Aula 12: Enzimas Introdução e Cinética · Disciplina de Bioquímica Geral Curso de Biologia Aula 12: Enzimas – Introdução e Cinética Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]

Disciplina de Bioquímica Geral

Curso de Biologia

Aula 12: Enzimas – Introdução

e Cinética

Prof. Marcos Túlio de Oliveira

[email protected]

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

mailto:[email protected]

Enzimas

GRANDE maioria formada por proteínas

(algumas enzimas são formadas por RNA)

Composto A (substrato)

Composto B (produto)

Centro ativo ou sítio

catalítico de uma

enzima é a porção da

molécula onde ocorre a

atividade catalítica.

Observe que não há

consumo ou modificação

permanente da enzima

Reação

catalisada

pela enzima

Enzimas

Função: Catalizadores de reações químicas (aceleração das

reações químicas, especificidade pelo substrato, funcionam em

diversas condições de temperatura e pH)

Enzimas

+ +

Enzima holozima

Apoenzima parte proteica

Parte Não proteica (cofator)

metal

coenzima

.

Enzimas

apoenzima holoenzima

Coenzimas participam do ciclo catalítico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos químicos para a reação

grupo prostético

Enzimas

Classificação das Enzimas

Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou à atividade realizada: Urease – hidrolisa a uréia DNA-polimerase – polimeriza DNA Agora…. Nomenclatura oficial das enzimas é dada pela Enzyme Comission da International Union for Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) : Exemplo... ATPase: EC 3.6.1.3 - é uma hidrolase.........................3 - atua num anidrido......................3.6 - o anidrido contém fosfato..........3.6.1 - esse anidrido é ATP.....................3.6.1.3

1. Óxido-redutases

( Reações de óxido-

redução).

Transferência de elétrons

Se uma molécula se

reduz, há outra que se

oxida.

2. Transferases

(Transferência de grupos

funcionais)

•grupos aldeído

•gupos acila

•grupos glucosil

•grupos fosfatos (quinases)

3. Hidrolases

(Reações de hidrólise)

•Transformam polímeros em monômeros.

Atuam sobre:

•Ligações éster

•Ligações glicosídicas

•Ligações peptídicas

•Ligações C-N

4. Liases

(Adição a ligações

duplas)

•Entre C e C

•Entre C e O •Entre C e N

5. Isomerases

(Reações de

isomerização)

6. Ligases

(Formação de laços

covalentes com gasto de

ATP)

•Entre C e O

•Entre C e S

•Entre C e N

•Entre C e C

enzima

sítio ativo

(catalítico)

substrato

Como as enzimas funcionam...



como a reação progride

mudança de

energia durante

a reação

variação de energia livre

padrão (bioquímica)

energias de

ativação


... e não aqui!

É aqui que as enzimas

agem!!!


energia de

ativação SEM

catalizador

energia de

ativação COM

catalizador


intermediários da

reação


passo limitante

da reação


Enzimas

+ +

A energia de ativação é monstruosa!!!

Enzimas acelaram reações várias

ordens de grandeza

Enzima

Velocidade na

ausência de enzima

“Reações/segundo”

Velocidade da

reação catalisada

“Reações/segundo”

Poder

catalítico

Anidrase carbônica

Triosefosfato isomerase

Carboxipeptidase A

AMP nucleosidase

Nuclease de estafilococos

1.3 X 10 –1

4.3 X 10 –6

3.0 X 10 –9

1.0 X 10 –11

1.7 X 10 -13

1.0 X 106

4.300

578

60

95

7.7 X 106

1.0 X 109

1.9X 1011

6.0 X 1012

5.6 X 1014

Número de “turnover” ou de renovação: quantas vezes a enzima completa

o ciclo da reação em um segundo

Compare esses números !

moles de S catalisado por segundo

moles de enzima

Número

de

turnover

=

energia de

ligação

Maior fonte

de energia

livre usada

por enzimas

para abaixar

as energias de

ativação das

reações


Como as Enzimas Funcionam...

enzima

sítio ativo

(catalítico)

substrato formação de

ligações

covalentes

transientes

com o

substrato!


Intermediário

ES

(E e S ligados

covalentemente)


enzima

sítio ativo

(catalítico)

substrato

formação de

várias ligações

fracas dão

especificidade

para ES!

sítio de ligação



+

formação de

várias ligações

fracas dão

especificidade

para ES!

Modelo chave-fechadura Nesse modelo,

o sítio ativo da enzima é pre-formado e

tem a forma complementar à molécula

do Substrato, de modo que outras

moléculas não teriam acesso a ela.

Modelo de encaixe induzido Nesse

modelo, o contacto com a molécula do

substrato induz mudanças

conformacio-nais na enzima, que

otimizam as intera-ções com os resíduos

do sítio ativo. Esse é o modelo aceito hoje

em dia.

Modelo Chave-Fechadura

Modelo de encaixe induzido


Exemplo do modelo de encaixe induzido (Carbopeptidase)

Em B: A ligação do substrato dipeptídico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.

Em A: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, à direita) e de Glu270 (centro), e um átomo de Zn2+, que está acima do Glu270.

A B


Determinar a taxa (velocidade) da reação e como esta muda em resposta a

mudanças nos parâmetros experimentais – abordagem central para estudar o

mecanismo de reações catalisadas por enzimas.

Cinética Enzimática Uma abordagem à compressão do mecanismo

Equação de Michaelis-Menten:

Cinética Enzimática

V0 = Vmax [S]

Km + [S]

Michaelis e Menten formularam as bases da cinética enzimática, para explicar como a concentração do substrato [S] afeta a velocidade da reação .

V0 = Vmax [S]

Km + [S]

Para se chegar à equação da hipérbole do gráfico V x S…

[S] muda com o passar do tempo em uma reação

enzimática in vitro. E daí?


tempo

[S]

1 2 3 4 5 6


[S] [E]

Enzima funciona a todo vapor e a mudança na [S] é

mínima durante o estágio inicial da reação.

tempo

[S]

15 30 45 60

É por isso que a gente olha para a velocidade inicial (V0)


Praticamente linear; ou

seja, quanto mais

substrato, maior a V0


Saturação! Não adianta

adicionar substrato, a V0 não

muda significativamente.

[S] [E],

portanto

[ES] é

favorecido


[S] [E],

portanto

[E] é

favorecido

[S] [E],

portanto

[ES] é

favorecido


[S] [E],

portanto

[E] é

favorecido



y = m . x + b equação

de reta




Km = k-1 = Kd

k1

Nesta condição, Km mede a afinidade da

enzima pelo substrato

Interação Proteína-Ligante

concentração do ligante

porcentagem dos sítios de ligação ocupados

concentração constante da proteína


kcat

descreve a taxa do passo limitante da reação

equivalente ao número de moléculas de

substrato convertidas a produto em uma

unidade de tempo em uma molécula de enzima,

quando a enzima está saturada com substrato


moles de S catalisado por segundo

moles de enzima

Número

de

turnover

=

Eficiência catalítica

Kcat/Km Parâmetro mais adequado para

comparações cinéticas

Condições do meio que afetam estabilidade protéica

• pH

• temperatura

% a

tivid

ad

e e

nzim

áti

ca

má

xim

a

pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9

O pH ótimo de uma enzima reflete

variações no estado de ionização de

resíduos de aminoácidos do sítio

ativo.

Fatores que afetam a atividade enzimática

1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

• Variações de pH: pH ótimo

• Variações de temperatura: temperatura ótima

100-

50-

0-

% a

tivid

ad

e e

nzim

áti

ca

má

xim

a

Temperatura

ótima

Desnaturação

térmica da

proteína

Pouca energia

para a reação

acontecer Ao contrário da curva em

forma de sino no caso da

atividade enzimática versus

pH, a enzima só está

desnaturada em temperaturas

acima da temperatura ótima.

Fatores que afetam a atividade enzimática

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Próxima aula: 13/06 - Enzimas (continuação)

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