características especiais que os tornam muito importantes,principalmente na investigação de paternidade. Por não haver recombinação durante a meiose, devido à falta de cromossomos homólogos, todos os membros do sexo masculino de uma mesma família possuem os mesmos alelos, que são herdados em blocos; a esse tipo de herança chamamos de herança haplotípica, e ao conjunto de alelos, chamamos haplótipos. Dessa forma, os STRs do cromossomo Y de um filho (do sexo masculino) será sempre igual à de seu pai, avô e tios.
Banco de dados de DNA
O primeiro banco de dados de DNA foi criado na Inglaterra nos anos 1990. No entanto, nos últimos anos, a grande expansão da biologia molecular e da bioinformática tem contribuído para o desenvolvimento de inúmeros bancos de dados de DNA no mundo todo. A criação desses bancos, atualmente, é uma tendência mundial. A princípio, a criação dos bancos se deu principalmente para contribuir com a polícia no esclarecimento de crimes cometidos, uma vez que evidências de DNA podem acusar ou inocentar um indivíduo de ter cometido um crime, tornando-se, assim, uma ferramenta utilizada nos tribunais.
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